外周神经损伤对中枢核团的影响及骨髓间充质干细胞治疗外周神经损伤后中枢逆行性病变的可行性研究

摘要

第一部分、外周神经损伤后中枢核团的逆行性病变
　　 目的：建立大鼠单侧迷走神经离断模型，观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核神经元的变化，包括神经元形态学和数量的变化；观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH)的表达；观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达，以此来观察外周神经损伤后除了神经损伤部位的功能和生化发生改变外，损伤神经的更高位的通路比如脊髓和中枢核团是不是也会发生逆行性的改变，并初步探讨神经递质NO在迷走神经损伤后中枢背核逆行性病变中的意义及炎性细胞因子MCP-1在中枢背核逆行性病变中所起的作用。
　　 方法：
　　 1.选择健康雄性SD大鼠，体重220～280g，10％水合氯醛(0.3ml/kg)，腹腔内注射麻醉，固定大鼠，在颈部分离出左、右迷走神经，离断右侧迷走神经，左侧迷走神经则不做处理，随后缝合切口。对照组大鼠只分离出左、右迷走神经，但均不予切断，随后缝合切口。
　　 2.选择健康雄性SD大鼠，按方法1建立迷走神经离断模型，分别于术后1d、5d、10d做进一步研究，每组3只大鼠，每只大鼠5片切片。用10％水合氯醛深度麻醉大鼠后，即刻打开胸腔，显露心脏，经左心室插入灌注管，快速肝素化，剪开右心耳，快速灌注4℃冰生理盐水150ml，再以40g/L多聚甲醛行心脏灌注，灌注结束后开颅取脑，解剖出脑干，标本收集于40g/L多聚甲醛液中过夜，然后置20％蔗糖多聚甲醛浸泡3.0～4.0h，再置30％蔗糖磷酸缓冲液浸泡沉底，4℃保持12h，随之取出用冰冻组织包埋剂包埋后置于液氮冷冻固定，随后用Leica全自动冷冻切片机切片，片厚20μm，切片放置室温下1h干燥固定后置于-20℃恒温冰箱保存。
　　 3.取右侧迷走神经离断后1d、5d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片，置于甲酚紫染色液(CFV)中行尼氏染色，观察建立模型后不同时间点背核区神经元细胞的组织形态学改变并行神经元计数。
　　 4.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片，行一步法TUNEL，荧光染色，观察建立模型后不同时间点背核区神经元有无凋亡发生。
　　 5.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片，行免疫组织化学染色，观察建立模型后不同时间点背核区iNOS和NADPH的表达变化。
　　 6.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片，行免疫组织化学染色，观察建立模型后不同时间点背核区MCP-1的表达变化。
　　 结果：
　　 1.1背核神经元的免疫组化观察对照组大鼠左、右侧背核神经元形态完整，以大中型细胞为主，分布均匀，形态规则，大多数神经元呈椭圆形或锥体形，部分神经元可见突起分支，胞质轻微染色，胞核未见明显显色；有少量较小的神经元细胞，形态规则，结构完整。
　　 迷走神经离断后1d左侧背核神经元形态和分布与对照组相比，除染色稍微深之外无明显差异；但在右侧背核区，大多数神经元染色明显加深，不均匀分布，其中较大的神经元大多数明显皱缩，突起缩短或消失，胞质深染，部分神经元的胞核消失，部分较小神经元也表现出同样的变化，但神经元细胞的数量与对照组相比未见明显减少。
　　 迷走神经离断后5d左侧背核区神经元与对照组相比无明显变化，但在右侧背核区，神经元数量较左侧及对照组相比则明显减少，并有较多深染、胞膜皱缩的较小的神经元出现。
　　 1.2背核神经元计数为确认迷走神经离断后背核区神经元的死亡情况，模型组和对照组大鼠每只选5个切片，计数神经元数量。对照组大鼠左、右侧背核神经元计数分别为53±4/片和51±5/片；建立模型后1d大鼠左侧背核神经元数量为52±4，与对照组比无统计学意义，而右侧背核神经元数量为46±3，与对照组及同时间点左侧相比数量明显减少(p<0.05)；建立模型后5d左侧背核神经元计数为51±6/片，与对照组比无统计学意义，而右侧背核神经元数量为35±5/片，与对照组及同时间点左侧相比数量明显减少(p<0.01)。
　　 2.TUNEL染色结果对照组大鼠右侧背核区未见TUNEL阳性神经元，荧光强度深浅一致。
　　 右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核区，可见少数 TUNEL染色阳性神经元出现，表现为染色明显增强，荧光更为明亮，均匀一致的团块样结构。
　　 右侧迷走神经离断后10d的大鼠右侧背核区未观察到TUNEL，染色阳性神经元，同时神经元细胞的致密程度较对照组相比有所减弱。
　　 3.iNOS免疫组织化学染色结果对照组大鼠左、右侧背核区均未见iNOS染色阳性神经元。
　　 右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核区均可见大量iNOS染色阳性神经元，分布均匀，但在左侧背核区未见iNOS染色阳性神经元细胞。
　　 右侧迷走神经离断后10d大鼠左侧未见iNOS染色阳性神经元，右侧背核区仍可见iNOS染色阳性神经元细胞，但在染色深度及细胞数量上与迷走神经离断后5d大鼠右侧背核相比明显减弱及减少。
　　 4.NADPH免疫组织化学染色结果对照组大鼠左、右侧背核区均未见NADPH染色阳性神经元。
　　 右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核区均可见较多NADPH染色阳性神经元细胞，呈散在分布，但在左侧背核区未见NADPH染色阳性神经元细胞。
　　 5.右侧迷走神经离断后10d大鼠右侧背核区可见大量的NADPH染色阳性神经元细胞，并且在染色深度及阳性细胞数量上与迷走神经离断后5d大鼠右侧背核相比明显增强及增多，但在左侧背核区未见NADPH染色阳性神经元细胞。
　　 6.右侧迷走神经离断后背核区单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)免疫组织化学染色的结果对照组左、右侧背核区未见单核细胞趋化蛋白-1阳性细胞。
　　 右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核区可见较多散在分布的单核细胞趋化蛋白-1阳性细胞，左侧背核区未见单核细胞趋化蛋白-1免疫反应阳性细胞。右侧迷走神经离断后10d右侧背核区可见散在分布的单核细胞趋化蛋白-1阳性细胞，但阳性细胞数量较右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核相比要明显减少，左侧背核区未见单核细胞趋化蛋白-1免疫反应阳性细胞。
　　 结论：
　　 1.大鼠单侧迷走神经离断后可导致同侧迷走中枢背核发生逆行性改变，具体表现在神经切断后早期迷走中枢背核神经元数目减少，神经元形态发生改变，并且神经元细胞形态学的变化要早于数量的变化，表明大鼠单侧迷走神经离断后其同侧的中枢核团存在明显的神经元变性或凋亡，而对侧迷走中枢背核则无此变化。
　　 2.大鼠单侧迷走神经离断后5d时同侧迷走中枢背核iNOS和NADPH蛋白表达明显上调，而离断后10d时iNOS免疫反应性则逐渐减弱，NADPH免疫反应性则逐渐增强，提示迷走神经离断后同侧迷走神经中枢核团有内源性NO形成，从而可能导致迷走神经离断后同侧迷走神经中枢背核神经元发生凋亡，并且不同时间断有不同的NOS生成。
　　 3.大鼠单侧迷走神经离断后可导致同侧迷走中枢背核MCP-1表达上调，提示迷走神经离断后同侧迷走中枢背核MCP-1表达增多，表达增多的MCP-1作为炎性细胞因子可以通过聚集并活化吞噬细胞而对中枢造成进一步损伤。
　　 第二部分、骨髓基质干细胞治疗外周神经损伤所致的中枢核团逆行性病变的可行性研究
　　 目的：
　　 1.本实验拟在体外分离，纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞，免疫细胞化学染色观察第3代大鼠骨髓间充质干细胞CXCR4的表达情况。
　　 2.同本实验第一部分建立单侧大鼠迷走神经离断模型，用组织化学细胞染色观察大鼠右侧迷走神经离断后不同时间点迷走神经背核基质细胞衍生因子-1表达的变化。
　　 3.同本实验第一部分建立单侧大鼠迷走神经离断模型，用免疫组织化学法观察大鼠右侧迷走神经离断后经尾静脉移植的细胞增值示踪荧光探针标记的骨髓间充质干细胞在背核分布的变化。
　　 方法：
　　 1.根据文献，采用全骨髓法。取220～280 g SD大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/Kg)，15 min后断颈处死，碘伏消毒大鼠双下肢，收集双侧胫、股骨中全部骨髓。按1×106细胞/ml接种于75cm2培养瓶，24～72h后换液，去除未贴壁的细胞。以后每3～4天完全换液一次，12～14天后细胞密度达80％～90％，用0.25％的胰酶消化后1:3传代，记为P1代MSC(P1-MSC)。随后按上述方法传代培养。收集P3代的MSC(P3-MSC)，制成2×106/ml细胞悬液，以备迁移实验。细胞形态在倒置显微镜下观察，拍照。
　　 2.取生长旺盛的第3代细胞，选择兔抗CXCR4多克隆抗体并按照相应的试剂盒说明进行SP3法免疫组织化学染色，观察3代骨髓基质干细胞对CXCR4的表达情况。
　　 3.选择健康雄性SD大鼠，体重220～280g，10％水合氯醛(0.3ml/kg)，腹腔内注射麻醉，固定大鼠，在颈部分离出左、右迷走神经，离断右侧迷走神经，左侧迷走神经则不做处理，随后缝合切口。对照组大鼠只分离出左、右迷走神经，但均不予切断，随后缝合切口。取右侧迷走神经离断后10d及对照组大鼠，深度麻醉后，以4℃生理盐水，40g/L多聚甲醛依次行心脏灌注。灌注结后开颅取脑，脱水后行冰冻切片，片厚约20μm，以免抗基质细胞衍生因子-1多克隆抗体检测迷走神经背核基质细胞衍生因子-1的表达情况，二抗为CY3结合的羊抗免抗体，反应结束后用激光共聚显微镜观察、拍照。
　　 4.取3代大鼠MSCs，用细胞增殖示踪荧光探针(CFDA-SE)标记后，于大鼠右侧迷走神经离断后24h经尾静脉将1ml标记的MSCs(2×106/ml)注入实验组和对照组大鼠体内，分别于移植后5、10d，将大鼠灌注、固定、取脑、切片，在荧光显微镜下观察MSCs在迷走神经背核的分布。
　　 结果：
　　 1.大鼠骨髓基质干细胞(第3代)形态变得比较均匀一致，其中大部分细胞为细长梭形，也有小部分细胞为扁平形带突起的细胞，大部分细胞似成纤维样细胞，大部分梭形细胞集落明显呈克隆样生长，细胞呈极性排列，集落呈漩涡状，也有细胞呈散在生长。
　　 2.第3代骨髓基质干细胞大量表达CXCR4，CXCR4主要表达于大鼠骨髓基质干细胞的胞膜和胞浆，对照组未见阳性染色。
　　 3.右侧迷走神经离断后10d大鼠右侧迷走神经背核可见较多基质细胞衍生因-1阳性细胞，而对照组左、右侧背核及迷走神经离断后10d大鼠左侧背核均未见SDF-1阳性细胞。
　　 4.骨髓基质干细胞移植后5、10d，右侧迷走神经背核可见大量CFDA-SE阳性细胞，而左侧背核及对照组左、右侧背核均未见CFDA-SE阳性细胞。
　　 结论：
　　 1.免疫细胞化学染色发现，体外培养的大鼠骨髓基质干细胞可表达CXCR4，而CXCR4主要表达于MSCs的胞膜和胞浆。
　　 2.大鼠迷走神经离断后，同侧迷走神经背核可表达基质细胞衍生因子-1，而对侧背核及对照组左、右侧背核均未见明显SDF-1表达。
　　 3.经脉移植的骨髓基质干细胞可以迁移至迷走神经离断后的同侧迷走神经背核，其机制可能与同侧背核大量表达S F-1以及SDF-1/CXCR4的相互作用有关。