使用HDAC抑制剂的人源性自然杀伤细胞的扩增培养方法

摘要

本发明涉及一种用于自然杀伤细胞的扩增培养方法，更具体地涉及一种这样的用于自然杀伤细胞的扩增培养方法，其中用HDAC抑制剂处理经培养的自然杀伤细胞。根据本发明，当对自然杀伤细胞进行体外扩增培养时，可以阻止所述细胞经历细胞死亡，从而显著提高所述细胞的活力和产量。因此，可以有效地获得诸如癌症疗法等细胞疗法所需的自然杀伤细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及用于扩增自然杀伤细胞的培养方法，更具体地涉及这样的用于扩增自然杀伤细胞的培养方法，所述方法包括用HDAC抑制剂处理经培养的自然杀伤细胞。

背景技术

人类的免疫系统受复杂机制的调节，并且免疫系统异常可能导致免疫系统失衡，从而导致各种难治性疾病，如癌症。因此，免疫细胞疗法的发展已经受到关注，其是通过解决免疫系统的失衡、使免疫系统恢复到正常状态并增强免疫系统来治疗免疫相关疾病的方法。

人类的免疫系统分为先天性免疫系统和获得性免疫系统。先天性免疫系统由首先攻击进入人体的外来抗原的细胞组成。代表性细胞包括自然杀伤细胞，其作为细胞疗法产品已经引起关注，因为这些自然杀伤细胞的优势在于它们可以杀死各种类型的癌细胞并识别癌细胞，而不管存在还是不存在抗原。

为了将免疫细胞用作细胞疗法产品，特别需要获得大量细胞并使细胞能够具有高抗癌活性。另外，当将所获得的免疫细胞注射到患者体内时，它们应当在体内有效存活。

然而，当将离体培养的免疫细胞注射到体内时，其活性不能长时间维持。特别地，当过度扩增细胞时，它们不可避免地倾向于细胞死亡或细胞衰老。因此，只有当经培养的免疫细胞在患者体内长时间保持稳定时，这些细胞才可以有效地充当细胞疗法产品。

表观遗传是这样的一种现象，其中基因表达受到调节，而DNA的核苷酸序列不改变。染色质的结构改变影响“染色质重塑”，并且基因表达受到调节。此领域最近受到关注，并且据报道在免疫细胞的激活和失活中起重要作用(Schenk等人,Int J Mol Sci,2016)。

组蛋白脱乙酰酶(HDAC)是参与染色质重塑的酶。已知HDAC主要影响转录过程，并且据报道组蛋白的过度乙酰化导致转录的抑制(Smith等人,BioEssay,30:15-24,2007)。另外，已知HDAC除修饰组蛋白外还通过靶向许多非组蛋白的蛋白质底物来调节基因表达。因此，当HDAC受到抑制时，染色质结构打开，使得各种转录调节因子可以与其结合。

先前已经报道，当用抗CD2抗体处理用IL-2培养的自然杀伤细胞(NK细胞)时，染色质凝聚并诱导细胞死亡(Ida等人,Eur J Immunol,28:1292-1300,1998)。因此，当NK细胞被外部刺激激活时，染色质结构被HDAC封闭，使得转录因子不能与其结合，从而导致细胞增殖的抑制和细胞死亡的诱导。因此，已经做出努力来开发通过抑制HDAC来诱导染色质结构改变从而使细胞存活相关的转录因子可以与染色质结合来抑制细胞死亡的方法。

关于HDAC抑制剂，据报道组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)在多种癌细胞系中诱导分化、细胞周期停滞、细胞死亡、自噬和坏死(Senese等人,Molecular and CellularBiology,27:4784-4795,2007)。已知HDAC抑制剂通过增强癌细胞的DNA损伤反应并抑制DNA修复来促进癌细胞凋亡，并且此机制在正常细胞中不会发生。因此，认为HDAC抑制剂在癌症和正常细胞中将显示出不同的作用。

关于免疫细胞，据报道当用HDAC抑制剂治疗癌细胞时，NKG2D配体的表达增加，使得NK细胞容易地识别癌细胞(Lopez-Soto等人,Oncogene,28:2370-2382,2009)，表明此治疗具有抗癌作用。另外，据报道用HDAC抑制剂治疗增加免疫原性细胞死亡(West等人,Cancer Research,7:7265-7276,2013)。

据报道用HDAC抑制剂丙戊酸处理NK细胞降低NK细胞的增殖和癌细胞杀伤能力(Ogbomo等人,FEBS Letters,581:1317-1322,2007)。另外，据报道当用伏立诺他(vorinostat)处理经激活的NK细胞时，NK细胞的癌细胞杀伤能力没有改变(Wang等人,BiolBlood Marrow Transplant,18:747-753,2012)。

在T细胞的情况下，据报道当用抑制剂处理CD4 T细胞时，其细胞活力降低并且其增殖和细胞因子分泌受到抑制(Schmudde等人,Cancer Lett,295:173-181,2010)。另外，据报道当用抑制剂处理CD8 T细胞时，其记忆功能增强(Vo等人,Cancer Research,69:8693-9699,2009)。

相比之下，据报道在作为调节性免疫细胞的Treg细胞的情况下，Foxp3表达和免疫抑制能力增加(Tao等人,Nature Med,13:1299-1307,2007)，并且MDSC分化增强(Rosborough等人,J Leukoc Biol,91:701-709,2012)。

因此，诸位发明人已经进行了广泛的努力以开发出在免疫细胞的扩增过程中有效提高其活力和产量的方法，并且结果，已经发现当在NK细胞的离体扩增培养过程中用HDAC抑制剂处理NK细胞时，NK细胞的扩增增强，使得细胞的活力和产量显著提高，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种在离体培养过程中增强自然杀伤细胞的扩增的培养方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于扩增自然杀伤细胞的培养方法，所述方法包括：(a)将自然杀伤细胞培养1至15天；(b)用HDAC抑制剂处理所述经培养的自然杀伤细胞；以及(c)另外培养所述经处理的自然杀伤细胞。

附图说明

图1示出了分析HDAC抑制剂对自然杀伤细胞生长的作用的结果。图1(A)示出了在自然杀伤细胞的扩增培养过程中用HDAC抑制剂对其进行处理的方法，图1(B)示出了在用HDAC抑制剂处理之后自然杀伤细胞的生长曲线和自然杀伤细胞分布的改变，并且图1(C)示出了在第0天或第10天添加HDAC抑制剂之后经培养的NK细胞的生长曲线。

图2示出了分析HDAC抑制剂对自然杀伤细胞生长的作用的结果。图2(A)示出了在自然杀伤细胞的扩增培养过程中用HDAC抑制剂对其进行处理的方法和经处理的自然杀伤细胞的生长曲线，并且图2(B)示出了在自然杀伤细胞的扩增培养过程中用各种浓度的HDAC抑制剂处理的自然杀伤细胞的生长曲线。

图3示出了分析HDAC抑制剂对自然杀伤细胞生长的作用的结果，并且示出了用HDAC抑制剂处理或未用HDAC抑制剂处理的自然杀伤细胞的凋亡和增殖。

图4(A)示出了分析在用HDAC抑制剂处理之后自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力的结果，并且图4(B)示出了分析在用HDAC抑制剂处理或未用HDAC抑制剂处理的经培养的自然杀伤细胞中CD107a的表达(细胞毒性能力的量度)和IFN-g(细胞因子)的分泌的结果。

具体实施方式

除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法是本领域公知且通常使用的。

在本发明中，开发出了在NK细胞的离体扩增培养过程中使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂提高自然杀伤细胞(NK细胞)的产量的方法。另外，发现当在最初阶段用HDAC抑制剂处理NK细胞时，NK细胞的增殖以与先前的报道中相同的方式受到抑制，但是当用HDAC抑制剂处理增殖的NK细胞时，与先前的报道不同，与未使用HDAC抑制剂处理的对照组相比，NK细胞的扩增增强。此事实表明，用HDAC抑制剂处理可以通过抑制凋亡来获得更多数量的自然杀伤细胞。也就是说，新发现与增殖细胞不同，由于HDAC活性在静息自然杀伤细胞的增殖中是重要的，因此用HDAC抑制剂处理增殖细胞是增加细胞数量的关键。另外，发现用HDAC抑制剂处理的自然杀伤细胞可以维持其癌细胞杀伤能力，而不管用HDAC抑制剂处理还是不处理。

因此，本发明涉及用于扩增自然杀伤细胞的培养方法，所述方法包括：(a)将自然杀伤细胞培养5至15天；(b)用HDAC抑制剂处理经培养的自然杀伤细胞；以及(c)另外培养经处理的自然杀伤细胞。

在本发明中，HDAC抑制剂可以选自SAHA、丙戊酸、伏立诺他、恩替诺特(entinostat)和罗米地辛(romidepsin)。在本发明中，优选地以20至500nM、更优选地31.25至125nM、甚至更优选地50至80nM的浓度使用HDAC抑制剂。

在本发明中，在培养5至15天、优选地培养6至12天、更优选地培养7至10天之后，用HDAC抑制剂处理自然杀伤细胞。

在本发明中，可以将自然杀伤细胞首先在培养的第6天用HDAC抑制剂处理，然后以4天的间隔另外用HDAC抑制剂处理3至4次。

在本发明中，步骤(c)中的培养可以在补充有IL-2的培养基中进行。

在本发明中，可以将自然杀伤细胞与饲养细胞(如Jurkat(KL-1)细胞、EBV-LCL细胞或K562细胞)共培养。

在本发明的一个例子中，证实当将人外周血单核细胞分离，与Jurkat细胞和EBV-LCL细胞共培养10天，然后用SAHA作为HDAC抑制剂处理时，与常规培养方法相比，自然杀伤细胞的数量增加，并且用抑制剂处理没有改变细胞的增殖且抑制自然杀伤细胞的凋亡，并且用抑制剂处理也没有改变自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力。另外，用抑制剂处理不会改变细胞的干扰素-γ分泌。

因此，本发明的方法是这样的方法，其不改变自然杀伤细胞的功能，但是可以通过抑制凋亡而获得与常规方法相比更多数量的细胞。

在本发明的另一个例子中，证实当在不进行培养的情况下在最初阶段用SAHA作为HDAC抑制剂处理自然杀伤细胞时，未观察到细胞数量的增加。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员而言明显的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不应解释为受这些实施例的限制。

实施例1：在自然杀伤细胞的培养过程中通过HDAC抑制剂处理引起的细胞数量增加

收集人血，然后将其使用Ficoll(Ficoll-Paque

为了证实HDAC抑制剂对自然杀伤细胞的作用，将在上述条件下培养6天的自然杀伤细胞每4天用125nM的HDAC抑制剂(SAHA，Sigma Aldrich，美国)处理一次，并且对细胞数量进行计数(图1A)。此时，在将细胞进一步培养约12天的同时每4天使用血细胞计数器对细胞数量进行一次计数，并且在培养过程中，用含有500U/ml的IL-2的hRPMI培养基更换培养基。

结果，如图1B所示，证实用HDAC抑制剂SAHA处理的实验组中的细胞数量是未用HDAC抑制剂处理的对照组中的细胞数量的两倍多。

另外，图1C示出了在自然杀伤细胞的培养过程中第0天或第10天添加HDAC抑制剂之后经培养的自然杀伤细胞的生长曲线。如在其中可以看到的，与在培养的第10天用HDAC抑制剂处理NK细胞相比，当在培养的第0天用HDAC抑制剂处理NK细胞时，NK细胞的增殖降低。

另外，如在图2A中可以看到的，从共培养第6天起用SAHA处理的实验组中的细胞数量被测量为最高。如图2B所示，证实当用浓度为62.5nM的SAHA处理NK细胞时，NK细胞的增殖是最高的(图2B)。因此，治疗的时机和量得到优化。

实施例2：测量在自然杀伤细胞的培养过程中通过HDAC抑制剂处理引起的细胞凋亡和增殖

以与实施例1中相同的方式，用HDAC抑制剂处理离体扩增10天的自然杀伤细胞，并且将其进一步培养8天。在收获细胞之后，获得5×10

为了测量凋亡，收获细胞并将其用膜联蛋白V(2.5μl)和7AAD(2μl)染色15分钟，然后使用FACS CantoII(BD)分析被膜联蛋白V/7AAD染色的细胞的比例。为了测量细胞增殖，将经PerCP标记的CD3 mAb(Biolgend目录号344814克隆SK7)和经APC标记的CD56 mAb(Biolegend目录号362504克隆5.1H11)添加到细胞中，并且允许在4℃下反应20分钟。对于细胞内FACS，将细胞用FACS缓冲液洗涤，并且用eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience目录号00-5523-00)对细胞核中的Ki67染色进行分析。

结果，如图3所示，可以证实当用HDAC抑制剂处理自然杀伤细胞时，自然杀伤细胞的增殖没有显著改变，并且通过HDAC抑制剂处理抑制自然杀伤细胞的凋亡。

实施例3：证实在自然杀伤细胞的培养过程中通过HDAC抑制剂处理引起的自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力的改变

为了检查通过实施例1的方法离体扩增的自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力是否改变，制备K562(韩国细胞系银行)和A375(韩国细胞系银行)细胞作为靶癌细胞，将其用铬标记1小时，与自然杀伤细胞以1:1的比率混合，然后在37℃下共培养。在4小时之后，取上清液，并且使用γ计数器分析其同位素值。

将2.5μl的经FITC标记的抗CD107a mAb添加到细胞中，并且添加Golgi终止液(BDPharmingen)，然后在37℃下培养5小时。在培养完成之后，将经PerCP标记的CD3 mAb(Biolgend目录号344814克隆SK7)和经APC标记的CD56mAb(Biolegend目录号362504克隆5.1H11)添加到细胞中，并且允许在4℃下反应20分钟。对于细胞内FACS，将细胞用FACS缓冲液洗涤，固定，使用BD Cytoperm/Cytofix试剂盒(BD Pharmingen，加利福尼亚圣地亚哥)透化，用经PE标记的IFN-g mAb染色，然后通过流式细胞术进行分析。作为阳性对照，使用用PMA/离子霉素处理的自然杀伤细胞。

结果，如图4所示，可以看到发现用HDAC抑制剂处理的自然杀伤细胞组的癌细胞杀伤能力与未经处理的对照组相似。图4B示出了分析在用HDAC抑制剂处理或未用HDAC抑制剂处理的经培养的自然杀伤细胞中CD107a的表达(细胞毒性能力的量度)和IFN-g(细胞因子)的分泌的结果。如在其中可以看到的，在用HDAC抑制剂处理之后，自然杀伤细胞的功能没有改变。

工业实用性

根据本发明，可以通过在自然杀伤细胞的离体扩增培养过程中抑制其凋亡以显著提高细胞的活力和产量来有效地获得诸如癌症疗法等细胞疗法所需的自然杀伤细胞。

尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言清楚的是，此描述仅是其优选实施方案的描述，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。