通过有效的成肌细胞介导的向肌细胞的基因转殖突破基因转移的瓶颈

摘要

最近的一项重要的研究突破是人们发现骨骼肌纤维可以用于作为重组蛋白的生物工厂，在骨骼肌局部或者全身产生并分泌出功能蛋白，从而治疗肌肉组织局部的或系统疾病。在这方面的多年研究积累的结果对于基因转移和对有治疗意义的蛋白的产生提过了新的途径。骨骼肌本身具有的以下优点使其可以作为基因治疗策略的理想靶器官：首先，骨骼肌可以看作是全身最大的分泌器官，而且针对骨骼肌的操作相对比较容易：第二，骨骼肌丰富的血液供应使其成为一个高效率的运输系统，将分泌出的蛋白带入血循环；第三，肌纤维已终止分化并长期存活，从而为重组的转基因产物的长期表达提供稳定的环境。即使肌纤维受到损伤，也只是单个受损纤维的局部降解，未累及部分的肌核不受影响；最后，存在于肌纤维间的卫星细胞使得肌纤维有极大的再生潜能。这些在正常肌肉中处于休眠状态的卫星细胞会被肌肉损伤激活，活化的细胞开始分裂，迁移，并彼此融合形成新的肌管取代受损纤维，从而使受损部位再生修复。而且，卫星细胞还可以从肌纤维中分离出来原代培养，并保持其分化成肌纤维的能力。 骨骼肌的这些优势使其成为基因转移的理想靶器官，在基因治疗中有很大的应用潜力。尽管人们付出了很多努力，但基因转移的低效率融合始终是个障碍。 向宿主细胞转移目的基因的载体有很多种，脂质体的优点是无毒性，但不能通过细胞膜，向宿主细胞转移目的基因的载体有很多种，脂质体的优点是无毒性，但不能通过细胞膜，因此转移基因只有瞬时少量的表达。逆转录病毒载体可以整合到宿主DNA中，而且也没有毒性，但这种整合随机的，因此有可能造成基因突变或细胞死亡。尽管腺病毒和腺病毒相关病毒可以有效地被细胞吞入而不整合到宿主DNA中，因此不会造成突变，但它们只能携带能力限制在5kb以内。成肌细胞是体内唯一可以大量分裂，迁移，并融合成肌管的细胞，一旦与宿主细胞融合，所有的正常以及其携带的目的基因就成为原本多核的肌纤维的一部分，因此可以影响宿主细胞进行基因修复。作为内源性细胞，成肌细胞不会产生病毒载体的副作用，并在自体移植的情况下没有免疫排斥反应。 由于融合率低使基因转移的效率不高，目前对于成肌细胞作为载体向肌纤维中进行基因转移的研究以及临床测试(如杜兴肌营养不良症)中的结果并不理想。但是如果能解决目前转移效率低的问题，显著提高供体成肌细胞与宿主细胞的融合率，成肌细胞介导的基因转移在治疗原发性肌肉疾病和一些系统性疾病中将具有很好的前景。 有研究结果显示，在肌肉匀浆提取物中含有促进卫星细胞活化分裂的物质。初步结果提示，经碾压的肌肉纤维提取物中的可以促进卫星细胞分裂原的含量是未经碾压的两倍以上，说明有某些本身就存在于细胞内的肌源性特异性融合因子(MSF)从碾压造成的损伤部位释放了出来，刺激肌纤维间卫星细胞的活化，迁移，以及与肌纤维的融合。基于以上结果，我们假设由于损伤部位会释放出特异性融合因子，这些因子可能会促进成肌细胞的活化增殖以及与宿主细胞的融合。我们用BMP-4作为标识基因，一旦BMP-4作为靶基因成功整合到肌源性细胞系中，细胞就会表达骨形成相关的蛋白，并向骨系分化，从而可以作为供体细胞与宿主细胞成功融合的简单有效的指标。 本研究以BMP-4为标识基因，致力于肌肉匀浆组织提取物(CME)对提高成肌细胞介导的基因转移的融合效率的研究，从而突破目前阻碍成肌细胞介导的基因治疗发展的主要瓶颈。此方法的成功应用可以改善目前对于遗传及获得性疾病无法达到有效治疗的状况。 10以包含体形式存在于E.Coli中的BMP-4的蛋白重组及一步法提纯—应用温度诱导的表达系统，在E.Coli中产生以包含体存在的重组人BMP-4蛋白(rhBMP-4)。包含体经洗涤和溶解后，应用一种简单稀释方法使rhBMP-4经过重组，二聚体化，产量为100mg/l。应用基于亲和柱层析的一步法纯化分离rhBMP-4二聚体，在C2C12细胞培养中检测纯化得到的rhBMP-4二聚体的活性。结果显示，培养的成肌细胞在纯化的rhBMP-4的作用下，不论在增殖或者分化阶段，都不会形成肌管，也不表达肌球蛋白重链(MHC)。相反，可以见到骨样的结构，并能检测到碱性磷酸酶(ALP)活性，骨钙素(OC)含量也有显著提高。可以推断，应用温度诱导的表达载体以及高细胞密度培养程序，跟以rhBMP-4复性重构和亲和柱层析一步法纯化，可以获得高产量rhBMP-4。功能测试显示ALP活性及OC产量的显著提高，说明了rhBMP-4的生物活性。 BMP-4诱导的成肌细胞的细胞周期定向的改变—具有生物活性的rhBMP-4可以诱导异位骨形成，因此，为了进一步确定rhBMP-4的活性，应用C2C12成肌细胞培养系统检测含有rhBMP-4的培养液对C2C12增殖分化的作用，并检测将BMP-4基因转移到C2C12成肌细胞中是否会引起己分化的细胞周期由成肌细胞向骨母细胞转化。rhBMP-4制备及纯化见第一部分。通过在C2C12培养液中加入BMP-4以及将BMP-4基因转移至C2C12细胞内，研究BMP-4改变细胞周期定向分化的作用。结果显示，培养液中含有rhBMP-4的成肌细胞，不论在增殖或是分化阶段，都不形成肌管，也未见MHC的表达，相反，可见细胞形成骨样形态，并有ALP活性和OC含量的显著增高。含有pCI-neo质粒或不含pCI-neo质粒的C2C12细胞都没有BMP-4的表达，细胞呈现典型的星形形态，没有ALP活性增高或OC含量增高。当处于分化阶段的时候，细胞彼此融合，形成典型的细长，多核的肌管结构。而转染有pCI/BMP-4的C2C12细胞在其增殖和分化过程中都表达大量的BMP-4，不形成肌管形态，而可以观察到骨母细胞样形态。经过rhBMP-4处理并向骨系分化的C2C12细胞，当培养液中不再含有BMP-4的时候，可以恢复变回成原来的成母细胞形态，同时ALP活性下降，OC含量11降低。而经pCI/BMP-4转染的C2C12细胞在更新培养液后也不会恢复成原来的形态。可以推断，包含体中重组的BMP-4有很好的生物活性，而且，将BMP-4基因转染到C2C12中去可以改变已分化的成肌细胞的细胞周期定向，并且是可以长期存在的。作用在细胞外的培养液中的rhBMP-4也可以改变成肌细胞的周期定向，但这种改变在外来作用消失后就不再持续。BMP-4作为标识基因，在所标识细胞的定向分化发生改变时，可以提供显著并容易检测到的指标。 在肌源性特异融合因子作用下的成肌细胞介导的肌细胞的基因转移效率的有效提高—基因治疗的最大挑战就是如何有效地将治疗基因转移至足够数量的宿主细胞并有效表达，所产生的多肽经过适当重组，分泌出细胞或者必要时进入血循环，从而达到临床治疗效果。我们将肌肉匀浆提取物部分分离纯化，得到可能含有肌源性特异性融合因子(MSF)的组分，这个组分可以显著提高带有目的基因的成肌细胞与完整的宿主肌纤维的融合，因此，供体的成肌细胞的核或者带有目的基因的构件可以融合到杂交的肌纤维中。这种融合一旦完成，被引入的核或者带有目的基因的构件可以参与杂交细胞的生物过程，表达目的蛋白。转染有pCI/BMP-4的C2C12成肌细胞作为基因转移的载体，应用BrdU标记来追踪pCI/BMP-4供体成肌细胞，抗BMP-4抗体的免疫染色用来说明被转入的BMP-4基因通过宿主细胞的生物过程合成，检测ALP活性及OC产量可以说明杂交细胞产生出的BMP-4经过了适当的重组，并经应有的修饰，正确的分泌出细胞外因而具有生物活性。结果显示，在MSF的作用下，宿主杂交细胞中可见大量BrdU阳性的核，而且可见BMP-4的大量表达。而在用BSA代替MSF的对照组，只见到少数BrdU核阳性。而且，在有MSF作用的杂交肌纤维中的ALP活性和OC产量的提高，说明所表达的外源基因经过正确的重组，修饰，分泌到细胞外。可以推断，MSF的作用可以极大提高成肌细胞介导的基因转殖的效率，从而突破了目前利用正常或带有目的基因的成肌细胞基因转移在治疗遗传性肌肉和系统疾病的实际操作中存在的主要障碍。*