一种提高磷脂酶D转脂活性的方法以及用其生产磷脂酰丝氨酸的方法

摘要

提供了一种提高磷脂酶D转脂活性的方法，包括：向酶催化生产磷脂酰丝氨酸的酶反应体系中加入醇类物质，前述醇类物质为短链的一级醇和/或二级醇，该方法能够加快酶催化反应速度并减少酶的用量，同时缩短至少一半的反应时间，具有普遍适用性。还提供了一种酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法，包括：将含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与水、L‑丝氨酸、氯化钙、醇类物质以及磷脂酶D混合，在39‑43℃下搅拌反应4‑6h；其中，醇类物质为短链的一级醇和/或二级醇；具有酶反应时间短、转化率高、生产成本低的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及一种提高磷脂酶D体外催化过程中转脂活性的方法以及用其生产磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D，英文简称PLD)属于磷脂酰二酯合成酶类，可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，基于磷脂酶D所具有的这种转酯活性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂、稀有磷脂以及系列功能性磷脂，现已成为合成和改造磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等稀有磷脂的重要工具酶。

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，英文简称PS)又名丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸、复合神经酸等，是一类普遍存在于细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂，通常位于细胞膜的内层，是细胞膜的活性物质，尤其存在于大脑细胞中。其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能等。由于PS具有很强的亲脂性，吸收后能够迅速通过血脑屏障进入大脑，起到舒缓血管平滑肌细胞，增加脑部供血的作用，被誉为继胆碱和“脑黄金”DHA之后的一大新兴的“智能营养素”。

磷脂酰丝氨酸的制备方法主要包括提取法和生物酶催化法。提取法主要是从植物(大豆、葵花籽等)、动物(牛、羊、马)的大脑中提取，但由于原料中的PS含量较低且提取工艺复杂，导致该方法成本较高，不利于现代化工业生产。因此，目前工业上主要是采用生物酶催化法生产磷脂酰丝氨酸，其是利用磷脂酶D催化卵磷脂(来源于大豆、葵花籽、鸡蛋等)和L-丝氨酸发生转磷脂酰基反应生成磷脂酰丝氨酸，由于该方法中的原料来源广泛，且原料中的目标物质含量较高，所以其生产成本较提取法大大降低，已经被广泛应用于工业生产中。

利用生物酶催化法生产磷脂酰丝氨酸的过程中，用于催化的磷脂酶D的转脂活性的高低对反应的转化率起到关键性作用，多年来，人们致力于开发出具有更高活性的磷脂酶D，包括寻找新的来源的磷脂酶D，以及对已知的磷脂酶D进行基因改造，却往往忽视了从工艺本身入手来提高磷脂酶D的转脂活性。

发明内容

鉴于上述背景技术中提到的现有技术存在的问题，本发明的目的在于，另辟蹊径，从工艺本身入手，开发一种能够提高磷脂酶D的转脂活性的方法，并基于此，同时开发一种磷脂酰丝氨酸的酶催化生产方法。

为实现上述目的，发明人通过大量的实验探索发现，在磷脂酰丝氨酸的磷脂酶D催化反应体系中添加特定的醇类物质，可以提高磷脂酶D的转脂活性，从而加快反应速度和减少酶的用量。因此，本发明提供了一种提高磷脂酶D转脂活性的方法，包括：向酶催化生产磷脂酰丝氨酸的酶反应体系中加入醇类物质，前述醇类物质为短链的一级醇和/或二级醇。

优选地，本发明提供的上述提高磷脂酶D转脂活性的方法中，醇类物质为乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、异丙醇和仲丁醇中的一种或多种。

更优选地，本发明提供的上述提高磷脂酶D转脂活性的方法中，醇类物质为乙醇和/或异丙醇。

优选地，本发明提供的上述提高磷脂酶D转脂活性的方法中，醇类物质的加入体积为酶反应体系总体积的5-10％。

基于本发明提供的上述提高磷脂酶D转脂活性的方法，本发明进一步提供了一种酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：将含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与水、L-丝氨酸、氯化钙、醇类物质以及磷脂酶D混合，在39-43℃下搅拌反应4-6h；其中，醇类物质为短链的一级醇和/或二级醇。

优选地，本发明提供的上述酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法中，醇类物质为乙醇和/或异丙醇。

优选地，本发明提供的上述酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法中，醇类物质的体积为水的体积的5-10％。

优选地，本发明提供的上述酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法中，水的加入量为5-10ml/g天然磷脂的质量，L-丝氨酸的加入量为100-200g/L水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/L水的体积，磷脂酶D的加入量为10-25U/g天然磷脂。

优选地，本发明提供的上述酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法中，天然磷脂中磷脂酰胆碱的含量为20-90％。

优选地，本发明提供的上述酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法中，天然磷脂为大豆磷脂和/或葵花磷脂。

有益效果：

与现有技术相比，本发明抛开寻找新的高活性的磷脂酶D或者对磷脂酶D本身进行改造的传统做法，另辟蹊径，从工艺本身入手，开发出了一种能够提高磷脂酶D的转脂活性的方法，该方法工艺简单易操作，对试剂及设备无特殊要求，能够加快酶催化反应速度并减少酶的用量，经试验证实，该方法能够缩短至少一半的反应时间，具有普遍适用性。另外，基于此，本发明提供的酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法具有酶反应时间短、转化率高、生产成本低的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

转脂活性对比实验

在1L纯水中加入100g磷脂酰胆碱含量为58.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，搅拌均匀后，分为4份，分别编号为1、2、3、4组，放入42℃恒温水浴锅，搅拌300rpm，每组均加入125uL磷脂酶D(25U/g)，其中第2-4组分别加入12.5mL乙醇(水体积的5％)、25mL乙醇(水体积的10％)、12.5mL异丙醇(水体积的5％)，使用高效液相色谱仪监控PC→PS的转化率，反应进行2h、4h、6h和8h后的转化率测定结果见下表。

实施例2

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入100g磷脂酰胆碱含量为53.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入0.5mL磷脂酶D(25U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为50.9％、77.9％、87.1％。

实施例3

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入100g磷脂酰胆碱含量为53.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入50mL乙醇，0.5mL磷脂酶D(25U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为71.0％、90.5％、94.4％。

实施例4

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为58.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入0.6mL磷脂酶D(15U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为38.9％、57.7％、69.5％。

实施例5

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为58.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入50mL乙醇，0.6mL磷脂酶D(15U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为61.8％、75.4％、84.6％。

实施例6

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为58.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入100mL乙醇，0.6mL磷脂酶D(15U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为69.3％、80.8％、92.6％。

实施例7

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为58.6％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入100mL异丙醇，0.6mL磷脂酶D(15U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为70.1％、81.2％、92.3％。

实施例8

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入120g磷脂酰胆碱含量为62.2％的大豆磷脂，100g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入50mL丙醇，0.6mL磷脂酶D(25U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为67.7％、87.5％、91.2％。

实施例9

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为23.8％的大豆磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入75mL丁醇，0.4mL磷脂酶D(10U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为73.9％、88.4％、92.4％。

实施例10

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入200g磷脂酰胆碱含量为20.6％的葵花磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入75mL2-甲基-1-丙醇，0.4mL磷脂酶D(10U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为69.2％、81.1％、90.9％。

实施例11

酶催化生产磷脂酰丝氨酸

在1L纯水中加入120g磷脂酰胆碱含量为43.1％的葵花磷脂，200g L-丝氨酸，20g氯化钙，500rpm搅拌均匀且升温至39-43℃，加入50mL2-甲基-1-丁醇，0.6mL磷脂酶D(25U/g)，反应2h、4h、6h检测PC→PS转化率分别为74.9％、84.7％、90.9％。