间充质干细胞和神经病变治疗剂

摘要

本发明的目的在于提供神经病变的新型治疗剂。用于解决上述课题的本发明为间充质干细胞，其特征在于，HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上为高表达。

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞和神经病变治疗剂。

背景技术

随着老龄化社会的发展，作为大脑的神经细胞的障碍的神经退行性疾病持续逐年增加。作为神经退行性疾病，可列举出阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓小脑变性等。阿尔茨海默氏病中，大脑皮层、海马等部位的神经细胞脱落，记忆力减退。另外，帕金森氏病中，位于被称为黒质的部位的神经细胞脱落，运动功能出现障碍。进而，作为由大脑的神经细胞障碍所引起的疾病，除了神经退行性疾病之外已知有脑中风所致的脑梗塞、脑出血。

另外，围产期的新生儿脑损伤以每出生1000人中有1～2人的频率发病，成为终生性大脑麻痹的原因。成为这样的大脑麻痹的原因的围产期脑损伤有缺血缺氧性脑病、脑出血、脑室周围白质软化病等，它们的主要病状是由线粒体功能障碍所产生的活性氧的上升、巨噬细胞的活化及与其相伴的高细胞因子血症之类的炎症病状。上述的神经退行性疾病、脑中风，大脑麻痹的疾病的原因和症状不同，但可以说共通之处在于神经细胞数量减少这一点。

阿尔茨海默氏病使用了多奈哌齐、帕金森氏病使用了左旋多巴等治疗药，这些治疗药旨在通过补充化学递质信号来恢复由神经细胞减少导致的神经网络的信息处理功能，无法抑制神经细胞减少本身。另外，针对神经退行性疾病、脑中风的现有的治疗药中，没有显示出保护神经细胞作用的物质。因此期望开发出具有保护神经细胞的作用的新型治疗药。

间充质干细胞是1982年由Friedenstein首次从骨髓分离的具有多分化能力的祖细胞(参照非专利文献1)。已经明确的是间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新型治疗方法(参照专利文献1～2)。最近，已知存在具有与脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等基质细胞同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-157263号公报

专利文献2：日本特表2012-508733号公报

非专利文献

非专利文献1：Pittenger F.M.et al.Science,(1999),284,pp.143-147

发明内容

本发明的目的在于，在上述那样的情况下，提供神经病变的新型治疗剂。

为了解决上述课题而进行了深入研究，结果本发明人等发现：HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上高表达的间充质干细胞(mesenchymal stem(stromal)cell；MSC)对于神经病变的治疗是有效的，从而完成了本发明。根据本发明，可以提供用于治疗神经病变有效的治疗剂。即本发明的主旨如下所述。

即，本发明涉及下述内容：

[1]一种间充质干细胞，其特征在于，HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上为高表达。

[2]根据[1]所述的间充质干细胞，其为异体来源。

[3]根据[1]或[2]所述的间充质干细胞，其为脐带组织或脂肪组织来源。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的间充质干细胞，其利用悬浮培养法而制备。

[5]一种神经病变治疗剂，其含有[1]～[4]中任一项所述的间充质干细胞。

根据本发明，可以提供神经病变的新型治疗剂。

附图说明

图1是示出对利用各种培养基进行的培养中得到的间充质干细胞中的、各种因子的mRNA表达量进行比较的结果的图。

图2是示出对间充质干细胞的平面培养细胞(ADH)和悬浮培养细胞(SUS)中的各种因子的mRNA表达量进行比较的结果的图。

图3是示出利用各种培养法的培养中得到的间充质干细胞的、向大鼠短暂性脑缺血模型给药的给药效果的图(体重)。

图4是示出利用各种培养法的培养中得到的间充质干细胞的、向大鼠短暂性脑缺血模型给药的给药效果的图(神经症状评分)。

图5是示出利用各种培养法的培养中得到的间充质干细胞的、向大鼠短暂性脑缺血模型给药的给药效果的图(台阶次数)。

图6是示出利用各种培养法的培养中得到的间充质干细胞的、向大鼠短暂性脑缺血模型给药的给药效果的图(胶带剥离试验)。

图7是示出神经细胞与间充质干细胞的细胞之间相互作用的状态的定时自动间隔拍摄(Time Lapse)图像。

图8是示出利用无血清培养基(Rohto公司)的培养中得到的间充质干细胞的神经细胞死抑制效果的图。

图9是示出利用无血清培养基(Rohto公司)的培养中得到的间充质干细胞的用量依赖性神经细胞活化效果的图。

图10是示出使用无血清培养基(Rohto公司)进行平面(ADH)或悬浮(SUS)培养而得到的间充质干细胞的神经细胞活化效果的图(与成纤维细胞的比较)。

图11是示出利用无血清培养基(Rohto公司)的培养中得到的间充质干细胞的神经细胞活化效果的图(与在其它培养基中培养的细胞的比较)。

图12是示出利用无血清培养基(Rohto公司)的培养中得到的间充质干细胞的神经细胞死抑制效果的细胞照片(与在其它培养基中培养的细胞的比较)。

图13是示出利用无血清培养基(Rohto公司)的培养中得到的间充质干细胞的神经细胞死抑制效果的图(与在其它培养基中培养的细胞的比较)。

具体实施方式

以下对本发明的间充质干细胞、神经病变治疗剂进行详细地说明。

[间充质干细胞]

本发明的间充质干细胞的特征在于，肝细胞生长因子(HGF：hepatocyte growthfactor)、音猬因子(SHH：sonic hedgehog)、少突胶质细胞转录因子2(OLIG2：oligodendrocyte transcription factor 2)、血管内皮生长因子A(VEGFA：vascularendothelial growth factor A)、神经原质蛋白1(NEUROG1：neurogenin 1)、胃泌素释放肽受体(GRPR：gastrin releasing peptide receptor)、白细胞介素-1受体1(IL1R1：interleukin-1receptor 1)、促肾上腺皮质激素释放素受体2(CRHR2：corticotropinreleasing hormone receptor 2)、缩胆囊素A受体(CCKAR：cholecystokinin Areceptor)、脱脂载脂蛋白E(APOE：apolipoprotein E)、配对框3(PAX3：paired box 3)、配对框5(PAX5：paired box 5)、表皮生长因子(EGF：epidermal growth factor)、C-X-C基序趋化因子配体1(CXCL1：C-X-C motif chemokine ligand 1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF：glial cell derived neurotrophic factor)、神经元细胞黏附分子(NRCAM：neuronal cell adhesion molecule)、Delta样标准Notch配体1(DLL1：delta likecanonical Notch ligand 1)、带有YRPW基序样的hes相关家族bHLH转录因子(HEYL：hesrelated family bHLH transcription factor with YRPW motif-like)、骨形态发生蛋白2(BMP2：bone morphogenetic protein 2)、导蛋白1(NTN1：netrin 1)、缺刚毛-胸部刚毛家族bHLH转录因子1(ASCL1：achaete-scute family bHLH transcription factor 1)、神经毡蛋白2(NRP2：neuropilin 2)中的任一者或两者以上为高表达。

已知HGF是一种生长因子，具有神经保护作用。已知SHH是属于刺猬(Hedgehog)家族的基因，参与针对氧化应激的神经细胞的保护。已知VEGFA是一种生长因子，通过诱导血管新生来参与神经细胞的保护。已知IL1R1是作为炎症性细胞因子之一的IL1的受体，参与炎症反应。已知DLL1属于作为Notch配体的DSL家族，参与Notch信号的调节。

需要说明的是，上述HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2为高表达包括：各自的mRNA表达为高表达、或各自的蛋白质为高表达、或者该两者为高表达。

另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比只要高表达上述因子即可，具体而言，本发明的间充质干细胞与在现有的培养条件下(例如，利用含有10％FBS的MEM-α培养基的培养)得到的间充质干细胞相比只要高表达上述因子即可。优选与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比表达2倍以上，更优选表达5倍以上，进一步优选表达10倍以上，特别优选表达100倍以上。

本发明的间充质干细胞与成纤维细胞相比，高表达HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上即可。优选相对与皮肤成纤维细胞表达2倍以上，更优选表达5倍以上、进一步优选表达10倍以上、特别优选表达100倍以上。

本发明中间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质类的一种以上细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的分化能力，并在维持该能力的状态下能够增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，还有时简记为间充质类细胞。作为包含间充质干细胞的组织，例如可列举出：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源基质干细胞。其中，从对神经病变疾病的治疗有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞，最优选脐带来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种类，可列举出：人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞。优选为异体细胞。

由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞，作为本发明的疾病治疗剂中的间充质干细胞。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，商品化容易且容易稳定地得到一定效果，从这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。

本发明中间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％以上为间充质干细胞。

本发明中脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的疾病治疗剂的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的疾病治疗剂对人给药，更优选为人的脐带。

本发明中脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪外科切除或吸取哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得、考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。

本发明中骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。

本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％以上为所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞除了高表达HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上之外，例如还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中公知的其它方法等而赋予特征。

(间充质干细胞的制备方法)

HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上为高表达的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下方式进行制备。即，本领域技术人员可以依据公知的方法从脂肪、脐带、骨髓等组织中分离间充质干细胞并进行培养，使用与HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2特异性结合的抗体，利用细胞分选仪、磁珠等将HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达细胞分离而获得。另外，通过使用了特定的培养基的培养，诱导间充质干细胞中的HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2的表达，从而还能够获得HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达的间充质干细胞。在通过该诱导而得到的细胞群中，优选细胞群的50％以上为HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达，更优选70％以上为HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达，进一步优选80％以上高表达HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2，特别优选90％以上高表达HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2，最优选实质上为HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2的高表达的均匀的细胞群。以下对HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达的间充质干细胞的制备方法进行具体地说明。

间充质干细胞可以通过本领域技术人员利用公知的方法来制备。以下作为一个例子对脐带组织来源间充质干细胞和脂肪组织来源间充质干细胞的制备方法进行说明。

脐带可以通过从包括以经阴道分娩和通过剖腹而分娩出的胎盘和脐带在内的产褥组织中适宜地去除回收胎盘。由所回收的脐带去除脐带血后，可以进行无菌或抗菌处理。脐带血的去除可通过用含有肝素的溶液等抗凝固溶液冲洗来进行。无菌或抗菌处理没有特别限定，可以浸渍在涂布了聚维酮碘或添加了青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素等中的1种以上的抗生剂和/或抗真菌剂的培养基或缓冲液中。另外，根据需要，还可以包括选择性地溶解红细胞的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，例如可以使用基于通过氯化铵的溶解的在高渗培养基或低渗培养基中的孵育等本技术领域中公知的方法。

本发明的脐带来源细胞是指将脐带作为原材料而制得的细胞群，可以利用公知的制造方法而得到，例如可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法制造：

(i)切断脐带的工序；

(ii)培养(i)的工序中得到的脐带的工序；以及

(iii)进行传代的工序。

另外，作为其它该细胞的制备方法，代替(i)切断脐带的工序，还可以包括(i')通过对脐带进行酶处理来分离组织的工序。进而，除了(i)切断脐带的工序之外，还可以包括(i')通过对脐带进行酶处理来分离组织的工序。

本发明的(i)切断脐带的工序中，可以通过将利用上述的方法获得的脐带在包含羊膜、血管、血管周围组织和华顿氏胶的状态下利用机械力(切碎力或剪切力)进行切断来进行。没有特别限定，通过切断而得到的脐带切片可示例出1至10mm

本发明的(ii)，培养(i)的工序中得到的脐带的工序为，在固体表面上使用适合的细胞培养基，在适合的细胞密度和培养条件下培养(i)的工序中得到的脐带。

本工序中使用的培养基，只要是能培养间充质干细胞的培养基，没有特别限定，这样的培养基可以通过在基础培养基中添加血清和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的一种以上的血清替代物来制作。这些培养基中还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素类、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，例如可列举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需(Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM))培养基、MEM-α培养基、达尔伯克改良伊格尔(Dilbeco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM))培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、MCDB201培养基以及它们的混合培养基等。

作为上述血清，例如可列举出人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以在基础培养基中添加5v/v％至15v/v％，优选添加10v/v％。

作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出：透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脐带来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。这样的培养基例如以由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司和Rohto公司等以作为间充质干细胞(基质细胞)用预先制备的培养基的形式提供。

本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终保持与固体表面结合/粘附状态的细胞作为脐带组织来源间充质干细胞的细胞群。

本发明的脐带组织来源间充质干细胞可以利用悬浮培养制造法来制造。作为悬浮培养制造法，有如下方法：使细胞凝聚而作为球体上的细胞团块进行搅拌培养的方法；使细胞粘附于微载体上并搅拌微载体由此进行培养的方法等。需要说明的是，搅拌有如下方法：用搅拌器旋转容器内的搅拌叶片的方法；将装有培养液和细胞的袋子放在摇床上使整个袋子摇动，由此使培养液悬浮的方法等。另外，悬浮培养制造法中使用的培养基，只要是能培养间充质干细胞的培养基，没有特别限定，可示例出上述那样的培养基。作为微载体，只要能在悬浮培养中使用，没有特别限定，可示例出聚酯、聚苯乙烯、玻璃、葡聚糖等。

脂肪组织来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：

(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及

(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。

工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(PBS))，并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。这是为了从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为残骸(debris)，例如损伤组织、血液、红细胞等)。如此，重复进行清洗和沉淀，一般直至从上清液中整体上去除了残骸。残留的细胞以各种尺寸的块的形式存在，为了将细胞本身的损伤抑制在最小限度的同时使其解离，而优选用使细胞间结合变弱或破坏细胞间结合的酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞团块进行处理。这样的酶的量和处理时间基于所使用的条件而变化，这在本技术领域中是已知的。作为这样的酶处理的替代或与之组合，可利用机械搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞团块分解，但为了将细胞的损伤抑制在最小限度而优选仅通过酶处理进行。使用酶时，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，期望的是在经过合适的期间后使用培养基等使酶失活。

通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。接着，还可以分离、去除聚集状态的细胞和它们的夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘附和清洗来去除，因此可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞时，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将包含得到的夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的由粘附于固体表面进行的选择而被排除，因此未必一定需要溶解的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法例如通过用氯化铵溶解在高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级，从所需的细胞中分离溶解物。

工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，还可以进行1次或连续多次清洗、离心分离，并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标记物图谱或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。

再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基，没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清、和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，例如可列举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需(Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM))培养基、MEM-α培养基、达尔伯克改良伊格尔(DMEM))培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、MCDB201培养基和它们的混合培养基等。

作为上述血清，例如可列举出：人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以相对于基础培养基添加5v/v％至15v/v％，优选添加10v/v％。

作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脂肪来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。这样的培养基例如以由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&DSystems公司、Corning公司和Rohto公司等作为间充质干细胞(基质细胞)用预先制备的培养基的形式提供。

接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终保持与固体表面结合/粘附的状态的细胞作为脂肪组织来源间充质干细胞的细胞群。

对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的间充质干细胞，还可以使用流式细胞仪等利用现有的方法对表面抗原进行解析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。

本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；

(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘附性、

(2)表面抗原、CD73、CD90为阳性，CD45为阴性、和

(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

从通过上述工序而得到的间充质干细胞中，使用细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法，对高表达了HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2蛋白的细胞进行选择性地分离，由此能够获得高表达了HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2蛋白的间充质干细胞。另外通过使用能够诱导HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2的表达的特定的培养基的培养，还能够诱导间充质干细胞中的HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2表达，有效地获得HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1或NRP2高表达的间充质干细胞。作为一个例子，以下对基于使用了细胞分选仪的免疫学方法进行的选择性分离的具体的方法进行说明。

将通过胰蛋白酶/EDTA溶液等对上述制备的间充质干细胞进行处理而得到的细胞悬浮液离心分离(室温、400G、5分钟)并去除上清液。向细胞中加入染色缓冲液(1％BSA-PBS)，制成1×10

(间充质干细胞的冷冻保存)

本发明中的间充质干细胞只要具备疾病治疗效果，就可以是适宜重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：本领域技术人员将间充质干细胞悬浮于公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以根据需要通过如下方式进行：利用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。

冷冻保存液作为冷冻保护剂还可以含有二甲基亚砜(DMSO：Dimethylsulfoxide)，但DMSO除了细胞毒性之外还具有分化诱导间充质干细胞的特性，因此优选减少DMSO含量。作为DMSO的替代物，可示例出：甘油、丙二醇或多糖类。使用DMSO时，含有5％～20％浓度，优选含有5％～10％浓度，更优选含有10％浓度。此外还可以包含WO2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由Bioverde Inc.、NIPPONGenetics Co.,Ltd.、REPROCELL Inc.、ZENOAQ公司、Cosmo Bio Co.,Ltd.、Kohjin BioCo.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific Inc.等提供的冷冻保存液。

冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-100℃～-80℃之间的温度(例如，-80℃)下冷冻为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。没有特别限定，为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者指示来进行。

保存期间只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质，没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。通过在更低的温度下保存而能够抑制细胞毒性，因此还可以移至液氮上的气相(从-180℃以上至约-150℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。没有特别限定，例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。

融解的间充质干细胞在下次冷冻保存前，可以适宜进行培养。间充质干细胞的培养使用能培养上述的间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，还可以在30～40℃，优选为在约37℃的培养温度下、在含有CO

经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如可示例出通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。

本发明的间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中被冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小部分进行冷冻保存后的细胞时，在稳定地得到同样的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并悬浮于冷冻保存液的状态下输液或直接混合于培养基等溶液中。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后悬浮于输液或培养基等溶液中。此处，本发明中的“输液”是指：对人进行治疗时所使用的溶液，没有特别限定，溶液例如可列举出：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格溶液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补充剂)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。

[神经病变治疗剂]

本发明的神经病变治疗剂含有上述的本发明的高表达HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE、PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2中的任一者或两者以上的间充质干细胞。根据本发明的神经病变治疗剂，能够有效地保护神经病变。对于包含本发明的神经病变治疗剂的间充质干细胞，可以适用上述间充质干细胞项目的说明。

本发明的神经病变治疗剂只要在不损害本发明的效果的范围内，除上述间充质干细胞以外，可以根据其用途、形态，按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加物。这作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限定于这些。作为代表性的成分，例如可列举出以下的载体、添加物等。

作为载体，例如可列举出：水、含水乙醇等的水性载体；作为等渗剂(无机盐)，例如可列举出：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等；作为多元醇，例如可列举出：甘油、丙二醇、聚乙二醇等；作为增稠剂，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、藻酸、聚乙烯醇(完全、或部分皂化物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇等；作为糖类，例如可列举出：环糊精、葡萄糖等；作为糖醇类，例如可列举出：木糖醇、山梨醇、甘露糖醇等(它们可以是d构型、l构型或dl构型中的任意者)；作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、烷基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐、苯甲酸钠、乙醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、山梨酸、山梨酸钾、氨丁三醇、脱氢醋酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、羟基喹啉硫酸盐、苯乙醇、苄醇、双胍化合物(具体而言，聚己缩胍盐酸盐(聚六亚甲基双胍盐酸盐)等)、Glokill(Rhodia公司制商品名)等；作为pH调节剂，例如可列举出：盐酸、硼酸、氨基乙基磺酸、ε-氨基己酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、碳酸钠、硼砂、三乙醇胺、单乙醇胺、二异丙醇胺、硫酸、硫酸镁、磷酸、多聚磷酸、丙酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、葡萄糖酸内酯、乙酸铵等；作为稳定化剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、氨丁三醇、甲醛次硫酸氢钠(RONGALIT)、生育酚、焦亚硫酸钠、单乙醇胺、单硬脂酸铝、单硬脂酸甘油酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；作为油性基质，例如可列举出：橄榄油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油等植物油、中链脂肪酸甘油三酯等；作为水性基质，例如可列举出：聚乙二醇400等；作为凝胶基质，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、胶质等；作为表面活性剂，例如可列举出：聚山梨醇酯80、氢化蓖麻油、脂肪酸甘油酯、山梨坦倍半油酸酯等；作为悬浮化剂，例如可列举出：白蜂蜡、各种表面活性剂、阿拉伯胶、阿拉伯胶粉末、黄原胶、大豆磷脂等；作为粘结剂，例如可列举出：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等；作为赋形剂，例如可列举出：蔗糖、乳糖、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等；作为润滑剂，例如可列举出：蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸镁、滑石等；作为崩解剂，例如可列举出：低取代度羟丙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；作为发泡剂，例如可列举出：碳酸氢钠等；作为流动化剂，例如可列举出：偏硅酸铝钠、轻质硅酸酐等。

本发明的神经病变治疗剂根据目的可以以各种形态、例如固体制剂、半固体制剂、液体制剂等各种各样的剂型来提供。例如可以以固体制剂(片剂、粉末、散剂、颗粒剂、胶囊剂等)、半固体制剂[软膏剂(硬软膏剂、软软膏剂等)、霜剂等]、液体制剂[洗剂、萃取剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、注射剂(包括输液剂、嵌入式注射剂、缓释型注射、使用时制备型的注射剂)、透析用剂、气雾剂、软胶囊剂、营养剂等]、贴剂、巴布剂等的形态加以利用。另外，本发明的神经病变治疗剂还可以以油性或水性的赋形剂中的溶液或乳液等的形态加以利用。进而，本发明的神经病变治疗剂还可以通过喷雾来用于患部，本发明的神经病变治疗剂还可以以喷雾后在患部被凝胶化或片化的形态加以利用。本发明的神经病变治疗剂还可以在将上述间充质干细胞制成片状或立体结构体后用于患部。

对于本发明的神经病变治疗剂，可以使用生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补给液)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等输液、或DMEM等细胞培养培养基进行悬浮或稀释来使用，优选用生理盐水、5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)，更优选用5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)进行悬浮或稀释来使用。

本发明的神经病变治疗剂为液体制剂时，神经病变治疗剂的pH只要在药物上、药理学上(制药上)或生理学上可接受的范围内，没有特别限定，作为一个例子，可列举出为2.5～9.0，优选为3.0～8.5，更优选为3.5～8.0的范围。

本发明的神经病变治疗剂为液体制剂时，对于神经病变治疗剂的浸透压，只要在生物体可接受的范围内就没有特别限制。作为本发明的组合物的渗透压比的一个例子，可列举出优选为0.7～5.0，更优选为0.8～3.0，进一步优选为0.9～1.4的范围。渗透压的调节可以使用无机盐、多元醇、糖醇、糖类等，利用该技术领域中已知的方法进行。渗透压比是基于第十五次修订日本药典、试样的渗透压相对于286mOsm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压之比，渗透压参考日本药典中记载的渗透压测定法(冰点下降法)进行测定。需要说明的是，对于渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)，可以如下制备：将氯化钠(日本药典标准试剂)在500～650℃下干燥40～50分钟后，在干燥器(硅胶)中进行自然冷却，准确称量其0.900g，溶解于纯化水中准确地制成100mL，或使用市售的渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)。

本发明的神经病变治疗剂向对象的给药途径可列举出：口服给药、皮下给药、肌肉给药、静脉内给药、动脉内给药、脑室内给药、髄腔内给药、腹腔内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、眼内给药、经鼻给药、吸入、经皮给药、植入物、向脏器表面的喷雾及通过片等的粘贴进行的直接给药等，从发明的神经病变治疗剂的有效性的观点出发，优选为动脉内给药、静脉内给药、脑室内给药和髄腔内给药，从减轻对象者的负担的观点出发，更优选为静脉内给药、肌肉给药、鼻腔内给药，从效果的观点出发，优选脑室内给药和髄腔内给药。

本发明的神经病变治疗剂中，用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的神经病变治疗剂的剂型等而不同，从发挥充分的神经病变治疗剂的治疗效果的观点出发，有优选间充质干细胞的量大的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有优选间充质干细胞的量小的倾向。通常，在对成人给药(喷雾)时，作为细胞数，为1×10

本发明的神经病变治疗剂可以与一种或二种以上的其它药剂一起给药。作为其它药剂，可列举出能用作神经病变的治疗药的任意的药剂，例如可列举出左旋多巴、金刚烷胺、卡比多巴等抗帕金森氏病药；溴麦角环肽、培高利特、罗匹尼罗、普拉克索等多巴胺激动药；丙炔苯丙胺、雷沙吉兰等选择性B型单胺氧化酶抑制剂(MAO-B)；恩他卡朋、托卡朋等儿茶酚-o-甲基转移酶(COMT)抑制剂；苯甲托品、苯海索等抗胆碱药；苯海拉明、邻甲苯海明等抗组胺剂；多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、他克林等胆碱酯酶抑制剂；美金刚等N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂；氟哌啶醇、硫醚嗪、甲哌硫丙硫蒽、奥氮平、利培酮、奎硫平、氯氮平等抗精神病药；心得安等β受体阻滞剂；苯二氮等镇静药；肝素、低分子肝素、华法林等抗凝固剂；卡马西平、加巴喷丁、苯妥英、普瑞巴林、丙戊酸、拉莫三嗪等抗痉挛药；三环系、万拉法新、安非他酮、阿米替林、地昔帕明、帕罗西汀等抗抑郁药；氯压定、替托尼定等中枢性α-2肾上腺素受体激动剂；地塞米松、泼尼松龙等皮质类固醇；金刚烷胺、右美沙芬等NMDA受体拮抗剂；利多卡因、美西律、辣椒素等局部麻醉药；依托度酸、吲哚美辛、舒林酸、甲苯酰吡啶乙酸、纳布美通、吡罗昔康、对乙酰氨基酚、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、酪洛芬、萘普生、萘普生钠、奥沙普秦、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、甲氯芬那酸盐、甲灭酸、苯基丁氮酮、酮咯酸、塞来昔布、可待因、二氢可待因、丙氧芬、芬太尼、二氢吗啡酮、左啡诺、哌替啶、美沙酮、吗啡、氧可酮、羟吗啡酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡、镇痛新等镇痛剂；异丙酚等自由基清除剂；消炎药、血清素、去甲肾上腺素、非甾体抗炎药(NSAID)、银杏叶提取物等。另外，与本发明的神经病变治疗剂的给药一起，还可以与低温疗法、脑低温疗法、脑低体温疗法等低温疗法组合来进行。

本发明的间充质干细胞可以用于各种神经病变，作为具体的疾病，可列举出自主神经病、霍纳氏综合征、多系统萎缩症、单纯性自主神经衰竭等自主神经系统失调、慢性疼痛、神经性疼痛、复杂性区域性疼痛综合征等疼痛、缺血性脑中风，短暂性脑缺血发作、缺氧-缺血、脑内出血/脑室内出血等颅内出血、蛛网膜下出血等脑中风(脑血管意外)、阿尔茨海默氏病、脑血管性痴呆、路易体痴呆、与HIV相关的痴呆、额颞叶痴呆等痴呆、痉挛性综合征、单肢徐动症或异常运动综合症和共济失调综合征等大脑麻痹综合征、低血糖、高钠血症、低钠血症、低镁血症、由先天性代谢缺陷等导致的新生儿痉挛性疾病、多发性硬化症等脱髓鞘病、格林-巴利综合征、遗传性神经病、包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)在内的运动神经元病、重症肌无力、单神经病、多发神经病、神经丛疾病等外周神经系统障碍、急性横贯性脊髓炎、动静脉畸形、脊髓缺血(脊髓缺血损伤)等脊髓损伤、脊髓小脑性共济失调、脊髓小脑变性等小脑疾病、脑肿瘤、脑炎、脑脊膜炎、帕金森氏病等。另外，还可以用于以新生儿为对象的围产期脑损伤、新生儿脑病和大脑麻痹等。这些当中，优选缺血性脑中风，短暂性脑缺血发作、缺氧-缺血、脑内出血/脑室内出血等颅内出血、蛛网膜下出血等脑中风(脑血管意外)、围产期脑损伤、新生儿脑病和大脑麻痹等。

实施例

以下列举实施例和试验例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例等的限定。

[脐带来源间充质干细胞的制备和培养]

利用Cytotherapy、18、229-241、2016所述的方法采集脐带来源细胞。简而言之，在东京大学医学科学研究所伦理委员会的批准下，将经提供者的同意而采集的脐带切成1至2mm

使用胰蛋白酶(TrypLE Select(1X))剥离得到的UCMSC，移至离心管中，以400×g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冷冻管中，在冷冻仪内以-80℃保存。然后，移至液氮上的气相中继续保存。

[mRNA表达]

将UCMSC自P2至P4为止分别在间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基)、PromoCell培养基(在间充质干细胞生长培养基2(PromoCell公司制、C-28009、Lot.435M415)中添加Supplement mix(PromoCell公司制、C-39809、Lot.435M126))和MEM-α培养基(在Thermo Fisher公司制、#12571-063、Lot.18997009中使其成为10％的方式添加血清)中分别进行培养，制作冷冻储存物。在MEM-α培养基中培养成纤维细胞后，制作冷冻储存物。使各自的P4细胞和成纤维细胞(Fibroblast)苏醒，以15000细胞/cm

可知：与MEM-α培养基相比，在无血清培养基中培养的细胞中HGF、SHH、OLIG2、VEGFA、NEUROG1、GRPR、IL1R1、CRHR2、CCKAR、APOE的mRNA表达显著高。另外，与MEM-α培养基中培养的细胞相比，在PromoCell培养基中培养的细胞中VEGFA、NEUROG1、GRPR、CRHR2、CCKAR的mRNA表达量显著高(图1)。

[悬浮培养细胞(SUS)和平面培养细胞(ADH)的制备]

使前述的脐带组织来源冷冻细胞苏醒，接种于细胞培养烧瓶中使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)进行培养。回收培养第4天的细胞，将包含所需细胞数的细胞悬浮液与微载体混合，添加至培养槽中，开始进行搅拌培养。在第3天或第4天分取一部分细胞/微载体悬浮液，加入新的微载体，进行2周的3天或4天的传代培养，得到悬浮培养细胞(以下称为“SUS”)。使前述的脐带组织来源冷冻细胞苏醒，接种在细胞培养烧瓶中并使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)进行培养。3天或4天进行一次传代，总计进行2周培养，得到平面培养细胞(以下称为“ADH”)。

[平面培养细胞(ADH)与悬浮培养细胞(SUS)的比较]

从利用上述方法得到的平面培养细胞(ADH)或悬浮培养细胞(SUS)的冷冻储存物中回收了总RNA。分别使用定量PCR检测了PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2、VEGFA、APOE的mRNA表达。

可知：与平面培养细胞(ADH)相比，悬浮培养细胞(SUS)中PAX3、PAX5、EGF、CXCL1、GDNF、NRCAM、DLL1、HEYL、BMP2、NTN1、ASCL1、NRP2、VEGFA、APOE的mRNA表达量显著高(图2)。

[脂肪来源间充质干细胞的制备]

获得人供体的同意后，用生理盐水清洗利用吸脂法得到的皮下脂肪组织。为了实现细胞外基质的破坏和细胞的分离，添加胶原酶(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟使其分散。接着，将该上述悬浮液以800g进行5分钟离心分离而得到间质血管细胞群的沉淀。在上述细胞的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g进行5分钟离心分离，去除上清液后再悬浮于间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，将细胞接种于烧瓶中。将细胞在37℃下5％CO

[脂肪组织来源间充质干细胞的冷冻保存]

使用胰蛋白酶将得到的ADMSC剥离并移至离心管中，以400×g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冷冻管中，在冷冻仪内以-80℃保存。然后转移至液氮上的气相中继续进行保存。

[使用了大鼠短暂性脑缺血模型(小泉模型)的治疗效果的确认]

阻塞大鼠(Wistar、CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN,INC.)的中大脑动脉(MCA)，在23.3～27.8小时后将ADMSC、ADH和SUS悬浮于汉克平衡盐溶液(HBSS：Hank’sBalanced Salt solution)中，从尾静脉内给药(8×10

在手术前和手术14天后，将大鼠的躯干、后肢和右前肢保持固定并提升，仅使左前肢接触实验台，实施将水平面沿反方向以约5秒移动30cm的台阶测验。记录此时的左前肢的步数。重复进行3次，测定步数的平均值(台阶测验)。另外，参考木全等人的报道(药理和治疗，1991；19：4491-4503)来进行神经症状的观察。

基于由Leong等人报道的测定方法(Leong et al.Stem Cells TranslationalMedicine、2012；1：177-187)进行胶带剥离试验。在右(麻痹侧)前肢的内面贴上15mm

明确了通过给药ADMSC、ADH和SUS而体重的减少程度减轻(图3)。另外，明确了通过给药ADMSC、ADH和SUS而使神经症状评分减少(图4)。明确了通过给药ADMSC、ADH和SUS而使台阶次数上升(图5)。明确了通过给药ADMSC、ADH和SUS而使剥离胶带所需的时间缩短(图6)。

根据以上的结果，显示出针对脑血管损伤后的神经病变的改善效果。

[神经细胞与间充质干细胞的相互作用]

将用Vybrant DiO Cell-labeling solution(Thermo Fisher公司制、#V22886)进行了DiD荧光染色的SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)接种于12孔板中，用包含10％FBS(Thermo Fisher公司制、#10437-028、Lot.1658423)和Pen-Strep的DMEM/F12(Thermo Fisher、#11320-033、Lot.1930023)培养基在37℃、O

UCMSC和SH-SY5Y相互延伸突起，并观察到细胞之间相互作用。

将SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)接种于96孔板中，用包含5％FBS(Thermo Fisher公司制、#10437-028、Lot.1658423)和Pen-Strep的DMEM/F12(Thermo Fisher、#11320-033、Lot.1930023)培养基在37℃、O

证实了：通过在缺氧无糖(OGD：Oxygen and glucose deprivation)条件下进行培养，从而SH-SY5Y细胞的LDH活性上升，而通过与UCMSC进行共培养，使得LDH活性的上升得到抑制，由缺血所致的神经细胞死得到抑制。

将SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)分别以0.038×10

证实了：通过在OGD条件下进行培养，神经细胞的细胞活性显著降低，而通过与MSC进行共培养，能够抑制细胞活性的降低。

将SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)分别以0.038×10

证实了：通过与MSC进行共培养，能够抑制在OGD条件下进行培养所致的神经细胞的细胞活性降低，而通过成纤维细胞(Fibroblast)则不具有该效果，是MSC特异性的效果。

将SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)分别以0.038×10

证实了：通过与MSC进行共培养，能够抑制在OGD条件下进行培养所致的神经细胞的细胞活性降低，而在无血清培养基中培养的MSC中该效果更为显著。

将SH-SY5Y(人来源神经母细胞瘤；ECACC制、Lot.16E028、Acc Nc：94030304)分别以0.038×10

证实了：与细胞无给药组、成纤维细胞组、PromoCell组和MEM-α组相比，无血清组的细胞增殖活性高。另外，证实了：与细胞无给药组、PromoCell组和MEM-α组相比，无血清组中死细胞数相对于全部细胞数少。

根据本发明，可以提供神经病变的新型治疗剂。