一种早发冠心病基因检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种突变基因，它是人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异。还提供了检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂在制备早发冠心病的检测试剂中的用途。本发明将LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异应用于早发冠心病相关的基因检测试剂盒的制备中，能达到临床辅助诊断的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种早发冠心病基因检测试剂盒。

背景技术

冠心病(coronary artery disease，CAD)是威胁人类健康的主要疾病之一。《中国心血管健康与疾病报告2019》指出，我国约有1100万冠心病患者。早发冠心病(Prematurecoronary artery disease,PCAD)是冠心病的特殊形式，根据美国国家胆固醇教育计划成人治疗组第3次会议报告(NECP-ATPⅢ)规定：早发冠心病是指冠心病的发病年龄男性＜55岁，女性＜65岁。国内外研究表明，PCAD正以不低的比率在年轻人群中发病。PCAD发病前多无征兆、发病急、多表现为急性冠脉综合征，死亡率高；因其特殊的年龄段，会给社会及家庭带来沉重的经济负担。对于PCAD的传统鉴别和诊断方法主要依靠生化检查和影像学检查，如B超检查、冠状动脉造影和心电图检查等。这些手段存在多种缺点，如检查种类多、灵敏度和特异度低、易受药物和精神状况等因素的影响；检测时间要求苛刻等。

55岁以前发生的PCAD，约5％～10％是由家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia，FH)引起的，FH是PCAD常见的遗传易感因素。FH又称家族性高β脂蛋白血症，其临床特点是高胆固醇血症、特征性黄色瘤、早发心血管疾病家族史。FH是儿童期最常见的遗传性高脂血症，也是脂质代谢疾病中最严重的一种，可导致各种危及生命的心血管疾病并发症出现，是冠状动脉疾病的一种重要危险因素。本病最特征的临床表现为血LDL-C水平增高、黄色瘤、角膜弓和早发性冠心病。纯合子的临床表现比杂合子严重得多。FH患者的临床表现取决于其基因型，非遗传因素也对其有影响。FH基因型与表现型的关系比较复杂，即使带有相同突变，甚至属于同一家族的个体其临床表现差异也较大。另外，非遗传因素如高龄、男性、吸烟、饮食等也可显著影响LDL水平，增加CAD的发生。

对FH患者的B型超声检查常可发现主动脉根部硬化，主动脉根部硬化逐渐加重，同时可出现主动脉瓣钙化和(或)左冠状动脉主干狭窄。15％患者有冠状动脉瘤样扩张(指冠状动脉的局限或弥漫性扩张，其直径超过了相邻正常冠脉的1.5～2倍)，而年龄、性别配对的对照组(非FH冠心病患者)中仅2.5％有冠状动脉瘤样扩张。并同时发现冠状动脉瘤样扩张与血浆HDL-C水平呈负相关，因而认为FH者易发生冠状动脉瘤样性疾病。

目前，基因检测是确诊FH的一种新型手段，FH最常见的三种致病基因：LDLR、ApoB、PCSK9，也是PCAD的易感基因。由于基因检测用于PCAD的情况较为少见，因此，任何一个或一组PCAD的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。

发明内容

本发明提供一个新的LDLR基因的变异位点，及其检测试剂盒，用于临床(辅助)诊断早发冠心病，为携带早发冠心病致病变异的家庭提供遗传阻断，提高优生优育质量。

本发明通过对早发冠心病的家系成员进行分析，意料不到地发现了：家系中的早发冠心病患者具有LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异，家系中的未患病成员均未检测到该变异，说明该变异与早发冠心病密切相关。

以上发现通过相当数量的无关样本得以验证，样本包括500名表型健康的对照成员和1例早发冠心病的患者成员。经验证：500名表型健康的对照成员均未检测到该变异；1例早发冠心病的患者成员检测到LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异。

进一步扩大阴性样本数量，在扩大至1232名的随机的表型健康的对照成员的志愿者样本范围内，均未检测到该变异。

进一步扩大阳性样本数量，在扩大至3名的随机患者成员的志愿者样本范围内，均检测到该变异。

以上，说明该变异能够用于早发冠心病的检测。

基于上述发现，本发明所要解决的技术问题是，提供一个新的早发冠心病相关的致病基因变异，同时提供该变异的检测方法和试剂盒，以及它们在临床辅助诊断早发冠心病中的用途。

首先，本发明提供了一种突变基因，所述变异为LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异(LDLR:p.Cys95GlyfsTer36)。查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。该插入变异使第95位氨基酸后的蛋白移码表达，并于其后第36位密码子处提前出现一终止密码子，可能会使蛋白截短表达。查询Clinvar、HGMD数据库未发现该变异，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。但发现该位点前后的氨基酸变异C134Y/F/W/R/*、p.D136N/Y/V、p.G137S/V、p.D139E/G/H/V/N(NM_000527.4)等均曾被报导为早发冠心病的致病突变，提示该位点可能位于蛋白的重要功能区。根据现有证据：该变异为罕见变异、本地数据库中无人携带该变异、可能会使蛋白截短表达、位于重要功能区，因此认为该变异为高度可疑致病突变(B级)。

本发明还提供了检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂在制备早发冠心病基因检测试剂中的用途。

如前述的用途，所述的试剂包括检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类LDLR基因编码区第279-282位碱基的核酸片段的相关试剂。

如前述的用途，所述检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的方法包括但不限于现有技术中对基因变异位点的任何可选检测方法：例如Sanger测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)。

如前述的用途，包括但不限于对人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异进行定性和/或定量检测。

如前述的用途，所述的定量检测包括但不限于现有技术中对基因的任何可选检测方法，例如荧光定量PCR。

如前述的用途，所述检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂为测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性方法用试剂、单链构象多态性分析用试剂或者等位基因特异的寡聚核苷酸杂交用试剂。

本发明还提供了一种早发冠心病的基因检测试剂盒，它包括任选的用于检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂。

如前述的试剂盒，所述的试剂包括检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类LDLR基因编码区第279-282位碱基的核酸片段的相关试剂。

如前述的试剂盒，所述检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂为测序试剂。

如前述的试剂盒，所述检测人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异的相关试剂包括但不限于现有技术中对基因变异位点的任何可选检测试剂：例如Sanger测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)的检测试剂。

如前述的试剂盒，包括但不限于对人类LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异进行定性和/或定量检测试剂。

如前述的试剂盒，所述的定量检测试剂包括但不限于现有技术中对基因的任何可选检测试剂，例如荧光定量PCR检测试剂。

本发明的另一目的在于使用Sanger测序法对该变异进行检测，包括如下步骤：

(1)使用经设计的引物组合对LDLR基因进行扩增；

(2)将扩增产物经吸附柱进行纯化；

(3)纯化后的PCR产物进行Sanger测序；

(4)测序结果分析。

具体地，所述步骤(1)中采用PCR扩增引物序列如下：

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异可以将早发冠心病患者和正常人群区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断早发冠心病的生物标志物。

2、通过检测受试者是否携带上述变异，可以检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

3、为人类攻克早发冠心病提供可能的药物治疗靶点，促进创新药物研发。

附图说明

图1是早发冠心病家系图；

图2是家系中其他患病成员的Sanger测序图；

图3是患者的Sanger测序图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员所使用的常规操作。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

需要特别说明的是，下述实施例仅用于对本发明进行进一步的描述，不应理解为对本发明的限制。在不脱离上述技术基础的前提下对本发明所作的修改、替换或变更，均属于本发明的保护范围。

实施例1患者/携带者验证实验

样本来源：中国人民解放军第二五二医院，在先证者及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

1.制备基因组DNA

对人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，对DNA的浓度和纯度进行检测。

2.配制PCR扩增试剂(1反应体系)

该PCR扩增试剂用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成见表1所示。

表1 PCR扩增试剂组成

表1中PCR Mix中包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg

表2上下游引物信息

3.目的片段扩增

将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序如下表3所示。扩增完成后使用Agencourt AMPure XP磁珠(购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)对PCR产物进行纯化。

表3 PCR扩增程序

4.PCR产物的检测

取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考。

5.PCR产物纯化

5.1涡旋振荡磁珠30秒，使其彻底混匀为均一溶液。

5.2向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5分钟。

5.3将上一步的离心管放于磁力架上，直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.4保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。

5.5向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10秒钟后将离心管重新放回磁力架，静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。

5.6重复步骤5.5。

5.7保持离心管固定于磁力架上静置放置10分钟，使乙醇完全挥发干净。

5.8将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5分钟。

5.9将离心管放于磁力架上直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.10将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

6.Sanger测序

使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪进行Sanger测序。

7.测序结果进行生物信息学分析。

8.基因变异论证：结果表明该样本携带LDLR基因c.279_282dupGGAC杂合插入变异。

实施例2一种早发冠心病基因检测试剂盒

1.试剂盒组分

实施例3无关样本验证实验：早发冠心病家系基因检测

1.实验方法

招募1个早发冠心病家系，对所有的家系成员的骨骼系统、皮肤系统、眼部、神经系统及心血管系统进行全面的检查，初步确认其符合早发冠心病的特征。

通过基因检测，在该家系中检查到有3名早发冠心病患者(家系图如图1所示)。

另外招募了1232名未患有早发冠心病的健康人群作为对照。

使用实施例1中所述的方法扩增该家系每个成员以及对照人群的LDLR基因c.279_282dupGGAC，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。

样本可公开信息：

1、家系国别/地区：中国/郑州

家系成员男女比例：1:2

家系成员年龄分布：11-73岁

2、招募者国别/地区：中国

招募者男女比例：1:1

招募者年龄分布：16-72岁

3、结果

测序结果显示，家系中患病成员携带c.279_282dupGGAC杂合突变；而家系内非患病成员和对照人群未见前述任一位点的突变。突变位点测序图如图2和图3所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。