miR-34a-5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用

摘要

本发明公开了miR‑34a‑5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明首次研究发现miR‑34a‑5p参与镉诱导的神经细胞损伤，在CdCl2处理的PC12细胞中miR‑34a‑5p表达上调，敲除或抑制PC12细胞中miR‑34a‑5p的表达，可显著减轻CdCl2诱导的PC12细胞的形态损伤。由此，以miR‑34a‑5p作为分子干预靶点，设计或筛选具有下调miR‑34a‑5p表达作用的药物，为镉中毒带来的神经损害提供了新的治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-34a-5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用。

背景技术

镉(Cd)对人体来说是一种非必需且有毒的元素，且因其生物半衰期长，具有较强的生物效应，可通过直接接触或通过食物链积聚在人体体内，对健康影响较大，特别是对神经的毒性作用。因Cd可引起中枢神经系统的形态变化和功能异常，会导致记忆力减退和智力发育迟缓等，可诱发阿尔茨海默症、帕金森等神经系统疾病。因此，重金属镉污染是个严重危害健康的环境问题，镉中毒带来的神经损害备受重视。

微小RNA分子(micro RNA，miRNA)是非编码的RNA分子，大小长约20-25个核苷酸，对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。目前已从线虫、果蝇、小鼠和人的细胞中分离发现了上千种miRNAs，然而，与新miRNA的频频发现相比，miRNA的功能研究相对缓慢。虽然生物信息学的方法预测了一系列miRNAs与靶基因的作用，但是能给出直接证据证明miRNA的靶基因及其功能的miRNA却很少。因此，如何确定miRNA的功能已成为该领域中最艰巨和迫切的任务之一。

miR-34a-5p属于miR-34家族，现有研究表明：miR-34a-5p广泛参与前列腺癌、骨肉瘤等多种肿瘤的化疗耐药，以及在卵巢癌细胞中表达抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。但在镉诱导的神经损伤方面的作用还未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供miR-34a-5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用。本发明研究发现，CdCl

基于上述研究，本发明提出如下技术方案：

本发明的第一方面，提供miR-34a-5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用。

优选的，所述miR-34a-5p的核苷酸序列为5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′；(SEQID NO.1)。

优选的，所述药物以miR-34a-5p作为靶点，沉默或下调miR-34a-5p的表达，减轻镉诱导的神经细胞损伤。

本发明的第二方面，提供miR-34a-5p抑制剂在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用。

优选的，所述miR-34a-5p抑制剂选自miR-34a-5p的反义核酸、含有miR-34a-5p反义核酸的表达载体或下调miR-34a-5p表达的物质。

优选的，所述miR-34a-5p抑制剂通过下调p-tau蛋白表达、并上调NEP蛋白表达来治疗镉诱导的神经损伤。

优选的，所述镉诱导神经损伤为CdCl

本发明的第三方面，提供一种治疗镉诱导神经损伤的药物，所述药物以miR-34a-5p抑制剂为活性成分。

优选的，所述miR-34a-5p抑制剂选自miR-34a-5p的反义核酸、含有miR-34a-5p反义核酸的表达载体或下调miR-34a-5p表达的物质。

本发明的有益效果：

本发明首次研究发现miR-34a-5p参与镉诱导的神经细胞损伤，在CdCl

附图说明：

图1：A为不同浓度CdCl

图2：不同浓度CdCl

图3：A为不同抑制剂处理对神经细胞中miR-34a-5p表达量的影响；B为不同处理组的神经细胞的存活率；C为不同处理组的结晶紫染色结果；D和E为不同处理组的蛋白质印迹分析结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前miRNA的功能研究相对缓慢，如何确定miRNA的功能已成为该领域中最艰巨和迫切的任务之一。miR-34a-5p虽然已报道具有多方面的应用，但其在镉诱导的神经损伤方面的作用仍是目前研究的空白。

基于此，本发明对miRNA在镉诱导的神经损伤方面的作用进行了深入研究。镉是具有很强毒性的重金属，一些以神经元和神经胶质细胞为模型的体外研究表明，μM级的镉就具有神经毒性。关于Cd的神经损伤机制，相关研究主要认为：Cd通过打破细胞内钙稳态、诱导细胞凋亡、干扰相关信号通路、诱导氧化应激损伤、与金属硫蛋白结合蓄积体内等途径导致神经损伤。

本发明以PC12细胞作为神经细胞模型，采用不同浓度的CdCl

为进一步验证miR-34a-5p在CdCl

综上，本发明通过试验研究证实，miR-34a-5p参与了CdCl

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

1.试验材料：

PC12细胞购买自Tongpai Biological Technology Company(Shanghai,China)；CdCl

miR-34a-5p的模拟物和抑制剂由GenePharma设计和合成(中国上海)；其中：

miR-34a-5p抑制剂的序列：ACAACCAGCUAAGACACUGCCA；(SEQ ID NO.2)

miR-34a-5p模拟物的序列：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU；(SEQ ID NO.3)

inhibitor NC的序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。(SEQ ID NO.4)

2.试验方法：

2.1细胞培养：

将PC12细胞在RPMI-1640培养基中于37℃培养，并补充10％的胎牛血清(FBS)和1％的青霉素(100U/mL)-链霉素(100μg/mL)混合物。

2.2 CdCl

将培养后的PC12细胞以1×10

通过MTT实验检测上述不同处理的细胞存活率。

2.3细胞形态观察、蛋白质印迹分析和miR-34a-5p的表达量分析：

将培养后的PC12细胞分成三组，分别用0、2μM和4μM的CdCl

2.3.1结晶紫染色：

处理后，除去上清液，并将细胞用PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛固定15分钟，并用0.5％结晶紫(Beyotime)染色10分钟。在显微镜下(Nikon Instruments，东京，日本)观察细胞形态。

2.3.2蛋白质印迹分析：

用镉处理细胞24小时，然后在添加了蛋白酶抑制剂PMSF的冰冷缓冲液中裂解(江苏省Beyotime生物技术研究所，中国)。并使用BCA方法测量蛋白质浓度。使用的主要抗体是：(p-tau，Ser202)，NEP(Servicbio，GB111120，1/500)，β-actin(Abcam，ab179467，1/5000)。

2.3.3PCR实验检测miR-34a-5p的表达量：

根据miR-34a-5p的序列设计并合成正、反向引物序列，具体如下：

正向序列：TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT；(SEQ ID NO.5)

反向序列：GCGAGCACAGAATTAATACGAC。(SEQ ID NO.6)

选择U6为内参。

用TRIzol裂解组织后，氯仿、异丙醇萃取后离心，70％乙醇漂洗2次，20min室温挥发，加入DEPC水后提取总RNA，测定RNA浓度。按照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA。按照各组cDNA加1μL+DEPC水3.2Ul+前后引物各0.4μL+TB Green 5μL＝10μL体系加样，复孔3个，热循环进行RCR反应。条件如下：95℃初始变性30s，40个循环(95℃下5s，60℃下30s)，融解阶段(95℃下15s，60℃下30s，95℃下15s)，置于罗氏PCR仪上检测。以上实验重复三次，选择U6为内参，按照2

U6-F：CTCGCTTCGGCAGCAGCACA；(SEQ ID NO.7)

U6-R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。(SEQ ID NO.8)

建议补充：PCR反应的体系组成、PCR反应程序。

2.4抑制miR-34a-5p的表达对CdCl

将培养后的PC12细胞分成四组，分别为：CK组、Inhibitor NC组、CdCl

3.试验结果：

3.1不同浓度CdCl

如图1A所示，CdCl

根据MTT实验的结果，选择CdCl

3.2细胞形态观察、蛋白质印迹分析和miR-34a-5p的表达量分析结果：

结晶紫染色表明CdCl

如图2所示，CdCl2处理后的PC12细胞中miR-34a-5p表达的上调，并且由4μM CdCl

3.3敲除miR-34a-5p可减轻CdCl

为了探索miR-34a-5p在CdCl

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> miR-34a-5p在制备治疗镉诱导神经损伤的药物中的应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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