一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用，脑缺血是对人类威胁最大的脑血管疾病，尽早建立再灌注会导致氧化损伤、炎症反应以及随后的兴奋毒性细胞死亡；本发明利用多巴胺在碱性的条件下被氧化形成多巴胺醌，而多巴胺醌进一步氧化形成具有超分子结构的聚多巴胺纳米粒子，形成的粒子表面光滑圆整,球形度较好，粒径分布较均匀,且在溶液中保持良好的分散状态，通过体外和体内实验，聚多巴胺纳米粒子证明了它的生物安全性，通过应用于脑缺血模型，表明其可减轻脑缺血再灌注损伤，抑制炎症反应，抑制NF‑κB信号通路的活化、抑制小胶质细胞的过度激活，具有抑制脑部炎症反应和减轻脑缺血再灌注损伤的潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用，属于药物制备领域。

背景技术

脑卒中是一组急性脑循环障碍所致的局部或全面性脑功能缺损综合征，每年造成约620万人死亡，是全世界第2位致死原因、首位致残原因。脑卒中分为缺血性脑卒中及出血性脑卒中。缺血性脑卒中又称脑梗死，是脑卒中主要的表现形式，约占70～80％。TOAST分类系统将其分为大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中(腔隙性卒中)、其他明确病因型脑卒中和不明原因型脑卒中。出血性脑卒中又称颅内出血，虽然发病率低于缺血性脑卒中，但是预后差，其致残率和病死率均高于缺血性脑卒中，可发生于血压出现剧烈波动时。对于缺血性脑卒中的首要治疗原则是尽早重建血液再灌，恢复脑部的血氧供应，使缺血脑组织重新获得营养物质供应，同时将有害的代谢产物清除掉。但脑缺血后再灌注可加重缺血脑组织的病理损害，使病情恶化，这种现象被称为脑缺血再灌注损伤(CerebralIschemia-Reperfusion Injury,CIRI)。针对CIRI的病理机制，世界各国的科技工作者进行了广泛而深入的研究，提出了能量代谢障碍、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、线粒体损伤、一氧化氮大量合成、炎症损伤、氧化应激、多巴胺和神经细胞凋亡等一系列学说；其中氧化应激损伤是近些年来研究的热点。当机体遭受有害刺激时，机体内产生的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)介导的抗氧化防御和氧化损伤之间的平衡被打破，ROS在机体或细胞内蓄积，引起机体组织细胞的氧化损伤过程即为氧化应激。氧化损伤以及随后继发的炎症反应以及兴奋毒性细胞死亡，不仅严重影响神经元的修复和功能恢复，而且还会导致使更多的组织损伤和出血转化。缺血/再灌注后活化的小胶质细胞和星形胶质细胞增加了促炎细胞因子的分泌，进一步加重了血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的破坏，随后循环白细胞迁移至受伤部位。这些失调的中性粒细胞可能释放促炎性细胞因子，蛋白酶和活性氧(ROS)，继续引起组织损伤和功能障碍。因此，消除促炎细胞因子和活性氧以减少组织损伤可能是脑卒中的重要治疗手段之一。

由于溶栓取栓治疗时间窗较窄以及部分地区医疗条件的限制，仅有部分急性缺血性脑卒中患者可以接受溶栓取栓治疗，因此神经保护治疗有了更为广泛的前景和重大的意义。目前主要的神经保护药物包括了自由基清除剂、钙离子通道阻断剂、谷氨酸受体拮抗剂、镁剂、GABA受体激动剂、细胞膜稳定剂、神经节苷脂类药物等等。然而2018年的ASA/AHA指南并没有推荐使用神经保护剂，因为到目前为止，没有足够的证据来证明它们能改善缺血性中风后的临床转归。不过在实际的应用中，一些神经保护剂确实显示了它们在减轻氧化应激、扩张缺血区小动脉、促进患者康复等方面的作用。由多巴胺的自聚合反应而产生的聚多巴胺纳米颗粒(PDA NPs)具有许多独特的化学特性，在纳米医学领域引起了广泛的关注。聚多巴胺作为黑色素的主要成分，由于出色的生物相容性和生物可降解性，已广泛用于药物输送，分子成像和癌症治疗。更重要的是，由于其结构中具有丰富的酚羟基，因此PDA具有出色的清除自由基的能力，并已被用作抗炎药来治疗包括急性腹膜炎和急性肺损伤在内的急性炎症性损伤。先前的研究已经证明PDA纳米颗粒可以降低ROS的水平并改善急性炎症，因此我们考虑是否将PDA应用于保护脑缺血再灌注损伤，并探究其与氧化应激和NF-κB信号通路等的作用关系。鉴于聚多巴胺纳米粒子出色的生物相容性和生物可降解性，倘若能进一步应用于脑血管疾病的治疗当中，将可能给该类患者的康复带来更多受益。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物的制备，以解决现有技术中存在的问题。

本发明利用线栓法制造大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型，观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经功能损伤情况，然后给予不同的药物处理，观察大鼠脑组织梗死体积，大鼠神经功能评分、行为学及NF-κB信号通路、炎症细胞因子以及氧化应激水平的表达，并通过免疫荧光观察小胶质细胞的活化程度，以此探讨PDA纳米颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑内氧化应激和炎症水平的影响，以及对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的修复的影响。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

聚多巴胺纳米颗粒的制备，包括以下步骤：

(1)配置弱碱性反应缓冲溶液

在敞口圆底烧瓶中先将8-10mL无水乙醇与18-20mL去离子水均匀混合，然后加入0.1-0.2mL氨水，在室温下使用磁力搅拌器搅拌20-30min，以配置氨水-乙醇混合溶液反应缓冲液。

(2)多巴胺自聚合反应

称取质量为100mg盐酸多巴胺粉末加入预先配置好的氨水-乙醇混合溶液反应缓冲液25-30mL，并在室温下保持搅拌24-48小时，可发现溶液颜色逐渐由无色变成棕色，又逐渐变成黑色，当盐酸多巴胺在弱碱性溶液中经过24-48小时的自聚合反应后，溶液变为深黑色的PDA悬浮液。

(3)PDA清洗、收集和表征

使用去离子水作为透析液，将生成的PDA悬浮液置于透析袋中透析48-72小时,并及时更换透析液，直至透析液澄清无色，且使用pH试纸测得pH值为中性。收集透析袋中PDA悬浮液，加入离心管中，以转速3000-5000rpm，在离心机中离心10-20分钟，将上清液(未参与反应的剩余物)去除，得到聚多巴胺纳米颗粒的混悬液，将聚多巴胺纳米颗粒的混悬液进行冷冻干燥，即可得到聚多巴胺纳米颗粒。

聚多巴胺纳米颗粒应用于制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

(1)本发明合成的制备得到的聚多巴胺纳米颗粒，聚多巴胺纳米颗粒形成了均匀且单分散的球形结构，可以稳定分散再水溶液中，而没有明显的聚集。

(2)本发明中在进行反应时，除了氢氧化铵和盐酸多巴胺这两种反应底物外，不添加其他催化剂，保证了制备得到的聚多巴胺纳米颗粒的安全性。

(3)本发明合成的制备得到的聚多巴胺纳米颗粒，通过应用于脑缺血模型，表明其可减轻脑缺血再灌注损伤，抑制炎症反应，抑制NF-κB信号通路的活化、抑制小胶质细胞的过度激活，具有抑制脑部炎症反应和减轻脑缺血再灌注损伤的潜力。

附图说明

图1为PDA的表征图，其中，图A，B为透射电镜下聚多巴胺纳米颗粒图像，图C为分散的聚多巴胺纳米颗粒尺寸范围的直方图，粒径为193.39±21.12nm；

图2为各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酸(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)含量的统计学差异图；

图3为各组PC12细胞、HBZY-1细胞、BRL-3A细胞的活力测定结果图；

图4为各组脑脊液抽取及万古霉素浓度测定结果图；

图5为PDA纳米颗粒对健康状况的影响结果图；

图6为改良神经系统严重程度评分结果图；

图7为行为学测试结果；图A为运动总路程，图B为中心区域时间；其中MCAO+NS组vsMCAO+PDA组，*p<0.05；

图8为TTC染色结果；经2％TTC染色后的四组脑切片照片(图A)，并对脑梗死体积进行定量分析(图B)，MCAO+NS组vs MCAO+PDA组，*p<0.05；

图9为脑干/湿重比结果图；

图10为海马中促炎细胞因子IL-1β，IFN-γ和TNF-α表达的蛋白质印迹分析，数据用SD±SEM表示；其中MCAO+NS vs Sham+NS组，#p<0.05，##p<0.01；MCAO+NS vs MCAO+PDA组，*p<0.05；

图11为酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-α和IL-10，数据用SD±SEM表示；MCAO+NS vs Sham+NS组，#p<0.05，##p<0.01；MCAO+NS vs MCAO+PDA组，*p<0.05；

图12为大鼠海马SOD活性和MDA水平示意图；

图13为(A)NF-κB p65，磷酸-NF-κB p65和GAPDH的Western blotting分析，(B,C,D)NF-κBp65，Phospho-NF-κB p65和GAPDH表达的定量分析，(E)IκBα的Western blotting分析(F)定量分析IκBα和Tubulin的表达；MCAO+NS vs Sham+NS组，*p<0.05；MCAO+NS vs MCAO+PDA组，#p<0.05；

图14为免疫荧光检测不同组别间海马CA1小胶质细胞数量的变化；小胶质细胞由IBA1标记为绿色，细胞核由DAPI标记为蓝色；MCAO+NS vs Sham+NS组，#p<0.05；MCAO+NS vsMCAO+PDA组，*p<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。

实施例1：聚多巴胺纳米颗粒的制备材料与方法

1、主要试剂和耗材

2、主要实验设备

3、聚多巴胺纳米粒子的制备

(1)配置弱碱性反应缓冲溶液

在敞口圆底烧瓶中先将8mL无水乙醇与18mL去离子水均匀混合，然后加入150μL氨水，在室温下使用磁力搅拌器搅拌30min，以配置氨水-乙醇混合溶液，最终得到的混合液体积约为25mL。

(2)多巴胺自聚合反应

称取质量为100mg盐酸多巴胺粉末加入预先配置好的25mL氨水-乙醇混合溶液反应缓冲液，并在室温下保持搅拌30小时，可发现溶液颜色逐渐由无色变成棕色，又逐渐变成黑色，当盐酸多巴胺在弱碱性溶液中经过30小时的自聚合反应后，溶液变为深黑色的PDA悬浮液。(3)PDA清洗、收集和表征

使用去离子水作为透析液，将生成的PDA悬浮液置于透析袋中透析48小时,并及时更换透析液，直至透析液澄清无色，且使用pH试纸测得pH值为中性。收集透析袋中PDA悬浮液，加入离心管中，以转速5000rpm在离心机中离心15分钟，将上清液(未参与反应的剩余物)去除，得到聚多巴胺纳米颗粒的混悬液，将聚多巴胺纳米颗粒的混悬液进行冷冻干燥，即可得到聚多巴胺纳米颗粒，产率为80％。

将混悬液用去离子水稀释至2mg/ml备用，并使用透射电子显微镜对所制备的PDA的形态和尺寸进行表征。

4、结果和讨论

多巴胺在碱性的条件下容易被氧化形成多巴胺醌，而多巴胺醌进一步氧化形成的低聚体通过共价和非共价相互作用形成具有超分子结构的PDA纳米粒子。与此同时，溶液颜色会随着氧化聚合反应的进行而不断变化，由初始的透明无色逐渐变成棕色，最终变为深黑色，因此通过观察反应溶液颜色的变化，也有助于判断反应进展情况。

使用透射电子显微镜(TEM)成像，对制备而成的PDA的形态和尺寸进行观测，并获得尺寸范围的直方图(图1)。如图所示，在扫描电子显微镜下,它们在溶液中保持良好的分散状态，形成的粒子表面光滑圆整,球形度较好，无明显破球及融合现象，而且粒径分布较均匀,平均尺寸约为200nm。

实施例2：聚多巴胺纳米颗粒对肝肾组织功能的影响

1、实验动物

24只雄性SD大鼠。将大鼠置于标准饲养环境中，环境温度控制在(22-24℃)，湿度为60％，控制光照时间和黑暗时间每12小时交替，大鼠可随意获取标准食物和清洁饮用水。

2、实验方法：

实验动物随机分笼，适应性饲养3天后开始给药，方法见组别及给药方案。

3、组别及给药方案：

24只大鼠按照给予PDA的剂量不同随机分为4组：低剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、高剂量组(20mg/kg)、空白对照组(等容量生理盐水)。仅给予一次腹腔药物注射后，观察大鼠7天，第7天使用10％水合氯醛麻醉后剖腹，从腹主动脉血抽取2mL血液测定肝功能指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酸(AST)；以及肾功能指标：尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)含量。采血后处死大鼠，迅速取部分肝、肾组织，使用4％多聚甲醛固定24小时，然后用不同浓度的酒精梯度脱水,最后用石蜡包埋切片。

4、实验结果与讨论

肝肾功能检测结果：为了探讨PDA对大鼠肝肾功能的影响，采用了三组不同剂量组和一组空白对照组，分别单次腹腔注射5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg剂量的PDA(空白组为等量生理盐水)。检测7天后大鼠的肝肾功能指标情况，发现四组大鼠的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酸(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)含量并无统计学差异(图2)，这表明，单次给予腹腔注射20mg/kg及以下剂量的PDA对肝肾功能的影响较小，并不会导致相关检测指标的变化。

实施例3：聚多巴胺纳米颗粒对大鼠细胞毒性作用观察

1、实验细胞：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12，大鼠肾内膜细胞HBZY-1，大鼠正常肝细胞BRL-3A，以上细胞株由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。

2、实验方法：

将细胞消化、计数，配制细胞悬液(PC12 5.0×104个/mL，HBZY-1,BRL-3A 3.5×104个/mL)，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液；

96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO

用培养基稀释药物至所需工作液浓度，分别于第0，24，48，60h于每孔加入100μL相应的含药培养基，3个复孔，同时设立阴性对照组；

将96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO

细胞活力(％)＝实验组OD值/阴性对照组OD值×100％。

3、实验结果和讨论

为了评估PDA对不同类型大鼠细胞的细胞毒性的影响，我们选择PC12、HBZY-1和BRL-3A三种细胞系进行研究。PC12细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，可分化为具有交感神经元特性的细胞，因此常被用于神经元的体外研究；HBZY-1细胞是大鼠肾内膜细胞，而BRL-3A细胞则是大鼠正常肝细胞，我们选用这三种细胞系分别代表大鼠肝、肾和神经等重要脏器系统。我们采用4种不同浓度的PDA(10、50、100、200μg/mL)，并按照先前文献制定的方案进行MTT测定而没有采用CCK-8测定，是为了避免PDA较强的吸光能力从而对检测结果的影响。如图3所示，当PDA浓度低于100ug/mL时，在24小时内三种细胞的活性均大于80％，但如果延长给药时间(48小时)或PDA浓度再增加两倍(200ug/mL)时，会出现细胞活性明显下降。以上结果表明，PDA中、低剂量在短时间内对细胞活性影响不大，而PDA高剂量或连续给药对细胞活性有一定的毒性抑制作用。

实施例4：聚多巴胺纳米颗粒的血脑屏障通透性研究

1、实验动物：SD大鼠18只，体重300g左右

2、实验方法

将10mg PDA与6mg盐酸万古霉素加入10mL PBS中，使用摇床轻微振荡混匀24小时，制备成PDA-万古霉素预混液。

将18只SD大鼠分为三组，每组6只，V组直接经腹腔注射万古霉素0.6mg，VMP组注射PDA-万古霉素预混液1mL(内含PDA 1mg，万古霉素0.6mg)，VP组先腹腔注射PDA 1mg，等待30分钟后再注射万古霉素0.6mg。

给药后观察24小时，抽取清亮的脑脊液100μL；通过液相色谱分别测定各组大鼠脑脊液中万古霉素浓度。

3、实验结果和讨论

为了确定PDA纳米颗粒能否通过血脑屏障在大脑中起直接作用，我们利用PDA的吸附特性设计了一个实验。将万古霉素和PDA预先混合24小时，促使PDA吸附万古霉素，然后经外周给药。经研究发现，注射预混药液后，脑脊液中万古霉素的浓度增加了约7倍(6.66±0.67 vs 0.96±0.15，p＜0.01)，参见图4。为了排除PDA破坏了血脑屏障从而导致万古霉素的通透性增加这种可能性，于是我们又顺序注射相同剂量的没有经过预混这一步骤的PDA和万古霉素，经测得脑脊液中万古霉素的浓度与单独给予万古霉素组相比并没有显著增加(1.488±0.19 vs 0.96±0.15，p＞0.05)。这个结果提示，脑脊液中万古霉素浓度的升高并不是由PDA破坏血脑屏障的完整性引起的，而是由万古霉素与PDA预先混合后被吸附，后跟随PDA一同通过血脑屏障所导致，这也表明了PDA纳米颗粒是可以通过血脑屏障的。

实施例5：PDA对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

1、实验动物

雄性SD大鼠120只，饲育条件同实例2。

2、实验方法

(1)线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型

(2)分组将120只大鼠根据治疗方案分为4组(每组30只)，如下：(1)Sham+NS组，(2)Sham+PDA组，(3)MCAO+NS组，(4)MCAO+PDA组。PDA处理组的大鼠腹膜内注射溶于盐水的PDA，剂量为3mL/kg；NS治疗组大鼠腹腔注射等量生理盐水。实验结束时，过量吸入异氟烷将大鼠安乐死。死亡后，迅速取出全脑进行2,3,5-三苯氯化四氮唑(Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色(每组6例)，脑含水量测定(每组6例)，剪取海马组织或抽血进行蛋白质和相关因子检测(每组6例)，以及进行荧光染色分析(每组3例)。

(3)神经功能评分：给药后第24小时、48小时和72小时使用改良神经缺损评分(mNSS)评估四组大鼠的神经功能。

(4)行为学测试：我们选择了旷场实验(Open Field Test,OFT)对大鼠进行行为学测试。

(5)大鼠脑组织行2,3,5-三苯氯化四氮唑(TTC)染色：

染色结束后拍照记录大脑切片的染色结果，正常的脑组织为红色，而梗塞区域为白色。使用Image J图像处理软件分析每个脑切片和梗塞区域的面积。梗塞程度通过整个脑切片中梗塞面积的百分比来反映。

(6)干湿比重法测定脑组织含水量：

每组各取6只大鼠，麻醉后断头处死取脑，除去嗅球、脑干和小脑，用吸水纸轻轻吸去脑表面的血液。用微量电子天平准确称得湿重，置于100℃烤箱中烘烤24h至恒重后测得干重，根据以下公式计算脑组织含水量百分比：

脑组织含水量％＝((湿重-干重))/湿重×100％。

(7)Western Blotting检测NF-κB P65、phosphor-p65、IκB-Alpha等蛋白表达以及IL-1beta、IFN-γ、TNF-α等炎性因子表达；

(8)酶联免疫吸附法检测大鼠血清中炎症因子含量：使用ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-10、TNF-α的含量。

(9)血清总SOD活性检测(WST-8法)；

(10)血清MDA检测；

(11)灌注及免疫荧光染色；

(12)统计方法；

数据用均数±标准差表示，统计分析采用GraphPad Prism 8.0软件。采用Student’st检验比较两组数据。采用单因素重复方差分析(ANOVA)或者双因素重复方差分析(Two-wayANOVA)确定不同多组间的显著性。p<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

(1)PDA纳米颗粒对健康状况和生存率的影响

体重变化是评估健康状况的常用物理参数。实验开始时，四组之间的体重没有差异。实验结束时与实验开始相比，除MCAO+NS组外，其余三组的体重都有显著增加。Sham+NS组和Sham+PDA组中没有动物死亡。MCAO+NS组的生存率为73.33％，而MCAO+PDA组为90.00％(Log-Rank Tes，p＜0.05)(图5)。

(2)神经功能缺损评分

图6显示了四组在24小时，48小时和72小时的改良神经系统严重程度评分(mNSS)结果。如图所示，大脑中动脉栓塞引起了大鼠严重的神经功能障碍，而MCAO+NS组相比，使用PDA治疗可明显减轻神经功能障碍。Sham+NS组和Sham+PDA组之间的神经功能缺损评分无显著差异。

(3)行为测试

与两个假手术组(Sham+NS组和Sham+PDA组)相比(图7)，两组脑缺血组的旷场实验运动总路程明显降低(p<0.05)，活性明显降低，并且运动趋向于旷场的四个角落，表明脑缺血对大鼠的行为和精神状态具有显著影响。同时，与MCAO+NS组相比，PDA治疗后MCAO+PDA组的旷场实验运动总路程显著提高(p<0.05)，大鼠表现出适应性反应，活动能力增加，并且其行为表现得以恢复，这表明PDA可以部分改善脑缺血后大鼠的行为症状。

(4)缺血半球的梗塞体积

图8显示了根据TTC方法染色的大鼠大脑的冠状切片。在Sham组的两个半球均完整无损伤，因为在所有部分中都没有白色区域。对照缺血组(MCAO+NS组)缺血(右)半球冠状部分的白色区域显示，MCA的阻塞已引起缺血(右)半球的皮质和纹状体脑梗塞。定性比较MCAO+PDA组右半球冠状切片的白色区域，表明PDA减轻了脑梗塞。如图8B所示，MCAO+NS组大鼠的梗塞体积平均值，PDA处理降低了该值。

(5)干湿比

脑干/湿重(W/D)比是脑含水量和脑水肿的良好指标，并且是评估脑损伤程度的重要指标。MCAO+NS组的W/D率明显高于MCAO+PDA组(p<0.05)，这表明MCAO+NS组的脑水肿和脑损伤程度比MCAO+NS组更严重。MCAO+PDA组(图9)，提示PDA可以减轻脑缺血再灌注损伤后的脑水肿。

(6)海马和血液中炎性因子表达水平

Western blotting结果如图10所示，在第7天，海马中白介素-1β(IL-1β)，干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平显著升高。缺血再灌注组与假手术组相比差异有统计学意义(p<0.05)。双因素方差分析证实，MCAO+PDA组的IL-1β，IFN-γ和TNF-α水平显著低于MCAO+NS组(p<0.05)。

(7)用ELISA法测定大鼠血清中炎性因子(TNF-α和IL-10)的表达水平

用ELISA法测定大鼠血清中炎性因子(TNF-α和IL-10)的表达水平。如图11所示，与假手术组相比，MCAO+NS组的TNF-α含量显著增加(p<0.05)，而IL-10则明显降低(p<0.05)。与MCAO+NS组相比，MCAO+PDA组的TNF-α含量明显降低(p<0.05)，IL-10则明显升高。以上结果表明，经PDA处理可以降低大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤引起的促炎细胞因子的表达，同时增加抗炎因子的表达。

(8)PDA对氧化应激的影响

脑缺血再灌注损伤诱导的自由基过度积累会激活炎症小体。SOD是一种有效的自由基清除剂，并且是一种重要的抗氧化酶，可清除脑缺血事件后的氧自由基。在图12中，我们的数据表明PDA增加了SOD水平(VS MCAO+NS组，IL-10则明显降低p＜0.05)，从而降低了氧化应激。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的指标，它是组织损伤的生物标记。结果表明，MCAO+NS组脑组织中MDA含量明显高于对照组(p＜0.05)，提示脑缺血再灌注损伤伴脂质过氧化水平升高。MCAO+PDA组海马的MDA含量低于MCAO+NS组(p＜0.05)，说明PDA可能抑制脂质过氧化。Sham+NS组和Sham+PDA组的MDA含量无统计学差异(p＜0.05)。

(9)NF-κBp65在海马中的表达及其磷酸化

用Western blotting检测大鼠脑细胞中NF-κb p65和磷酸化p65的表达，并探讨NF-κB信号通路是否参与PDA对脑缺血再灌注损伤的保护作用。与假手术组相比，MCAO+NS组海马中磷酸化p65的表达明显增加，而总p65的表达并没有差异(图13)。另外，与MCAO+NS组相比，MCAO+PDA组中磷酸化p65的表达显著降低。同时我们发现使用PDA时IκBα的磷酸化显著降低。

(10)小胶质细胞活性

为了观察不同组别的小胶质细胞在脑缺血再灌注后数量和形态的变化，采用免疫荧光染色法，使用IBA1标记各组海马CA1区的小胶质细胞，发现脑缺血再灌注后小胶质细胞显著活化。统计分析显示，与MCAO+PDA组相比，MCAO+NS组小胶质细胞的数量增加44％(p<0.05)(图14)

4、结论

通过研究再次证明了聚多巴胺纳米颗粒所表现出的广泛的抗氧化活性，突出了它作为一种强大的自由基清除剂的潜力。聚多巴胺纳米颗粒可以消除脑缺血再灌注时过量产生的ROS，抑制NF-κB炎性信号通路的激活，抑制促炎细胞因子并促进抗炎细胞因子的产生，抑制小胶质细胞过度活化，从而减少脑梗塞面积，减轻脑水肿，改善神经功能，证明了其可以在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。