大黄药材基原的鉴别模型及其构建方法，鉴别方法

摘要

本发明涉及药材鉴别技术领域，具体而言，涉及大黄药材基原的鉴别模型及其构建方法，鉴别方法。通过检测大黄药材指纹图谱，选定共有色谱峰，以峰面积为自变量代入典则判别式函数得到对应的坐标点，再观察其与标准坐标位置的一致性。这种鉴别方法更加直观，能够快速的鉴别基原大黄的种类。采用分类函数模型，将自变量代入分类函数中计算，比较判别值，值最大者即为待鉴定样品对应的基原。这样的鉴别方法简单、快速，鉴别结果也更加准确。本发明提供的鉴别方法计算简单，并且鉴别的结果准确，丰富了鉴别手段，有利于企业进行内控质量标准的建立。

说明书

技术领域

本发明涉及药材鉴别技术领域，具体而言，涉及大黄药材基原的鉴别模型及其构建方法，鉴别方法。

背景技术

大黄，本品为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。

目前，关于药材的基原鉴别，《中国药典》是通过DNA条形码分子鉴别。然而很多品种的药材都没有DNA条形码。企业在控制药材基原时，往往只能采用药典标准中的鉴别方法，即进行外观形状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、化学鉴别等。但是，对于部分药材品种，采用上述方法仍然不能将同品种不同基原鉴别开来。因此，开发一种经济、可靠的药材基原的鉴别方法具有重大意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种大黄药材基原鉴别模型及其构建方法，通过上述构建方法构建得到的鉴别模型为线性模型，计算简单。对17个变量进行降维，消除多重线性共线问题，使鉴别更加准确。并且，利用高效液相色谱法对药材进行指纹图谱分析，数据准确、稳定。

本发明的第二目的在于提供一种大黄药材基原的鉴别方法，通过典则判别式函数计算待鉴定样品的判别得分，在散点图中观察该样本的聚类情况，这种鉴别方法简单明了，可以更加直观的得到鉴别结果。

本发明的第三目的在于提供另一种大黄药材基原的鉴别方法，通过分类函数计算待鉴定样品的判别值，取最大值为本样品的判别类别。这样的鉴别方法更加简单，快速。并且，鉴别结果也更加准确。丰富了鉴别手段，有利于企业进行内控质量标准的建立。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种大黄药材基原鉴别模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用液相色谱法分别建立药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄的三组标准指纹图谱，独立地计算三组所述标准指纹图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到三组自变量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16和X17；

(2)将所述三组自变量分别代入典则判别式函数计算，得到三组判别得分D1和D2；

所述典则判别式函数为：

函数1：

D1＝155.8×X1-39.9×X2-129.1×X3+117.5×X4+6.8×X5+489.9×X6+92.7×X7+786.4×X8+147.8×X9-46.6×X10+718.9×X11+167.5×X12+7.2×X13+333.8×X14-139.9×X15+1429.1×X16-53.8×X17-70.7；

函数2：

D2＝56.5×X1+1.7×X2+5.8×X3+4.4×X4-6.9×X5-54.5×X6+16×X7+70.4×X8+222×X9-22.6×X10-139×X11+18.4×X12+14.8×X13+76.4×X14+75.7×X15-137.1×X16+1.5×X17-8.8；

(3)以D1为横坐标、D2为纵坐标，得到药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图，即大黄药材基原鉴别模型。

本发明提供了一种大黄药材基原鉴别模型的构建方法，通过上述构建方法构建得到的模型能够准确的鉴别三种大黄药材基原。

优选的，所述建立药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄的三组标准指纹图谱的步骤包括：取大黄样品0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

一种大黄药材基原的鉴别模型，由如上所述的构建方法得到。

本发明采用主成分分析和聚类分析，建立了一种可鉴别三种大黄药材基原的模型，经过检验，本判别模型准确可靠，通过此模型能够准确的得到鉴别结果。

一种大黄药材基原的鉴别方法，将待鉴定样品制成待试品溶液，进行液相色谱分析，得到待试品图谱，计算待试品图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到自变量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16和X17；代入典则判别式函数，得到待试品对应的判别得分D1和D2；以D1为横坐标、D2为纵坐标，得到待试品对应的坐标位置；观察待试品的坐标位置与标准坐标位置的一致性，从而鉴别该待鉴定样品的基原；所述标准坐标位置为药用大黄、唐古特大黄和掌叶大黄通过典则判别式函数获得的标准坐标位置。

优选的，所述标准坐标位置由上述大黄药材基原鉴别模型的构建方法得到。

优选的，所述制成待试品溶液的步骤包括：取大黄样品0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

在一些具体的实施方式中，大黄药材可以通过以下方法鉴别：先通过所述构建方法构建大黄药材基原鉴别模型，得到药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图。然后得到待测样品图谱及其自变量，代入典则判别式函数得到待测样品对应的判别得分D1和D2的坐标位置散点图。最后，观察待测样品的坐标位置与药用大黄、唐古特大黄和掌叶大黄对应的三组标准坐标位置的一致性，从而鉴别该待鉴定样品的基原。

优选的，所述鉴别模型还包括药用大黄、掌叶大黄、唐古特大黄三种基原药材的标准坐标位置图。

所述标准坐标位置图的具体坐标包括：

药用大黄：横坐标24.558，纵坐标4.812。

唐古特大黄：横坐标11.264，纵坐标-6.171。

掌叶大黄：横坐标-35.822，纵坐标1.359。

在一些具体的实施方式中，大黄药材还可以通过以下方法鉴别：先按照所述具体坐标构建药用大黄、掌叶大黄、唐古特大黄三种基原药材的标准坐标位置图。然后得到待测样品图谱及其自变量，代入典则判别式函数得到待测样品对应的判别得分D1和D2的坐标点。最后观察所述坐标点与所述标准坐标位置图的一致性，从而鉴别待测样品的基原。

采用这种鉴别方法更加简单、方便，并且鉴别也更加快速，鉴别的结果一目了然。

本发明通过检测大黄药材指纹图谱，选定共有色谱峰，以峰面积为原始数据，通过主成分分析、聚类判断，建立了一种可鉴别三种大黄药材基原的模型，计算方法简单，相对于一般的显微鉴别、薄层鉴别法，本发明提供的鉴别方法更能深入同品种不同基原鉴别，丰富了鉴别手段。

优选的，所述液相色谱分析的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05-0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

本发明在建立典则判别式函数和分类函数时采用的液相色谱分析的色谱条件如上所述，因此，待检测的样品采用上述标准进行分析时得到的鉴别结果会更加准确。

优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm。

优选的，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

优选的，所述色谱条件为：流速为每分钟0.30ml。

优选的，柱温为25℃。

优选的，检测波长为260nm。

待检测的样品采用上述标准进行分析时得到的鉴别结果会更加准确。

一种大黄药材基原的鉴别方法，包括如下步骤：

(1)采用液相色谱法建立待测样品的指纹图谱，计算所述指纹图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到自变量A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16和A17；

(2)将所述自变量代入药用大黄、唐古特大黄和掌叶大黄对应的分类函数计算，得到三组判别值Y1、Y2和Y3；

所述分类函数为：

药用大黄：

Y1＝4.1×A1-0.97×A2-3.14×A3+2.91×A4+0.13×A5+11.77×A6+2.35×A7+19.65×A8+4.7×A9-1.25×A10+16.98×A11+4.2×A12+0.25×A13+8.56×A14-3.07×A15+34.44×A16-1.32×A17-2.09；

唐古特大黄：

Y2＝1.41×A1-0.46×A2-1.49×A3+1.3×A4+0.12×A5+5.85×A6+0.94×A7+8.42×A8+0.29×A9-0.39×A10+8.96×A11+1.77×A12-0.01×A13+3.29×A14-2.04×A15+16.94×A16-0.62×A17-8.25；

掌叶大黄：

Y3＝-5.5×A1+1.43×A2+4.63×A3-4.2×A4-0.25×A5-17.62×A6-3.3×A7-28.08×A8-4.99×A9+1.64×A10-25.94×A11-5.98×A12-0.24×A13-11.85×A14+5.11×A15-51.38×A16+1.93×A17+1.88；

(3)比较判别值Y1、Y2和Y3，值最大者即为待测样品对应的基原。

本发明还提供了另外一种大黄药材基原的鉴别方法，这种鉴别方法是采用分类函数模型，在应用时仅需要将自变量代入分类函数中计算，然后比较判别值Y1、Y2和Y3即可。这样的鉴别方法更加简单，快速。并且，鉴别结果也更加准确。本发明提供的大黄药材的鉴别方法丰富了鉴别手段，有利于企业进行内控质量标准的建立。

优选的，所述建立待测样品的指纹图谱的步骤包括：取大黄样品0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用，然后用高效液相色谱法检测，得到所述建立待测样品的指纹图谱。

优选的，所述液相色谱法的分析条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05-0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

本发明是通过高效液相色谱法收集原始数据，这种方法采集的数据更加准确为大黄药材基原的鉴别奠定了基础。

本发明在建立典则判别式函数和分类函数时采用的液相色谱分析的色谱条件如上所述，因此，待检测的样品采用上述标准进行分析时得到的鉴别结果会更加准确。

优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm。

优选的，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

优选的，所述色谱条件为：流速为每分钟0.30ml；

优选的，柱温为25℃；

优选的，检测波长为260nm。

待检测的样品的色谱条件采用流速为每分钟0.30ml、柱温25℃、检测波长260nm的标准进行分析时得到的鉴别结果会更加准确。

另外，关于典则判别式函数和分类函数的获得方法，包括以下步骤：

(1)取药用大黄、掌叶大黄、唐古特大黄各三批，建立三种大黄药材基原的指纹图谱。

具体的，建立大黄药材指纹图谱的步骤包括：制备供试品溶液和参照物溶液，分别精密吸取所述供试品溶液和参照物溶液各1μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

其中，所述制备供试品溶液的步骤包括：取大黄药粉0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

所述制备参照物溶液的步骤包括：取大黄素参照物，精密称定，加入甲醇，制得大黄素含量为50μg/mL的溶液，作为参照物溶液。

所述高效液相色谱仪是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为每分钟0.30ml，柱温为25℃，检测波长为260nm，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

所述梯度洗脱按以下程序进行：0～1min，流动相A为2％→11％，流动相B为98％→89％；1～3min，流动相A为11％，流动相B为89％；3～6min，流动相A为11％→15％，流动相B为89％→85％；6～8min，流动相A为15％，流动相B为85％。

并且，发明人还进行了精密度试验、稳定性试验和重复性试验。所述精密度试验的步骤包括：取同一供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算17组6次色谱峰的峰面积RSD，RSD≤1.4％。所述稳定性试验的步骤包括：取同一供试品，在0、1、2、4、8、24小时进样进行检测，记录色谱图，计算17组6次色谱峰的峰面积RSD，RSD≤3.2％。所述重复性试验的步骤包括：取同一大黄药材6份，采用相同的制备方法和色谱检测，计算17组6次色谱峰的峰面积RSD，RSD≤4.1％。

(2)收集指纹图谱共有色谱峰，计算所述共有色谱峰中各峰占总峰面积的比例，得到建模数据。所述的建模数据如图1所示。

(3)对所述建模数据进行主成分分析，然后进行k均值分类，获得典则判别式函数模型和分类函数模型。

具体的，采用建模数据得到各变量标准化转化系数数据，如图2所示。抽取所述各变量标准化转化系数数据得到三个主成分，如图3所示为主成分系数表，如图4所示为主成分得分表。其中，所述第一主成分累积解释变量为51.9％；所述第二主成分累积解释变量为83.6％；所述第三主成分累积解释变量为91.5％。说明主成分分析得到的结果能够解释绝大多数原始变量信息。因主成分分析得的第二个主成分解释累积变量达到83.6％，因此以第一、二个主成分进行分类(K均值分类)，定义分为3类，如图5所示。然后以主成分分析的三个主成分为自变量，以k均值分类得到的分类号进行分类判别，获得典则判别式函数和分类函数。典则判别式函数系数如图6所示，典则判别式函数分类质心得分如图7所示，分类判别函数系数如图8所示。经分析，最终得到典则判别式函数和分类函数。

本发明提供的典则判别式函数和分类函数是采用主成分分析法，对原始数据提取了3个主成分，没有明确影响主成分的色谱峰，因此可避免药材质量造假。并且，采用聚类判断分析得到典则判别式函数模型和分类函数模型，这两个函数模型均为线性模型，计算更加简单，便于使用者的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)采用高效液相色谱法收集原始数据，数据采集准确。

(2)本发明通过主成分分析、聚类判断，提供了一种典则判别式函数模型及其鉴别大黄药材基原的方法，通过观察待鉴定样品的坐标位置与标准坐标位置的一致性，鉴别其基原。这样的鉴别方法简单，对于鉴别结果一目了然。

(3)本发明提供了一种采用分类函数模型鉴别大黄药材基原的方法，在应用时仅需要将自变量代入分类函数中计算，然后比较判别值Y1、Y2和Y3即可。这种鉴别方法更加简单，快速。并且，鉴别结果也更加准确。

(4)本发明提供了两种鉴别模型及其鉴别方法，采用模型鉴别计算简单，并且这两种判别模型的鉴别结果准确、可靠，丰富了鉴别手段，有利于企业进行内控质量标准的建立。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为获得典则判别式函数和分类函数所用的建模数据；

图2为通过建模数据得到的各变量标准化转化系数数据；

图3为抽取各变量标准化转化系数数据得到的主成分系数表；

图4为抽取各变量标准化转化系数数据得到的主成分得分表；

图5为K均值分类号结果表；

图6为典则判别式函数系数表；

图7为典则判别式函数分类质心得分表；

图8为分类判别函数系数表；

图9为本发明实施例提供的大黄药材指纹图谱17组特征峰的位置图；

图10为由实施例1所述的构建方法得到的药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图；

图11为实施例4所述的药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄三种基原药材的标准坐标位置图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例所述的大黄药材基原鉴别模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)建立药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄的指纹图谱：分别取药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄各0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用，然后用高效液相色谱法检测，分别得到三组大黄的指纹图谱。

所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为每分钟0.30ml，柱温为25℃，检测波长为260nm，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

所述梯度洗脱程序如下：

。

(2)收集指纹图谱共有色谱峰，包括17组特征峰，所述的17组特征峰的位置如图9所示。然后独立地计算三组大黄指纹图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到三组自变量，参见下表1。

表1 17组特征峰占总峰面积的比例统计表

(3)将所述三组自变量分别代入典则判别式函数，得到三组判别得分D1和D2，参见表2。分别以三组判别得分的D1为横坐标、D2为纵坐标，得到药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图。

表2药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄的判别得分

实施例2

本实施例所述的大黄药材基原鉴别模型，是由实施例1所述的构建方法得到的药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图，如图10所示。其中，图10中的(1)为药用大黄的坐标位置点，(2)为唐古特大黄的坐标位置点，(3)为掌叶大黄的坐标位置点。

实施例3

本实施例所述的大黄药材基原的鉴别方法，包括如下步骤：

首先，建立待鉴定大黄样品的指纹图谱，其所有参数均与实施例1中建立药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄指纹图谱的参数一致。然后得到待鉴定大黄样品的自变量，参见下表3。再将其代入典则判别式函数，得到待鉴定大黄样品对应的判别得分D1和D2(参见下表4)及其坐标点。

表3待鉴定大黄样品的特征峰占总峰面积比例统计表

表4待鉴定大黄样品的判别得分

最后，观察所述待鉴定大黄样品的坐标点位置与实施例2得到的药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄分别对应的三组标准坐标位置散点图的一致性，从而鉴别待测样品的基原。

从图10能够看出，待鉴定大黄样品(4)的坐标点位置与药用大黄(1)的坐标位置一致，因此，待鉴定大黄样品的基原为药用大黄。

实施例4

本实施例所述的鉴别三种大黄药材基原的方法，包括如下步骤：

(1)建立待鉴定大黄样品的指纹图谱：取待鉴定大黄样品0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用，然后用高效液相色谱法检测，得到所述建立待测样品的指纹图谱。

所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为每分钟0.30ml，柱温为25℃，检测波长为260nm，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

所述梯度洗脱程序如下：

。

(2)计算待鉴定大黄样品的指纹图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到自变量，如下表5所示。

表5待鉴定大黄样品的特征峰占总峰面积比例统计表

(3)作出包括药用大黄、唐古特大黄、掌叶大黄三种基原药材的标准坐标位置图，所述标准坐标位置图的具体坐标为：

药用大黄：横坐标24.558，纵坐标4.812；

唐古特大黄：横坐标11.264，纵坐标-6.171；

掌叶大黄：横坐标-35.822，纵坐标1.359。

所述标准坐标位置图如图11所示，其中，图11中的(a)为药用大黄的标准坐标位置点，(b)为唐古特大黄的标准坐标位置点，(c)为掌叶大黄的标准坐标位置点。

(4)将自变量代入典则判别式函数，得到待鉴定大黄样品的判别得分D1和D2，以D1为横坐标、D2为纵坐标，作出待鉴定大黄样品的坐标点，即图11中的(5)。

(5)观察图11，可以显而易见的看出，待鉴定大黄样品的坐标点(5)与(a)-药用大黄的标准坐标位置点一致，因此，待鉴定大黄样品的基原为药用大黄。

实施例5

本实施例所述的鉴别三种大黄药材基原的方法，包括如下步骤：

(1)建立待鉴定大黄样品的指纹图谱：取4组样品，按照以下参数建立指纹图谱：

取待鉴定大黄样品0.5g，过2号筛，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，备用，然后用高效液相色谱法检测，得到所述建立待测样品的指纹图谱。

所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为每分钟0.30ml，柱温为25℃，检测波长为260nm，理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

所述梯度洗脱程序如下：

(2)计算4组待鉴定大黄样品的指纹图谱上的17组特征峰占总峰面积的比例，从左到右依次得到自变量，如下表6所示。

表6待鉴定大黄样品的特征峰占总峰面积比例统计表

(3)将所述自变量代入药用大黄、唐古特大黄和掌叶大黄对应的分类函数计算，得到三组判别值Y1、Y2和Y3，如下表7所示。

表7待鉴定大黄样品的判别值

(4)比较判别值Y1、Y2和Y3，值最大者即为待测样品对应的基原。

如表7所示，对于待鉴定大黄6号样品，Y1值最大，其对应的基原为药用大黄，因此待鉴定6号样品的基原为药用大黄。

对于待鉴定大黄7号样品，Y1值最大，其对应的基原为药用大黄，因此待鉴定7号样品的基原为药用大黄。

对于待鉴定大黄8号样品，Y2值最大，其对应的基原为唐古特大黄，因此待鉴定8号样品的基原为唐古特大黄。

对于待鉴定大黄9号样品，Y3值最大，其对应的基原为掌叶大黄，因此待鉴定9号样品的基原为掌叶大黄。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。