红细胞老化程度的评价方法

摘要

本发明的课题是提供红细胞老化程度评价方法，所述方法能够更高精度且恰当地评价红细胞的老化程度。解决手段为一种红细胞老化程度评价方法，其具有以下步骤：红细胞悬浮液制备步骤(S1)，由血液试样制备红细胞悬浮液；第1红细胞变形能力计算步骤(S2)，使红细胞悬浮液从第1滤器通过，分离成未通过第1滤器的老化红细胞和通过第1滤器的未老化红细胞，并且算出红细胞的变形能力；第2红细胞变形能力计算步骤(S3)，使经分离的未老化红细胞悬浮液从具有直径小于第1滤器的微孔的第2滤器通过，分离成未通过第2滤器的轻度老化红细胞和通过第2滤器的幼红细胞，并且算出未老化红细胞的变形能力；和评价步骤(S4)，使用红细胞的变形能力和未老化红细胞的变形能力，对红细胞的老化程度进行评价。

说明书

技术领域

本发明涉及对造成毛细血管幽灵(ghost)化的血液中的红细胞的老化程度进行评价的方法。

背景技术

近年来，利用媒体也在介绍的毛细血管镜时，能够观察到通常不可见的毛细血管，并能够发现毛细血管消失、变短、数量减少等毛细血管的幽灵化。所述毛细血管的幽灵化会在全身发生，因此不仅影响皱纹、松弛等肉眼可见的皮肤状态，还具有导致骨质疏松、痴呆症、生活习惯病(糖尿病、高胆固醇血症等)等严重疾病的危险性。

红细胞对于毛细血管的流动恶化、向幽灵化发展的过程而言是重要的。这是因为，毛细血管中不存在平滑肌，因而没有收缩·舒张的功能，红细胞在变形的状态下通过比自身的直径(约8μm)细的毛细血管(约5μm)，在全身进行循环。每1μL血液的红细胞数为400～500万个，红细胞的体积也达到血液体积的40％～50％。该红细胞的寿命短，为约120天，存在从幼红细胞至老化红细胞的各种阶段的红细胞。在这些阶段中，与毛细血管的幽灵化最相关的是变形能力降低的老化红细胞。认为老化红细胞堵塞在毛细血管中，细胞生存所必需的物质变得无法被送达至形成塞点之后的毛细血管的细胞，使得幽灵化发展。

近年来，提出了对这样的血液中的红细胞的变形能力进行评价的方法、装置。

作为在日本研发的装置，例如有MCFAN HR300(Micro Channel Array FlowAnalyzer，日本，MC Healthcare,Inc.)。MCFAN是在用硅由人工制成的毛细血管类似物中流通所采集的血液并观察图像这样的装置。开发初期夸赞其将为红细胞变形能力的研究做出巨大贡献，但之后判明其可靠性低，现在仅被用于非常有限的医院中。

另外，作为在日本国外研发的装置，有经旋转流动赋予离心应力而使红细胞进行椭圆变形、用激光的衍射图像进行评价的LORCA(Laser-assisted Optical RotationalCell Analyzer，荷兰，Mechatronics公司)，由负压施加剪切应力而使红细胞进行椭圆变形、用激光的衍射图像进行评价的RheoScan-D(韩国，RheoMeditech公司)等(非专利文献1)。RheoScan-D具有以下特征：能够用全血进行自动测定，由于在流路中使用一次性的塑料微芯片而无需在使用后清洗，还能够测定红细胞的凝聚；等等。

然而，生物体内的红细胞的生理性变形是弯曲变形，需要注意的一点是，使红细胞进行椭圆变形来测定变形能力的方式是否能被认为反映了生理性微循环的情况。而且，由于椭圆变形所需的应力远远大于弯曲变形所需的应力，因此，与测定弯曲变形的方法相比，尤其存在用小剪切应力时测定灵敏度低这样的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Patricia C.Sousa,Fernando T.Pinho,Manuel A.Alves和MonicaS.N.Oliveira,A review of hemorheology:Measuring techniques and recentadvances,Korea-Australia Rheology J,28(1),1-22(2016)

发明内容

发明所要解决的课题

以往的评价方法是将处于约120天的寿命中的各个阶段的红细胞作为整体，使用由该整体求出的变形能力对红细胞的老化程度进行评价，而尚未开发能够求出老化红细胞单独的变形能力或者去除了老化红细胞后的部分单独的变形能力的装置、将上述装置自动化而成的装置。

对于各个患者而言，造成毛细血管幽灵化的老化红细胞的比例是不同的，因此可以预见，如果能够研发这样的评价方法、装置，就能够在各个患者中对例如糖尿病性视网膜病、肾病等的并发症的进展风险等进行适当的诊断，临床意义重大。

本发明的课题是提供能够更高精度且恰当地评价红细胞的老化程度的红细胞老化程度评价方法。

用于解决课题的手段

血液的红细胞的柔韧性、流动容易性等流变性能对生活习惯病的预防和治疗非常重要，本申请的发明人着眼于此，开发了使用重力式镍网过滤法的红细胞变形能力测定装置，提供了红细胞变形能力检查。

使用所述重力式镍网过滤法(滤器的微孔的直径为3.2μm)，以139名体检的受试者为对象，仅对轻症高脂血症(总胆固醇值为260mg/dl以下)进行研究，结果显示红细胞变形能力与中性脂肪值呈负相关，与HDL胆固醇值呈正相关(Ejima J,Ijichi T,Ohnishi Y,Maruyama T,Kaji Y,Kanaya S,Fujino T,Uyesaka N和Ohmura T:Relationship of high-density lipoprotein cholesterol and red blood cell filterability:cross-sectional study of healthy subjects.Clin Hemorheol Microcirc 22:1-7,2000)。

另外，以101名高血压症患者为对象，使用微孔的直径为4.94μm的滤器进行研究，由此发现红细胞变形能力与平均血压呈负相关(K.Odashiro等人，Impaireddeformability of circulating erythrocytes obtained from nondiabetichypertensive patients:investigation by a nickel mesh filtration technique,Clin Hypertens.21:17，eCollection(2015))。

本申请的发明人为了更高精度且恰当地对血液中的红细胞的老化程度进行评价，进一步深入研究，结果发现，通过将红细胞进行多次分离，求出各分离步骤中的红细胞的变形能力并以此对红细胞的老化程度进行评价，能够更高精度且恰当地对红细胞的老化程度、进而对毛细血管的幽灵化进行评价，从而完成了本发明。

换言之，本发明如下所述。

[1]红细胞老化程度评价方法，其是使用至少两种具有多个微孔的滤器对红细胞的老化程度进行评价的方法，其特征在于，具有以下步骤：

红细胞悬浮液制备步骤，由血液试样制备红细胞悬浮液；

第1红细胞变形能力计算步骤，使所述红细胞悬浮液从第1滤器通过，分离成未通过第1滤器的老化红细胞和通过第1滤器的未老化红细胞，并且算出包含于所述红细胞悬浮液中的红细胞的变形能力；

第2红细胞变形能力计算步骤，使经所述分离的未老化红细胞悬浮液从具有直径小于所述第1滤器的微孔的第2滤器通过，分离成未通过第2滤器的轻度老化红细胞和通过第2滤器的幼红细胞，并且算出包含于所述未老化红细胞悬浮液中的未老化红细胞的变形能力；和

评价步骤，使用在所述第1红细胞变形能力计算步骤中算出的红细胞的变形能力和在所述第2红细胞变形能力计算步骤中算出的未老化红细胞的变形能力，对红细胞的老化程度进行评价。

[2]如上述[1]所述的红细胞老化程度评价方法，其特征在于，在第1红细胞变形能力计算步骤和/或第2红细胞变形能力计算步骤中，进一步算出红细胞的通过比例，将该通过比例用于评价步骤的评价中。

[3]如上述[1]或[2]所述的红细胞老化程度评价方法，其特征在于，第1滤器的微孔的直径为5.50～8.00μm。

[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的红细胞老化程度评价方法，其特征在于，第2滤器的微孔的直径为3.00～6.00μm。

发明效果

通过本发明的红细胞老化程度评价方法，能够更高精度且恰当地评价红细胞的老化程度。因此，能够正确地检测毛细血管的幽灵化的可能性，能够应用于各种疾病的诊断中。

附图说明

[图1]为本发明的一个实施方式所涉及的红细胞老化程度评价方法的流程图。

[图2]为用于本发明的一个实施方式所涉及的红细胞老化程度评价方法中的装置的概略说明图。

[图3]为示出由图2所示的装置的测定结果得到的“高度-时间曲线”的图。

[图4]为示出使用本发明的多阶段方法的情况下(实施例1)、通过滤器时的红细胞的变形能力的图。

[图5]为示出使用以往的单阶段方法的情况下、通过滤器时的红细胞的变形能力的图。

[图6]为示出使用本发明的多阶段方法的情况下(实施例1)、通过了滤器的红细胞数(比例)的图。

[图7]为示出使用以往的单阶段方法的情况下、通过了滤器的红细胞数(比例)的图。

具体实施方式

本发明的红细胞老化程度评价方法是使用至少两种具有多个均匀的微孔的滤器对红细胞的老化程度进行评价的方法，其特征在于，具有以下步骤：红细胞悬浮液制备步骤，由血液试样制备红细胞悬浮液；第1红细胞变形能力计算步骤，使红细胞悬浮液从第1滤器通过，分离成未通过第1滤器的老化红细胞和通过第1滤器的未老化红细胞，并且算出包含于红细胞悬浮液中的红细胞的变形能力；第2红细胞变形能力计算步骤，使经分离的未老化红细胞悬浮液从具有直径小于第1滤器的微孔的第2滤器通过，分离成未通过第2滤器的轻度老化红细胞和通过第2滤器的幼红细胞，并且算出包含于未老化红细胞悬浮液中的未老化红细胞的变形能力；和评价步骤，使用在第1红细胞变形能力计算步骤中算出的红细胞的变形能力和在第2红细胞变形能力计算步骤中算出的未老化红细胞的变形能力，对红细胞的老化程度进行评价。

本发明的红细胞老化程度评价方法可以使用记载于“丸山彻，冈本和彦，基于镍网过滤法的红细胞变形能力的定量分析(ニッケルメッシュ濾過法による赤血球変形能の定量的解析)，福冈医学杂志，95(6)，131-138(2004)”中的红细胞变形能力测定装置进行评价。

本发明的红细胞老化程度评价方法中，优选在第1红细胞变形能力计算步骤和/或第2红细胞变形能力计算步骤中算出红细胞的通过比例，并将该通过比例用于评价步骤的评价中。由此，能够更精确地评价红细胞的老化程度。

另外，本发明的方法中还可以设置使用第3滤器的第3红细胞变形能力计算步骤、使用第4滤器的第4红细胞变形能力计算步骤等进一步的红细胞变形能力计算步骤，利用在这些步骤中算出的红细胞的变形能力、通过比例进行评价。

下面，对本发明的红细胞老化程度评价方法进行详细说明。

如图1所示，本发明的一个实施方式所涉及的红细胞老化程度评价方法依次具有红细胞悬浮液制备步骤(S1)、第1红细胞变形能力计算步骤(S2)、第2红细胞变形能力计算步骤(S3)和评价步骤(S4)。

<红细胞悬浮液制备步骤>

红细胞悬浮液制备步骤(S1)是由血液试样制备红细胞悬浮液的步骤，例如是将采集自受试者的血液试样进行清洗、制备红细胞悬浮液的步骤。具体而言，例如，首先将对所采集的血液进行离心并用缓冲液清洗的处理重复多次，之后，用缓冲液进行稀释以使得红细胞比容(HCT)成为规定浓度，制备红细胞悬浮液。

<第1红细胞变形能力计算步骤>

第1红细胞变形能力计算步骤(S2)是使在红细胞悬浮液制备步骤(S1)中制备的红细胞悬浮液从第1滤器通过，分离成未通过第1滤器的老化红细胞和通过第1滤器的未老化红细胞，并且算出包含于红细胞悬浮液中的红细胞的变形能力的步骤。

作为用于本发明的第1滤器，为了确保高的定量性和重现性，微孔的形状、数量和分布全都均匀的滤器是优选的，例如，可以举出组合光致抗蚀剂法和特殊镀覆法制造而成的镍网滤器。需要说明的是，第1滤器的结构优选为难以对在制备红细胞悬浮液时混入的白细胞施加机械性刺激的结构。

作为第1滤器的微孔的直径，可以根据受试者的状况适当改变，但通常，优选为5.50～8.00μm，更优选为5.60～7.00μm，进一步优选为5.70～6.50μm。

在该步骤中，算出红细胞的变形能力。该变形能力为表示包含于红细胞悬浮液中的红细胞(未老化红细胞)通过第1滤器的能力的指标，可以使用红细胞悬浮液通过滤器的微孔时的压力差、通过规定量的红细胞悬浮液的通过时间、红细胞的流量(流速：Q)等由所谓的过滤法算出的各种数值。

作为本发明的变形能力的计算方法，具体可以使用例如图2所示那样的装置进行计算。如图2所示，向垂直竖立的玻璃管1上，介由Tygon管安装镍网滤器2(例如微孔的直径为6.0μm)，自规定的高度(例如15cm)过滤红细胞悬浮液。通过连续地测定此时的压力，得到高度(图2中的h)-时间曲线(参见图3)。与同样地得到的不含红细胞的缓冲液的高度-时间曲线进行比较，比较下降至规定高度(例如10cm)时的时间，将变形能力数值化。

在该步骤中，优选进一步算出红细胞的通过比例，即未通过第1滤器的老化红细胞、和通过第1滤器的未老化红细胞的比例。通过将该通过比例用于评价步骤中，能够进行更精确的评价。通过比例的计算可以使用以往已知的血细胞分析装置等，通过测量包含于红细胞悬浮液中的红细胞的总数、老化红细胞的数量和未老化红细胞的数量中的至少两者而求出。

<第2红细胞变形能力计算步骤>

第2红细胞变形能力计算步骤(S3)是使经上述第1红细胞变形能力计算步骤(S2)分离的未老化红细胞悬浮液从具有直径小于第1滤器的微孔的第2滤器通过，分离成未通过第2滤器的轻度老化红细胞和通过第2滤器的幼红细胞，并且算出包含于未老化红细胞悬浮液中的未老化红细胞的变形能力的步骤。

用于该步骤的未老化红细胞悬浮液可以直接使用经第1红细胞变形能力计算步骤(S2)分离得到的物质，也可以用缓冲液进行稀释以使得红细胞比容(HCT)成为规定浓度并加以使用。

该步骤的处理基本上与第1红细胞变形能力计算步骤(S2)的处理相同，但使用的滤器不同。即，在该步骤中，使用具有直径小于第1滤器的微孔的第2滤器。作为第2滤器的微孔的直径，可以根据第1红细胞变形能力计算步骤(S2)的结果适当改变，但通常，优选为3.00～6.00μm，更优选为3.50～5.80μm，进一步优选为4.00～5.50μm，特别优选为4.50～5.50μm。另外，与第1滤器的微孔的直径之差优选为0.1～2.0μm，更优选为0.3～1.5μm，进一步优选为0.5～1.0μm。

<评价步骤>

评价步骤(S4)是使用在第1红细胞变形能力计算步骤中算出的红细胞的变形能力和在第2红细胞变形能力计算步骤中算出的未老化红细胞的变形能力，对红细胞的老化程度进行评价的步骤。在该步骤中，优选的是，除了上述红细胞和未老化红细胞的变形能力外，还追加使用在第1红细胞变形能力计算步骤和/或第2红细胞变形能力计算步骤中算出的红细胞的通过比例来对红细胞的老化进行评价。由此，能够进行更精确的评价。

具体而言，在该步骤中，变形能力低的情况下，评价为红细胞已老化，进而同时地或追加地考虑基于通过比例的评价(通过比例越少，红细胞越老化)，来对红细胞的老化程度进行评价。由此，能够正确地检测毛细血管的幽灵化的可能性，能够应用于皱纹、松弛等皮肤状态的诊断、骨质疏松、痴呆症、生活习惯病(糖尿病、高胆固醇血症等)等的诊断中，疾病的早期发现成为可能。

尤其是，本发明的红细胞老化程度评价方法利用至少2个以上的分离步骤中的变形能力(和通过比例)进行评价，因此能够比以往更精确地评价红细胞的老化程度。另外，根据受试者的状况(年龄、血压、所患疾病、慢性病等)，通过改变滤器的微孔的尺寸的组合，能够更恰当地进行评价。

下面，通过实施例来具体地说明本发明。需要说明的是，本发明不限于这些实施例。本实施例的基本操作概略如图1所示。

[基本操作]

(红细胞悬浮液制备步骤)

首先，将自受试者采集的血液30cc用离心分离机以2500rpm的转速离心分离10分钟，用缓冲液进行清洗。然后，将转速依次变更为1950rpm、1700rpm、1550rpm而重复进行离心(各10分钟)及利用缓冲液的清洗，得到洗净的红细胞。将得到的洗净的红细胞用缓冲液稀释，制备红细胞比容(HCT)为3％的红细胞悬浮液。用血细胞分析装置测量每1μL红细胞悬浮液的红细胞数。

(第1红细胞变形能力计算步骤(阶段1))

使用如图2所示的设置有6.00μm镍网滤器的测定装置。用送液泵将红细胞悬浮液送入玻璃管，测定变形能力。另外，用血细胞分析装置测量通过了6.00μm镍网滤器的未老化红细胞的每1μL中的红细胞数。

(第2红细胞变形能力计算步骤(阶段2))

用缓冲液稀释未老化红细胞悬浮液，制备未老化红细胞悬浮液。将测定装置内部用缓冲液清洗后，将6.00μm镍网滤器更换为5.31μm镍网滤器。用送液泵将未老化红细胞悬浮液送入玻璃管，测定变形能力。另外，用血细胞分析装置测量通过了5.31μm镍网滤器的幼红细胞悬浮液的每1μL中的红细胞数。

(评价步骤)

使用所获得的各变形能力、各红细胞数，对血液的老化程度进行评价。

[实施例1]

下面示出按照上述基本操作、使用自真人采集的血液对血液的老化程度进行评价的例子。

通过在上述红细胞悬浮液制备步骤中示出的方法，由自人采集的血液制备HCT3％的红细胞悬浮液(样品液)。此时的样品液的红细胞数为32×10

另外，作为比较，制备向该样品液中添加500mM使红细胞变形能力降低的自由基产生物质AAPH(2,2’-偶氮二-2-甲基-丙基脒二盐酸盐)而得到的比较样品液(红细胞数为32×10

通过利用6.00μm镍网滤器的上述第1红细胞变形能力计算步骤(阶段1)中的方法，测定变形能力和红细胞数。如图4(左侧各图)所示，阶段1中的样品液的变形能力为93％，比较样品的变形能力为90％。另外，如图6(左侧各图)所示，通过了阶段1中的滤器的样品液的红细胞为26×10

需要说明的是，如下求出红细胞的变形能力(％)。

使红细胞悬浮液(样品液或比较样品液)自15cm的高度通过镍网滤器，连续地检测通过期间的压力变化，得到高度-时间曲线，以不含红细胞的缓冲液的高度-时间曲线作为对照，对红细胞的变形能力进行评价。将下降至10cm的时间点的变形能力与对照进行比较并数值化。

第1红细胞变形能力计算步骤(阶段1)后的样品液和比较样品液的红细胞数经稀释调整为9×10

如图4(右侧各图)所示，阶段2中的样品液的变形能力为95％，比较样品的变形能力为66％，呈现出接近30％的大的差异。另外，如图6(右侧各图)所示，通过了阶段2中的滤器的样品液的红细胞为8×10

另一方面，如图5所示，在仅利用5.31μm镍网滤器的以往的单阶段方法(样品液的红细胞数为34×10

如上所述，通过本发明的多阶段的方法，能够精度良好地掌握红细胞的状态，使正确的评价成为可能，并且能够更精细地进行优劣的分类。

产业实用性

本发明的红细胞老化程度评价方法可以对红细胞的老化程度进行评价，因此在产业上是有用的。

附图标记说明

1 玻璃管

2 镍网滤器

3 恒温水槽