再生及转殖大麻的方法

摘要

本发明公开一种大麻的体外克隆繁殖、再生及转殖的方法。本发明亦公开将此种方法用于改善大麻品种的用途，例如通过育种。

说明书

本申请要求于2018年6月7日提交美国临时专利申请案第62/681,697号的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

建立于2019年6月5日且标题为77944序列表.txt的包括49,173个字节的ASCII文件与本申请同时提交，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明的一些实施例，涉及一种再生及转殖大麻的方法。

寻常大麻L.(Cannabis sativa L.)是一年生草本植物。其是最早起源于中亚的栽培植物之一。其被视为是一食品、石油、纤维、药用及休闲用药物的来源，因此已经散布于世界各地。寻常大麻(大麻)中含有大麻素，其是一类独特的萜酚化合物，主要积累在植物的腺毛中。从大麻中已分离出超过100种大麻素，主要的生物活性化合物为Δ9-四氢大麻酚，通称为THC。

植物的遗传转殖技术的发展已在朝向具有增强的生产特性，例如除草剂、昆虫及抗病性的植物进行遗传性设计方面产生巨大的进步。数种转基因植物的商业品种已被释放。利用生物技术策略可进一步促进具有经性状改良的新大麻品种的发展。许多大麻品种的雌雄异株的生命周期使为改善诸如抗病虫害的特定性状而进行的育种工作变得复杂。开发用于再生大麻幼苗的组织培养系统及农杆菌介导的转殖方案将允许利用更多的遗传多样性来改良植物，并有助于具有理想性状的植物的无性繁殖。

关于大麻的组织培养的报道很少。此等研究大多数旨在开发一种细胞培养系统以获得次生代谢产物，特别是大麻属所特有的一类大麻素(特纳等人，1980)。愈伤组织培养物(汉普希尔等人，1978、海特里希及拜恩德，1982)及悬浮培养物(维利及格内斯特，1972、伊特克瓦等人，1977、哈特塞尔等人，1983、罗等人，1983、布雷默及帕里斯，1987)已被建立并用于次生代谢产物的提取及生物转殖的研究。

已描述通过刺激结节上的腋芽或在茎顶上诱导不定芽来体外繁殖苜蓿植物的方法(拉塔等人，2009.vitro Cell Dev Biol Plant.45，12-19.doi：10.1007/s11627-008-9167-5、王等人，2009.Pak J.Bot.41，603-608)。结果表明，微繁殖植物是遗传稳定的。因此，所述方法对于此重要作物的无性繁殖是合适且有用的(拉塔等人，2010.PlantaMed.76，1629-1633doi：10.1055/s-0030-1249773、拉塔等人，Journal of AppliedResearch on Medicinal and Aromatic Plants.3(2016)18-26)。

亦已开发通过合成的种子技术繁殖大麻的方案。根据此程序，将腋芽或结节封装在藻酸钙珠粒中(拉塔等人，2009.Physiol Mol Biol Plants.15，79-86doi：10.1007/s12298-009-0008-8、拉塔等人，2011.Biotechnol.Lett.33,2503-2508,doi：10.1007/s10529-011-0712-7)，之后可将其存储并随后用于植物的克隆繁殖。此系统显示即使在储存6个月后，此系统仍可以使同质的且遗传稳定的大麻植物生长(拉塔等人，2011.Biotechnol.Lett.2503-2508doi：10.1007/s10529-011-0712-7)。

器官的再生，尤其是茎，可能非常麻烦，因此必须进行不同的植物生长调节剂浓度及组合的筛选，以找出合适的培养基组成物。

寻常大麻是一种臭名昭著的难以转殖的植物，由于其再生效率非常低(斯卢萨尔科维奇-加丽娜等人，2005.Acta Biol Cracov Ser Bot.47，145-151)。

基因组编辑是一种有前途的植物育种的新技术。使用称为CRISPR-Cas9突变的设计者核酸酶，可精确地针对任何感兴趣的基因。成功的基因组编辑需要简单的遗传学(二倍体)及高质量基因组DNA序列的可用性。编辑之后，应删除CRISPR-Cas基因，例如通过杂交并选择继承经诱导突变的空分离子。杂交不适用于诸如大麻的异型合子的作物，以无性繁殖方式进行繁殖。需要开发在叶片原生质体中短暂表达的方法。

其他的背景技术包括：

Zhao等人，2017-Nature Plants.3(12)：956、

麦金农,L.、麦克杜格尔,G.、阿齐斯,N.及米拉姆,S(2001)“纤维大麻的转殖的进展”Annual Report of the Scottish Crop Research Institute 2000/2001,eds W H.麦克法兰史密斯及T.D.海尔布隆(丹地：SCRI因弗戈里),84-86、

美国专利申请公开第20120311744号。

发明内容

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种体外繁殖大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)在一固体培养基上培养包括一分生组织的一大麻植物部分，以获得一外植体；以及随后

(b)使所述外植体经受一细胞壁破坏剂处理；

(c)在一液体培养基中培养所述外植体；以及随后可选地，

其中步骤(a)至(c)进行1至n次，直至出现适合再生的叶片为止。

根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：在步骤(a)之前对所述外植体进行灭菌。

根据本发明的一些实施例，所述液体培养基包括所述细胞壁破坏剂。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(c)是在摇晃中进行。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(a)是进行7至30天。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(c)是进行5至30天。

根据本发明的一些实施例，所述分生组织是一顶端分生组织或一腋生分生组织。

根据本发明的一些实施例，包括所述分生组织的所述外植体是一茎的外植体。

根据本发明的一些实施例，所述外植体是来自一幼苗。

根据本发明的一些实施例，所述外植体是来自一成熟的植株。

根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：在步骤(a)与(c)之间自所述外植体移除叶片以及坏死区域。

根据本发明的一些实施例，所述细胞壁破坏剂是选自由一化学药剂、一酵素及一物理性处理所组成的群组。

根据本发明的一些实施例，根据本发明的一些实施例，所述酵素包括多个酵素。

根据本发明的一些实施例，以一亚致死浓度提供所述酵素。

根据本发明的一些实施例，所述酵素是选自由果胶酶、角质酶及其组合所组成的群组。

根据本发明的一些实施例，在所述步骤(a)中，所述固体培养基缺乏所述细胞壁破坏剂。

根据本发明的一些实施例，所述出现适合再生的叶片是通过生根以及驯化来体现。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种依据本文中所述的方法所获得的可再生的大麻外植体。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种在一组织培养物中再生大麻的方法，所述方法包括：在一固体培养基上体外培养一可再生的大麻外植体，以再生大麻，其中所述固体培养基包括至少一再生剂以及一细胞壁破坏剂。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种体外转殖大麻的方法，所述方法包括：将一可再生的大麻外植体与一多核苷酸及一细胞壁破坏剂体外接触，其中所述多核苷酸编码感兴趣的一表达产物。

根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：在接触之前，使叶片受伤。

根据本发明的一些实施例，所述转殖包括一短暂转殖。

根据本发明的一些实施例，所述转殖包括一稳定转殖。

根据本发明的一些实施例，所述接触是通过轰击法或农杆菌而实现的。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种在植物体中再生大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及

(b)利用一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种在植物体中转殖大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及

(b)利用一组合物及另一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素，所述另一组合物包括一核酸序列，所述核酸序列编码感兴趣的一表达产物。

根据本发明的一些实施例，包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物是相同的组合物

根据本发明的一些实施例，包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物是不同的组合物。

根据本发明的一些实施例，同时以包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物进行处理。

根据本发明的一些实施例，依序以包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物进行处理。

根据本发明的一些实施例，所述依序进行是在24至96小时的一间隔内进行。

根据本发明的一些实施例，所述大麻植物是一幼苗。

根据本发明的一些实施例，所述大麻植物是一成熟的植株。

根据本发明的一些实施例，所述成熟的植株包括：至少两个节点。

根据本发明的一些实施例，所述暴露是在留下单一叶片或子叶以进行光合作用的同时而进行的。

根据本发明的一些实施例，所述组合物是配制为允许所述组合物附着于所述分生组织经耗尽的大麻组织的一表面上。

根据本发明的一些实施例，包括至少一植物激素的所述组合物以及包括感兴趣的一核酸序列的另一组合物中的至少一者包括一乳化剂。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种通过体胚形成进行再生大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)在一液体培养物中培养一愈伤组织或一可再生的大麻外植体，同时摇晃直至出现球状结构为止；

(b)在另一液体培养物中培养所述球状结构，同时摇晃直至出现叶片为止。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(a)是在氯吡脲的存在下进行的；且步骤(b)是在氯吡脲+大麻二酚的存在下进行的。

根据本发明的一些实施例，所述步骤(a)是在缺少大麻二酚下进行的。

根据本发明的一些实施例，将依据本文中所述的方法所生产的一叶片与一多核苷酸接触，所述多核苷酸编码感兴趣的一表达产物。

根据本发明的一些实施例，所述多核苷酸是包含在含有农杆菌或聚乙二醇的一制剂中。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种生产大麻原生质体的方法，所述方法包括：利用离析酶R-10及甘露醇处理一大麻组织，以获得原生质体。

根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：利用纤维素酶温祖卡R-10及/或半纤维素进行处理。

根据本发明的一些实施例，所述离析酶R-10是以0.4至1.5％的浓度提供。

根据本发明的一些实施例，所述半纤维素是以0.5至2％的浓度提供。

根据本发明的一些实施例，所述温祖卡R-10是以0.5至3％的浓度提供。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种由依据本文中所述的方法所获得的原生质体。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种转殖大麻的方法，所述方法包括：将如本文中所述的原生质体与一组合物接触，所述组合物包括编码感兴趣的一表达产物的一核酸序列。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种转殖大麻的方法，所述方法包括：在一磁场下，将一大麻植物的花粉与多个颗粒接触，所述多个颗粒包括编码感兴趣的一表达产物的一核酸序列，所述磁场使所述多个颗粒集中以及允许所述感兴趣的核酸序列渗透至所述花粉中。

根据本发明的一些实施例，所述花粉是在收获后最长达12小时内被使用。

根据本发明的一些实施例，所述大麻是寻常大麻。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种再生大麻的方法，所述方法包括：利用一再生的基因进行所述大麻的一外植体的转殖，并使所述组织再生。

根据本发明的一些实施例，所述转殖是依据本文中所述的方法。

根据本发明的一些实施例，所述再生的基因包括：CsBBM及CsSERK1的一核酸序列或其一同源物。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种如本文中所述的方法所获得的经转殖的大麻植物。

根据本发明的一些实施例，编码感兴趣的一表达产物的所述核酸序列是选自由一基因组编辑剂、一RNA沉默剂、一再生剂、赋予一农业价值剂的一基因以及一大麻代谢体调节剂所组成的群组。

根据本发明的一些实施例的一方面提供一种育种的方法，所述方法包括：将如本文中所述的植物与另一个大麻植物进行杂交。

根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：选择感兴趣的一表型。

根据本发明的一些实施例，所述表型包括：存在或缺少一转基因。

根据本发明的一些实施例，所述感兴趣的表型包括：一农业价值的性状及/或一大麻价值的性状。

除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管与本文中所描述的彼等类似或等同的方法及材料可用于实践或测试本发明的实施例，然而以下描述示例性的方法及/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并非意图必然是限制性的。

附图说明

本文仅通过示例的方式，并参考附图描述本发明的一些实施例。具体详细地参考附图，要强调的是，所示出的细节是通过实例显示且是出于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。就这此方面，结合附图所进行的描述对于本领域技术人员而言显而易见的是能够如何实施本发明的实施例。

在图式中：

图1显示大麻组织培养的建立。将十种不同的大麻品种幼苗和茎条切条进行灭菌，并在补充有10g/L蔗糖、pH 6.8的5.5g/L琼脂及不同的植物激素组合的1/2MS培养基上每天光照16h进行生长。大部分的品种在补充有不同的激素组合的固体培养基上显示出限制性的生长。

图2是一柱状图，显示组织培养对于各种生长培养基的反应。生长率自1(生长停滞)至5(快速生长)进行评分。

图3A至图3C是图像，显示根据在实例部分中所述的实施例，使用“液体处理”的大麻植物在组织培养中的繁殖。图3A：在固体培养基中培养28天的组织培养物生长及发育缓慢。图3B：根据在实例部分中所述的实施例，经21天“液体处理”的培养49天的组织培养物。图3C：“液体处理”后的同一植物(图3B)，在一固体培养基中培养。

图4显示液体介质与亚致死剂量的角质层切口酶以及植物及表面活性剂组合处理的结果。

图5A至图5C显示根据图4所产生的大麻植物的生根及驯化。图5A：在液相中经具有切口酶的固-液-固态培养后的体外植物。图5B：生根圆筒中的植物。图5C：驯化(种植)一个月后温室中的盆栽植物。

图6是一图像，显示来自不同植物组织的大麻再生(组织培养的叶片及愈伤组织，来自种子的子叶)。

图7是显示不同植物组织的大麻转殖。使用uidA-内含子及nptII基因成功转殖数个大麻品种。数个大麻品种的叶片、下胚轴、愈伤组织及子叶的有效短暂的转殖(上图)。所有的测试性克隆皆显示阳性PCR(下图)。

图8A至图8F是图像，显示在实例部分中所述的实施例中使用“再生糊”及适当的植物激素组合在植物体中再生大麻幼苗。图8A：幼苗分生组织-虚线表示切割、受伤的地方。图8B：剥下子叶与茎之间的组织并暴露。应注意，并未隐藏分生组织。由箭头指示开始切割的位置。图8C：切下的幼苗的扫描电子显微照片。图8D：切开的幼苗的立体显微镜照片。图8E至图8F：再生芽，箭头指示经移出的茎的残留。

图9是一图像，显示根据在实例部分中所述的实施例，使用“再生糊”及适当的植物激素组合，在植物体中大麻插条的再生。应用“再生过去”后14天观察到植物再生

图10A至图10C显示使用带有二元载体pME504的农杆菌品种EHA 105，在植物体中进行的转殖，所述二元载体pME504带有β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)及新霉素磷酸转移酶(nptII)的基因。通过幼苗的GUS组织化学染色分析及利用PCR所进行的分子鉴定及GUS及nptII可证明T0代的可转殖性。

图11A至图11C显示使用带有二元载体pX11的农杆菌品种EHA 105，在植物体中进行的转殖，所述二元载体pX11带有nptII及甜菜碱的基因。通过甜菜碱染色(图11A至图11B)及PCR证明T0代的可转殖性。

图12A至图12B显示起始于补充有10mg/l CPPU的B5培养基的一液体培养物(图12A)及球形阶段的胚体(图12B)。

图13A至图13B显示在液体培养基上的植物再生。在补充有10mg/l CBD-CPPU的B5培养基上开始悬浮培养，以形成球状胚体(图13A)愈伤组织(图13B)及植物再生(图13C)。

图14是一图表，显示在各种酶的处理下，三个不同变种的大麻(Canabis sativa)的叶肉原生质体产量(X10

图15A及图15B显示在酶处理(酶C的复合物)之后所分离出的大麻原生质体。

图16显示使用RFP基因的原生质体转殖。

图17A至图17D是大麻花粉的光学显微镜的图像。图17A：利用番红O染色的花粉粒。图17B：18h后花粉粒的发芽。(图17C：表达外源报告基因GUS基因的转殖花粉粒。图17D：无转殖的染色对照。

图18显示CsBBM及CsSERK1基因的序列(分别为SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：1)。可自网址www.medicalinalplantgenomics.msu.edu/index.shtml所获得的数据库得到转录物序列。起始密码子及终止密码子是以黄色突出显示。

图19是用于在大麻植物中诱导体细胞胚发生及基因组编辑的质粒图。CAS9受到CsUBIQUITIN10启动子(SEQ ID NO：11)的控制、CsBBM及CsSERK1基因受到同一个CsUBIQUITIN10启动子(SEQ ID NO：11)的控制。

具体实施方式

本发明的一些实施例涉及再生及转殖大麻的方法。

在详细解释本发明的至少一实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下描述中所阐述或通过实例举例说明的细节。本发明能够具有其他的实施例，或者能够以各种方式被实施或执行。

大麻由于其丰富的植物化学物质、其纤维及其农业特性，称为抗干旱及害虫，其发达的根系可防止土壤流失及相对于诸如棉花的其他作物具有较低的需水量，因此大麻目前正在复苏中。目前正在栽培可生产石油、生物质及植物化学物质的大麻品种。基因组序列的可用性极大地帮助对此重要作物的分子研究(范巴克尔等人，2011，“寻常大麻的基因组及转录组草图”.GenomeBiol.12：R-102.doi：10.1186/gb-2011-12-10-R-102)。此外，科学界非常感兴趣于利用大麻作为药理作用。

然而，迄今，关于大麻的组织培养的报道很少。此等研究大部份旨在开发一种细胞培养系统以获得次生代谢产物，尤其是大麻属所特有的一类大麻素(特纳等人，1980)。愈伤组织培养物(汉普希尔等人，1978、海特里希及拜恩德，1982)悬浮培养物(维利及格内斯特，1972、伊特克瓦等人，1977、哈特塞尔等人，1983、罗等人，1983、布雷默及帕里斯，1987)已被建立并用于次生代谢产物的提取及生物转殖的研究。然而，大麻植物的转基因品种尚未被发布，且研究尚未证明此技术可被应用。

在减少实施本发明的实施例的同时，本发明的发明人能够在培养物中再生大麻并开发用于在组织外植体、花粉或甚至在植物体内的植物转殖的方案。

此等方案可通过过度表达、基因组编辑或基因组沉默来开发对此农作物的遗传操作，从而使整个大麻产业受益。

本文中所使用的术语“植物”包括整株植物、一经嫁接的植物、植物及植物部分的源始及后代，包括种子、芽、茎、根(包括块茎)、砧木、嫁接枝及植物细胞、组织及器官。此植物可为任何形式，包括悬浮培养物、胚体、分生组织区域、愈伤组织、叶片、配子体、孢子体、花粉及小孢子。

术语“大麻”是指包括所有不同种类的大麻，包括寻常大麻、印度大麻和莠草大麻以及野生大麻。

大麻是二倍体，具有2n＝20的染色体补体，尽管多倍体个体是人工产生的，且亦已考量在本文中。加拿大科学家的一个团队于2011年发表大麻的第一个基因组序列，估计大小为820Mb(范巴克尔等人，同上)。

所有已知的大麻品种皆为风传粉的且果实是瘦果。大麻的大部分品种皆是短日植株，除了寻常大麻亚种栽培自发性变种(莠草大麻)，通常被描述为“自动开花”，且可能是日中性的。

根据一具体的实施例，所述植物为寻常大麻。

长期以来，大麻已被用于药物及产业用途：纤维(大麻)、种子及种子油、药用提取物以及作为一休闲用药物。经选择的遗传背景(例如：品种)取决于未来的用途。产业的大麻产品是由经选择的大麻植物所制成的，以生产大量的纤维。已栽培出一些大麻品种以产生最低水平的THC，THC是负责与大麻有关的精神活动的主要精神活动成分。就历史而言，大麻是由大麻植物的干花所组成，大麻被选择地繁殖以产生高水平的THC以及其他具有精神活性的大麻素。包括大麻树脂及大麻油的各种提取物亦从所述植物所制得。

因此，例如，富含CBD的品种可选自戈兰(Galon)、阿维德克尔(Avidekel)、飞多儿17(Fedora)17、ACDC以及其任何组合；或其中所述大麻植物是一富含THC的品种；所述富含THC的品种是选自由珠穆朗玛峰(Everest)、黑色毁灭者(Black Destroyer)、关键内维尔雾霾(Critical Neville Haze)、马塔罗蓝(Mataro Blue)、LSD OG Kush(LSD OG库什)、菠萝块(Pineapple Chunk)、蓝色怪物霍尔克(Blue Monster Holk)、Y格里加(Y Griega)、萨托里(Satori)、图坦卡蒙(Tutankhamon)及其任何组合所组成的群组。

在以下实例部分的实例1中提供一些额外的变种(例如，WON21、皮诺拉(Pinola)、古德里奇(Goodrich)、格洛里(Glory)、雷梦哈泽(Lemon Haze)、杰克赫里尔(Jackherer)、雷梦哈泽本恩.、起司及SLH)。

本文中所使用的“变种”一词，与在1972年11月10日、在1978年10月23日及在1991年3月19日于日内瓦所修订的1961年12月2日植物新品种的国际保护公约(UPOV条约)中的相应定义具有相同的意义。因此，“变种”是指在已知植物等级最低的单一植物分类单元内进行分组的一植物，无论是否授予育种者权利的条件完全满足，可为：i)通过自一给定的基因型或基因型组合产生的特征的表达来定义、ii)通过表达所述特征中的至少一者而与任何其他的植物分组区分，以及iii)就其是否适合繁殖而被视为一单位。

术语“变种”可与“品种”互换。

如上所述，本发明的实施例涉及大麻转殖及植物再生。能理解组织转殖的过程取决于植物再生的能力。再生方案可选自体外再生及在植物体中再生。

如本文中所使用，“再生”(regeneration)或“再生”(regenerating)是指例如在组织培养(体外)或在植物体中自体细胞发育出整个植物。

如本文中所使用，“可再生的”是指体外发育成一完整的植株的能力。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的再生效率为至少50％(来自源组织或器官的再生剂)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的再生效率为至少60％。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的再生效率为至少70％。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的再生效率为至少80％

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的再生效率为至少90％

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少60％(例如，在短暂转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少70％(例如，在短暂转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少80％(例如，在短暂转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少90％(例如，在短暂转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少1％(例如，在稳定转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少2％(例如，在稳定转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少3％(例如，在稳定转殖中)。

根据一具体的实施例，使用本发明的实施例的转殖效率为至少5％(例如，在稳定转殖中)。

在植物体内及体外植物的再生的常见模式是从头的器官发生，其中植物切条或外植体首先形成异位的顶端分生组织，而且之后发育成茎及根。分生组织是特殊的植物组织，通过细胞分裂及分化会产生新的细胞、组织及器官。植物亦可通过体细胞胚发育进行体外再生，由此经分离的原生质体或细胞首先形成与合子胚体相似的细胞结构，随后产生完整的植株体，如本文中所预期且于下文中进一步描述。此等二种再生过程是直接发生在亲本组织(例如，叶片、茎、根)上，或者通过一愈伤组织的形成而间接发生。

针对大规模、可再现、一致的(±10％)的植物材料/外植体的生产，体外再生方案可先通过克隆繁殖的步骤进行。

如本文中所使用，“可再生的外植体”是指用于在组织培养中进行转殖及再生大麻的可再生的细胞(大麻细胞)。包括可再生的细胞的组织培养物能够再生具有大麻的生理和形态特征(经转殖的或未经转殖的)的植物。

根据一具体实施例，“经转殖的”是指转基因的。

根据另一具体实施例，“经转殖的”是指非转基因的，例如藉由基因组编辑。

在此种组织培养物中的可再生的细胞可来自胚体、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶片、花药、雌蕊、根、根尖、花、种子、豆荚、铃、芽、茎等。

根据一具体实施例，可再生的细胞适合应用再生方案。

本发明的发明人通过一连串艰难的实验已了解，成功的体外繁殖的关键因素(由时间依赖性生物量的积累而确定)是在固体培养基上的初始生长、转移至液体培养基上，以及再转移回到固体培养基上，以便使外植体能够利用介质中的物质。此种与细胞壁破坏剂的结合处理是与克隆繁殖的成功相关的。

因此，根据本发明的一方面，提供一种体外繁殖大麻的方法，所述方法包括：

(a)在一固体培养基上培养包括一分生组织的一大麻植物部分，以获得一外植体；以及随后

(b)使所述外植体经受一细胞壁破坏剂处理；

(c)在一液体培养基中培养所述外植体；以及随后可选地，

其中步骤(a)至(c)进行1至n次，直至出现适合再生的叶片为止。

如本文中所使用，“体外繁殖”或“植物微繁殖”是指将所选植物的细胞、组织或器官分离、表面灭菌，以及在促进生长的无菌环境中培养，以产生许多克隆幼苗的整体过程。(奥特曼，2000，Spier，R.E.细胞技术的百科全书。纽约：约翰威利&宋斯，916-929)。

因此，体细胞在适当的条件下可分化为整株植物。

根据一具体实施例，克隆繁殖的过程是在无菌条件下进行。

根据一具体实施例，在开始培养之前，将用于组织培养的植物部分进行灭菌。

例如，将植物部分在大量的水流下进行洗涤(例如，2小时)，之后进行醇处理(例如，70％乙醇)及任选的NaClO(例如，1.5％)，其依据需求重复进行。

因此，将包含分生组织的大麻植物部分在固体培养基上进行培养，以获得一外植体。

如本文中所使用，“分生组织”是指含有未分化细胞(分生细胞)的植物组织，其存在于可进行生长的植物的区域中。分生细胞会分化成植物的各种器官并维持植物生长。分生组织具有三种类型：顶端的(在顶端)、居间的(在中间)及侧生的(轴向，在侧面)。

根据一具体实施例，所述分生组织是一顶端分生组织或一腋生分生组织。

根据一具体实施例，植物部分是一茎，例如芽尖或腋芽。

根据一具体实施例，植物部分包括顶端分生组织及腋生分生组织二者。

根据一具体实施例，植物部分包括一根分生组织。

根据一具体实施例，植物部分包括一根尖。

植物部分及组织在此可互换。

此种组织可取自一成熟的植物或一幼苗，例如，由于植物中存在的植物激素水平不同，因此具有自根部切下的两片真叶(幼苗可能较成熟的植物更为敏感)。本发明的发明人能够证明两种选择的克隆繁殖(参见实例1)。

根据一具体实施例，植物部分包括一结节。

通常，用于克隆繁殖(或再生或转殖)的培养基是一基础培养基，例如白色培养基、Nitsch及Nitsch培养基、B5培养基及Gamborf培养基。

根据一具体实施例，培养基是Murashige及Skoog(1962)(MS培养基)。

可针对方案优化培养基或培养基组合的强度(例如，繁殖、再生或转殖)。

根据一具体实施例，所述培养基是补充有pH为6.8的蔗糖的1/2MS培养基。

根据一具体实施例，碳源的浓度为1-4％。

根据一具体实施例，pH值为5.4至7.2。

应采取措施为在培养基中补充适当的矿物质营养及碳源(例如，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖及半乳糖以及糖醇甘油及山梨糖醇)。添加至培养基中的碳水化合物为代谢提供能量。由于培养物中的光合作用通常不足，因此在任何营养培养基中添加碳源对于体外生长及发育是至关重要的。

培养基可分为液体或固体。液体介质较固体介质具有更快、更便宜的繁殖优势。然而，使用液体进行克隆繁殖的一严重的缺点是，永久浸没在液体培养物中的芽体(茎)可能会变得超度含水的，且因此无法进行克隆繁殖。

根据一具体实施例，所述培养基是补充有组合蔗糖及激素的1/2MS培养基。

本发明的发明人已发现，为了成功地进行克隆繁殖，外植体需要在固相上的一第一培养周期，之后进行液体培养并再返回至固相。

因此，固体培养基的第一阶段是进行7至30天培养(例如，21天)，或者只要外植体受益于固态培养物且可自培养基吸收养分/碳源即可。可更换用于固化培养基的胶凝剂。通常使用的是琼脂及水晶洋菜。由于诸如琼脂的胶凝剂的浓度可能会影响发育(例如，根)，因此所述浓度是高达1％，例如，琼脂为0.7％至1.0％w/w(例如0.8％)。

为了改善碳源、矿物质或其他因子(例如，下文中进一步描述的再生剂、转殖剂等)的吸收，可利用细胞壁破坏剂处理外植体。其可在培养的任何步骤，例如，在固相及/或液相的培养期间进行。

根据一具体实施例，细胞壁破坏剂仅存在于液体培养阶段(即，固体培养基缺乏细胞壁破坏剂)。

如本文中所使用，“细胞壁破坏剂”是指对外植体的化学、生物或物理性处理，由于诸如表皮层及/或木栓质层的聚酯的聚合物的水解或细胞壁的机械性分解，导致细胞壁受损但不影响细胞活力。

此等酶的实例可自以下论文中找到：《实验植物学杂志》，第64卷、第12期、第3519-3550页.2013.doi：10.1093/jxb/ert201、达尔文评论“剪切并粘贴”植物细胞壁多糖的酶的生物化学及生理作用，及植物细胞壁松弛的催化剂，[丹尼尔J.科斯格罗夫2016，描述可用于细胞壁破坏的酶及例如扩增的其他蛋白质。

此等包括，但不限于扩增、内切葡聚糖酶、内转葡糖基化酶以及角质酶、果胶甲酸酯酶及果胶修饰酶。在整个CAZy组的范围内，大约有22个家族与后合成修饰植物细胞壁的酶有关。植物糖苷酶主要分为GH家族1、2、3、27、29、31、35、36、38、51及95，而植物聚糖酶则属于GH家族2、5、9、10、16、17、28及81。

因此，细胞壁破坏剂可存在于液体培养基、固体培养基中[培养即将结束于在固体培养基上的培养，即，非起始于步骤(a)]或将外植体自培养基中取出，并在转移至液体培养基之前利用细胞壁破坏剂处理。

根据一具体实施例，利用细胞壁破坏剂进行的处理是在(例如，仅在)液相中进行。

根据一具体实施例，所述生物处理包含酶(例如，“角质层切口酶”)。

以亚致死剂量/浓度，即低于致死剂量/浓度使用细胞壁破坏剂，但所述剂量/浓度足够高以破坏细胞壁。可使用各种手段来确定对细胞壁的损伤，所述手段包括使用光学显微镜的视觉检测。亦应确定细胞活力(例如，染色、FACS等)。

根据一具体实施例，所述酶是果胶酶及角质酶的一真菌混合物。

如本文中所使用，角质酶(EC 3.1.1.74)是催化化学反应角质+H

根据一具体实施例，所述酶是果胶酶，例如，果胶切割酶(EC 4.2.2.10)，其催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸甲酯的消除性切割，以在其非还原端提供具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖-4-醛酸基基团的寡糖。

酶可自商业供应商处获得，例如，BSG手工液体果胶酶(BSG HandCraft LiquidPectic Enzyme)、角质酶(西格马、费迪南德玛丽亚昆西)。能理解的是，可使用单一细胞壁破坏剂，然而亦可使用2种、3种、4种或更多种试剂的组合(相同或不同类型，例如生物、化学及物理性)。

根据一具体实施例，所使用的酶包括果胶酶及角质酶。如实例2所示，两种酶的组合提高培养物中外植体的生长速率。

因此，角质酶可作为果胶酶及角质酶的一真菌混合物而被获得，其可商购自诸如BSG手工液体果胶酶、角质酶-西格马、费迪南德玛丽亚昆西。

在液体阶段(与固体培养基的培养阶段分离的阶段)，可使用相同的基础培养基、碳水化合物及/或矿物质，且缺乏聚合剂(例如，琼脂)。然而，亦可使用不同的介质及/或补充剂。

在液体培养基中的培养可进行5至30天(例如，21天)。

根据一具体实施例，在摇晃置放有外植体的容器(在液体培养基中)进行培养。搅拌方法具有多种，包括用使有限量的液体进行轨道的、水平轨道的摇晃。

摇晃可防止在液相的培养过程中导致培养基覆盖整个外植体。

从培养开始(a至c)的任何阶段，皆会移除叶片(即，已分化的结构)及无法再生的坏死区域。

在培养基(无论是固相、液相或所有的相)中可包括额外的试剂，所述试剂包括，但不限于植物激素、酶、维生素、碳水化合物及矿物质。

如上所述，任选地，在液体培养基中培养之后，将外植体转移至固体条件下培养20至45天，且整个过程，即液体、固体可重复n次(例如2、3、4、5或更多次)。

根据一具体实施例，每3至4周自固体介质向液体介质转移一次，其显着改善生长及发育。

不同的品种可能需要不同的繁殖时间，通常需要50至100天。一旦出现适合再生的叶片，即可终止培养。根据一具体实施例，此种叶片的天龄长达48天(例如，从培养物自液体至固体的转移算起为21至48天)，具有高达约0.5cm的表面积宽度，且任选地可容易地受伤，例如例用手术刀或如下文所述。

可使用本领域众所周知的方法，例如，生根及驯化来确定再生的能力。

增长及根部的诱导或发育(生根阶段)：此阶段旨在诱导建立完全发育的幼苗。其是将小苗转移至离体条件之前的最后一个体外时期。根诱导通常在根诱导固体培养基上进行，所述根诱导固体培养基存在有IBA及任选的其他成分，例如硫胺素及可能的肌醇及/或木炭的存在下。生根很大程度上是受培养基中盐浓度的影响。而且，与细胞分裂素相反，在此阶段生长素的存在是很重要的(例如，IBA、IAA、NAA)。生根时，重要的是平衡生根所需的湿度及植物对湿度的敏感性。在此种考量下，可降低胶凝剂(例如琼脂)的量、添加干燥剂(例如硅酮球)并给培养皿通气。在生根培养基中使用吉贝素可能会减少或阻止不定根及芽的形成，尽管低浓度的吉贝素可刺激根的形成。

转移至离体条件亦称为“驯化”。驯化被定义为一生物体的气候或环境的适应性，特别是已转移至一新环境中的植物(古在及佐拜耶德，2003.www.doi.org/10(dot)1002/0471250570(dot)spi001)。采取措施保护再生的外植体免于脱水，其通常是通过逐步降低湿度来实现的，方法是逐步地自温室或隧道(例如，利用聚乙烯薄片覆盖)逐步转移至部分覆盖甚至完全不覆盖。

以下实例1中提供生根及驯化方案的实例。

可在开始测定的数周后(例如3至5周)评估结果。

技术人员将在培养期间考虑其他的参数。此等包括，但不限于培养容器内的气体交换及相对的空气湿度。

培养容器通常是一密闭的系统，但是取决于容器，可能会发生一些气体交换。使用允许气体交换的具有滤片或通风器的封闭物，可提高植物在驯化阶段的光合作用的能力、繁殖率及存活率。

根据一具体实施例，培养物(即培养容器)中的相对湿度为90％。用于再生的温度及光照方案是技术人员已知的，且通常包括在24℃下的长日照(例如16小时)。

本文亦考虑根据本文中所述的方法可获得的可再生的大麻外植体。应当理解，克隆繁殖的过程不会形成愈伤组织。

一旦有任何可再生的大麻外植体可用(例如，通过本文中所述的克隆繁殖方法)，即可对其进行再生。

因此，根据本发明的一方面，提供一种在一组织培养物中再生大麻的方法，所述方法包括：在一固体培养基上体外培养一可再生的大麻外植体，以再生大麻，其中所述固体培养基包括至少一再生剂以及一细胞壁破坏剂。

所述可再生的大麻外植体可为如上所述的克隆繁殖的产物。亦考量已发芽的种子，包括子叶、下胚轴叶片；或者，愈伤组织。

再生方案是本领域已知的。

基本上，除了基础盐混合物之外，培养基额外包括至少一生长素、至少一细胞分裂素及任选地至少一吉贝素。通常，所使用的基础盐混合物是半强度MS(Murashige及Skoog)培养基，生长素是吲哚-3-丁酸(IBA)、细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BA)、吉贝素是GA

将培养物在25℃的光周期为16小时的光照及8小时的黑暗中暴露于冷荧光灯下。通常，光强度在40至70μmol/m

可根据品种的需求进一步调整各品种的培养基，例如使用细胞分裂素(例如TDZ、ZEATIN、NAA)、活性炭、间苯三酚、GA/辅助细胞分裂素的浓度等。

根据一具体实施例，再生是根据以下实例部分的实例2中所列出的方案进行的。

如上所述，通过将叶片置放在具有细胞壁破坏剂的再生培养基上，可自3至4周龄的植物上进行叶片的再生。将培养物在低光照强度(例如2.5mmol/m

从子叶再生可如下进行：将种子消毒并放入培养基中。将种子发芽(例如，在黑暗中2天，之后转移至光中)。切下含有两片真叶的大幼苗的子叶，并将其置放于含有细胞壁破坏剂的再生培养基上。在室温下(例如25℃)，于16/8小时的光周期中，将培养物保持在高光照强度下(例如40mmol/m

愈伤组织例如通过以下方案进行诱导。将21天龄的组织培养物置放于PR12固体培养基(MS、2％蔗糖、2mg/l BA、1mg/l GA3、0.8西格马琼脂，pH 5.8)上，以促进愈伤组织的形成。两周后，将愈伤组织置放于含有细胞壁破坏剂的再生培养基上[例如，Murashige及Skoog(MS)培养基盐混合物，其含有0.05至5.0μM噻唑隆、补充有100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、pH 5.7的2％蔗糖(w/v)及5ml果胶酶反应混合物(0.25ml 10％酶、0.25ml 200mMTris-HCl)]。将培养物在25℃下、于16/8小时的光周期中保持高光照强度(40mmol/m

再生可在DNA转殖之前、DNA转殖的同时或DNA转殖之后进行。

因此，根据一方面提供一种体外转殖大麻的方法，所述方法包括：将一可再生的大麻外植体与一多核苷酸及一细胞壁破坏剂体外接触，其中所述多核苷酸编码感兴趣的一表达产物。

因此，为了再生及转殖，考量使用如上所述的细胞壁破坏剂。

应当理解，在与多核苷酸接触之前，完成对外植体(例如叶片)的额外伤害可改善效率。

伤口诱导多种细胞反应，包括植物激素的产生、细胞间通讯的丧失及长距离信号的破坏。建议在受伤时诱导AP2/ERF型转录调节子WIND1及其同源物WIND2、WIND3或AIND4，并促使在切割部位形成愈伤组织。

例如可通过使用手术刀或砂纸划伤植物表面从而在产生物力性伤口。

如上所述，转殖引入编码感兴趣的一表达产物。

如本文中所使用，“表达产物”是指RNA或蛋白质(本文亦称为“多肽”)。

根据一具体实施例，所述表达产物是一蛋白质。

根据一具体实施例，所述表达产物引起一内源基因或其同源物或一外源基因表达产物的全部过度表达。在此种情况的实施例中，表达产物与被转殖的植物/组织是异源的。

应当理解，异源的表达产物例如可通过基因组编辑或RNA沉默而引起内源基因的下调节。

如本文中所使用，术语“异源的”是指外源的、非天然存在于一特定发育阶段的大麻植物的天然细胞中，或未在一植物中表达、未在一特定的植物品种中表达，或相较于天然的蛋白质，在植物中表达不同的表达水平或在植物中不同的位置表达。

然而，例如使用基因组编辑亦可影响内源基因的过度表达(例如，通过“功能获得”的方式)。

如本文中所预期，基因组编辑亦介导功能的丧失。

如本文中所使用，术语“多肽”与术语“肽”、“寡肽”及“蛋白质”可互换使用，且是指由通过肽键连接在一起的任何长度的氨基酸组成的一生物分子。

感兴趣的多肽可为例如一植物多肽、一细菌多肽、一病毒多肽、一哺乳动物多肽或一合成的多肽(例如嵌合核酸酶、例如cas9的核酸酶)。因此，感兴趣的异源多肽可为一植物多肽或蛋白质，其为一植物多肽或蛋白质的一变体或突变形式，或在植物品种、品系或变种中非天然发生的一植物多肽或蛋白质。

如本文中所使用，术语“多核苷酸”是指经分离或以一RNA序列、一互补多核苷酸序列(cDNA)、一基因组多核苷酸序列及/或一复合多核苷酸序列的形式所提供的单链或双股核酸序列(例如，上述各项的组合)。

术语“经分离的”是指与自然环境至少部分地分离。

根据一实施例，感兴趣的异源多肽可包括，但不限于：一报道多肽、一抗病毒多肽、一病毒部分、一抗病毒多肽、一抗真菌多肽、一抗菌多肽、一抗昆虫多肽、一抗除草剂多肽、一生物或非生物耐逆性多肽、一药物多肽、一诱导生长的多肽、一抑制生长的多肽、一酶、一转录因子及一转位酶。

可生产的示例性蛋白质包括，但不限于：核酸酶、激酶、蛋白酶、酶、激素、提供抗病性的蛋白质、抗微生物的蛋白质、抗病毒的蛋白质及蛋白质的DNA编辑剂。

根据一实施例，感兴趣的异源多肽包括两个或更多个(例如2、3、4)异源多肽。

根据一实施例，感兴趣的异源多肽能够修饰植物基因组，例如核酸酶。

如本文中所使用，术语“核酸酶”是指可在基因组，例如在基因组DNA中产生一股断裂的任何多肽或包含所述多肽的复合物。根据一实施例，切割是位点特异性的，通常由一辅助的次单元所赋予，或者核酸酶是固有地特异于感兴趣的靶序列。

如本文中所使用，术语“切割”或“DNA切割”是指一DNA分子的共价主链的断裂。单股切割及双股切割皆是可能的，且由于两个不同的单股切割事件的结果，可能发生双股切割。DNA切割可导致产生平末端或交错末端。

根据本教导可使用的示例性核酸酶包括限制性内切酶(例如：II型限制性内切核酸酶)、拓扑异构酶[例如：DNA促旋酶、真核拓扑异构酶II(拓扑II)及细菌拓扑异构酶IV(拓扑IV)]、重组酶(例如：Cre重组酶、Hin重组酶)、整合酶、DNA酶、内切－外切核酸酶(例如：微球菌核酸酶)及归巢核酸内切酶。

根据一实施例，所利用的核酸酶可包括一非特异性DNA切割结构域，例如：II型限制性核酸内切酶，例如FokI限制酶的切割结构域(基因库登录号J04623)。

根据一实施例，核酸酶是兆核酸酶。

如本文中所使用，术语“兆核酸酶”是指具有大的多核苷酸识别位点的双股核酸内切酶，例如，至少12个碱基对(bp)或自12bp至40bp的DNA序列。兆核酸酶亦可称为稀切或非常稀切的核酸内切酶。本发明的兆核酸酶可是单体或二聚体。兆核酸酶可包括任何天然兆核酸酶，例如归巢核酸内切酶，但亦可包括具有高特异性的任何人工或人造的兆核酸酶，其衍生自第I组内含子和内含肽的归巢核酸内切酶，或者诸如锌指蛋白或第II组内含子蛋白的其他蛋白质，或化合物，例如与化学化合物融合的核酸。

本发明的人工兆核酸酶包括，但不限于，定制的兆核酸酶，其是衍生自天然的或非自然的任何初始兆核酸酶的兆核酸酶，其呈现出不同于初始兆核酸酶的位点的识别及切割位点，即，相较于天然的兆核酸酶，定制的兆核酸酶切割新位点的功效高至少10倍、至少50倍或至少100倍。

定制的兆核酸酶可通过本领域已知的任何方法来产生，例如，通过制备兆核酸酶变体的文库并通过选择及/或筛选来分离能够切割靶DNA序列的变体。可通过本领域技术人员已知的任何方法在兆核酸酶中引入多样性，例如，可通过以下方式引入多样性：靶向诱变(即盒式诱变、寡核苷酸定向密码子诱变、靶向随机诱变)、通过随机诱变(即，突变品种)、粗糙脉孢菌系统(美国专利第6,232,112号、WO 01/70946，易错PCR)、DNA改组、定向突变或此等技术的组合(参见《分子生物学的当前方案》第8章“克隆DNA中的诱变”编辑者：奥苏贝尔等人、约翰威利&宋斯)。可在与DNA靶接触或与DNA靶直接或间接相互作用的残基的位置引入多样性，或者可在特异地相互作用的氨基酸的位置处引入。在通过靶向诱变所产生的文库中，可在选择的可变位置处引入20个氨基酸。根据一实施例，存在于可变位置的氨基酸是众所周知通常与蛋白质-DNA相互作用有关的氨基酸。更特别地，此等氨基酸通常是亲水性氨基酸，例如包括D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Y。亦可使用合成或修饰的氨基酸。

定制的兆核酸酶可源自任何的初始兆核酸酶。

根据一实施例，选择初始兆核酸酶，以便其自然识别及切割位点最接近靶DNA位点。根据一实施例，初始兆核酸酶是归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶根据保留良好的氨基酸基序分为4个独立的家族，即LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、组氨酸-半胱氨酸盒家族及HNH家族(谢瓦利埃等人，2001，NAR，29,3757-3774)。根据一实施例，归巢核酸内切酶是I-Dmo I、PI-Sce I、I-SceI、PI-Pfu I、I-Cre I、I-Ppo I或一杂合的归巢核酸内切酶I-DmoI/I-Cre I称为E-Dre I(如谢瓦利埃等人，2001，Nat Struct Biol，8，312-316中所述)。

有关兆核酸酶的进一步细节可在美国专利第8,697,395号中找到，其通过引用并入本文中。

根据本发明的另一实施例，核酸酶包括一寡核苷酸依赖性核酸酶，例如Cas或RISC。

RISC酶在马丁内斯J、图兹尔T.RISC是一种产生5’磷酸单酯产生的RNA核酸内切酶.Genes Dev.2004；18：975-980中教示。亦考量改善植物表达的序列修饰，即至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的同源物。本文亦考量同源性及同一性(例如，使用具有默认参数的Blast(N)/(P))。

根据一实施例，Cas9或RISC连接至单一导向RNA(sgRNA)以利用序列特异性方式切割基因组DNA，因此多核苷酸可编码RNA靶向部分，例如gRNA。

如本文中所使用，“单一导向RNA”或“sgRNA”是指一嵌合RNA分子，其是由成簇的规则散布的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)及反式编码的CRISPR RNA(tracrRNA)所组成。crRNA定义Cas9蛋白的位点特异性靶向。序列长为19至22个核苷酸，例如与靶互补的20个连续的核苷酸，通常位于sgRNA分子的5’端。crRNA可与靶序列具有100％的互补性，但是根据本发明的教导，亦预期与靶序列的整体同源性至少为80％、85％、90％、及95％。

tracrRNA长为100至300个核苷酸，且为核酸酶提供一结合位点，所述核酸酶例如形成CRISPR/Cas9复合物的Cas9蛋白。

根据一具体实施例，向植物细胞提供与不同靶核酸序列互补的多个sgRNA，且诸如Cas9酶的核酸酶以位点特异性方式切割不同的靶核酸序列。

应当理解，sgRNA可由与核酸酶相同的表达载体编码，例如，Cas9。额外地或可替代地，sgRNA可由另一核酸构建体编码，因此，CRISPR-Cas9复合物是由一核酸构建体系统编码。

根据另一实施例，sgRNA是从本发明的植物表达载体所编码而成。在此种情况下，核酸酶，例如Cas9，可自另一核酸构建体编码，因此CRISPR-Cas9复合物是从核酸构建体系统所编码而成。

同样地，多个sgRNA可从如本文中所述的单个载体或多个载体编码而成。多个sgRNA的使用允许多重化。

因此，本发明的RNA导向的核酸内切酶包括至少一核酸酶(例如Cas9或RISC)及至少一RNA结合结构域(例如CRISPR)。本发明的CRISPR/Cas蛋白可包括核酸酶结构域、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域及/或二聚化结构域。

根据一实施例，CRISPR/Cas蛋白可为一野生型CRISPR/Cas蛋白、一经修饰的CRISPR/Cas蛋白，或一野生型或一经修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。此外，可修饰CRISPR/Cas蛋白以增加核酸结合亲和力及/或特异性，或改变蛋白的酶促活性。例如，可修饰CRISPR/Cas蛋白的核酸酶(即，Cas9)结构域。

根据本教导可使用的合适的Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3，Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及Cu1966。

根据一具体实施例，cas核酸酶是Cas9。Cas9是一种导向至邻近原间隔子相邻基序(PAM)的DNA靶序列的单体DNA核酸酶。Cas9蛋白包括两个与RuvC及HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补的DNA股链，而RuvC样结构域切割非互补的股链，结果，钝切被引入至靶DNA中。

在一些实施例中，CRISPR/Cas系统包括一野生型Cas9蛋白或其片段。

在其他的实施例中，CRISPR/Cas系统包括一经修饰的Cas9蛋白。例如，可修饰Cas9蛋白的氨基酸序列以改变所述蛋白的一种或多种特性(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。或者，可自蛋白质中消除不参与RNA导向的切割的Cas9蛋白质的结构域，使得经修饰的Cas9蛋白质小于野生型Cas9蛋白质。

根据一实施例，可将Cas9蛋白修饰为缺乏至少一功能性核酸酶结构域。根据一实施例，可将Cas9蛋白修饰为缺乏所有的核酸酶活性。根据另一实施例，将CRISPR/Cas系统与各种效应子结构域融合，所述效应子结构域例如DNA切割结构域。DNA切割结构域可获自任何的核酸内切酶或核酸外切酶。可衍生出DNA切割结构域的核酸内切酶的非限制性实例包括，但不限于，限制性核酸内切酶及归巢核酸内切酶(参见例如新英格兰生物实验室目录或贝尔福等人(1997)Nucleic Acids Res)。在示例性实施例中，CRISPR/Cas系统的切割结构域是一Fok1核酸内切酶结构域或一经修饰的Fokl核酸内切酶结构域。

用于设计CRISPR/Cas的各种方法是本领域已知的，且可根据本教导进行实施。关于CRISPR/Cas的更多细节可在PCT出版物第WO 2014089290号中找到，其通过引用整体并入本文中。根据本发明的另一实施例，核酸酶包括嵌合核酸酶。

如本文中所使用，短语“嵌合核酸酶”是指形成单一开放阅读框(ORF)并以序列特异性方式介导DNA切割的合成嵌合多肽。

根据一具体实施例，本发明这个方面的嵌合核酸酶包括用于核酸结合(例如DNA结合)及用于核酸切割(例如DNA切割)的分开的结构域，使得所述切割是序列特异性的。

如本文中所使用，短语“序列特异性的”是指引入核酸切割(例如DNA切割)的独特的染色体位置。

如本文中所使用，短语“核酸结合结构域”是指天然或合成的氨基酸序列，例如以序列特异性方式(即靶位点)结合至双股或单股DNA或RNA的蛋白质基序。

为了诱导有效的基因靶向，本发明的核酸(例如DNA)结合结构域需要与DNA切割结构域(例如核酸酶)偶联，以允许在靶序列的可操作的邻近范围内进行DNA切割。可行的接近度是仍有助于序列靶向的任何距离。任选地，DNA结合结构域与靶序列重叠或可在靶序列内结合。

根据一实施例，嵌合核酸酶诱导靶位点的单股或双股切割。

在产生嵌合核酸酶时，可使用以足够的特异性识别所需的靶序列(例如DNA结合序列)的任何DNA或RNA结合结构域。多种此类DNA及RNA结合结构域是本领域已知的。

DNA结合结构域的实例包括，但不限于，兆核酸酶结合结构域、螺旋-转角-螺旋(pfam 01381)结合结构域、亮氨酸拉链(ZIP)结合结构域、带翼的螺旋(WH)结合结构域、带翼的螺旋转角螺旋结构域(wHTH)结合结构域、螺旋-环-螺旋结合结构域、转录激活子样(TAL)结合结构域、重组酶及锌指结合结构域。

在本发明的示例性实施例中，DNA结合结构域是锌指结合结构域。

因此，根据此方面的一实施例，嵌合核酸酶是包含特异性锌指结合结构域(例如，pfam00096)及DNA切割结构域的嵌合蛋白，例如FokI限制酶(在本文中亦称为FokI切割结构域)，在本文中称为锌指核酸酶(ZFN)。

锌指结构域长为30个氨基酸，且是由一识别螺旋及2股β-折叠所构成。所述结构域亦包含四个规则间隔的锌配体(组氨酸或半胱氨酸)。锌离子稳定结构域的3D结构。各个手指包含一锌离子，并识别一特定的DNA碱基对三联体。

锌指结构域可被工程化以结合一预定的核苷酸序列。各单独的锌指(例如Cys2/His2)主要以模块化方式接触DNA的三个连续碱基对[帕夫列蒂奇等人，Science(1991)252：809-817、贝格等人，Science(1996)271：1081-1085]。通过操纵锌指的数量以及直接与DNA接触的关键氨基酸残基的性质，可逐步形成并选择具有新特异性的DNA结合结构域[参见，例如，德斯贾莱斯等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：7345-7349、雷巴尔等人，Science(1994)263：671-673、格里斯曼等人，Science(1997)275：657-661、西格尔等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：2758-2763]。因此，非常广泛的DNA序列可用作锌指蛋白的特异性识别靶。先前已公开基于锌指识别的具有数种不同特异性的嵌合核酸酶[参见，例如，黄等人，J.Protein Chem.(1996)15:481-489、金等人，Biol.Chem.(1998)379：489-495]。

设计具有锌指结合结构域的嵌合核酸酶的各种方法是本领域已知的。

在一实施例中，DNA结合结构域包括分别结合3、6、9、12、15或18个核苷酸序列的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个锌指结构域。本领域技术人员能理解，识别序列越长，将得到更高的特异性。

可使用多肽展示文库选择特异性DNA结合锌指。在亲和力选择步骤中，将靶位点与多肽展示文库一起使用，以选择与靶位点结合的变异锌指。通常，恒定的锌指及随机锌指是由任何合适的C2H2锌指蛋白所制成，例如SP-1、SP-1C、TFIIIA、GLI、Tramtrack、YY1或ZIF268[参见，例如雅各布斯，EMBO J 11：4507(1992)、德斯贾莱斯&贝格，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2256-2260(1993)]。多肽展示文库，其编码包括随机化锌指以及选择所述随机化锌指的一个或多个变体，且取决于选择步骤，根据本领域技术人员已知的方法构造一或两个恒定的锌指。可选地，所述文库包括设计成易于移除恒定的锌指并添加随机的锌指的限制位点。例如通过使用简并的寡核苷酸、诱变盒或易错PCR而随机化锌指。参见，例如，美国专利第6,326,166、6,410,248及6479626。

锌指亦可通过设计选择。经设计的锌指蛋白是自然界中所缺乏的蛋白，其设计/组成主要来自理想标准。针对设计的理想标准包括替换规则的应用及在储存现有的ZFP设计及结合数据信息的数据库中处理信息的计算机算法。参见，例如，美国专利第6,140,081、6,453,242及6,534,261号；另参见WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536及WO 03/016496。

根据另一实施例，嵌合核酸酶是TALENs或紧密TALENs(cTALENs)。

如本文中所使用，术语“TALENs”或“转录激活子样的效应子核酸酶”是指通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。本发明的TALENs实现有效地、可编程的及特异性的DNA切割。

应当理解，转录激活子样效应物(TALE)可被快速工程化以几乎结合任何DNA序列。如本文中所使用，术语TALEN是宽泛的并且包括单体TALEN，其可切割双股DNA而无需另一TALEN的帮助。术语TALEN亦用于指一对TALEN的一个或两个成员，其经工程设计可共同作用以在同一位点切割DNA。一起工作的TALEN可称为左边-TALEN及右边-TALEN。关于TALENS的更多细节可在美国专利第8,450,471号、美国专利第8,440,431号、美国专利第8,440,432号及美国专利申请案第20140256798号中找到，其全部内容通过引用整体并入本文中。

TALE是黄单胞菌细菌所分泌的蛋白质。TALE的DNA结合结构域除了第12及13个氨基之外，包含高度保留的33至34个氨基酸序列酸。此二个位置是高度可变的[重复可变的双残基(RVD)]，并显示出与特定核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列及DNA识别之间的此种简单关系允许通过选择包含适当的RVD的重复片段的组合来设计特定的DNA结合结构域。

通常使用非特异性DNA切割结构域，例如FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割结构域来构建本发明的TALEN。因此，可使用野生型FokI切割结构域及具有被设计为改善切割特异性与切割活性的突变的FokI切割结构域变体。FokI结构域是用作二聚体，需要两个带有独特DNA结合结构域的构建体，方能以适当的方向及间距对目标基因组中的位点进行定位。在TALEN DNA结合结构域与DNA切割结构域(例如FokI切割结构域)之间的氨基酸残基的数目，以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目皆是实现高水平活性的参数。在TALENDNA结合结构域与DNA切割结构域(例如FokI切割结构域)之间的氨基酸残基数目可通过在多个TAL效应子重复序列与核酸酶(例如FokI核酸内切酶结构域)之间引入间隔基来修饰。间隔序列可为12至30个核苷酸。

此外，根据本教导，可使用紧凑型TALEN(cTALEN)。此等cTALEN通常被设计为具有部分特异性的I-TevI催化结构域，且是单体DNA切割酶，即TALEN，其是半尺寸的单一多肽紧凑型转录激活子样效应子核酸酶(参见伯德利M.等人，Nature Communications(2013)4：1762，其全部内容通过引用并入本文中。

氨基酸序列与TALEN结合结构域的DNA识别之间的关系可设计出蛋白质。在此种情况下，可使用软件程序(例如DNAWorks)来计算适合于在两步PCR中组装的寡核苷酸；组装寡核苷酸，之后进行全基因扩增。亦可使用用于产生工程TALE构建体的模块化组装方案。两种方法皆提供工程化DNA结合结构域的系统方法，其在概念上类似于用于产生锌指DNA识别域的模块化组装方法(上文所述)。

可使用本领域公知的方法来进行由此所产生的用于特定靶标识别的核酸酶(例如ZFN、TALEN及CRISPR/Cas)及兆核酸酶进行鉴定。

设计用于基因靶向的核酸酶(例如嵌合核酸酶、ZFN、TALEN、Cas9、RISC、兆核酸酶)的方法可包括测试核酸酶对一细胞的毒性的方法。如此的过程可包括在细胞中表达核酸酶或以其他方式将其引入细胞中，并通过与对照比较，来评估细胞的生长或死亡率。核酸酶在基因组中一个以上位置切割的趋势可通过体外切割分析法进行评估，之后通过电泳(例如，可使用脉冲场电泳来解析非常大的片段)，并可选地进行探测或南方印迹。鉴于本公开，本领域普通技术人员可针对切割特异性设计其他的测试。

本文公开的感兴趣的异源多肽(例如核酸酶)可进一步包括至少一核定位信号(NLS)，其有助于将核酸酶运输至含有DNA的细胞器。通常，NLS包括一段碱性氨基酸，其可被核孔处的特定受体识别。NLS可位于核酸酶的N端、C端或内部的位置。

基本上可使用任何的NLS，无论是合成的抑或是天然存在的NLS，只要NLS是与靶细胞(即植物细胞)相容的NLS即可。

尽管在本文中讨论核定位信号，然而本教导并不意味着限于此等定位信号，因为本教导设想任何指向包含DNA的细胞器的信号。如此的信号在本领域中是众所周知的，且可被技术人员容易地取回。

根据本教导可使用的核定位信号包括，但不限于，SV40大T抗原NLS、hnRNP A1的酸性M9结构域、酵母转录抑制子Matα2中的KIPIK序列以及U snRNPs、烟草NLS及水稻NLS的复合信号。

在其他示例性实施例中，包含DNA的细胞器的定位信号可为一线粒体定位信号(MLS)或一叶绿体定位信号(CLS)。

根据本教导可使用的线粒体定位信号(MLS)包括，但不限于，βATPase亚基的转换信号[编码来自蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)β-ATPase的线粒体前序列的cDNA(核苷酸387至666)]、线粒体伴侣蛋白CPN-60[编码阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)CPN-60的线粒体前序列的cDNA(核苷酸74至186)以及COX4[编码线粒体靶向序列的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)COX4的前25个密码子]。

根据本教导可使用的叶绿体定位信号包括，但不限于，核糖-1,5-双磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(ats1A)相关转运肽的转换信号、LHC II的转换信号，以及阿拉伯芥SIG2及SIG3 ORF的N端区域。

另参见www.springerlink.com/content/p65013h2636l7795/。

或者，叶绿体定位序列(CLS)可衍生自类病毒[埃文斯及普拉丹(2004)US 2004/0142476A1]。所述类病毒可为鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)，例如，鳄梨鳄梨日斑类病毒(ASBVd)、桃潜隐花叶类病毒(PLMVd)、菊花里绿斑驳类病毒(CChMVd)或茄子潜伏类病毒(ELVd)。

根据本发明的特定实施例，定位信号可包括一叶绿体定位信号。

在一些实施例中，感兴趣的异源多肽(例如核酸酶)进一步包含至少一细胞穿透结构域。在一实施例中，细胞穿透结构域可为一细胞穿透肽(CPP)序列，所述细胞穿透肽序列是衍生自Tat、Tat2、富含精氨酸的细胞内传递肽(AID)、pVEC、穿膜肽(transportan)及穿膜肽(penetratin)。

根据本发明的一具体实施例，CPP序列包含Tat分子(Tat2)的二聚体，由于存在大量的精氨酸残基，因此其跨植物细胞膜转运的能力增强。

根据本发明的一些实施例的教导，可使用各种克隆试剂盒[例如，New EnglandBiolabs(NEB)的GoldenGate组装试剂盒]。

根据一具体实施例，核酸构建体是二元载体。二元载体的实例是pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(哈尤基维茨，P.等人，PlantMol.Biol.25,989(1994)，及海伦斯等人，Trends in Plant Science,5，446(2000))。

用于DNA传递(例如转染、电穿孔、轰击、病毒接种)的其他方法的其他载体的例子是：pGE-sgRNA(张等人,Nat.Comms.2016 7：12697)、pJIT163-Ubi-Cas9(王等人,Nat.Biotechnol 2004 32，947-951)、pICH47742::2x35S-5'UTR-hCas9(STOP)-NOST(贝尔汗等人,Plant Methods.2013 11；9(1)：39)、pAHC25(克里斯滕森,A.H.及奎尔,P.H.,1996.泛素启动子基的载体，用于在单子叶植物中可选择的及/或考可筛选的标记基因的高水平表达.Transgenic Research,5：213–218)、pHBT-sGFP(S65T)-NOS(希恩等人,蛋白质磷酸酶活性是玉米中光诱导基因表达所必需的,EMBO J.12(9)，3497-3505(1993)。

根据一具体实施例，所述载体是二元载体，pME 504。

根据一具体实施例，所述转殖包括一短暂转殖。

根据一具体实施例，所述转殖包括一稳定转殖。

已知多种用于植物转殖的方法。例如，可在缺乏选择标记的情况下进行3至14天的短暂转殖。在含有选择标记(例如抗生素)的情况下，稳定转殖通常需要4至10周。下文描述进一步的转殖方案。

在本发明的实施例中，可通过本领域技术人员已知的任何方法将核酸传递至植物细胞(接触的)中，包括，例如但不限于：通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见(例如，波特里库斯等人(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8)、通过电穿孔(参见，例如，美国专利第5,384,253号)、通过与碳化硅纤维一起搅拌(参见，例如，美国专利第5,302,523号及第5,464,765号)、通过农杆菌介导的转殖(参见，例如，美国专利第5,563,055号、第5,591,616号、第5,693,512号、第5,824,877号、第5,981,840号及第6,384,301号)、通过加速经DNA涂布的颗粒(参见，例如，美国专利第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号及第6,403,865号)以及通过纳米颗粒、纳米载体及细胞穿透肽(WO201126644A2、WO2009046384A1、WO2008148223A1)将DNA、RNA、肽及/或蛋白质或核酸与肽的组合传递至植物细胞中。

其他的转染方法包括使用转染试剂(例如Lipofectin、ThermoFisher)，树枝状聚合物(库科夫斯卡-拉塔洛，JF等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，4897-1902)、细胞穿透肽(

根据一具体实施例，通过电穿孔将DNA引入植物细胞。

根据一具体实施例，通过轰击/生物弹药将DNA引入植物细胞。

根据一具体实施例，通过农杆菌介导的转殖将DNA引入植物细胞。

已显示对植物宿主转殖有用的病毒包括CaMV、TMV、TRV及BV。使用植物病毒的植物转殖是描述于美国专利第4,855,237号(BGV)、第EP-A 67,553(TMV)号、日本公开申请第63-14693号(TMV)、第EPA 194,809号(BV)、第EPA 278,667(BV)号，以及格鲁兹曼，Y等人，《分子生物学通讯：病毒载体》，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约，pp.172-189(1988)。用于在包括植物在内的许多宿主中表达外源DNA的伪病毒颗粒是描述在WO 87/06261中。

以上参考文献以及道森，W.O.等人，Virology(1989)172：285-292、高松等人,EMBOJ.(1987)6:307-311、法兰奇等人,Science(1986)231:1294-1297，以及高松等人,FEBSLetters(1990)269:73-76，证明用于在植物中引入及表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建。

当病毒是DNA病毒时，可对病毒本身进行适当的修改。或者，可首先将病毒克隆至细菌质粒中，以易于使用外源DNA构建所需的病毒载体。之后可自质粒中切除病毒。倘若病毒是DNA病毒，则细菌的复制起点可附着在病毒DNA上，之后通过细菌进行复制。此DNA的转录及转译将产生外壳蛋白，其将包覆病毒DNA。倘若所述病毒是RNA病毒，则通常将所述病毒克隆为cDNA并插入质粒中。之后将质粒用于构建所有的构建体。之后通过转录质粒的病毒序列并转译病毒基因，以产生外壳蛋白，所述外壳蛋白包覆病毒RNA。

以上的参考文献以及美国专利第5,316,931号证明用于在植物中引入及表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建，例如本发明的一些实施例的构建体中所包括的所述非病毒外源核酸序列。

在一实施例中，提供一种植物病毒核酸，其中已自病毒核酸、一非天然的植物病毒外壳蛋白编码序列及一非天然的启动子中删除天然的外壳蛋白编码序列，所述非天然的启动子优选地是非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达、包装重组植物病毒核酸，并确保已插入重组植物病毒核酸对宿主进行系统性感染。或者，可通过在外壳蛋白基因中插入非天然核酸序列，以使外壳蛋白基因失活，从而产生蛋白质。重组植物病毒核酸可包括一种或多种其他非天然的亚基因组启动子。各个非天然亚基因组启动子皆能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因或核酸序列，并且无法彼此重组，亦无法与天然的亚基因组启动子进行重组。倘若包括多个核酸序列，则可在天然植物病毒亚基因组启动子或天然及一非天然植物病毒亚基因组启动子中附近插入非天然的(外源的)核酸序列。非天然的核酸序列在亚基因组启动子的控制下，在宿主植物中进行转录或表达，以产生所需的产物。

在一第二实施例中，如同在第一实施例中，提供一重组植物病毒核酸，除了将天然的外壳蛋白编码序列置放于邻近其中一非天然的外壳蛋白亚基因组启动子，而非在一非天然的外壳蛋白编码序列上。

在一第三实施例中，提供一重组植物病毒核酸，其中天然的外壳蛋白基因与其亚基因组启动子相邻，且一或多个非天然的亚基因组启动子已插入病毒核酸中。经插入的非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中进行转录或表达相邻基因，且无法彼此重组，亦无法与天然的亚基因组启动子进行重组。可将非天然的核酸序列插入至非天然的亚基因组植物病毒启动子附近，使得所述序列在亚基因组启动子的控制下，在宿主植物中进行转录或表达，以产生所需的产物。

在一第四实施例中，如同第三实施例，提供一重组植物病毒核酸，不同之处在于天然的外壳蛋白编码序列是被非的天然外壳蛋白编码序列代替。

病毒载体被重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白包覆，以产生一重组植物病毒。所述重组植物病毒核酸或重组植物病毒是用于感染合适的宿主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中进行复制、在宿主中进行系统性传播以及能够在宿主中进行转录或表达外源基因(经分离的核酸)，以产生所需的蛋白质。

基因组转殖可评估表型，即通过是否存在某些特性(例如：抗生素抗性、对疾病或除草剂的抗性)、形态(例如植物高度)、报告基因表达(例如GUS)等来评估。

基因组转殖亦可进行分子的评估。其在基因组编辑的情况下是特别重要的。

因此，针对转殖事件的存在对再生的组织/植物进行验证。下文提供用于基因组编辑事件的验证方法，在本文中亦称为“突变”或“编辑”，取决于所寻求的编辑类型，例如插入、缺失、插入-缺失(Indel)、倒位、取代及其组合。

用于检定序列改变的方法在本领域中是众所周知的，包括，但不限于DNA定序(例如，下世代定序)、电泳、酶基错配检测分析法及杂交分析法，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、原位杂交、引物延伸、南方印迹、北方印迹及点印迹分析。亦可使用用于检测单一核苷酸多态性(SNP)的各种方法，例如PCR基T7核酸内切酶、Hetroduplex及Sanger定序。

验证诸如IndelsDNA编辑事件的存在的另一种方法包括一错配切割分析法，其使用识别及切割错配DNA的结构选择酶(例如，内切核酸酶)。

错配切割分析法是检测插入缺失的简单且经济有效的方法，因此是检测基因组编辑诱导的突变的典型方法。所述分析法使用的酶可在错配及多个核苷酸形成的螺旋外环上切割异源双股DNA，产生两个或更多个较小的片段。当所预期的核酸酶切割位点偏离中心时，PCR产物产生约300至1000bp，因此所产生的片段的大小是不同的，且可通过常规的凝胶电泳或高效液相色谱(HPLC)轻松地解析。末端标记的消化产物亦可通过自动凝胶或毛细管电泳进行分析。可通过检测PCR扩增子及经切割的DNA条带的整合强度来估计基因座上插入缺失的频率。消化步骤需要15至60分钟，且当加入DNA制备及PCR步骤之后，整个测定可在3小时内完成。

在所述分析中通常使用两种替代酶。T7核酸内切酶1(T7E1)是一可分辨酶，可识别并切割上游错配的第一、第二或第三磷酸二酯键上不完全匹配的DNA。T7E1基测定的灵敏度为0.5至5％。相反的，Surveyor

验证编辑是否存在的另一种方法甚至包括高分辨率熔解分析。

高分辨率熔解分析(HRMA)涉及通过掺入荧光染料的实时PCR扩增跨越基因组靶(90至200bp)的DNA序列，之后对扩增子进行熔解曲线分析。HRMA是基于在热变性的过程中双股DNA释放嵌入染料时荧光的损失。其记录扩增子的温度依赖性变性图，并检测熔解过程是否涉及一种或多种分子。

另一方法是异源双股迁移率分析。亦可通过天然的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)直接分析重新杂交的PCR片段来检测突变。此方法是利用聚丙烯酰胺凝胶中异源双股及同源双股DNA的差异迁移。因插入缺失所引起的匹配及错配DNA股之间的夹角意味着异源双股DNA在天然条件下的迁移速率远高于同源双股DNA，且可根据其迁移率轻松地区分它们。140至170bp的片段可在15％的聚丙烯酰胺凝胶中分离。在最佳条件下，此分析的灵敏度可达到0.5％，其与T7E1相似(在重新粘合PCR产物之后，分析电泳成分需要约2小时)。

在日舒夫斯基,2017Biotechnol.Advances 1(1):95-104中详细介绍验证编辑事件是否存在的其他方法。

应当理解，对于转殖事件，阳性克隆可唯同型组合的或异型组合的。技术人员将根据所预期的用途选择克隆，以进一步的培养/再生。

应当理解，可进行植物杂交以改善农业性状，丧失一转基因，亦称为“杂交”(例如，成功地实施基因组编辑后的核酸酶)，或近交或杂种的产生。

依剧本教导，本发明的发明人能够表现出至少50％的再生效率，如同通过叶片上的再生数量/处理的叶片总数所计算。

在简化本发明的实施例的同时，本发明的发明人已设计出用于在植物中再生及转殖的方案。分生组织是负责损伤后的修复：当茎顶分生组织的克隆区域被局部消融时，在外围区域中的周围细胞将重建功能性分生组织。在芽中，通过腋生分生组织的存在使腋芽中的分生组织保持休眠。一旦失去此等根尖分生组织，根尖休眠即被打破，且腋芽会开始生长。

如本文中所使用，“在植物中”是指不在组织培养物的无菌条件下。

据此，提供一种植物体中再生大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及

(b)利用一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素(例如，细胞分裂素、生长吉贝素、乙烯、ABA、茉莉酸)的组合物处理所述分生组织耗尽的大麻组织；

根据一具体实施例，至少一种植物激素包含细胞分裂素和生长素。

根据本发明提供一种在植物体中转殖大麻的方法，所述方法包括步骤：

(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及

(b)利用一组合物及另一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素(例如，细胞分裂素、生长吉贝素、乙烯、ABA、茉莉酸)，所述另一组合物包括一核酸序列，所述核酸序列编码感兴趣的一表达产物。

根据一具体实施例，所述至少一植物激素包括细胞分裂素及生长素。

根据此方面，如所述，大麻组织是在其耗尽之前包括分生组织(轴向或顶端)的组织。

根据本发明的一实施例，使大麻种子发芽并生长直至观察到至少两个结节的大小为止。

为了暴露所述分生组织，自幼苗上(例如，在145°处)切下一子叶以及具有叶片(即，幼苗的叶片)的分生组织，以仅使幼苗具有一子叶以进行光合作用。当在成熟植物上完成时(例如，具有成年植物的2个结节的插条)，本发明的其他实施方式涉及相同的方案。在后一种情况下，亦至少留下一片叶片(例如，不超过1片叶片)以进行光合作用。

在此阶段，使用激素以处理组织。例如，细胞分裂素及生长素的相关比例。另外可添加吉贝素、乙烯、ABA及/或茉莉酸。

糊剂制剂的使用可增强通透性，但是亦可使用其他的应用方式(例如，喷雾、滴落)。

根据一具体实施例，配制所述组合物以使得所述组合物能够附着在分生组织耗尽的大麻组织的表面上。

根据一具体实施例，所述制剂包含(例如，藻酸盐，ALGANATE)根据佩雷拉等人，2017(Colloids and surfaces B:Biointerfaces 150:141-152)所制备的纳米乳液糊剂，例如将细胞分裂素及生长吉贝素、乙烯、ABA、茉莉酸激素组合与纳米乳剂(例如3：4v/v)混合，以产生“再生糊”。糊状物是散布在受伤的插条上。

根据一具体实施例，所述纳米乳剂包括羊毛脂。

如本文中所使用，“纳米乳剂”是指油、水及表面活性剂，其是透明的、热力学稳定的、等向性的液体混合物，且经常与助表面活性剂进行组合。相较于普通的乳剂，水相可能包含一种或多种盐及/或其他成分，且“油”实际上可能是不同烃及烯烃的复杂混合物。

再生可与转殖一起进行(在此种情况下，当使用农杆菌时，最好使用可包括细菌细胞的微乳剂)。据此，包括再生激素的组合物亦可包括感兴趣的多肽核酸。相反地，即使采取两个不同的步骤，相同的组合物(例如，藻酸盐基)亦可用于转殖及再生。

在一连续的实施例中，其中在转殖步骤之后进行再生，在施用转殖组合物0至96小时之后施用包含激素的再生组合物。

应当理解，可首先转殖植物，之后进行再生方案。

根据一具体实施例，转殖是农杆菌基的。

农杆菌可以诸如浸入、微囊化、注射及滴落不同的方式施用于大麻组织。

本文描述转殖及验证的方法。

本文还提供通过体细胞胚发生而再生大麻的方法，所述方法包括：

(a)在液体培养物中培养一愈伤组织或一可再生的大麻外植体，同时摇晃直至出现球状结构为止(例如，如图13A所示)；

(b))在另一液体培养物中培养所述球状结构，同时摇晃直至出现叶片为止。

根据一具体实施例，根据如上所述的克隆繁殖的方案以获得可再生的大麻外植体。

根据一具体实施例，在摇动(如上文所述)下进行培养，以引起胚体组织的发育，即去分化，之后在氯吡脲(CPPU)及CPPU+大麻二酚(CBD)的存在下进行分化。

根据一具体实施例，步骤(a)是在CPPU的存在下进行；且其中步骤(b)是在CPPU+cBD存在下进行。

根据一具体实施例，步骤(a)在不缺少cBD的情况下进行。

根据一具体方案，通过体细胞胚发生的再生如下：选择具有1.5cm直径及4-5cm长的叶片片段的组织外植体。斜切最里面的叶轮(0.5至1.0cm)，并用锋利的手术刀刀片使叶片受伤，以实现愈伤组织的萌生(去分化)。叶片片段是用作外植体，培养在补充有2,4-D(4.0mg/L)及激动素[Kin](0.5mg/L)的MS培养基上(Murashige及Skoog 1962)。在2至3周后，将培养物置放在25±2℃、70-80％湿度、黑暗的液体Gamborg B5培养基中进行培养，所述液体Gamborg B5培养基是补充有6％蔗糖及包括CPPU及cBD的不同植物激素。每三周更换一次培养基。

亦提供一种体外转殖大麻的方法，所述方法包括使根据本文中所述的方法所生产的一叶片与一多核苷酸接触，所述多核苷酸编码感兴趣的一表达产物。根据一具体实施例，所述多核苷酸是包含在含有根瘤农杆菌或聚乙二醇的一制剂中(如本文中所述)。

植物亦可自原生质体或花粉中再生。在简化本发明的实施例的同时，本发明的发明人已确定使用酶消化以有效生产原生质体的方案。

据此，提供一种生产大麻原生质体的方法，所述方法包括利用离析酶R-10及甘露醇处理一大麻组织，以获得原生质体。

如本文中所使用，“原生质体”是指无细胞壁的植物细胞。

原生质体可自各种大麻组织及器官中分离出来，此等组织和器官包括幼苗(例如子叶)或成熟植物(例如叶片)的叶片、根、茎尖、胚、小孢子及叶肉组织。此外，愈伤组织及悬浮培养物亦用作原生质体分离的来源。

使用无菌组织。可在生产原生质体之前的任何时间进行消毒。

本发明的发明人已发现，在液体(滴加)培养物中培养48小时之后，组合离析酶R-10及甘露醇允许至少4％的分离的原生质体存活。此外，不到1％的原生质体形成细胞壁。

离析酶R-10是根霉属的一种浸渍酶，其适用于分离植物细胞。所述酶具有果胶酶及半纤维素酶的活性。离析酶R-10可自许多供应商处购得，包括但不限于西格马-奥德里奇、GoldBio.Com及Yakult Pharmaceutical Industries公司。

如本文中所使用，“甘露醇”在本文中是用作碳源。应当理解，可替代地使用其他的碳源，例如，山梨糖醇、果糖、葡萄糖、半乳糖及蔗糖。甘露醇在代谢上是惰性的，可能是优选的。

在示例性方案中，将无菌的子叶切成薄片(例如1至5mm)，并在细胞壁降解溶液中培养，所述细胞壁降解溶液例如W5-1.5％的纤维素、0.5％的离析酶、0.4％的甘露醇、20mMKCl、20mM MES、10mM CaCl

根据一具体实施例，亦使用温祖卡R-10及/或半纤维素来处理组织。

纤维素酶或半纤维素是用于自细胞碎片中释放原生质体。

如本文中所使用，“温祖卡R-10”是指衍生自绿木霉菌(Trichoderma viride)的纤维素酶，其分解植物细胞壁。

亦可使用其他的温祖卡纤维素酶，例如温祖卡FA及温祖卡。

根据一具体实施例，所述温祖卡R-10是以0.4至1.5％的浓度提供。

根据一具体实施例，所述半纤维素是以0.5至2％的浓度提供。

根据一具体实施例，所述温祖卡是以0.5至3％的浓度提供。

根据一具体实施例，所述甘露醇是以的0.1至0.3％的浓度提供。

用于原生质体分离的各种酶是可商购的。例如，温祖卡R-10可自许多供应商处购得，包括，但不限于西格马-奥德里奇、GoldBio.Com及Yakult Pharmaceutical Industries公司。

此等酶通常在pH 4.5至6.0(例如5.8)、温度25-30℃(例如室温)下使用，培养期的变化范围很大，可能在半小时至20小时之间(例如5小时)。

经酶消化的植物细胞，除了原生质体外，亦包括未经消化的细胞、已破碎的原生质体及未经消化的组织。细胞团块及未经消化的组织可通过过滤而去除。之后进行离心并洗涤原生质体。离心之后，将原生质体回收至可能含有percoll或组合甘露醇及盐(例如MgCl

根据一具体实施例，至少50-70％的制剂包括活的且完整的原生质体。

因此，根据一实施例，测试经分离的原生质体的活力及经历持续的细胞分裂及再生的能力。

评估原生质体存活力的方法的例子包括但不限于：荧光素二乙酸酯(FDA)染色法。染料积聚在活的原生质体内部，其可通过荧光显微镜检测、通过死去的原生质体(变成红色)选择性地吸收酚红素染剂，而活细胞未被染色、完整膜对伊文思蓝染剂的排除、测量细胞壁形成-荧光白(CFW)染剂与新形成的且发出荧光的细胞壁结合、可通过氧气电极测量原生质体对氧气的吸收、原生质体的光合活性，以及原生质体经历连续有丝分裂的能力(此是直接的度量)。

此种原生质体可用于转殖的方法。

通常，在缺乏细胞壁的情况下，可使用简单的试剂(例如PEG)转移DNA。

因此，根据本发明的一实施例，将DNA引入原生质体包括聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取。有关更多详细的信息，参见卡雷施等人(1991)Plant Cell Rep.9：575-578、马图尔等人(1995)Plant Cell Rep.14：221-226、内格鲁蒂乌等人(1987)Plant Cell Mol.Biol.8：363-373。

基于本教导，本发明的发明人能够成功地将RFP基因引入大麻原生质体。

根据本教导亦提供可获得的原生质体(经转殖的或未经转殖的)。

之后在允许原生质体生长细胞壁、开始分裂形成一愈伤组织、形成芽及根以，以及再生完整的植株的条件下培养原生质体。

原生质体培养的第一步是在原生质体膜的周围形成细胞壁。之后进行细胞分裂，形成小集落。细胞集落可作为培养物而连续生长或再生为完整的植株。在半固体琼脂或液体培养基中培养原生质体。在一实施例中，首先允许原生质体在液体培养基中发育细胞壁，之后转移至琼脂培养基中。

固体培养物(例如琼脂)：琼脂的浓度应使其与原生质体悬浮液混合时，形成柔软的琼脂凝胶，例如0.5至0.7％。根据一具体实施例，原生质体的铺板是通过伯格曼细胞铺板技术而进行的。在琼脂培养物中，原生质体保持在固定位置、分裂并形成细胞克隆。琼脂培养的优点是避免原生质体的结块。

根据另一实施例，使用液体培养物。液体培养可用于原生质体的培养，原因如下：

1.易于稀释及转移。

2.细胞密度可根据需要进行控制。

3.液体介质的渗透压可根据需要改变。

通常，如上所述，原生质体的营养需求与经培养的植物细胞的营养需求相似(例如，MS)。

根据一些实施例，进行以下考虑：

1.介质应不含铵，且铁及锌的含量应少。

2.钙的浓度应比细胞培养所使用的钙高2至4倍。其对于膜稳定性是必需的。

3.高的生长素/生长激素比例是适合用于诱导细胞分裂，而高的生长素/生长激素比例则是再生所需的。

4.尽管可使用糖(葡萄糖及蔗糖)的组合，葡萄糖是原生质体优选的碳源，。

5.用于原生质体培养的维生素与在标准组织培养基中所使用的维生素相同。

渗压剂及渗透压：

如本文中所使用，“渗压剂”是指被添加以增加液体的渗透压的试剂/化学物质。

原生质体的分离及培养需要渗透保护，直至形成坚固的细胞壁为止。实际上，倘若将新鲜分离的原生质体直接添加至正常培养基中，则其将破裂。因此，添加渗透剂对于原生质体的分离及培养基受损皆是必要的，以防止原生质体受损。

根据一具体实施例，所述渗透剂是非离子的。最常使用的非离子物质是可溶性碳水化合物，例如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖及蔗糖。根据一具体实施例，使用甘露醇。

根据一具体实施例，所述渗透剂是离子的。氯化钾、氯化钙及磷酸镁是用于维持渗透压的离子性物质。当将原生质体转移至培养基上时，使用代谢活性的渗透稳定剂(例如葡萄糖、蔗糖)以及代谢惰性的渗透稳定剂(甘露醇)是有益的。随着原生质体的生长及细胞壁再生的发生，利用代谢活性化合物，其导致渗透压降低，从而维持适当的渗透压。

原生质体的培养技术可能有所不同。

根据一具体实施例，使用供料层技术或微滴培养。

在经培养的原生质体中细胞壁形成的过程是在分离后几小时内开始，在合适的条件下可能需要两至数天。当发生细胞壁发育时，原生质体失去其特征性的球形。原生质体所新产生的细胞壁可通过使用calcofluor白色荧光染剂进行鉴定。

新形成的细胞壁是由松散结合的微纤维所组成，所述微纤维组织起来以形成典型的细胞壁。细胞壁发育的此过程需要持续供应营养素，尤其是容易代谢的碳源(例如蔗糖)。

已发现在培养基中存在离子渗透稳定剂的情况下，对于细胞壁的发育不适当的。具有适当的细胞壁发育的原生质体经历正常的细胞分裂。另一方面，具有再生的细胞壁不良的原生质体显示发芽且无法进行正常的有丝分裂。

由于原生质体周围的细胞壁形成完成，因此细胞会增大，且第一次分裂通常在2至7天内发生。随后的分裂导致小集落，并在第三周结束时形成可见的集落(宏观集落)。之后将此等菌落转移至无渗透(无甘露醇或山梨醇)的培养基中以进一步发育以形成愈伤组织。

通过诱导及适当的操作，愈伤组织可进行器官发生或胚发生的分化，最终形成完整的植株。

可自原生质体或植物器官培养物中获得的愈伤组织以进行植物再生。然而，此二种愈伤组织存在某些差异。来自植物器官的愈伤组织带有预先形成的芽或有组织的结构，而来自原生质体培养的愈伤组织则不具有此种结构。

为了增强任何上述的再生方案，本发明的发明人已鉴定有助于植物再生的再生基因，所述再生基因称为CsBBM(SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6)及CsSERK1(SEQ ID NO：1及SEQID NO：10)。

亦考量天然存在的或合成的同源物(例如，其至少30％、40％、50％或80％的核酸同一性)。

因此，根据本发明的一方面，提供一种再生大麻的方法，所述方法包括使用一再生基因[例如，CsBBM(SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6)及CsSERK1(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：10)]将大麻的外植体或植物(即，在植物体中)进行转殖。

此等同源物可为例如与SEQ ID NO：10(CsSerk1的氨基酸序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，如同由威斯康辛州序列分析软件包的BestFit软件，利用史密斯与沃特曼演算法确定，其中缺口权重等于50、长度权重等于3、平均匹配数等于10及平均不匹配数等于-9。

根据另外的或替代的实施例，所述同源物可为例如与SEQ ID NO：6(CsBBM的氨基酸序列)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，如同由威斯康辛州序列分析软件包的BestFit软件，利用史密斯与沃特曼演算法确定，其中缺口权重等于50、长度权重等于3、平均匹配数等于10及平均不匹配数等于-9。

在BnBBM、AthBBM、ZmBBM、AtSERK1、BnSERK1、SlSERK1(SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：9)中提供天然存在的同源物。。

在整个说明书中描述转殖方案(病毒或非病毒依赖性的)。

用于表达的启动子可为组成型活性的或诱导型的(参见，例如，WO2017/115353、WO2016/030885)。

本发明一些实施例的多肽的核酸序列可针对植物表达进行优化。此类序列修饰的实例包括，但不限于，经改变的G/C含量以更接近通常在感兴趣的植物物种中发现的方法，以及去除通常在植物物种中所发现的非典型密码子，通常称为密码子优化。

亦提供一种转殖大麻方法。所述方法包括在一磁场下，将一大麻植物的花粉与多个颗粒接触，所述多个颗粒包括编码感兴趣的一表达产物的一核酸序列，所述磁场使所述多个颗粒集中以及允许所述感兴趣的核酸序列渗透至所述花粉中。

在磁场下的转殖通常称为“磁转染”。

使用磁转染技术转殖大麻的能力令人惊讶的，因为迄今为止尚未描述过大麻的花粉孔。

所述方法是有利的，因为其无需植物再生。

在所述系统中，负载有磁性纳米粒子的外源DNA在磁场的作用下被传递至花粉中。

本发明的发明人惊奇地发现新鲜的花粉，即在收获后长达12小时，显示出更好的转殖性。

据此，磁性纳米颗粒(MNP)用作DNA载体，其可以磁场的方向电位(外部施加)穿过花粉中的孔。因此，经带正电的聚乙烯亚胺涂布的Fe

根据一示例性方案，在添加转殖培养基之前，在室温下将质粒DNA(例如1μg)与MNP(MAGBIO，美国)结合，之后添加转殖培养基：10g至40g的蔗糖、10.3mg的H

将花粉(1千万颗粒)添加至含有结合的MNP-质粒的培养基中，并在室温下置放在磁体(Chemicell)上30分钟，之后在30℃下干燥30分钟。

基于本教导，本发明的发明人能够成功地将GUS基因引入大麻的花粉中。

相较于具有相同的遗传背景、发育阶段及生长条件，但未经转殖的未转殖植株，在本文中亦称为“控制”，本文中所述的任何植物材料皆可用于生成具有进阶的农业、营养、药物、娱乐特性的大麻植物。

如本文中所使用，术语“约”是指约10％。

术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有”及其共轭词是表示“包括但不限于”。

术语“由...所组成”是指“包括并限于”。

术语“基本上由…所组成”是指所述组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是所述额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的本质及新颖特征。

如本文所使用的，单数形式“一(a)”，“一(an)”及“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

在整体的本申请中，本发明的各种实施例可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便及简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。据此，应该将范围的描述视为已具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，针对范围自1至6的描述应被视为已明确公开了自1至3、自1至4、自1至5、自2至4、自2至6、自3至6的子范围，以及在所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5及6。其与范围的广度无关。

每当在本文中指示数值范围时，其意在包括在指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在一第一指示数字及一第二指示数字之间的“范围(ranging)/范围(ranges)”以及自一第一指示数字“至”一第二指示数字的“范围(ranging)/范围(ranges)”在本文中是可互换使用的，且意在包括所述第一指示数字及所述第二指示数字以及它们之间的所有小数及整数。

如本文中所使用，术语“方法”是指用于完成一给定的任务的方式，手段、技术及过程，包括，但不限于已知的方式、手段，或易于由化学、药理、生物学、生化及医学领域的从业人员所开发的已知的方式、手段、技术及过程。

如本文中所使用，术语“处理”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病情的进展、基本上改善病情的临床或美学症状或基本上防止病情的临床或美学症状的出现。

当提及特定的序列表时，应理解为此参考亦涵盖基本上对应于其互补序列的序列，包括由于例如定序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变而引起的微小序列变化，其条件是此种变异的频率是小于50个核苷酸中的1个、或者小于100个核苷酸中的1个、或者小于200个核苷酸中的1个、或者小于500个核苷酸中的1个、或者小于1000个核苷酸中的1个、或者小于5,000个核苷酸中的1个、或者小于10,000个核苷酸中的1个。

应当理解，本申请中所公开的任何序列识别号(SEQ ID NO)皆可指DNA序列或RNA序列，其取决于提及该SEQ ID NO的上下文，即使所述SEQ ID NO仅以DNA序列格式或RNA序列格式表达。

应当理解，为清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征亦可在个别的实施例中组合提供。相反地，为简洁起见，在个别的实施例的上下文中所描述的本发明的各种特征，亦可单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中所描述的某些特征不应被认为是彼等实施例的必要特征，除非所述实施例在无那些要素的情况下是不可操作的。

如上文所述的以及如以下权利要求书所述的本发明的各种实施例及方面，在以下的实施例中得到实验上的支持。

实例

现在参考以下的实例，其与上述一起以非限制性的方式说明本发明。

通常，本文所使用的命名法及本发明中所使用的实验室方法包括分子、生化、微生物学及重组DNA技术。此种技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，“分子克隆：实验室手册”，桑布鲁克等人,(1989)、“分子生物学的当前方案”，第I至III卷奥苏贝尔,R.M.编辑(1994)、沃森等人,“重组DNA”,Scientific American Books，纽约、比伦等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，第1至4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约(1998)、美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号及第5,272,057号所记载的方法、“细胞生物学：实验室手册”，第I至III卷，赛利斯,J.E，编辑(1994)、“免疫学的当前方案”，第I至III卷，科利根J.E.，编辑(1994)、斯蒂茨等人(eds)，“基本的及临床的免疫学”(第8版)，Appleton&Lange，诺沃克，康乃狄克州(1994)、米雪及志吉(编辑)，“细胞免疫学的筛选方法”，W.H.弗里曼及公司，纽约(1980)、可利用的免疫分析法在专利及科学文献中有广泛的描述，例如参见美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771及第5,281,521号、给特，M.J.,编辑，“寡核苷酸合成”(1984)、“核酸杂交”，海姆斯，B.D.，及希金斯S.J.，编辑(1985年)、“转录及转译”，海姆斯，B.D.，及希金斯S.J.，编辑(1984)、“动物细胞培养”，夫瑞旭尼,R.I.，编辑(1986)、“固定化的细胞及酶”，IRL出版社，(1986)、“分子克隆实用指南”，珀巴尔，B.，(1984)及“酶学方法”，第1至317卷，Academic出版社、“PCR方案”：“方法及应用指南”，Academic出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)、马沙克等人，“蛋白质纯化及表征的策略-实验室课程手册”CSHL出版社(1996)，所有此等文献皆通过引用而将其并入本文中，如同在此完整阐述一样。本文档中提供其他一般参考。据信其中的过程在本领域中是众所周知的，且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息皆通过引用并入本文中。

实例1

大麻品种的体外繁殖、强化及生根

大麻作为世界各地的食品、石油、纤维、药用及娱乐性药物的来源作物，已获得相当重要的地位。此种特别的多功能重要的植物材料自然要求开发合适的方案，以通过生物技术的介入自大麻品种生产足够量的均匀种植材料。在生物技术的方法中，微繁殖是最可行的技术之一，其可使许多重要的经济作物快速有效地进行无性繁殖。

此项研究描述一种有效的体外繁殖、强化及生根的过程，可自大麻的芽尖及幼苗中获得植株。将十种不同的大麻品种的幼苗及芽插枝进行灭菌，并将于pH为6.8的条件下添加有10g/L蔗糖、5.5g/L琼脂及不同的激素组合的半强度1/2MS培养基每天在光照下放置16h。在大多数测试品种中，在补充有不同激素组合的固体培养基上观察到有限的生长。为了提高大麻植物的通透性，开发一种利用“液体处理”的方案，其中每3至4周将组织培养外植体自固体培养基转移至液体培养基中，并补充数种亚致死浓度的角质层切口酶，其导致显着地改善生长及发育。增殖的芽成功地生根于补充有85％幼苗的固体MS培养基上。针对10个不同的大麻品种建立体外克隆繁殖、生根及驯化小苗生产。所述程序需要50至70天的体外克隆繁殖周期(芽繁殖需要20天、根诱导需要30天)，其中包括15至30天的驯化小苗生产。不同品种可能具有不同的处理时间，通常需要50至100天。

材料与方法

植物材料

这项研究使用代表广泛遗传多样性的十种不同的大麻品种(表1)。其中一些是具有低/非THC的大麻素，其主要用于纤维，而其他则是具有高含量THC的大麻素，以及用于医疗及休闲用途的其他大麻素(例如0至22％的THC及0.2-13％的CBD)。寻常大麻的植株从种子及插条中生长出来。

表1

来自成熟植物的大麻组织培养物的建立及繁殖

组织灭菌：

将来自成熟植物的含有顶端及腋生分生组织的切割组织在大量水流下洗涤3小时。之后将组织在70％乙醇中洗涤10秒，再于1.5％NaClO中洗涤20分钟。

将组织在蒸馏水中进一步充分洗涤4次，并置于不同的无菌增殖生长培养基上。为了确定各培养基的理想组成(表2)。

组织繁殖

每隔21天，将植物小心地移除叶片并暴露侧分生组织之后，将其转移至新鲜的繁殖培养基中。

从种子建立及繁殖

种子杀菌和发芽

将种子在大量水流下洗涤2小时，之后在70％的乙醇中洗涤10秒，之后在添加有0.1％Tween 20的1.5％NaClO中洗涤20分钟。然后在蒸馏水中将种子进一步充分地洗涤4次，并置于无菌生长培养基(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)上。种子在黑暗中萌发2天，之后转移至光照下。两周后，将含有至少两片真叶的大幼苗自其根部切下，并转移至不同的无菌增殖生长培养基中。为了确定各培养基的理想组成(表2)。

液体处理

幼芽自叶片及坏死组织中耗尽。之后将其转移至包含除了下表2中所提及的琼脂以外的所有生长成分的液体培养基中。将小植株在装有5ml培养基的250ml广口瓶中摇动21天，之后转移回到固体培养基。

优质液体处理

在“液体处理”的液体阶段添加数个亚致死浓度的角质层切口酶。将5ml酶反应混合物(0.25ml的10％果胶酶及角质酶的真菌混合物，所述角质酶为0.25ml的200mM Tris-HCl的BSG手工液体果胶酶、角质酶-西格马、费迪南德玛丽亚昆西)添加至5ml液体培养基中。在30℃下培养30分钟，之后转移至新鲜的液体介质中。

相同的培养基是用于液体及固体培养。

表2-本研究中用于大麻组织培养的不同增殖培养基(PR)

生根及驯化

首先对大麻品种213及108进行生根及驯化实验。

将芽单独置放在装有根诱导(RI)培养基的试管中，所述培养基是补充有100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素HCl、90mg/l间苯三酚、2％蔗糖(w/v)、0.25％活性炭(AC)、含有或不含IBA(不同浓度(0、1、2mg/l)及0.8％琼脂的半强度MS培养基(1/2MS)。通过将生根圆筒浸泡在补充有0、1或2mg/l IBA的液态RI培养基中，以滋润土壤混合物，各处理包括10个芽且于4周后对结果进行评分。各实验重复3次。

结果

角质层切口酶及将植物自固体培养基转移至液体培养基对于大麻组织培养增殖的效果

建立针对10种不同的大麻品种的组织培养方案，此等品种代表广泛的遗传多样性(图1)。测试数种增殖(PR)培养基，以根据其在1至3个月后的生长速度确定各品种的最佳培养基(表2)。结果如图2所示。

进一步分析组织培养物显示，在6个生长周期之后，生长速率下降，其可能是由于有限的成分吸收(图3A)。为了提高大麻植物的通透性，制定针对“液体处理”的方案，其中每3至4周将组织培养物自固体培养基转移至液体培养基，结果显着地改善其生长及发育(图3B至图3C)。

为了进一步提高植物的通透性，通过向液体阶段添加数种亚致死角质层切口酶来补充“液体处理”，其目的是在植物的角质层中产生裂缝。果胶酶及角质酶是细胞外酶，其催化角质层及木栓质的聚酯的水解，从而保护植物表面。称为“优质液体处理”的方案是指存在细胞壁降解酶(表3、图4)。

表3：组织培养对于“优质液体处理”的反应。自1(生长停滞)至5(快速生长)测量生长速率。

液体介质与亚致死角质层切口酶及植物表面活性剂的组合(“优质液体处理”)可显着提高植物的生长发育。此外，即使在固体培养基上再次继代培养时，大麻品种表面的通透性的变化仍然持续(图4)。

生根及驯化

为了得到根诱导，检验不同浓度的IBA。将芽置于含有生根培养基的管中，所述生根培养基含有0、1或2mg/l的IBA。使用此种方法及2mg/l的IBA，大约85％的芽形成根。然而，此等植物中只有很少一部分在温室条件下成功地适应环境。根据第二种方法，将芽直接在生根圆筒中培养。4周之后，达到100％的根形成，其与所用生长素的浓度无关(图5A至图5C)。此等植物在温室条件下具有更好的硬化性、且更容易适应环境。针对10种不同的大麻品种建立了体外克隆繁殖、生根及驯化小苗的生产。根据本发明的一实施例，所述过程需要50至70天的周期以用于体外克隆繁殖(20天用于枝条繁殖且30天用于根诱导)，其中包括15至30天用于驯化的小苗生产。

实例2

利用组织培养技术进行大麻的再生及转殖

通过应用生物技术策略，有助于开发具有经改良的性状的新大麻品种。此研究的目的是建立组织培养物中大麻的有效再生，并建立根瘤农杆菌介导的外源基因导入的转殖方案。

在含有角质层切口酶的优质处理培养基上，使用含有来自大麻组织培养植株的腋芽的节段诱导高频芽的再生，将其添加至含0.05至5.0μM噻唑啉酮的Murashige及Skoog(MS)中等盐混合物中、补充100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、2％的蔗糖(w/v，pH 5.7)及5ml的角质层切口酶反应混合物(0.25ml的10％酶、果胶酶及角质酶的真菌混合物(0.25ml200mM Tris-HCl的BSG手工液体果胶酶、角质酶-西格马、费迪南德玛丽亚昆西)。利用角质层切口酶及噻地隆(0.5μM噻地隆)进行培养基处理，使再生的质量及数量更好。将吉贝素添加至含有0.5μM噻地隆的培养基中之后，芽的生长会略有提升，将来自四种大麻品种的幼苗及组织培养的茎及叶片片段置放在含有甘博格维生素B5的Murashige及Skoog培养基上Itamins(MB)，并补充有不同组合的植物生长调节剂及3％蔗糖以及8g/L琼脂。所有的品种在4周内产生大量的愈伤组织。建立带有携带用于大麻愈伤组织、下胚轴、叶片及子叶的nptII及uidA-内含子基因的载体pME 504的根瘤农杆菌品种EHA105的转殖。

材料与方法

使用优质处理进行再生

利用组织培养以自大麻植物材料中再生，使用已发芽的叶片、子叶及下胚轴进行再生。将植物置于含有20ml的再生培养基的培养皿中，使用角质层切口酶进行优质处理：MS盐混合物，其在pH 5.7下补充有100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、2％蔗糖(w/v))，及含有及不含5ml果胶酶反应混合物(在0.25ml 200mM Tris-HCl中的0.25ml果胶酶及角质酶的10％酶真菌混合物)。

自叶片再生

自3至4周龄的植物中分离出的三个最年轻的扩大的叶片并置放于含有角质层切口酶的再生培养基(Murashige及Skoog(MS)中等盐混合物上，其含有0.05至5.0μM噻唑隆，且补充有100mg/l肌醇)、1mg/l硫胺素-HCl、pH 5.7的2％蔗糖(w/v)及5ml果胶酶反应混合物(在0.25ml 200mM Tris-HCl中的0.25ml的10％角质层切口酶)。培养物保存在低光照强度(2.5mmol/m

从子叶再生

将种子在大量的水流下洗涤2小时，之后在70％的乙醇中洗涤10秒，之后在带有0.1％Tween 20的1.5％NaClO中洗涤20分钟。将种子在蒸馏水中洗涤4次并置于无菌生长培养基上(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)。种子在黑暗中萌发2天，之后转移至光照下。两周后，将含有两片真叶的大幼苗的子叶切下，并置于含有角质层切口酶的再生培养基(Murashige及Skoog(MS)中等盐混合物上，其含有0.05至5.0μM噻唑隆，并补充有100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、pH 5.7的2％蔗糖(w/v)及5ml果胶酶反应混合物(在0.25ml 200mM Tris-HCl中的0.25ml 10％酶)。将培养物在25℃下、于16/8小时的光周期中保持高光照强度(40mmol/m

从愈伤组织再生

将21天龄的组织培养物置放于PR12固体培养基(MS、2％蔗糖、2mg/l BA、1mg/lGA3、0.8西格马琼脂，pH 5.8)上，以促使形成愈伤组织。两周后，将愈伤组织转移放置于含有角质层切口酶的再生培养基(Murashige和Skoog(MS)中等盐混合物上，其含有0.05至5.0μM噻唑隆，并补充有100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、pH 5.7的2％蔗糖(w/v)及5ml果胶酶反应混合物(在0.25ml 200mM Tris-HCl中的0.25ml 10％酶)。将培养物在25℃下、于16/8小时的光周期中保持高光照强度(40mmol/m

根瘤农杆菌品种及质粒

使用带有nptII及uidA-内含子基因的载体pME 504的超高价根瘤农杆菌品种EHA105。农杆菌培养物在含有适当抗生素的LB培养基中生长过夜。通过离心(4000rpm，15分钟)以分离细菌、重悬于补充有100μM乙酰丁香酮(AS)的液体SIM培养基中，以得到的最终OD600为0.7，且在28℃及250rpm的轨道振荡器中培养4h。

大麻的转殖

使3至4周龄的微繁殖芽的叶片受伤并浸入细菌悬浮液中20分钟，在滤纸上吸干，并在再生培养基上进行培养，并使用基于MS盐混合物的亚致死角质层切口酶进行优质处理，其补充有2.0mg/l TDZ及2mg/l IBA、100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素-HCl、pH 5.7的2％蔗糖(w/v)及5ml果胶酶混合物(0.25ml的10％的酶、0.25毫升的200mM Tris-HCl)。通过GUS染色评估转殖。

GUS染色

将新鲜的植物材料转移至组织化学试剂(在100mM磷酸钾缓冲液中，pH 7.0的1.1mM X-Gluc：5mM亚铁氰化钾、5mM铁氰化钾及0.1％Triton X-100)中，于37℃下培养1小时至过夜。染色后，将圆盘转移至70％乙醇中1小时至过夜，直至漂白为止。

转殖的分子确认

为了验证nptII及GUS基因的存在及完整，所有经选定的克隆皆通过PCR进行分子分析。根据默里，M.G

用于nptII基因的645bp片段的PCR扩增的寡核苷酸引物为：

直接引物5’-GCC GCT TGG GTG GAG AGG CTA T(SEQ ID NO：12)-3’(63.6℃)、

反向引物5’-GAG GAA GCG GTC AGC CCA TTC(SEQ ID NO：13)-3’(60℃)。

GUS基因的676bp片段的引物为：

GUSup 5’-CGA GCG ATT TGG TCA TGT GAA G(SEQ ID NO：14)-3’(57.5℃)、

GUSlow引物5’-CAT TGT TTG CCT CCC TGC TGC GGT T(SEQ ID NO：15)-3’(55.9℃)(西格马)。

使用热循环仪(Biometra)以25μl等分试样进行扩增。扩增nptII基因片段的PCR条件为95℃5分钟、之后再94℃1分钟、62℃1分钟、72℃1分钟及在72℃的最终延伸10分钟的35个循环。uidA-内含子片段的扩增依据以下程序进行：95℃ 5分钟、之后再94℃ 45秒、55℃45秒、72℃ 45秒及在72℃的最终延伸10分钟的35个循环。

结果

含有角质层切口酶的“再生优质处理”提高了大麻的再生率。在初步的实验中，当在补充有激素的再生培养基上培养时，约5％至10％的外植体表现出芽再生。

为了增加植株的再生速率，添加“再生优质处理”，其包括向固体培养基中添加角质层切口酶。在所有经测试的品种中，“再生优质处理”相较于未经处理的植物，植物再生增加了十倍(表4)。

表4：激素浓度及“再生优质处理”对数种大麻品系的芽再生再生的影响(再生％)

“优质处理”强化大麻从不同植物器官(子叶、愈伤组织及叶片)的再生(图4)。

转殖

本研究描述使用uidA-内含子及nptII基因成功地转殖数种大麻品种。观察到数种大麻品种的叶片、下胚轴、愈伤组织及子叶的有效短暂转殖(图7的上图)。通过GUS组织化学测定及分子分析已证实所选克隆的转殖。在所有经测试的克隆中皆显示阳性PCR(图7的下图)。通过GUS染色及PCR证实转殖。通过在100mg L

实例3

在大麻品种中的植物再生及转殖

避免/最小化组织培养的替代方法将有利于新的转基因大麻品种的开发。转基因大麻植物是通过独立于组织培养的根瘤农杆菌介导的转殖过程所生产的。切下两个发芽的大麻幼苗的子叶之其中一者。将在纳米封装糊剂中使用植物激素的独特再生方法引入至发芽幼苗的经切除的顶端分生组织中。获得超过80％的发芽幼苗的再生。使用三种不同品种的成年大麻植物得到相似的再生率，其表明纳米封装糊剂诱导有效的再生。农杆菌品种EHA105带有二元载体pME504，所述载体带有β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)及新霉素磷酸转移酶(nptII)的基因，或带有nptII及甜菜碱基因的质粒(波托拉克，隑等人“在抗甜菜碱的农作物及观赏植物中的经工程改造的灰霉病抗性、抗氧化能力及色素沉着“Proceedings ofthe National Academy of Sciences(2017)：201707176)。

为了进行在植物体内的转殖，将具有不同的二元质粒的农杆菌品种EHA 105与乳液糊剂混合以增强对切下的植物表面的附着。在共培养十天后，对幼苗(带有单子叶的受伤的幼苗)进行GUS组织化学分析，表明在T0代可转殖性的证据，并通过PCR分析及典型的甜菜碱红叶表达以进一步证实。使用PCR进行分子表征及GUS及甜菜碱表达分析。

材料及方法

植物材料

种子：利用1.5％次氯酸钠将大麻(来自不同的品种)的种子表面进行消毒，之后使用无菌水洗涤数次。种子在无菌、潮湿的滤纸盘上萌发，直至出现可见的根部为止。

幼苗：种子在固体培养基(土壤、蛭石、MS等)中发芽，直至观察到前两片真叶(在2至4片真叶之间)为止。

当观察到两个节点时，允许植物种子发芽并生长至一定的尺寸。

“再生前的组织准备”

在145°处从幼苗上切下一子叶及分生组织及其叶片，仅在幼苗上留下一子叶。允许植物生长直至至少出现2个节点为止，之后从最底的叶片的145°处切下枝条，使植物仅留下一片叶片。

“再生胶”

制备数种激素组合组，并通过喷雾或通过根据佩雷拉等人，2017(胶体及表面B：Biointerfaces 150：141-152)所制备的ALGANATE

浆糊剂涂布在受伤的枝条上

成像以检测在植物体中的再生

扫描电子显微镜

扫描电子显微镜是用Hitachi

组织学

将组织在10％福尔马林、5％乙酸及50％酒精(FAA)中固定24小时，之后在一组逐渐增加浓度的乙醇中逐渐脱水，之后用Histo-Clear替代，并包埋在石蜡中。使用徕卡RM2245切片机将经包埋的组织切成10μm的切片，并用番红/固绿进行染色。使用光学显微镜(DMLB，徕卡)或立体镜(MZFLIII，徕卡)观察样品。

根瘤农杆菌品种及质粒

使用具带有携带uidA-内含子报告基因及nptII抗性基因的载体pME 504的超高价农杆菌品种EHA105，或携带nptII和甜菜碱基因的载体pX11。另参见波拉鲁卡等人,PNAS2017年8月22日.114(34)9062-9067。

通过离心以分离细菌(8000g，10分钟)。将细菌重悬于含有100mg/l乙酰丁香酮的转殖缓冲液(1MS、5.86g/l MES、1％蔗糖，pH 7.0)中，最终OD600为0.6，并在轨道振荡器中于28℃培养的同时以250rpm摇晃3小时，直到植物被感染为止。

将植物材料(来自组织培养物、幼苗或种子的微繁殖芽)在真空干燥器中真空渗透5分钟。之后与农杆菌在室温下共培养30分钟，之后转移至感染培养基上以进一步生长。

转殖前的组织准备

在农杆菌转殖之前，对所有的组织进行机械处理。将种子进行切割、压碎或打孔，以使根保持完整。在145°处从幼苗上切下一子叶及分生组织及其叶片，仅在幼苗上留下一子叶。允许植物生长直至至少出现2个节点为止，之后从最底的叶片的145°处切下茎，使植物仅留下一片叶片。

农杆菌介导的转殖

将用于各种遗传修饰目的的二元质粒引入根瘤农杆菌中。农杆菌以不同的方式应用于组织。a.浸入、b.微囊化、c.注射及d.滴落。无论如何，包含所需质粒的农杆菌在选择性抗生素的存在下生长，之后被活化培养基替代。倘若是以浸入的方式，将经处理的种子或幼苗与细菌共培养2分钟至数小时。当应用微囊化时，测试数种活化的介质：MSO、一半的MSO、SIM及CT。

微囊化转殖

如材料及方法所述，使农杆菌生长及活化，之后将其与羊毛脂纳米乳化剂(根据张等人,2014,Nanotechnology，25(12)，125101)通常以3：4(v/v)的比例混合。在进行切割后的24小时内，将所得的糊状物涂布在插条上。

GUS染色

将新鲜的植物材料转移至组织化学试剂(在100mM磷酸钾缓冲液中，pH 7.0中的1.1mM X-Gluc：5mM亚铁氰化钾、5mM铁氰化钾及0.1％Triton X-100)中，于37℃下培养1小时至过夜。染色后，将圆盘转移至70％乙醇中1小时至过夜，直至漂白为止。

甜菜碱的分离

为了观察甜菜碱，将新鲜组织(0.5g)在CTAB缓冲液(3％CTAB、28％NaCl、4％EDTA、10％Tris HCl、3％PVP及25％水)的存在下进行研磨，并与氯仿混合并离心。

结果

在使用再生糊剂的在植物体中的再生

遗传修饰(即基因组编辑、基因转移等)需要一平台，用于将彼等修饰引入植物细胞中，且需要一种有效的方法来使经修饰的细胞再生，从而获得新的经修饰的植物。在许多情况下，其可能是建立有效转换方案的瓶颈。在植物中转殖的方案的开发无需使用组织培养。

当观察到前两片叶片(图8A至图8B)时，幼苗在固体培养基中发芽(图8A至图8B)，移除分生组织及其叶片以及一子叶(图8A至图8D)。受伤的组织与再生糊剂一起铺开。使幼苗在16小时光照下生长，并在7天后观察到从切割区域周围再生(图8E至图8F)。如下表5所示，在7天后观察到再生的结果，并在12天后评估幼苗的不同的结果。

从插条中浸没的3至5周龄的年轻大麻植物可生长，直至观察到两个节点为止，之后以与处理幼苗相同的方式切割茎，仅留下一片叶片。使用再生糊剂涂布伤口，并将植物置放在光照下16小时，使植物再生(图9)。

表5：将不同的激素涂布在不同的大麻品种上的影响：从受伤中恢复的百分比表示为恢复百分比。R(再生)、M(分生组织)、C(愈伤组织)、N(不变)。

在植物体中微囊化农杆菌转殖

在植物中，由于细菌与伤口区域的附着力差而使得农杆菌的应用变得复杂。对于植物体内的转殖，将具有不同的二元质粒的农杆菌品种EHA 105与乳液糊剂混合，以强化对经切下的植物表面的附着。依照材料及方法中所描述，使农杆菌生长及活化，之后将其通常以3：4(v/v)的比例与羊毛脂纳米乳化剂混合。在受伤后的24小时内，将所得的糊状物涂布在插条上。将携带具有β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)及新霉素磷酸转移酶(nptII)基因的二元载体pME504的农杆菌品种EHA 105，或具有nptII及甜菜碱基因的质粒pX11使用于转殖。在共培养后十天，通过幼苗的GUS组织化学分析表明T0代是可转殖性的证据，并通过PCR分析及典型的甜菜碱红叶的表达进一步得到证实(图10A至图10C及图11A至图11C)。使用PCR进行分子表征以及GUS及甜菜碱的表达分析(图10A至图10C及图11A至图11C)。

实例4

通过体细胞胚发生再生大麻

材料及方法

使用在两个大麻品种(108及201)的固体培养基(直径1.5厘米、长4至5厘米)上生长的组织培养叶段。斜切最里面的叶轮(0.5至1.0cm)，并用锋利的手术刀刀片使叶片受伤，以实现愈伤组织的萌生。叶片片段是用作外植体，培养在补充有2,4-D(4.0mg/L)及激动素[Kin](0.5mg/L)的MS培养基上(Murashige及Skoog 1962)。在2至3周后，将培养物置放在25±2℃、70-80％湿度、黑暗的液体Gamborg B5培养基中进行培养，所述液体Gamborg B5培养基是补充有6％蔗糖及不同植物激素(表1)。每三周更换一次培养基。

来自两种不同基因型(108及201)的组织培养物中的叶片片段已被使用作为主要的外植体。将外植体切成小块(小于0.5毫米)，并在补充有6％蔗糖及不同植物激素的液体Gamborg B5培养基中培养(表1)。每三周更换一次培养基。

结果

大麻通过体细胞胚发生进行微繁殖-大麻二酚(CBD)与CPPU微乳剂的作用

在起始后4周观察到第一个球形的胚体。

单独或作为CBD-CPPU微乳剂的CPPU(浓度为10mg/l)对于胚体发生是至关重要的。在使用2iP：3mg/l CPPU的培养基中产生的胚体数量很少，但是添加CBD-CPPU微乳剂可显着地增加体细胞胚的发生。于黑暗中在旋转摇晃器上培养胚体。

表6.在大麻外植体中用于体细胞胚体发生的激素类型：

在相同的培养基中将起始的悬浮培养物与球形阶段的胚体一起培养(图12A至图B)三周。将部分的培养物转移至B5 Gamborg培养基中，并补充不同的激素/化学物质(表2)，以诱导胚体的延伸及进一步的发育。每三周将培养物转移至新鲜培养基中。

表7.使用于大麻体细胞胚发育中的不同的补充物：

在补充有CBD-CPPU和6％蔗糖(而非3％)的B5培养基上第二次继代培养之后，对一些体细胞胚进行鱼雷形胚体的培养。

对于某些鱼雷形胚体，在补充有CBD-CPPU及6％蔗糖的B5培养基上进行第三次继代培养之后，植物在液体培养基中进行再生(图13A至图13C)。

实施例5

三种不同大麻品种的原生质体分离及转殖

在所有经测试的大麻品种中成功分离出原生质体。优化酶的组合及浓度以及处理时间。甘露醇的存在及优选的浓度(0.5M)对于原生质体的培养是重要的。在液体培养中培养48小时后，约4％的原生质体存活。一些原生质体形成的细胞壁-少于1％。亦建立原生质体的转殖。

材料与方法

原生质体的分离

利用1.5％次氯酸钠将种子进行灭菌20分钟，之后利用一连串的无菌水进行洗涤。将种子留在无菌MS培养基上发芽，且当发芽时收获子叶。将子叶切成小块，并在含有1.5％纤维素、0.5％离析酶、0.4％甘露醇、20mM KCl、20mM MES、10mM CaCl

原生质体的转殖

将质粒DNA(5至20μg)中的可视标记的红色荧光蛋白(RFP)以及等体积的40％PEG溶液(在0.2M甘露醇及0.1M CaCl

结果

测试三种不同的酶组合(表8)对于自三个大麻品种(品种1、2、3为201、202、203)中分离原生质体的能力。将叶片外植体进行酶处理4小时或17小时。仅一种酶的组合-酶混合物C是有效的(图14)。自所有的三个测试品种中分离出原生质体。不同品种的原生质体产量不同(图14)。自大麻品种1收获最大量的原生质体(原生质体浓度为2.2x10

表8.大麻原生质体中所使用的酶的组合

原生质体的转殖

如上所述，使用不同的植物组织开发有效的大麻原生质体分离方案。图16显示使用RFP基因的原生质体的转殖(宋桑民、爱伦L.弗兰克曼及茨维茨菲拉。“一种在植物中表达多种基因的多功能载体系统”Trends in plant science.10.8(2005)：357-361)。

此原生质体分离方案允许从10种不同的大麻品种中分离原生质体，所述大麻品种是在培养物中进行克隆繁殖的。

实施例6

大麻花粉的转殖

当前大多数转殖方法需要组织培养中的植物再生，其涉及到漫长而费力的过程。为了克服体外组织培养物再生的限制，经花粉介导的转殖方法被认为是有前途的替代方法。花粉在授粉及受精过程中向卵巢释放活性DNA。转基因种子可通过外源DNA转殖的花粉授粉直接产生。在花粉的磁转染技术中，带正电的经聚乙烯亚胺涂布的Fe

材料与方法

质粒

对于大麻花粉的转殖，使用二元载体CsUBQ::GUS。所述质粒在寻常大麻UBQ 10启动子下携带GUS报告基因。

花粉

使用自四个不同的样品中所采集的花粉，重复两次进行：

1.来自基因型213的新鲜、“黑化的”；

2.一个月月龄，来自基因型212“黑化的”；

3.两个月月龄，来自基因型108的雄蕊；

4.两个月月龄，来自基因型216“黑化的”；

在转殖之前测试样品的生存力。

转殖

在添加转殖培养基之前，在室温下将1μg质粒与MNP’s(MAGBIO，美国)结合30分钟，之后加入转殖培养基：10g至40g蔗糖、H

将花粉(1千万粒)添加至含有经结合的MNP’s-质粒的培养基中，并在室温下置于磁体(Chemicell)上30分钟，并在30℃下干燥30分钟。

结果

大麻花粉的特性及成像。大麻是经风授粉的，因此其花粉粒径约为25μm，每1毫克花粉约有50万粒花粉颗粒(数据未显示)。在番红O的存在下，在光学显微镜下检查大麻花粉(图17A)，且清楚地显示在发芽培养基上培养花粉粒后所观察到的花粉壁缺失或花粉活力降低的孔，并于18小时后观察花粉管(图17B)。

大麻花粉中的外源基因的表达

为了测试外源基因是否可在花粉中表达，使用MNP将CsUBQ::GUS质粒中的报告基因转殖至大麻花粉中。倘若成功转殖GUS基因，将表达GUS蛋白(β-葡萄糖醛酸酶)，之后可通过X-gluc溶液将其染成蓝色。光学显微镜显示，花粉粒被X-gluc染成蓝色，表明MNP-DNA复合物并未抑制转殖功能，且GUS基因确实被成功地转殖及表达(图17C)。

实施例7

CsBBM及CsSERK1基因的鉴定及分离

为了鉴定大麻的BBM及SERK1基因的同源基因，使用阿拉伯芥的BBM及SERK1基因(SEQ ID NO：3和7)作为诱饵进行blast分析。与此等基因具有最高同源性的基因序列如图18所示。为了分离CsBBM及CsSERK1基因，从大麻愈伤组织中提取总RNA，之后合成cDNA。之后，使用针对CsBBM的引物5’ATGAGTATTATTACTAATGATAGTAATCTCAG3'(SEQ ID NO：16)及TTATTCCATGCCGAATATTGGTGTT3’(SEQ ID NO：17)，以及针对CsSERK1的引物5’ATGGGTGGATGACTTGCATAGTC3’(SEQ ID NO：18)及5’TTACCTCGGACCAGATAACTCGACC3’(SEQ IDNO：19)。

使用针对CsBBM及CsSERK1基因的特异性引物扩增此等cDNA，并在建构的35S启动子的控制下克隆至pCAMBIA二元载体中，并在CsUBIQUITIN10启动子的控制下融合至CAS9基因的表达盒中(SEQ ID NO：11，图19)。

尽管已经结合本发明的特定实施例描述本发明，然而显然地许多替代、修改及变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有此等的替代、修改及变化。

在本说明书中所提及的所有出版物、专利及专利申请案皆通过引用而整体并入本文东，其程度与如同各个单独的出版物、专利或专利申请案被具体地及单独地指示通过引用并入本文的程度相同。此外，在本申请中对于任何参考文献的引用或标识皆不应被解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。就使用章节标题而言，不应将其解释为必然的限制。

此外，本申请的任何优先权文件的全文在此以引用方式并入本文中。

序列表

<110> 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心

莫西·阿里·弗拉什曼

列乌特·科恩·佩尔

奥德·科恩

塞缪尔·博科布扎

<120> 再生及转殖大麻的方法

<130> 77944

<150> US 62/681,697

<151> 2018-06-07

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2292

<212> DNA

<213> Cannabis sativa

<400> 1

gtttgggttt ggggttgggg taggaatttt ttgtgatgtt gtgtttgggt gtggcatacc 60

atttggatct aaggtttttg gttacttaga ctaaaatagc aagggaggaa atatggaaag 120

gaagaagctt tggtggtctt cattttgcct ttggttgatt ttggtagttc atcctttatg 180

ggtgattatg gtatctgcta atatggaagg tgatgccttg catagtctga ggtccaattt 240

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<210> 2

<211> 1661

<212> DNA

<213> Cannabis sativa

<400> 2

aataataata ataataatat tatgagtatt attactaatg atagtaatct cagttgccag 60

ctggaagcgc cgccgtctgc ggtggctccg gtgtcgtcta agaagaccgt tgacactttt 120

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tatttgggtg gatatgataa agaagaaaag gcagcaagag cttatgattt ggctgccctt 300

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<212> PRT

<213> Zea mays

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<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

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Pro Pro Pro Val Ser Thr Pro Ser Gly Tyr Gly Ile Thr Gly Ala Ile

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Thr Tyr Asn Leu His Ala Val Glu Leu Ser Gly Pro Arg

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<210> 9

<211> 629

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 9

Met Val Lys Val Met Glu Lys Asp Thr Val Val Val Ser Leu Val Val

1 5 10 15

Trp Leu Ile Leu Val Val Tyr His Leu Lys Leu Ile Tyr Ala Asn Met

20 25 30

Glu Gly Asp Ala Leu His Ser Leu Arg Val Asn Leu Gln Asp Pro Asn

35 40 45

Asn Val Leu Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp

50 55 60

Phe His Val Thr Cys Asn Asn Asp Asn Ser Val Ile Arg Val Asp Leu

65 70 75 80

Gly Asn Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Val Pro Gln Leu Gly Leu Leu

85 90 95

Lys Asn Leu Gln Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu

100 105 110

Ile Pro Ser Asp Leu Gly Asn Leu Thr Asn Leu Val Ser Leu Asp Leu

115 120 125

Tyr Leu Asn Asn Phe Val Gly Pro Ile Pro Asp Ser Leu Gly Lys Leu

130 135 140

Ser Lys Leu Arg Phe Leu Arg Leu Asn Asn Asn Ser Leu Thr Gly Asn

145 150 155 160

Ile Pro Met Ser Leu Thr Asn Ile Ser Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu

165 170 175

Ser Asn Asn Arg Leu Ser Gly Ala Val Pro Asp Asn Gly Ser Phe Ser

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Leu Phe Thr Pro Ile Ser Phe Ala Asn Asn Leu Asp Leu Cys Gly Pro

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210 215 220

Pro Phe Val Pro Pro Pro Pro Ile Ser Ala Pro Gly Gly Asn Gly Ala

225 230 235 240

Thr Gly Ala Ile Ala Gly Gly Val Ala Ala Gly Ala Ala Leu Leu Phe

245 250 255

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Glu Tyr Leu Phe Asp Val Pro Ala Glu Glu Asp Pro Glu Val His Leu

275 280 285

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Ser Phe Ser Asn Lys Asn Ile Leu Gly Arg Gly Gly Phe Gly Lys Val

305 310 315 320

Tyr Lys Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val Ala Val Lys Arg Leu

325 330 335

Lys Glu Glu Arg Thr Pro Gly Gly Glu Leu Gln Phe Gln Thr Glu Val

340 345 350

Glu Met Ile Ser Met Ala Val His Arg Asn Leu Leu Arg Leu Arg Gly

355 360 365

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Asn Gly Ser Val Ala Ser Cys Leu Arg Glu Arg Pro Pro Ser Glu Pro

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Pro Leu Asp Trp Pro Thr Arg Lys Arg Ile Ala Leu Gly Ser Ala Arg

405 410 415

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Asp Val Lys Ala Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Glu Phe Glu Ala Val

435 440 445

Val Gly Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Met Asp Tyr Lys Asp Thr His

450 455 460

Val Thr Thr Ala Val Arg Gly Thr Ile Gly His Ile Ala Pro Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Thr Gly Lys Ser Ser Glu Lys Thr Asp Val Phe Gly Tyr Gly

485 490 495

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500 505 510

Arg Leu Ala Asn Asp Asp Asp Val Met Leu Leu Asp Trp Val Lys Gly

515 520 525

Leu Leu Lys Glu Lys Lys Leu Glu Met Leu Val Asp Pro Asp Leu Gln

530 535 540

Asn Lys Tyr Val Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Ile Gln Val Ala Leu

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Leu Cys Thr Gln Ser Asn Pro Met Asp Arg Pro Lys Met Ser Glu Val

565 570 575

Val Arg Met Leu Glu Gly Asp Gly Leu Ala Glu Arg Trp Asp Glu Trp

580 585 590

Gln Lys Val Glu Val Leu Arg Gln Glu Val Glu Leu Ala Pro His Pro

595 600 605

Gly Ser Asp Trp Leu Val Asp Ser Thr Glu Asn Leu His Ala Val Glu

610 615 620

Leu Ser Gly Pro Arg

625

<210> 10

<211> 598

<212> PRT

<213> Cannabis sativa

<400> 10

Met Glu Gly Asp Ala Leu His Ser Leu Arg Ser Asn Leu Gln Asp Pro

1 5 10 15

Asn Asn Val Leu Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr

20 25 30

Trp Phe His Val Thr Cys Asn Asn Asp Asn Ser Val Ile Arg Val Asp

35 40 45

Leu Gly Asn Ala Ala Leu Ser Gly Gln Leu Val Pro Gln Leu Gly Leu

50 55 60

Leu Lys Asn Leu Gln Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Asn Asn Ile Ser Gly

65 70 75 80

Thr Ile Pro Ser Asp Leu Gly Asn Leu Thr Ser Leu Val Ser Leu Asp

85 90 95

Leu Tyr Leu Asn Ser Phe Thr Gly Pro Ile Pro Asp Thr Leu Gly Lys

100 105 110

Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Arg Leu Asn Asn Asn Ser Leu Thr Gly

115 120 125

Pro Ile Pro Met Ser Leu Thr Asn Ile Thr Ser Leu Gln Val Leu Asp

130 135 140

Leu Ser Asn Asn Lys Leu Thr Gly Glu Val Pro Asp Asn Gly Ser Phe

145 150 155 160

Ser Leu Phe Thr Pro Ile Ser Phe Ala Asn Asn Leu Asn Leu Cys Gly

165 170 175

Pro Val Thr Gly Arg Pro Cys Pro Gly Ser Pro Pro Phe Ser Pro Pro

180 185 190

Pro Pro Phe Val Pro Pro Pro Pro Ile Ser Val Pro Gly Gly Asn Ser

195 200 205

Ala Thr Gly Ala Ile Ala Gly Gly Val Ala Ala Gly Ala Ala Leu Leu

210 215 220

Phe Ala Ala Pro Ala Ile Ala Phe Ala Trp Trp Arg Arg Arg Lys Pro

225 230 235 240

Gln Glu Phe Phe Phe Asp Val Pro Ala Glu Glu Asp Pro Glu Val His

245 250 255

Leu Gly Gln Leu Lys Arg Phe Ser Leu Arg Glu Leu Gln Val Ala Thr

260 265 270

Asp Ser Phe Ser Asn Lys Asn Ile Leu Gly Arg Gly Gly Phe Gly Lys

275 280 285

Val Tyr Lys Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ser Leu Val Ala Val Lys Arg

290 295 300

Leu Lys Glu Glu Arg Thr Pro Gly Gly Glu Leu Gln Phe Gln Thr Glu

305 310 315 320

Val Glu Met Ile Ser Met Ala Val His Arg Asn Leu Leu Arg Leu Arg

325 330 335

Gly Phe Cys Met Thr Pro Thr Glu Arg Leu Leu Val Tyr Pro Tyr Met

340 345 350

Ala Asn Gly Ser Val Ala Ser Cys Leu Arg Glu Arg Pro Pro His Gln

355 360 365

Leu Pro Leu Asp Trp Pro Thr Arg Lys Arg Ile Ala Leu Gly Ser Ala

370 375 380

Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Asp His Cys Asp Pro Lys Ile Ile His

385 390 395 400

Arg Asp Val Lys Ala Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Glu Phe Glu Ala

405 410 415

Val Val Gly Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Met Asp Tyr Lys Asp Thr

420 425 430

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435 440 445

Tyr Leu Ser Thr Gly Lys Ser Ser Glu Lys Thr Asp Val Phe Gly Tyr

450 455 460

Gly Ile Met Leu Leu Glu Leu Ile Thr Gly Gln Arg Ala Phe Asp Leu

465 470 475 480

Ala Arg Leu Ala Asn Asp Asp Asp Val Met Leu Leu Asp Trp Val Lys

485 490 495

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595

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CsUBIQUITIN10启动子核酸序列

<400> 11

ccgtgaaaac ttaacacagt acacaatatt tttgagcccc atagtaaaaa aataaaaaag 60

ttaaaaattt gagtatgtgg cgtaaaaatt ccatatatat ggaatatgga agatatatag 120

aagggataat tacaccacat cgtgaaattt cttagttttt tactttcata ctgtggggcg 180

gaattttttt caaaaatact gtgtgagttt tatactggtt aagttttcac tgttgttcta 240

cggttgtttt tagttgttcc actgttattt ttagttgttc tgttttgtat tctattttgt 300

attctattgt tgttttataa aaatatagta ttttttaaaa aatttccggg tgacagtatt 360

tttataaatt ttcttatata aaactaaacc taataacgag gcccagccca gtaacacttc 420

taaatctcaa aatgggtcaa aaatgtttta actagaagcc caagcccatt aaacaggcaa 480

tgaatgacgt cattaccgta ggaattggtg gtcttggaaa ggccaactcg acaaaactaa 540

tattccaaac tttgcgtgta agcggagcgt aagacacgtc atcctttata cgtggcctaa 600

tataattggt aaccctagtc aagtgggttt ggtttggcct gaccaagtcg gtttaggatt 660

tatccatttc cttctttttt aaaaaaagaa atatcagaga aagtcggtca agttgattta 720

taaattgcct cttacccttc atctttcatc 750

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 12

gccgcttggg tggagaggct at 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 13

gaggaagcgg tcagcccatt c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 14

cgagcgattt ggtcatgtga ag 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 15

cattgtttgc ctccctgctg cggtt 25

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 16

atgagtatta ttactaatga tagtaatctc ag 32

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 17

ttattccatg ccgaatattg gtgtt 25

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 18

tggaaggtga tgccttgcat agtc 24

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 19

ttacctcgga ccagataact cgacc 25