新型罗汉果苷、获得新型罗汉果苷的方法及用途

摘要

本文提供了新型罗汉果苷和包含所述新型罗汉果苷的组合物，包括消费品。还提供了通过纯化和/或生物转化获得所述新型罗汉果苷的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月23日提交的美国临时专利申请第62/661,422号的优先权，该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及新型罗汉果苷，以及包含此类新型罗汉果苷的组合物，包括消费品。本发明进一步扩展到通过生物转化和/或纯化从例如罗汉果提取物中获得新型罗汉果苷的方法。

发明背景

天然有热量的糖诸如蔗糖、果糖和葡萄糖被用来给饮料、食品、药物和口腔卫生/化妆品产品提供令人愉悦的味道。特别地，蔗糖赋予消费者偏爱的味道。虽然蔗糖提供了优越的甜度特性，但它不利地是热量型的。

已经引入无热量或低热量甜味剂以满足消费者需求。然而，无热量和低热量的甜味剂以挫败消费者的方式尝起来不同于天然热量型糖。基于味道，无热量或低热量甜味剂表现出不同于糖的时间特征曲线、最大响应、风味特征曲线、口感和/或适应行为。具体地，无热量或低热量甜味剂表现出延迟的甜度起始、存留的甜回味、苦味、金属味、涩味、清凉味(cooling taste)和/或像甘草的味道。从来源来看，许多无热量甜味剂或低热量甜味剂是合成甜味剂。消费者对尝起来像蔗糖的天然无热量或低热量甜味剂的期望仍然很高。

罗汉果(Luo Han Guo)是由罗汉果(Siraitia grosvenorii)的果实制成的甜提取物的常用名称，罗汉果是一种原产自中国南方和泰国北部的葫芦科藤本植物。罗汉果提取物的甜度是糖的近250倍并且因为无热量且是天然来源的而受到欢迎。

罗汉果提取物的甜度通常归因于果实肉质部分中以约1重量％的水平存在的罗汉果苷。提取鲜果和干果均得到罗汉果苷含量为80％或更高的粉末。但是，一些罗汉果苷，诸如罗汉果苷III和罗汉果苷IIE可能无味或甚至是苦的。罗汉果提取物还可能含有多种杂质，这些杂质具有可影响罗汉果提取物的颜色、气味和味道特征的不良感官特性。

仍然需要天然、无热量的甜味剂。

仍然进一步需要用于从罗汉果提取物制备和纯化罗汉果苷的方法。

发明概述

一方面，提供了罗汉果苷V、罗汉果IIIE和罗汉果IV的新型衍生物。本发明的罗汉果苷V衍生物属于下文所述的式I、式II或式III。本发明的罗汉果苷IIIE衍生物属于下文所述的式IV和式V。本发明的罗汉果苷IV衍生物属于下文所述的式VII和式VIII。另一方面，本发明是包含本文所述的本发明的至少一种罗汉果苷的组合物。在一个具体实施例中，本发明是包含本文所述的至少一种经分离并纯化的罗汉果苷的组合物。

在一个实施例中，本发明是包含本文所述的本发明的至少一种罗汉果苷的甜味剂组合物。在一个具体实施例中，本发明是包含本文所述的本发明的至少一种经分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物。

在又一个实施例中，本发明是包含本文所述的本发明的至少一种罗汉果苷的消费品。合适的消费品包括但不限于基于液体的或干燥的消费品，例如药物组合物、可食用凝胶混合物和组合物、牙科组合物、食品、饮料和饮料产品。

另一方面，本发明是制备本发明的罗汉果苷(也称为“目标罗汉果苷”)的方法，该方法包括使包含选自罗汉果苷IV、罗汉果苷V和罗汉果苷IIIE的起始罗汉果苷的介质与生物催化剂接触，从而产生包含目标罗汉果苷的组合物。

介质可以进一步包含例如生物催化剂的共底物以充当葡萄糖源。示例性共底物包括但不限于蔗糖、葡萄糖-1-氟化物、糊精、可溶性淀粉和UDP-葡萄糖。

生物催化剂可以是纯化的酶、粗裂解物或全细胞悬液。替代性地，生物催化剂可以以细胞或微生物的形式提供。

起始罗汉果苷和生物催化剂的特性决定了目标罗汉果苷的特性。

可以从介质中分离出目标罗汉果苷，以提供分离的目标罗汉果苷组合物，可以任选地对分离的目标罗汉果苷组合物进行后续纯化，以提供包含至少约80重量％的目标罗汉果苷的纯化的目标罗汉果苷组合物。纯化可以通过本领域技术人员已知的任何手段实现，这些手段包括但不限于，结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。

本发明还提供了纯化本发明的罗汉果苷的方法，该方法包括(i)使包含含有本发明的罗汉果苷的源材料的溶液通过HPLC柱，并且(ii)将包含本发明的罗汉果苷的级分洗脱以提供包含至少约80重量％的本发明的罗汉果苷的纯化罗汉果苷组合物。示例性源材料包括但不限于罗汉果苷混合物、罗汉果提取物(商业或制备的)以及由本文所述的生物转化过程产生的组合物。

附图说明

图1：在4℃的水中CC-00371和CC-00367与Reb M 95％(全部在400ppm下)相比的味道属性比较。

图2：示出了在CD

图3：示出了在CD

图4：示出了在CD

图5：示出了在CD

图6：示出了在CD

图7：示出了在CD

图8：示出了在CD

图9：示出了在CD

具体实施方式

本发明总体上涉及可用作甜味剂的新型罗汉果苷，尤其是罗汉果苷V、罗汉果苷IIIE和罗汉果苷IV的衍生物。

本发明进一步扩展到通过从罗汉果提取物中纯化或通过从其他罗汉果苷生物转化而获得本文所述的新型罗汉果苷的方法。

本发明还涉及包含新型罗汉果苷的组合物(包括消费品)，以及使用这些新型罗汉果苷和组合物来增强消费品甜度的方法。

I.化合物

一方面，本发明提供了新型罗汉果苷化合物。

罗汉果苷V具有以下结构：

罗汉果苷V含有五个悬挂于罗汉果醇核上的葡萄糖单元。核与C24和C3处的葡萄糖取代基之间的所有连键以及葡萄糖单元之间的所有连键均为β-连键。(i)GlcI与Glc II之间以及(ii)GlcIV与GlcV之间存在β1→6连键。Glc I与Glc III之间存在β1→2连键。

作为罗汉果苷V衍生物的本发明的新型化合物还含有与罗汉果苷V相同构型的GlcI-IV，在GlcII、GlcIII或GlcV上具有另外的葡萄糖取代基。

本发明提供了式I的新型罗汉果苷：

其中GlcII和GlcVII键合在R

Glc II与Glc VII之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式I的罗汉果苷选自以下这些：

本发明还提供了式II的新型罗汉果苷：

其中GlcIII和GlcVII键合在R

Glc III与Glc VII之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式II的罗汉果苷如下：

本发明还提供了式III的新型罗汉果苷：

其中GlcV和GlcVII键合在R

Glc V与Glc VII之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式III的罗汉果苷选自以下这些：

罗汉果苷IIIE具有以下结构：

罗汉果苷IIIE含有三个悬挂于罗汉果醇核上的葡萄糖单元。核与C24和C3处的葡萄糖取代基之间的所有连键以及葡萄糖单元之间的所有连键均为β-连键。Glc I与Glc III之间存在β1→2连键。

作为罗汉果苷IIIE衍生物的本发明的新型化合物还含有与罗汉果苷IIIE相同构型的Glc I、GlcIII和GlcIV，在GlcIII上具有另外的葡萄糖取代基。

本发明提供了式IV的新型罗汉果苷：

其中GlcIII和GlcVII键合在R

Glc III与Glc VII之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，R

在一个具体实施例中，式IV的罗汉果苷选自以下这些：

在另一个实施例中，本发明提供了式V的罗汉果苷：

其中GlcIV和GlcVII键合在R

Glc IV与Glc VII之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，R

在一个具体实施例中，式V的罗汉果苷选自以下这些：

罗汉果苷IV具有以下结构：

罗汉果苷IV含有四个悬挂于罗汉果醇核上的葡萄糖单元。核与C24和C3处的葡萄糖取代基之间的所有连键以及葡萄糖单元之间的所有连键均为β-连键。

作为罗汉果苷IV衍生物的本发明的新型化合物还含有与罗汉果苷IV相同构型的Glc I、GlcIII、GlcIV和Glc V，并且具有另外的葡萄糖取代基。

本发明提供了式VI的新型罗汉果苷：

其中GlcI和GlcVII键合在R

(i)Glc I与Glc VII之间和(ii)Glc IV与GlcVI之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式VI的罗汉果苷如下：

在另一个实施例中，本发明提供了式VII的罗汉果苷：

其中GlcIV和GlcVI键合在R

Glc IV与GlcVI之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式VII的罗汉果苷如下：

在另一个实施例中，本发明提供了式VIII的罗汉果苷：

其中GlcV和GlcVI键合在R

Glc V与GlcVI之间的键可以是α-连键或β-连键。更特别地，这些键可以选自β-(1,2)-连键、β-(1,3)-连键、β-(1,4)-连键、β-(1,6)-连键、α-(1,2)-连键、α-(1,3)-连键、α-(1,4)-连键、α-(1,6)-连键。

在一个具体实施例中，式VIII的罗汉果苷如下：

在示例性实施例中，将本发明的罗汉果苷分离并纯化。如本文所用，术语“分离并纯化”意指按干重计罗汉果苷为约90重量％或更高，即，纯度高于90％。混合物的其余部分通常是其他罗汉果苷和/或罗汉果提取物。在更具体的实施例中，本文所述的式的罗汉果苷具有约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高或者约99％或更高的纯度。

在一些实施例中，本发明的罗汉果苷是甜的。给定组合物的甜度通常参考蔗糖溶液来测量。通常参见"A Systematic Study of Concentration-Response Relationshipsof Sweeteners[甜味剂的浓度-反应关系的系统研究],"G.E.DuBois,D.E.Walters,S.S.Schiffman,Z.S.Warwick,B.J.Booth,S.D.Pecore,K.Gibes,B.T.Carr和L.M.Brands，Sweeteners:Discovery,Molecular Design and Chemoreception[甜味剂：发现、分子设计和化学感受],D.E.Walters,F.T.Orthoefer和G.E.DuBois编辑，华盛顿特区美国化学学会(American Chemical Society,Washington,DC)(1991),第261-276页。

非蔗糖甜味剂的甜度可以相对于蔗糖参照物通过测定非蔗糖甜味剂的蔗糖等效值(SE)来测量。典型地，对味道专家组成员进行培训以检测含有1％-15％之间的蔗糖(w/v)的参考蔗糖溶液的甜度。然后在一系列稀释度下品尝其他非蔗糖甜味剂，以确定与给定百分比的蔗糖参照物一样甜的非蔗糖甜味剂的浓度。例如，如果甜味剂的1％溶液与10％蔗糖溶液一样甜，则将该甜味剂称为效力是蔗糖的10倍，并且具有10％的蔗糖等效值。

在一个实施例中，罗汉果苷以当被添加到消费品中提供大于约2％(w/v)，例如大于约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％或约14％的蔗糖等效值的量存在。

可以用白利糖度(°Bx)描述在参照溶液中的蔗糖的量，并因此描述甜度的另一种度量。一白利糖度是在100克溶液中有1克蔗糖，并且表示作为重量百分比的该溶液的强度(％w/w)(严格地说，按质量计)。在一个实施例中，本发明的罗汉果苷以当被添加到消费品中时提供约0.50至14白利糖度，例如约5白利糖度、约6白利糖度、约7白利糖度、约8白利糖度、约9白利糖度或约10白利糖度或更高的甜度等效值的量存在。

在示例性实施例中，与部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物相比，本发明的分离并纯化的罗汉果苷的甜度高约30％或更多，例如约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多或者约90％或更多。

在其他示例性实施例中，与部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物相比，本发明的分离并纯化的罗汉果苷的苦味(由某些物质如奎宁、咖啡因和蔗糖八乙酸酯刺激的味道)低至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，本发明的分离并纯化的罗汉果苷基本上没有苦味。测量化合物苦味的方法是本领域已知的。

在另外其他示例性实施例中，与部分纯化的罗汉果苷或罗汉果苷或罗汉果提取物相比，本发明的分离并纯化的罗汉果苷的存留甜回味(吐出后的甜味强度)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，本发明的分离的罗汉果苷基本上没有存留甜回味。测量存留甜回味的方法在本领域中是已知的。

在另外其他示例性实施例中，与部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物相比，本发明的分离并纯化的罗汉果苷的金属味(与金属锡或铁相关的味道)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，本发明的分离并纯化的罗汉果苷基本上没有金属味。

在示例性实施例中，与部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物相比，本发明的分离并纯化的罗汉果苷表现出高至少约30％的最大响应(随着化合物浓度增加而达到的最大甜度(％SE))，例如高至少约40％、高至少约50％、高至少约60％、高至少约70％、高至少约80％或高至少约90％。测量化合物的最大响应的方法是本领域已知的。在一个实施例中，该方法是体外细胞测定法。在一些实施例中，细胞表达甜味受体或甜味受体的二聚体。

在其他示例性实施例中，本发明的分离并纯化的罗汉果苷表现出的甜度起始(经历最大甜度的时间)比部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物短至少约30％，例如短至少约40％、短至少约50％、短至少约60％、短至少约70％、短至少约80％或短至少约90％。测量甜度起始的方法是本领域已知的。在一个实施例中，该方法是体外细胞测定法。在一些实施例中，细胞表达甜味受体或甜味受体的二聚体。

II.组合物

本发明包括含有本发明的至少一种罗汉果苷的组合物。如本文所用的术语“组合物”是指本发明的至少一种罗汉果苷和至少一种其他物质的混合物，其中该罗汉果苷与该至少一种其他物质配混。如本文所用，“配混”意指混杂或添加到别的东西中，但在任何情况下，均需要主动步骤。

在一个具体实施例中，该至少一种其他物质在自然界中(即罗汉果提取物中)不与该罗汉果苷一起存在和/或不与该罗汉果苷配混。因此，本发明考虑的组合物在自然界中不存在。

在一个实施例中，本发明是包含本发明的至少一种罗汉果苷的组合物，该罗汉果苷作为混合物的一部分提供。在一个特定的实施例中，该混合物选自由以下项组成的组：罗汉果苷混合物、罗汉果提取物、其他罗汉果分离和纯化过程的副产物、市售罗汉果提取物或其任何组合。

在一个实施例中，该混合物包含本发明的至少一种罗汉果苷，其量的范围按干重计为约1％至约99％，例如按干重计为约5％至约99％、约10％至约99％、约20％至约99％、约30％至约99％、约40％至约99％、约50％至约99％、约60％至约99％、约70％至约99％、约80％至大约99％以及约90％至约99％。在一个具体实施例中，该混合物包含按干重计大于约90％，例如大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％以及大于约99％的量的本发明的至少一种罗汉果苷。

在一个具体实施例中，混合物是罗汉果提取物。

该混合物可含一种或多种另外的罗汉果苷，即不是本发明的新型罗汉果苷的罗汉果苷，包括但不限于grosmogroside I、罗汉果苷IA、罗汉果苷IE、11-氧代罗汉果苷IA、罗汉果苷II、罗汉果苷II A、罗汉果苷II B、罗汉果苷II E、7-氧代罗汉果苷II E、罗汉果苷III、罗汉果苷Ille、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、11-氧代罗汉果苷IV、11-氧代罗汉果苷IV A、罗汉果苷V、异罗汉果苷V、11-脱氧罗汉果苷V、7-氧代罗汉果苷V、11-氧代罗汉果苷V、异罗汉果苷V、罗汉果苷VI、罗汉果醇、11-氧代罗汉果醇、翅子罗汉果I、罗汉果-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[P-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}及其组合。

在一个实施例中，本发明是包含至少一种本文所述的罗汉果苷的组合物，该罗汉果苷作为纯化合物提供，即，基于干重纯度>99％。

本发明的罗汉果苷可以当将组合物添加到消费品中时有效提供约1ppm至约10,000ppm，例如约1ppm至约4,000ppm、约1ppm至约3,000ppm、约1ppm至约2,000ppm、约1ppm至约1,000ppm的本发明的罗汉果苷浓度的量存在于该组合物中。

在另一个实施例中，本发明的罗汉果苷以当将组合物添加到消费品中时有效提供约10ppm至约1,000ppm，例如约10ppm至约800ppm、约50ppm至约800ppm或约50ppm至约600ppm的本发明的罗汉果苷浓度的量存在于该组合物中。

在一些实施例中，本发明的罗汉果苷是甜的。因此，本发明还提供了包含本发明的至少一种罗汉果苷的甜味剂组合物。如本文所用的术语“甜味剂组合物”是指本发明的至少一种罗汉果苷和至少一种其他物质的混合物，其中该至少一种罗汉果苷与该至少一种其他物质配混。

在一个具体实施例中，该至少一种其他物质在自然界中不与该罗汉果苷一起存在和/或不与该罗汉果苷配混。因此，本发明考虑的甜味剂组合物在自然界中不存在。在一个实施例中，该至少一种其他物质调节该至少一种罗汉果苷的味道特征，以提供与自然界中的该罗汉果苷和(如果适用的话)自然界中的该至少一种其他物质相比味道特征更像蔗糖的组合物。例如，在某些实施例中，该组合物表现出一种或多种以下特性：改善的甜度效力、改善的口感、缩短的甜度存留性、减少的苦味和/或减少的金属味。

在某些示例性实施例中，该甜味剂组合物包含本发明的至少一种纯化罗汉果苷。

在一个实施例中，本发明的罗汉果苷是甜味剂组合物中唯一的甜味剂，即，该罗汉果苷是甜味剂组合物中存在的提供可检测甜度的唯一化合物。

在进一步的实施例中，该甜味剂组合物包含本发明的至少一种罗汉果苷与至少一种另外的甜味剂的组合。在一个具体实施例中，该至少一种另外的甜味剂在自然界中不与该罗汉果苷一起存在。在一个更具体的实施例中，甜味剂组合物包含至少一种纯化的罗汉果苷和在自然界中不与该罗汉果苷一起存在的至少一种另外的甜味剂。

在该甜味剂组合物中的本发明的罗汉果苷的量可以变化。在一个实施例中，当甜味剂组合物添加到消费品中时，本发明的罗汉果苷是以赋予所需甜度的任何量存在于甜味剂组合物中。在一个具体实施例中，本发明的罗汉果苷以高于其阈值甜度识别浓度的浓度存在。

在一个实施例中，本发明的罗汉果苷以将甜味剂组合物添加到消费品中时有效提供大于约2％(w/v)，例如大于约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％或约14％的蔗糖等效值的量存在于甜味剂组合物中。

在一些实施例中，本发明的罗汉果苷以当添加到消费品中时，将会提供约1ppm至约100ppm，例如约1ppm至约90ppm、约5ppm至约80ppm、约5ppm至约70ppm、约5ppm至约60ppm、约5ppm至约50ppm、约5ppm至约40ppm、约5ppm至约30ppm、约5ppm至约20ppm或5ppm至约15ppm的本发明的罗汉果苷浓度的量存在于甜味剂组合物中。

在其他实施例中，本发明的罗汉果苷以当添加到消费品中时将会提供高于约10ppm，例如高于约20ppm、约30ppm、约40ppm、约50ppm、约60ppm、约70ppm、约80ppm、约90ppm、约100ppm、约200ppm、约300ppm、约400ppm、约500ppm、约600ppm、约700ppm、约800ppm或约900ppm的本发明的罗汉果苷浓度的量存在于甜味剂组合物中。

在另外其他实施例中，本发明的罗汉果苷以当添加到消费品中时将会提供约1ppm至约1,000ppm，例如约10ppm至约1,000ppm、约20ppm至约1,000ppm、约30ppm至约1,000ppm、约30ppm至约1,000ppm、约40ppm至约1,000ppm、约50ppm至约1,000ppm、约60ppm至约1,000ppm、约70ppm至约1,000ppm、约80ppm至约1,000ppm、约90ppm至约1,000ppm、约100ppm至约1,000ppm、约200ppm至约1,000ppm、约300ppm至约1,000ppm、约400ppm至约1,000ppm、约500ppm至约1,000ppm、约600ppm至约1,000ppm、约700ppm至约1,000ppm、约800ppm至约1,000ppm、约900ppm至约1,000ppm或约50ppm至约600ppm的本发明的罗汉果苷浓度的量存在于甜味剂组合物中。

在一个实施例中，该甜味剂是至少一种天然高效甜味剂。如本文所用，短语“天然高效甜味剂”是指在自然界中天然地发现并且在特征方面具有大于蔗糖、果糖、或葡萄糖的甜度效力，又具有较小卡路里的任何甜味剂。天然高效甜味剂可以作为纯化合物或替代性地作为提取物的一部分来提供。

在另一个实施例中，该甜味剂是至少一种合成甜味剂。如本文所用，短语“合成的甜味剂”是指在自然界中未天然地发现并且在特征方面具有大于蔗糖、果糖或葡萄糖的甜度效力，又具有较小卡路里的任何组合物。

在另外其他实施例中，考虑了天然高效甜味剂和合成甜味剂的组合。

在其他实施例中，该甜味剂是至少一种碳水化合物甜味剂。合适的碳水化合物甜味剂选自但不限于由以下项组成的组：蔗糖、甘油醛、二羟基丙酮、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、松二糖、唾液糖及其组合。

其他合适的甜味剂包括：莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、杜克苷B、甜茶苷、甜叶菊、甜菊苷、罗汉果苷IV、罗汉果苷IVA、罗汉果苷V、罗汉果苷VI、罗汉果苷IIIE、异罗汉果苷V、赛门苷I、莫那甜及其盐(莫那甜SS、RR、RS、SR)、仙茅甜蛋白(curculin)、甘草酸及其盐、索马甜、莫内林(monellin)、马宾灵(mabinlin)、布拉齐因(brazzein)、荷南度辛(hernandulcin)、叶甘素、根皮酚苷、根皮苷、三叶苷、白元参苷(baiyunoside)、欧亚水龙骨甜素(osladin)、聚波朵苷(polypodoside)A、蝶卡苷(pterocaryoside)A、蝶卡苷B、慕库若苷(mukurozioside)、弗米索苷(phlomisoside)I、巴西甘草甜素(periandrin)I、相思子三萜苷(abrusoside)A、甜菊双糖苷以及青钱柳苷I、糖醇类如赤藓糖醇、三氯蔗糖、乙酰舒泛钾、安赛蜜酸及其盐、阿司帕坦、阿力甜、糖精及其盐、新橙皮苷二氢查耳酮、环己基氨基磺酸盐、环己氨磺酸及其盐、纽甜、糖精(advantame)、糖基化的甜菊醇糖苷(GSG)及其组合。

在一个具体实施例中，该甜味剂是至少一种提供热量的碳水化合物甜味剂。因此，掺入该甜度增强剂降低了在给定消费品中必须使用以实现特定SE的提供热量的碳水化合物甜味剂的量，由此允许制备热量降低的消费品。

在一个实施例中，甜味剂是热量型甜味剂或热量型甜味剂的混合物。在另一个实施例中，热量型甜味剂选自蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米/淀粉糖浆、甜菜糖、甘蔗糖及其组合。

在另一个实施例中，甜味剂是稀有糖，该稀有糖选自：阿卢糖、山梨糖、来苏糖、核酮糖、木糖、木酮糖、D-阿洛糖、L-核糖、D-塔格糖、L-葡萄糖、L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、松二糖、曲二糖及其组合。

在又一个实施例中，甜味剂是至少一种天然高效甜味剂和至少一种碳水化合物甜味剂的混合物。在再一个实施例中，甜味剂是至少一种合成甜味剂和至少一种碳水化合物甜味剂的混合物。在进一步的实施例中，甜味剂是至少一种天然高效甜味剂、至少一种合成甜味剂和至少一种碳水化合物甜味剂。

在示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应甜味剂组合物相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物的甜度高约30％或更多，例如约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多或约90％或更多。

在其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应组合物相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物的苦味(由某些物质如奎宁、咖啡因和蔗糖八乙酸酯刺激的味道)低至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物基本上没有苦味。测量化合物苦味的方法是本领域已知的。

在另外其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应甜味剂组合物相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物的存留甜回味(吐出后的甜味强度)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物基本上没有存留甜回味。测量存留甜回味的方法在本领域中是已知的。

在另外其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应甜味剂组合物相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物的金属味(与金属锡或铁相关的味道)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物基本上没有金属味。

在示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应甜味剂组合物相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物表现出高至少约30％的最大响应(随着化合物浓度增加而达到的最大甜度(％SE))，例如高至少约40％、高至少约50％、高至少约60％、高至少约70％、高至少约80％或高至少约90％。测量化合物的最大响应的方法是本领域已知的。

在其他示例性实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的甜味剂组合物表现出的甜度起始(经历最大甜度的时间)比包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的甜味剂组合物短至少约30％，例如短至少约40％、短至少约50％、短至少约60％、短至少约70％、短至少约80％或短至少约90％。测量甜度起始的方法是本领域已知的。

除了本发明的至少一种罗汉果苷外，组合物还可以包含一种或多种下文详述的添加剂和/或功能性成分。

示例性添加剂包括但不限于碳水化合物、多元醇、氨基酸及其相应盐、聚氨基酸及其相应盐、糖酸及其相应盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐(包括有机酸盐和有机碱盐)、无机盐、苦味化合物、咖啡因、调味剂和调味成分、涩味化合物、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、植物提取物、类黄酮、醇、聚合物及其组合。

在一个实施例中，组合物进一步包含一种或多种多元醇。如本文所用，术语“多元醇”是指含有超过一个羟基的分子。多元醇可以是分别含有2个、3个和4个羟基的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇还可以含有超过4个羟基，如分别含有5个、6个或7个羟基的五元醇、六元醇、七元醇等。另外，多元醇还可以是作为碳水化合物的还原形式的糖醇、多羟基醇或多元醇，其中羰基(醛或酮，还原糖)已被还原成伯羟基或仲羟基。

在一些实施例中多元醇的非限制性实例包括麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油(丙三醇)、苏糖醇、半乳糖醇、帕拉金糖、还原性低聚异麦芽糖、还原性低聚木糖、还原性低聚龙胆糖、还原性麦芽糖糖浆、还原性葡萄糖糖浆以及糖醇或能够被还原的不会不利地影响味道的任何其他碳水化合物。

合适的氨基酸添加剂包括但不限于天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、苏氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、阿拉伯糖、反式-4-羟基脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、肉毒碱、氨基丁酸(α-异构体、β-异构体和/或δ-异构体)、谷氨酰胺、羟基脯氨酸、牛磺酸、正缬氨酸、肌氨酸及其盐形式如钠盐或钾盐或酸盐。氨基酸添加剂还可以呈D-构型或L-构型以及呈相同或不同氨基酸的一元、二元或三元形式。另外，如果适当的话，这些氨基酸可以是α-异构体、β-异构体、γ-异构体和/或δ-异构体。在一些实施例中，以上氨基酸及其相应的盐(例如，其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或其他碱金属盐或碱土金属盐，或酸式盐)的组合也是合适的添加剂。氨基酸可以是天然的或合成的。氨基酸还可以是改性的。改性的氨基酸是指其中至少一个原子已经添加、去除、取代或其组合的任何氨基酸(例如，N-烷基氨基酸、N-酰基氨基酸或N-甲基氨基酸)。改性的氨基酸的非限制性实例包括氨基酸衍生物，如三甲基甘氨酸、N-甲基-甘氨酸、和N-甲基-丙氨酸。如本文所用，改性的氨基酸既涵盖改性的氨基酸也涵盖未改性的氨基酸。如本文所用，氨基酸还既涵盖肽也涵盖多肽(例如，二肽、三肽、四肽和五肽)，如谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。合适的聚氨基酸添加剂包括聚-L-天冬氨酸、聚-L-赖氨酸(例如，聚-L-α-赖氨酸或聚-L-ε-赖氨酸)、聚-L-鸟氨酸(例如，聚-L-α-鸟氨酸或聚-L-ε-鸟氨酸)、聚-L-精氨酸、其他聚合物形式的氨基酸、以及其盐形式(例如钙盐、钾盐、钠盐或镁盐，如L-谷氨酸单钠盐)。聚氨基酸添加剂也可以呈D-构型或L-构型。另外，如果适当的话，聚氨基酸可以是α-异构体、β-异构体、γ-异构体、δ-异构体和ε-异构体。在一些实施例中，以上聚氨基酸及其相应的盐(例如，其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或其他碱金属盐或碱土金属盐或酸式盐)的组合也是合适的添加剂。本文描述的聚氨基酸还可以包括不同氨基酸的共聚物。聚氨基酸可以是天然的或合成的。聚氨基酸也可以是改性的，以使得至少一个原子被添加、去除、取代或其组合(例如，N-烷基聚氨基酸或N-酰基聚氨基酸)。如本文所用，聚氨基酸既涵盖改性的聚氨基酸也涵盖未改性的聚氨基酸。例如，改性的聚氨基酸包括但不限于具有不同分子量(MW)的聚氨基酸，如具有1,500的MW、6,000的MW、25,200的MW、63,000的MW、83,000的MW或者300,000的MW的聚-L-α-赖氨酸。

合适的糖酸添加剂包括但不限于醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、海藻酸、葡糖酸、葡糖醛酸、葡糖二酸、半乳糖二酸、半乳糖醛酸、及其盐(例如，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或其他生理上可接受的盐)及其组合。

合适的核苷酸添加剂包括但不限于，单磷酸肌苷(“IMP”)、单磷酸鸟苷(“GMP”)、单磷酸腺苷(“AMP”)、单磷酸胞嘧啶(CMP)、单磷酸尿嘧啶(UMP)、二磷酸肌苷、二磷酸鸟苷、二磷酸腺苷、二磷酸胞嘧啶、二磷酸尿嘧啶、三磷酸肌苷、三磷酸鸟苷、三磷酸腺苷、三磷酸胞嘧啶、三磷酸尿嘧啶、其碱金属盐或碱土金属盐及其组合。本文所述的核苷酸还可以包含核苷酸相关的添加剂，如核苷或核酸碱基(例如，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。

合适的有机酸添加剂包括包含-COOH部分的任何化合物，例如C2-C30羧酸、经取代的羟基C2-C30羧酸、丁酸(乙酯)、经取代的丁酸(乙酯)、苯甲酸、经取代的苯甲酸(例如，2,4-二羟基苯甲酸)、经取代的肉桂酸、羟基酸、经取代的羟基苯甲酸、茴香酸取代的环己基羧酸、鞣酸、乌头酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、异柠檬酸、葡糖酸、葡庚糖酸、己二酸、羟基柠檬酸、苹果酸、水果酒石酸(fruitaric acid)(苹果酸、富马酸和酒石酸的共混物)、富马酸、马来酸、琥珀酸、绿原酸、水杨酸、肌酸、咖啡酸、胆汁酸、乙酸、抗坏血酸、藻酸、异抗坏血酸、聚谷氨酸、葡糖酸δ内酯、及其碱金属盐或碱土金属盐衍生物。另外，有机酸添加剂也可以呈D-构型或L-构型。

合适的有机酸添加剂盐包括但不限于所有有机酸的钠盐、钙盐、钾盐、以及镁盐，如柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乳酸盐(例如，乳酸钠)、海藻酸盐(例如，藻酸钠)、抗坏血酸盐(例如，抗坏血酸钠)、苯甲酸盐(例如，苯甲酸钠或苯甲酸钾)、山梨酸盐以及己二酸盐。所述的有机酸添加剂的实例任选地可以被选自以下的至少一个基团取代：氢、烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、硫醇、亚胺、磺酰基、烃硫基、亚磺酰基、氨磺酰基、羧烷氧基、碳酰胺基(carboxamido)、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、酸酐、肟基、肼基、氨甲酰基、磷或膦酸酯基。

合适的无机酸添加剂包括但不限于磷酸、亚磷酸、聚磷酸、盐酸、硫酸、碳酸、磷酸二氢钠、及其碱金属盐或碱土金属盐(例如，肌醇六磷酸Mg/Ca)。

合适的苦味化合物添加剂包括但不限于咖啡因、奎宁、尿素、苦橘油、柚皮苷、苦木及其盐。

合适的调味剂和调味成分添加剂包括但不限于香草醛、香草提取物、芒果提取物、肉桂、柑橘、椰子、姜、绿花白千层醇(viridiflorol)、扁桃仁、薄荷醇(包括不含薄荷的薄荷醇)、葡萄皮提取物和葡萄籽提取物。“调味剂”和“调味成分”同义并且可以包括天然物质或合成物质或其组合。调味剂还包括赋予风味的任何其他物质并且可以包括在以通常接受的范围使用时对于人或动物是安全的天然物质或非天然(合成)物质。专有调味剂的非限制性实例包括

合适的聚合物添加剂包括但不限于壳多糖、果胶、果胶、果胶质酸、聚糖醛酸、聚半乳糖醛酸、淀粉、食品水解胶体或其粗提取物(例如，塞内加尔阿拉伯树胶(阿拉伯胶树(Fibergum

合适的蛋白质或蛋白质水解物添加剂包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、乳清蛋白(包括其级分或浓缩物，例如90％即溶乳清蛋白分离物、34％乳清蛋白、50％水解乳清蛋白和80％乳清蛋白浓缩物)、可溶性大米蛋白、大豆蛋白、蛋白质分离物、蛋白质水解物、蛋白质水解物的反应产物、糖蛋白和/或含有氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、正缬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸等)的蛋白聚糖、胶原蛋白(例如明胶)、部分水解的胶原蛋白(例如，水解的鱼胶原蛋白)以及胶原蛋白水解产物(例如，猪胶原蛋白水解产物)。

合适的表面活性剂添加剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60)、十二烷基苯磺酸钠、磺基琥珀酸二辛酯或磺基琥珀酸二辛基酯钠、十二烷基硫酸钠、氯化十六烷基吡啶(氯化十六烷基吡啶鎓)、溴化十六烷基三甲铵、胆酸钠、氨甲酰基、氯化胆碱、甘胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、月桂酰精氨酸酯、硬脂酰乳酸钠、牛磺胆酸钠、卵磷脂、蔗糖油酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖月桂酸酯以及其他乳化剂等。

合适的类黄酮添加剂分为黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷-3-醇、异黄酮或花色素。类黄酮添加剂的非限制性实例包括但不限于儿茶素(例如，绿茶提取物，如Polyphenon

合适的醇添加剂包括但不限于乙醇。

合适的涩味化合物添加剂包括但不限于鞣酸、氯化铕(EuCl

示例性功能性成分包括但不限于皂苷、抗氧化剂、膳食纤维源、脂肪酸、维生素、葡糖胺、矿物质、防腐剂、水合剂、益生菌、益生元、体重管理剂、骨质疏松症管理剂、植物雌激素、长链脂肪族饱和伯醇、植物甾醇及其组合。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种皂苷。如本文所用，该至少一种皂苷可以包括作为本文提供的组合物的功能性成分的单一皂苷或多种皂苷。皂苷是包含苷元环结构和一个或多个糖部分的糖苷天然植物产物。用于本发明的具体实施例中的特定皂苷的非限制性实例包括A组乙酰皂苷、B组乙酰皂苷和E组乙酰皂苷。皂苷的若干种常见来源包括具有按干重计大约5％皂苷含量的大豆、肥皂草植物(肥皂草属(Saponaria)，它的根在历史上用作肥皂)以及苜蓿、芦荟、芦笋、葡萄、鹰嘴豆、丝兰及各种其他豆类和野草。皂苷可以通过使用本领域普通技术人员熟知的提取技术从这些来源中获得。常规提取技术的描述可见于美国专利申请号2005/0123662，该专利申请的披露内容明确地通过援引并入。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种抗氧化剂。如本文所用，“抗氧化剂”是指阻止、抑制或减少对细胞和生物分子的氧化损害的任何物质。用于本发明的实施例的适合抗氧化剂的实例包括但不限于维生素、维生素辅因子、矿物质、激素、类胡萝卜素、类胡萝卜素萜类、非类胡萝卜素萜类、类黄酮、类黄酮多酚(例如生物类黄酮)、黄酮醇类、黄酮类、酚类、多酚、酚酯、多酚酯、非类黄酮酚类、异硫氰酸酯类及其组合。在一些实施例中，抗氧化剂是维生素A、维生素C、维生素E、泛醌、矿物质硒、锰、褪黑激素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉蜀黍黄素(zeanthin)、隐黄素(crypoxanthin)、白藜芦醇(reservatol)、丁子香酚、槲皮素、儿茶素、棉酚、橙皮素、姜黄素、阿魏酸、百里酚、羟基酪醇、姜黄、百里香、橄榄油、硫辛酸、谷胱甘肽(glutathinone)、谷氨酰胺(gutamine)、草酸、生育酚衍生化合物、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、叔丁基对苯二酚、乙酸、果胶、生育三烯酚、生育酚、辅酶Q10、玉米黄素、虾青素、斑蝥黄(canthaxantin)、皂苷、柠檬苦素、山柰酚(kaempfedrol)、杨梅酮、异鼠李素、原花色素、槲皮素、芦丁、木犀草素、芹菜素、红橘黄酮(tangeritin)、橙皮素、柚皮素、圣草酚(erodictyol)、黄烷-3-醇(例如，花青素)、没食子儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯形式、表没食子儿茶素及其没食子酸酯形式(ECGC)、茶黄素及其没食子酸酯形式、茶玉红精、异黄酮、植物雌激素、染料木黄酮、大豆黄素、黄豆黄素、花色素苷(anythocyanin)、氰化物(cyaniding)、飞燕草色素、锦葵花素、锦葵色素、锦葵色素、甲基花青素、矮牵牛素、鞣花酸、没食子酸、水杨酸、迷迭香酸、肉桂酸及其衍生物(例如，阿魏酸)、绿原酸、菊苣酸(chicoric acid)、五倍子鞣质、鞣花丹宁、花黄素、β-花青苷和其他植物颜料、水飞蓟素、柠檬酸、木酚素、抗营养素(antinutrient)、胆红素、尿酸、R-α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸、油柑宁(emblicanin)、苹果提取物、苹果皮提取物(苹果多酚)、红路易波士提取物(rooibos extract red)、绿路易波士提取物(rooibosextract,green)、山楂果提取物、覆盆子提取物、生咖啡抗氧化剂(GCA)、野樱梅提取物20％、葡萄籽提取物(VinOseed)、可可豆提取物、啤酒花提取物、山竹果提取物、山竹果壳提取物、蔓越莓提取物、石榴提取物、石榴皮提取物、石榴籽提取物、山楂浆果提取物、波梅拉(pomella)石榴提取物、肉桂皮提取物、葡萄皮提取物、越桔提取物、松树皮提取物、碧萝芷、接骨木提取物、桑树根提取物、枸杞(gogi)提取物、黑莓提取物、蓝莓提取物、蓝莓叶提取物、树莓提取物、姜黄提取物、柑橘属生物类黄酮、黑醋栗、姜、巴西莓粉、生咖啡豆提取物、绿茶提取物以及植酸或其组合。在替代性实施例中，抗氧化剂是合成的抗氧化剂，例如丁基化羟基甲苯或丁基化羟基苯甲醚。用于本发明的实施例的合适抗氧化剂的其他来源包括但不限于水果、蔬菜、茶、可可、巧克力、香辛料、药草、大米、来自家畜的器官肉类、酵母、全谷类(whole grain)或谷类(cereal grain)。

具体的抗氧化剂属于称为多元酚(也称为“多酚”)的植物营养素类，它是在植物中可见的一组化学物质，其特征在于每个分子存在超过一个酚基团。多种健康益处可以来源于多酚，例如包括预防癌症、心脏病和慢性炎性疾病以及提高脑力和体力。用于本发明的实施例的合适的多酚包括儿茶素、原花色素、原花青素、花青素、槲皮素、芦丁、白藜芦醇、异黄酮、姜黄素、安石榴苷、鞣花单宁、橙皮苷、柚皮苷、柑橘类黄酮、绿原酸、其他类似材料及其组合。

在具体实施例中，抗氧化剂是儿茶素，例如表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。在另一个实施例中，抗氧化剂选自原花色素、原花青素或其组合。在具体实施例中，抗氧化剂是花青素。在其他实施例中，抗氧化剂选自槲皮素、芦丁或其组合。在其他实施例中，抗氧化剂是白藜芦醇。在其他实施例中，抗氧化剂是异黄酮。在其他实施例中，抗氧化剂是姜黄素。在其他实施例中，抗氧化剂选自槲皮素、鞣花单宁或其组合。在其他实施例中，抗氧化剂是绿原酸。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种膳食纤维源。在组成和连键两方面具有显著不同的结构的多种聚合物碳水化合物落在膳食纤维的定义内。此类化合物是本领域技术人员熟知的，它们的非限制性实例包括非淀粉多糖、木质素、纤维素、甲基纤维素，半纤维素、β-葡聚糖、果胶、树胶、粘质、蜡、菊糖、寡糖、低聚果糖、环糊精、壳质及其组合。尽管膳食纤维通常源于植物来源，但是难消化动物产物如壳质也被分类为膳食纤维。壳质是由通过与纤维素键类似的β(1-4)键连接的乙酰基葡萄糖胺单元组成的多糖。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种脂肪酸。如本文所用，“脂肪酸”是指任何直链单羧酸并且包括饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、长链脂肪酸、中链脂肪酸、短链脂肪酸、脂肪酸前体(包括ω-9脂肪酸前体)和酯化脂肪酸。如本文所用，“长链多元不饱和脂肪酸”是指具有长脂肪族尾部的任何多元不饱和羧酸或有机酸。如本文所用，“ω-3脂肪酸”是指第一个双键作为从其碳链的末端甲基端起的第三个碳碳键的任何多元不饱和脂肪酸。在具体实施例中，ω-3脂肪酸可以包括长链ω-3脂肪酸。如本文所用，“ω-6脂肪酸”第一个双键作为从其碳链的末端甲基端起的第六个碳碳键的任何多元不饱和脂肪酸。

用于本发明的实施例中的合适的ω-3脂肪酸可以源于例如藻类、鱼、动物、植物或其组合。合适的ω-3脂肪酸的实例包括但不限于亚麻酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸及其组合。在一些实施例中，合适的ω-3脂肪酸可在鱼油(例如鲱鱼油、金枪鱼油、鲑鱼油、鲣鱼油和鳕鱼油)、微藻类ω-3油或其组合中提供。在具体实施例中，合适的ω-3脂肪酸可以源于可商购的ω-3脂肪酸油，如微藻DHA油(来自马里兰州哥伦比亚的马泰克公司(Martek,Columbia,MD)、OmegaPure(来自德克萨斯州休斯顿的ω-蛋白公司(Omega Protein,Houston,TX))、屈大麻酚(Marinol)C-38(来自伊利诺州长纳霍的脂类营养公司(Lipid Nutrition,Channahon,IL))、鲣鱼油和MEG-3(来自新斯科舍省达特茅斯的海洋营养公司(Ocean Nutrition,Dartmouth,NS))、Evogel(来自德国霍尔茨明登的德之馨公司(Symrise,Holzminden,Germany))、来自金枪鱼或鲑鱼的海洋油(来自康涅狄格州威尔顿的阿里斯塔公司(Arista Wilton,CT))、OmegaSource 2000、来自鲱鱼的海洋油和来自鳕鱼的海洋油(来自北卡罗来纳州研究三角区的ω资源公司(OmegaSource,RTP,NC))。

合适的ω-6脂肪酸包括但不限于亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸及其组合。

用于本发明的实施例的合适的酯化脂肪酸可以包括但不限于含有ω-3和/或ω-6脂肪酸的单酰基甘油、含有ω-3和/或ω-6脂肪酸的二酰基甘油或者含有ω-3和/或ω-6脂肪酸的三酰基甘油及其组合。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种维生素。合适的维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、维生素Bl、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12以及维生素C。

多种其他化合物已被一些官方分类为维生素。这些化合物可以被称为假维生素，并且包括但不限于如泛醌(辅酶Q10)、潘氨酸、二甲基甘氨酸、taestrile、苦杏仁苷、类黄酮、对-氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷酸和s-甲基甲硫氨酸等的化合物。如本文所用，术语维生素包括假维生素。在一些实施例中，该维生素是选自维生素A、维生素D、维生素E、维生素K及其组合的脂溶性维生素。在其他实施例中，该维生素是选自以下项的一种水溶性维生素：维生素Bl、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B12、叶酸、生物素、泛酸、维生素C及其组合。

在某些实施例中，功能性成分是葡糖胺，任选地进一步包含硫酸软骨素。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种矿物质。根据本发明的传授内容，矿物质包括生物体所需要的无机化学元素。矿物质由广泛范围的组合物(例如，元素、简单的盐和复合硅酸盐)组成并且晶体结构也广泛不同。它们可以天然地出现于食物和饮料中，可以作为补充剂添加，或者可以与食物或饮料分开地食用或给予。

矿物质可以被分类为相对大量需要的主体矿物质(bulk mineral)或相对小量需要的微量矿物质。主体矿物质通常每天需要大于或等于约100mg的量而微量矿物质是每天需要小于约100mg的量的那些矿物质。

在一个实施例中，矿物质是选自主体矿物质、微量矿物质或其组合。主体矿物质的非限制性实例包括钙、氯、镁、磷、钾、钠和硫。微量矿物质的非限制性实例包括铬、钴、铜、氟、铁、锰、钼、硒、锌和碘。尽管碘通常被分类为微量矿物质，但是它需要比其他微量矿物质更大的量并且常常被分类为主体矿物质。

在具体实施例中，矿物质是被认为对于人类营养所必需的一种微量矿物质，它的非限制性实例包括铋、硼、锂、镍、铷、硅、锶、碲、锡、钛、钨、以及钒。

本文呈现的矿物质可以呈本领域普通技术人员已知的任何形式。例如，在一个具体实施例中，矿物质可以呈其具有正电荷或负电荷的离子形式。在另一个具体实施例中，矿物质可以呈其分子形式。例如，硫和磷通常天然地作为硫酸盐、硫化物和磷酸盐存在。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种防腐剂。在本发明的具体实施例中，防腐剂选自抗微生物剂、抗氧化剂、抗酶剂或其组合。抗微生物剂的非限制性实例包括亚硫酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、山梨酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、细菌素、盐、糖、乙酸、二碳酸二甲酯(DMDC)、乙醇和臭氧。在一个实施例中，防腐剂是亚硫酸盐。亚硫酸盐包括但不限于二氧化硫、亚硫酸氢钠和亚硫酸氢钾。在另一个实施例中，防腐剂是丙酸盐。丙酸盐包括但不限于丙酸、丙酸钙和丙酸钠。在又另一个实施例中，防腐剂是苯甲酸盐。苯甲酸盐包括但不限于苯甲酸钠和苯甲酸。在还另一个实施例中，防腐剂是山梨酸盐。山梨酸盐包括但不限于山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸钙和山梨酸。在还另一个实施例中，防腐剂是硝酸盐和/或亚硝酸盐。硝酸盐和亚硝酸盐包括但不限于硝酸钠和亚硝酸钠。在另一个实施例中，该至少一种防腐剂是细菌素，例如尼生素。在另一个实施例中，防腐剂是乙醇。在还另一个实施例中，防腐剂是臭氧。适合用作本发明的具体实施例中的防腐剂的抗酶剂的非限制性实例包括抗坏血酸、柠檬酸和金属螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种水合剂。在具体实施例中，水合剂是电解质。电解质的非限制性实例包括钠、钾、钙、镁、氯化物、磷酸盐、碳酸氢盐及其组合。在美国专利号5,681,569中也描述了用于本发明的具体实施例中的适合电解质，该专利的披露内容明确地通过援引并入本文。在一个实施例中，电解质是从其相应的水溶性盐中获得的。用于具体实施例中的盐的非限制性实例包括氯化物、碳酸盐、硫酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、酒石酸盐、山梨酸酯、柠檬酸盐、苯甲酸盐或其组合。在其他实施例中，电解质通过果汁、果实提取物、蔬菜提取物、茶或茶提取物提供。

在本发明的具体实施例中，水合剂是补充肌肉所燃烧的贮能物质的碳水化合物。在美国专利号4,312,856、4,853,237、5,681,569和6,989,171中描述了用于本发明的具体实施例中的适合碳水化合物，这些专利的披露内容明确地通过援引并入本文。合适的碳水化合物的非限制性实例包括单糖、二糖、寡糖、复合多糖或其组合。用于具体实施例中的适合类型的单糖的非限制性实例包括丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖、辛糖和壬糖。特定类型的适合单糖的非限制性实例包括甘油醛、二羟基丙酮、赤藓糖、苏阿糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔洛糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖(sedoheltulose)、辛酮糖(octolose)和唾液糖(sialose)。适合二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖和麦芽糖。适合寡糖的非限制性实例包括蔗糖、麦芽三糖和麦芽糖糊精。在其他具体实施例中，碳水化合物通过玉米糖浆、甜菜糖、甘蔗糖、果汁或茶提供。

在另一个具体实施例中，水合剂是提供细胞再水合的黄烷醇。黄烷醇是存在于植物中的一类天然物质，并且通常包括附接到一个或多个化学部分的2-苯基苯并吡喃酮分子骨架。用于本发明的具体实施例中的适合黄烷醇的非限制性实例包括儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素3-没食子酸酯、茶黄素、茶黄素3-没食子酸酯、茶黄素3’-没食子酸酯、茶黄素3,3’-没食子酸酯、茶红素或其组合。黄烷醇的若干种常见来源包括茶树、果实、蔬菜和花。在优选的实施例中，黄烷醇从绿茶中提取。

在具体实施例中，水合剂是增强运动耐力的甘油溶液。含有甘油的溶液的摄取已显示提供多种有利的生理作用，如扩大的血容量、降低的心率和降低的直肠温度。

在某些实施例中，功能性成分选自至少一种益生菌、益生元及其组合。益生菌是影响人体天然存在的胃肠道微生物区系的有益微生物。益生菌的实例包括但不限于给予对人的有利作用的乳酸杆菌(Lactobacilli)属、双歧杆菌(Bifidobacteria)属、链球菌(Streptococci)属或其组合的细菌。在本发明的具体实施例中，该至少一种益生菌选自乳酸杆菌属。根据本发明的其他具体实施例，益生菌选自双歧杆菌属。根据本发明的其他具体实施例，益生菌选自链球菌属。

可以根据本发明使用的益生菌是本领域技术人员熟知的。包含益生菌的食品的非限制性实例包括酸乳、德国泡菜、克非尔(kefir)、韩国泡菜、发酵的蔬菜以及含有通过改善肠内微平衡来有利地影响宿主动物的微生物元素的其他食品。

根据本发明的教授内容，益生元包括而不限于粘多糖、寡糖、多糖、氨基酸、维生素、营养物前体、蛋白质及其组合。根据本发明的具体实施例，益生元选自膳食纤维，包括而不限于多糖和寡糖。根据本发明的具体实施例被分类为益生元的寡糖的非限制性实例包括低聚果糖、菊糖、低聚异麦芽糖、乳糖醇(lactilol)、低聚乳果糖、乳果糖、焦糊精、大豆寡糖、低聚反式半乳糖和低聚木糖。在其他实施例中，益生元是氨基酸。尽管多种已知的益生元发生分解为益生菌提供碳水化合物，但是一些益生菌也需要氨基酸来提供养分。

益生元天然地存在于多种食物中，这些食物包括而不限于香蕉、浆果、芦笋、大蒜、小麦、燕麦、大麦(以及其他全谷类)、亚麻籽、番茄、洋姜、洋葱和菊苣、菜叶(green)(例如，蒲公英嫩叶、菠菜、羽衣甘蓝叶、甜菜、无头甘蓝、芥菜叶、芜菁叶)以及豆类(例如，小扁豆、云豆、鹰嘴豆、海军豆、白豆、黑豆)。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种体重管理剂。如本文所用，“体重管理剂”包括食欲抑制剂和/或生热作用剂。如本文所用，短语“食欲抑制剂”、“食欲饱腹组合物”、“饱腹剂”和“饱腹成分”同义。短语“食欲抑制剂”描述了当以有效量递送时抑制、禁止、减少或以其他方式缩减人的食欲的大量营养素、草本植物提取物、外源性激素、减食欲药、食欲不振药、药物及其组合。短语“生热作用剂”描述了当以有效量递送时刺激或以其他方式增强人的生热作用或代谢的大量营养素、草本植物提取物、外源性激素、减食欲药、食欲不振药、药物及其组合。

合适的体重管理剂包括选自由以下项组成的组的大量营养素：蛋白质、碳水化合物、膳食脂肪及其组合。蛋白质、碳水化合物和膳食脂肪的消耗刺激了具有食欲抑制作用的肽的释放。例如，蛋白质和膳食脂肪的消耗刺激了胃肠激素胆囊收缩素(CCK)的释放，而碳水化合物和膳食脂肪的消耗刺激了胰高血糖素样肽1(GLP-1)的释放。

合适的大量营养素体重管理剂还包括碳水化合物。碳水化合物通常包括被身体转化成用于能量的葡萄糖的糖、淀粉、纤维素和树胶。碳水化合物通常被分成两类：可消化碳水化合物(例如，单糖、二糖和淀粉)和不可消化碳水化合物(例如，膳食纤维)。研究已显示在小肠内不可消化的碳水化合物和具有降低的吸收和消化性的复合聚合物碳水化合物刺激抑制食物摄取的生理反应。因此，本文呈现的碳水化合物理想地包括不可消化的碳水化合物或具有降低的消化性的碳水化合物。此类碳水化合物的非限制性实例包括聚葡萄糖；菊糖；单糖衍生的多元醇如赤藓糖醇、甘露糖醇、木糖醇和山梨糖醇；二糖衍生的醇如异麦芽酮糖醇、乳糖醇和麦芽糖醇；以及氢化淀粉水解产物。下文更详细地描述碳水化合物。

在另一个具体实施例中，体重管理剂是膳食脂肪。膳食脂肪是包含饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的组合的脂质。多元不饱和脂肪酸已显示具有比单不饱和脂肪酸更大的饱腹能力。因此，本文呈现的膳食脂肪理想地包括多元不饱和脂肪酸，其非限制性实例包括三酰基甘油。

在一个具体实施例中，体重管理剂是草本提取物。来自多种类型的植物的提取物已被认定为具有食欲抑制特性。其提取物具有食欲抑制特性的植物的非限制性实例包括蝴蝶亚(Hoodia)属、亚罗汉(Trichocaulon)属、水牛掌(Caralluma)属、豹皮花(Stapelia)属、奥贝亚(Orbea)属、马利筋(Asclepias)属以及山茶花(Camelia)属的植物。其他实施例包括源于匙羹藤(Gymnema Sylvestre)、可乐果(Kola Nut)、酸橙(Citrus Auran tium)、巴拉圭茶(Yerba Mate)、加纳谷物(Griffonia Simplicifolia)、瓜拉那(Guarana)、没药(myrrh)、香胶树脂质(guggul Lipid)和黑醋栗籽油(black current seed oil)的提取物。

草本提取物可以由任何类型的植物材料或植物生物质制备。植物材料和生物质的非限制性实例包括茎、根、叶、从植物材料中获得的干燥粉末，以及树液或干燥树液。草本提取物通常通过从植物中提取树液然后对树液进行喷雾干燥而制备。替代地，可以使用溶剂提取程序。在初始提取之后，可能希望进一步分馏初始提取物(例如，通过柱色谱法)，以便获得具有增强的活性的草本植物提取物。此类技术是本领域普通技术人员熟知的。

在一个具体实施例中，草本提取物源自蝴蝶亚属的植物，蝴蝶亚属的种类包括欧托尼蝴蝶亚(H.alstonii)、库洛里蝴蝶亚(H.currorii)、德吉蝴蝶亚(H.dregei)、佛来瓦蝴蝶亚(H.flava)、蝴蝶亚仙人掌(H.gordonii)、贾塔太蝴蝶亚(H.jutatae)、莫沙美丹蝴蝶亚(H.mossamedensis)、欧非西那利蝴蝶亚(H.officinalis)、巴维弗瑞蝴蝶亚(H.parviflorai)、派廸赛拉塔蝴蝶亚(H.pedicellata)、皮利非拉蝴蝶亚(H.pilifera)、路奇蝴蝶亚(H.ruschii)以及崔奈利蝴蝶亚(H.triebneri)。蝴蝶亚属植物是原产自南非的肉茎植物。称为P57的一种蝴蝶亚属的甾醇糖苷被认为是蝴蝶亚种类的食欲抑制作用的原因。在另一个具体实施例中，草本提取物源自水牛掌(Caralluma)属植物，水牛掌属的种类包括印度水牛掌(C.indica)、芬布里塔水牛掌(C.fimbriata)、减弱水牛掌(C.attenuate)、结节水牛掌(C.tuberculata)、伊杜利水牛掌(C.edulis)、艾德森丹水牛掌(C.adscendens)、史塔拉米费拉水牛掌(C.stalagmifera)、恩伯来水牛掌(C.umbellate)、笔状水牛掌(C.penicillata)、罗塞利安那水牛掌(C.russeliana)、雷托斯比森水牛掌(C.retrospicens)、阿拉比卡水牛掌(C.Arabica以及来西恩撒水牛掌(C.lasiantha)。水牛掌植物属于与蝴蝶亚属相同的亚科，即萝摩科。水牛掌是原产自印度的具有医学特性如食欲抑制的矮小直立并且肉质的植物，这些医学特性通常是归因于属于糖苷孕烷组的糖苷，这些糖苷的非限制性实例包括瘤水牛掌糖苷(caratuberside)A、瘤水牛掌糖苷B、布塞洛糖苷(bouceroside)I、布塞洛糖苷II、布塞洛糖苷III、布塞洛糖苷IV、布塞洛糖苷V、布塞洛糖苷VI、布塞洛糖苷VII、布塞洛糖苷VIII、布塞洛糖苷IX和布塞洛糖苷X。在另一个具体实施例中，该至少一种草本提取物源自亚罗汉(Trichocaulon)属的植物。亚罗汉属植物是通常原产自南非的肉质植物，与火地亚属类似，并且包括摩耶夫人(T.piliferum)和西洋蒲公英(T.officinale)。在另一个具体实施例中，该草本提取物源自豹皮花属(Stapelia)或奥贝亚属(Orbea)的植物，它们的种分别包括长须地毯海葵(S.gigantean)和杂色豹皮花(O.variegate)。豹皮花属和奥贝亚属植物二者属于与蝴蝶亚属相同的亚科，萝摩科。不希望受任何理论的束缚，据信表现出食欲抑制活性的化合物是皂苷，如孕烷糖苷，它们包括杂色豹皮花苷(stavaroside)A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K。在另一个具体实施例中，该草本提取物源自马利筋(Asclepias)属的植物。马利筋属植物也属于萝摩科族植物。马利筋属植物的非限制性实例包括沼泽乳草(A.incarnate)、黄冠马利筋(A.curassayica)、叙利亚马利筋(A.syriaca)、以及柳叶马利筋(A.tuberose)。不希望受任何理论的束缚，据信这些提取物包含具有食欲抑制作用的甾族化合物，如孕烷糖苷和孕烷苷元。

在一个具体实施例中，体重管理剂是具有体重管理作用的外源性激素。此类激素的非限制性实例包括CCK、肽YY、胃饥饿素、铃蟾肽和胃泌素释放肽(GRP)、肠抑素、载脂蛋白A-IV、GLP-1、淀粉不溶素、体抑素(somastatin)和瘦素。

在另一个实施例中，体重管理剂是药物。非限制性实例包括苯丁胺、二乙胺苯酮、苯甲曲秦、西布曲明、利莫那班、胃泌酸调节素、盐酸氟西汀、麻黄碱、苯乙胺或其他刺激物。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种骨质疏松症管理剂物。在某些实施例中，骨质疏松症管理剂是至少一种钙源。根据具体实施例，钙源是含有钙的任何化合物，包括钙的盐络合物、溶解物质和其他形式。钙源的非限制性实例包括氨基酸螯合钙、碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、硫酸钙、氯化钙、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、柠檬酸钙、苹果酸钙、柠檬酸苹果酸钙、葡萄糖酸钙、酒石酸钙、乳酸钙、其溶解物质及其组合。

根据一个具体实施例，骨质疏松症管理剂是一种镁源。镁源是含有镁的任何化合物，包括镁的盐络合物、溶解物质和其他形式。镁源的非限制性实例包括氯化镁、柠檬酸镁、葡庚糖酸镁、葡糖酸镁、乳酸镁、氢氧化镁、吡啶甲酸镁(magnesium picolate)、硫酸镁、其溶解物质及其混合物。在另一个具体实施例中，镁源包括氨基酸螯合镁或肌酸螯合镁。

在其他实施例中，骨质疏松症剂选自维生素D、C、K、其前体和/或β-胡萝卜素及其组合。

多种植物和植物提取物也已被认定为对于防止和治疗骨质疏松症是有效的。作为骨质疏松症管理剂的适合植物和植物提取物的非限制性实例包括如美国专利公开号2005/0106215中所披露的蒲公英属(Taraxacum)和唐棣属(Amelanchier)种类、以及如美国专利公开号2005/0079232所披露的以下属的种类：山胡椒属(Lindera)、艾属(Artemisia)、菖蒲属(Acorus)、红花属(Carthamus)、葛缕子属(Carum)、蛇床属(Cnidium)、姜黄属(Curcuma)、莎草属(Cyperus)、刺柏属(Juniperus)、李属(Prunus)、鸢尾花属(Iris)、菊苣属(Cichorium)、坡柳属(Dodonaea)、淫羊藿属(Epimedium)、绒毛属(Erigonoum)、大豆属(Soya)、薄荷属(Mentha)、罗勒属(Ocimum)、百里香属(thymus)、菊蒿属(Tanacetum)、车前属(Plantago)、留兰香属(Spearmint)、红木属(Bixa)、葡萄属(Vitis)、迷迭香属(Rosemarinus)、漆树属(Rhus)、以及莳萝属(Anethum)。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种植物雌激素。植物雌激素是在植物中发现的化合物，它们典型地可以通过摄取具有这些植物雌激素的植物或植物部分而递送到人体中。如本文所用，“植物雌激素”指的是当引入到身体内时引起任何程度的雌激素样作用的任何物质。例如，植物雌激素可以结合身体内的雌激素受体并且具有小的雌激素样作用。用于本发明的实施例的合适植物雌激素的实例包括但不限于，异黄酮、芪类、木酚素、雷琐酸内酯(resorcyclic acid lactone)、香豆素、香豆雌醇(coumestan)、香豆雌酚(coumestroI)、雌马酚及其组合。合适的植物雌激素的来源包括但不限于全谷类、谷物、纤维、水果、蔬菜、黑升麻、龙舌兰根、黑醋栗、樱叶荚卓、圣洁莓、痉挛树皮、当归根、魔鬼爪(devil's club)根、假独角兽根(false unicorn root)、人参根、地梁草、甘草汁、活根草、益母草、牡丹根、覆盆子叶、蔷薇科植物、鼠尾草叶、洋菝契根、塞润榈籽、野生山药根、开花蓍草、豆科植物、大豆、大豆产品(例如，味噌、大豆粉、豆奶、大豆坚果、大豆蛋白质分离物、印尼豆豉(tempeh)或豆腐)、鹰嘴豆、坚果、小扁豆、种子、三叶草、红三叶草、蒲公英叶、蒲公英根、胡芦巴籽、绿茶、啤酒花、红葡萄酒、亚麻仁、大蒜、洋葱、亚麻籽、琉璃苣、块根马利筋(butterfly weed)、葛缕子、女贞子树(chaste tree)、牡荆、大枣、莳萝、茴香籽、雷公根、水飞蓟、唇萼薄荷、石榴、青蒿、豆粉、艾菊、葛藤根(葛根)等及其组合。

异黄酮属于称为多元酚的植物营养素组。通常，多元酚(也称为“多酚类”)是在植物中发现的一组化学物质，其特征在于每个分子存在超过一个酚基团。

根据本发明的实施例的适合植物雌激素异黄酮包括染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素、鹰嘴豆素A、芒柄花黄素、其各自天然存在的糖苷和糖苷缀合物、马台树脂醇、开环异落叶松脂素、肠内二酯、肠二醇、植物组织蛋白及其组合。

用于本发明的实施例的异黄酮的适合来源包括但不限于大豆、大豆产物、豆科植物、苜蓿芽、鹰嘴豆、花生和红三叶草。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种长链脂肪族饱和伯醇。长链脂肪族饱和伯醇是不同组的有机化合物。术语“醇”是指以下事实：这些化合物的特征是结合到碳原子上的羟基基团(-OH)。用于本发明的具体实施例的具体长链脂肪族饱和伯醇的非限制性实例包括8碳原子1-辛醇、9碳1-壬醇、10碳原子1-癸醇、12碳原子1-十二烷醇、14碳原子1-十四烷醇、16碳原子1-十六烷醇、18碳原子1-十八烷醇、20碳原子1-二十烷醇、22碳1-二十二烷醇、24碳1-二十四烷醇、26碳1-二十六烷醇、27碳1-二十七烷醇、28碳1-二十八烷醇(octanosol)、29碳1-二十九烷醇、30碳1-三十烷醇、32碳1-三十二烷醇、以及34碳1-三十四烷醇。

在本发明的一个特别期望的实施例中，长链伯脂肪族饱和醇是普利醇。普利醇是关于主要由以下成分组成的长链脂肪族饱和伯醇的混合物的术语：28碳1-二十八烷醇和30碳1-三十烷醇以及较低浓度的其他醇如22碳1-二十二烷醇、24碳1-二十四烷醇、26碳1-二十六烷醇、27碳1-二十七烷醇、29碳1-二十九烷醇、32碳1-三十二烷醇和34碳1-三十四烷醇。

在某些实施例中，功能性成分是至少一种植物甾醇、植物甾烷醇或其组合。如本文所用，短语“甾烷醇”、“植物甾烷醇”和“植物甾烷醇”同义。植物甾醇和甾烷醇天然少量地存在于许多水果、蔬菜、坚果、种子、谷物、豆类、植物油、树皮和其他植物来源中。甾醇是在C-3处具有羟基基团的甾族化合物的亚组。通常，植物甾醇在甾核内具有双键，如胆固醇；然而，植物甾醇还可以在C-24处包含取代的侧链(R)，如乙基或甲基，或另外的双键。植物甾醇的结构是本领域技术人员熟知的。

已发现至少44种天然存在的植物甾醇，并且它们通常源于植物，诸如玉米、大豆、小麦和桐油；然而，它们还可以按合成方式产生以形成与天然的那些相同的组合物或者具有与天然存在的植物甾醇特性相似的特性的组合物。根据本发明的具体实施例，本领域普通技术人员已熟知的植物甾醇的非限制性实例包括4-去甲基甾醇(例如，β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、22-脱氢菜籽甾醇、以及Δ5-燕麦甾醇)、4-单甲基甾醇和4,4-二甲基甾醇(三萜烯醇)(例如，环阿屯醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇和环甾烷醇(cyclobranol))。

如本文所用，短语“甾烷醇”、“植物甾烷醇”和“植物甾烷醇”同义。植物甾烷醇是仅微量存在于自然界中的饱和甾醇并且也可以如通过对植物甾醇进行加氢而以合成方式产生。根据本发明的具体实施例，植物甾烷醇的非限制性实例包括β-谷甾烷醇、菜油甾烷醇、环木菠萝烷醇以及其他三萜醇类的饱和形式。

如本文所用的植物甾醇和植物甾烷醇包括多种异构体如α和β异构体(例如，α-谷甾醇和β-谷甾醇，它们分别包括用于降低哺乳动物中的血清胆固醇的最有效的植物甾醇和植物甾烷醇之一)。

本发明的植物甾醇和植物甾烷醇还可以呈其酯形式。用于得到植物甾醇和植物甾烷醇的酯的适合方法是本领域普通技术人员熟知的，并且在美国专利号6,589,588、6,635,774、6,800,317和美国专利公开号2003/0045473中披露，这些专利的披露内容通过援引以其全文并入本文。合适的植物甾醇和植物甾烷醇的酯的非限制性实例包括乙酸谷甾醇酯、油酸谷甾醇酯、油酸豆甾醇酯及其相应的植物甾烷醇酯。本发明的植物甾醇和植物甾烷醇还可以包括其衍生物。

通常，在组合物中的功能性成分的量根据具体组合物和期望的功能性成分而广泛地改变。本领域普通技术人员将容易确定用于每种组合物的功能性成分的适当量。

在一个实施例中，用于制备组合物的方法包括将本发明的至少一种罗汉果苷与至少一种甜味剂和/或添加剂和/或功能性成分组合。

在一个具体实施例中，用于制备组合物的方法包括将本发明的至少一种罗汉果苷与至少一种另外的甜味剂和/或添加剂和/或功能性成分组合。

在一个具体实施例中，用于制备组合物的方法包括将本发明的至少一种罗汉果苷与至少一种甜味剂和/或添加剂和/或功能性成分组合，其中该至少一种甜味剂和/或添加剂和/或功能性成分在自然界中不与该至少一种罗汉果苷一起存在(不与之配混)，并且与自然界中的罗汉果苷以及(如果适用的话)自然界中的该至少一种甜味剂和/或添加剂和/或功能性成分相比，该组合物提供更像蔗糖的味道特征。例如，在某些实施例中，该组合物表现出一种或多种以下特性：改善的甜度效力、改善的口感、缩短的甜度存留性、减少的苦味和/或减少的金属味。

在一个实施例中，本发明是包含本发明的至少一种罗汉果苷的消费品，或包含本发明的至少一种罗汉果苷的组合物。在一个具体实施例中，将该至少一种罗汉果苷分离并纯化。

本发明的一种或多种罗汉果苷或包含该罗汉果苷的组合物可以与任何已知的可食用或口服组合物(本文称为“消费品”)配混。如本文所用的消费品是指与人或动物的口接触的物质，包括被摄入并随后从口中排出的物质和被饮用、食用、吞咽或以其他方式摄入的物质，并且当以通常可接受的范围使用时对人或动物消费是健康的。

示例性消费品包括药物组合物、可食用凝胶混合物和组合物、牙科组合物、食品(甜食、调味品、口香糖、谷物组合物、烤焙食品、乳制品和桌面(tabletop)甜味剂组合物)、饮料和饮料产品。本发明的消费品需要配混，因此在自然界中不存在。

例如，饮料是消费品。该饮料可以是甜化的或未甜化的。可以将本发明的一种或多种罗汉果苷或包含该罗汉果苷的组合物添加到饮料或饮料基质中以使饮料变甜或增强其现有甜度或风味。

在一个实施例中，本发明是包含本发明的至少一种罗汉果苷的消费品。在具体实施例中，本发明的罗汉果苷以大于约1ppm，例如约1ppm至约1,000ppm、约25ppm至约1,000ppm、约50ppm至约1,000ppm、约75ppm至约1,000ppm、约100ppm至约1,000ppm、约200ppm至约1,000ppm、约300ppm至约1,000ppm、约400ppm至约1,000ppm、约500ppm至约1,000ppm或约50ppm至约600ppm的浓度存在于消费品中。

在其他具体实施例中，本发明的罗汉果苷相对于罗汉果苷的混合物或罗汉果提取物以至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约97％的纯度存在于消费品中。在另外其他实施例中，本发明的罗汉果苷以>99％的纯度存在于消费品中。

该消费品可以任选地包含添加剂、另外的甜味剂、功能性成分及其组合，如本文所述。以上描述的任何添加剂、另外的甜味剂和功能性成分可以存在于该消费品中。

在示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应消费品相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品的甜度高约30％或更多，例如约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多或约90％或更多。

在其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应消费品相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品的苦味(由某些物质如奎宁、咖啡因和蔗糖八乙酸酯刺激的味道)低至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品基本上没有苦味。测量化合物苦味的方法是本领域已知的。

在另外其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应消费品相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品的存留甜回味(吐出后的甜味强度)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品基本上没有存留甜回味。测量存留甜回味的方法在本领域中是已知的。

在另外其他示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应消费品相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品的金属味(与金属锡或铁相关的味道)低至少约30％，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一个具体实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品基本上没有金属味。

在示例性实施例中，与包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的相应消费品相比，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品表现出高至少约30％的最大响应(随着化合物浓度增加而达到的最大甜度(％SE))，例如高至少约40％、高至少约50％、高至少约60％、高至少约70％、高至少约80％或高至少约90％。测量化合物的最大响应的方法是本领域已知的。

在其他示例性实施例中，包含本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的消费品表现出的甜度起始(经历最大甜度的时间)比包含部分纯化的罗汉果苷或罗汉果提取物的消费品短至少约30％，例如短至少约40％、短至少约50％、短至少约60％、短至少约70％、短至少约80％或短至少约90％。测量甜度起始的方法是本领域已知的。

在另一个实施例中，本发明是饮料或饮料产品，该饮料或饮料产品包含含有本发明的至少一种罗汉果苷的组合物。在一个具体实施例中，该饮料或饮料产品包含含有本发明的至少一种分离并纯化的罗汉果苷的组合物。

如本文所用，“饮料产品”是立即可饮的饮料、饮料浓缩物、饮料糖浆或固体饮料(powdered beverage)。合适的立即可饮的饮料包括碳酸饮料和非碳酸饮料。碳酸饮料包括但不限于冰冻碳酸饮料、增强的起泡饮料、可乐、柠檬-酸橙味起泡饮料、橙风味起泡饮料、葡萄风味起泡饮料、草莓风味起泡饮料、菠萝风味起泡饮料、姜汁酒、汽水和根汁汽水。非碳酸饮料包括但不限于果汁、水果风味果汁、果汁饮品、花蜜、蔬菜汁、蔬菜风味汁、运动饮品、能量饮品、增强水饮品、具有维生素的增强水、近水饮品(例如，具有天然或合成调味剂的水)、椰子汁、茶类型饮品(例如，黑茶、绿茶、红茶、乌龙茶)、咖啡、可可饮品、含有乳组分的饮料(例如，乳饮料、含乳组分的咖啡、欧蕾咖啡(cafe au lait)、奶茶、果乳饮料)、含有谷物提取物的饮料、冰沙及其组合。

饮料浓缩物和饮料糖浆用初始体积的液体基质(例如，水)和期望的饮料成分制备。然后通过添加另外体积的水来制备全强度饮料。固体饮料通过在不存在液体基质的情况下对所有饮料成分进行干混而制备。然后通过添加全部体积的水来制备全强度饮料。

饮料含有基质，即其中溶解了这些成分(包括本发明的组合物)的基础成分。在一个实施例中，饮料包含饮料品质的水作为基质，例如可以使用去离子水、蒸馏水、反渗透水、碳处理水、纯水、软化水及其组合。另外的适合基质包括但不限于磷酸、磷酸盐缓冲液、柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液和碳处理水。

在一个实施例中，本发明是包含本发明的至少一种罗汉果苷的饮料。

在另一个实施例中，本发明是包含本发明的至少一种罗汉果苷的饮料产品。

该至少一种罗汉果苷可以作为单一化合物或作为上述任何组合物的一部分提供。在一个示例性实施例中，将该至少一种罗汉果苷分离并纯化。

在一个具体实施例中，饮料或饮料产品包含分离纯化形式的本发明的至少一种罗汉果苷和至少一种在自然界中不与该罗汉果苷一起存在的其他物质。在一个实施例中，该至少一种其他附加物质调节该至少一种罗汉果苷的味道特征，以提供与自然界中的该罗汉果苷和(如果适用的话)自然界中的该至少一种其他物质相比味道特征更像蔗糖的饮料。例如，在某些实施例中，该饮料表现出一种或多种以下特征：改善的甜度效力、改善的口感、缩短的甜度存留性、减少的苦味和/或减少的金属味。

本发明的罗汉果苷在饮料中的浓度可以高于、等于或低于本发明的罗汉果苷的阈值甜度或风味识别浓度。在其中罗汉果苷充当甜味剂的具体实施例中，罗汉果苷以等于或高于阈值甜味浓度的浓度存在。

在一个实施例中，本发明的罗汉果苷以高于约1ppm，例如约1ppm至约1,000ppm、约25ppm至约1,000ppm、约50ppm至约1,000ppm、约75ppm至约1,000ppm、约100ppm至约1,000ppm、约200ppm至约1,000ppm、约300ppm至约1,000ppm、约400ppm至约1,000ppm或约500ppm至约1,000ppm的浓度存在于饮料中。

在一个更具体的实施例中，本发明的罗汉果苷以约25ppm至约600ppm，例如约25ppm至约500ppm、约25ppm至约400ppm、约25ppm至约300ppm、约25ppm至约200ppm、约25ppm至约100ppm、约50ppm至约600ppm、约50ppm至约500ppm、约50ppm至约400ppm、约50ppm至约300ppm、约50ppm至约200ppm、约50ppm至约100ppm、约100ppm至约600ppm、约100ppm至约500ppm、约100ppm至约400ppm、约100ppm至约300ppm、约100ppm至约200ppm、约200ppm至约600ppm、约200ppm至约500ppm、约200ppm至约400ppm、约200ppm至约300ppm、约300ppm至约600ppm、约300ppm至约500ppm、约300ppm至约400ppm、约400ppm至约600ppm、约400ppm至约500ppm或约500ppm至约600ppm的浓度存在于饮料中。

在其他具体实施例中，本发明的罗汉果苷相对于罗汉果苷的混合物或罗汉果提取物以至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约97％的纯度存在于饮料中。在另外其他实施例中，本发明的罗汉果苷以>99％的纯度存在于饮料中。

饮料可以包含一种或多种甜味剂。可以使用本文详述的任何甜味剂，包括天然甜味剂、非天然甜味剂或合成甜味剂。这些甜味剂可以在本发明的一种或多种罗汉果苷之前、同时或之后添加到饮料中。

消费品可以任选地包含添加剂、功能性成分及其组合，如本文所述。以上描述的任何添加剂和功能性成分均可以存在于该消费品中。在某些实施例中，该添加剂和/或功能性成分调节该至少一种罗汉果苷的味道特征，以提供与自然界中的该罗汉果苷和(如果适用的话)自然界中的该添加剂和/或功能性成分相比味道特征更像蔗糖的组合物。例如，在某些实施例中，该组合物表现出一种或多种以下特性：改善的甜度效力、改善的口感、缩短的甜度存留性、减少的苦味和/或减少的金属味。

考虑到消费品(例如饮料)的pH不会实质上或不利地影响甜味剂的味道。饮料的pH范围的非限制性实例可以是从约1.8至约10。另一个实例包括从约2至约5的pH范围。在一个具体实施例中，饮料的pH可以是从约2.5至约4.2。本领域技术人员将理解，饮料的pH可以基于饮料的类型而改变。例如，乳品饮料可以具有大于4.2的pH。

饮料的可滴定酸度的范围可以例如是按饮料重量计从约0.01％至约1.0％。

在一个实施例中，起泡饮料产品具有按饮料的重量计约0.01％至约1.0％、例如按饮料的重量计约0.05％至约0.25％的酸度。

起泡饮料产品的碳酸化作用具有0至约2％(w/w)二氧化碳或其等效物，例如从约0.1％至约1.0％(w/w)。

饮料的温度可以例如在从约4℃至约100℃，例如从约4℃至约25℃的范围内。

饮料可以是富含卡路里饮料，它每8盎司份具有最高约120卡路里。

饮料可以是中值卡路里的饮料，它每8盎司份具有最高约60卡路里。

饮料可以是低卡路里的饮料，它每8盎司份具有最高约40卡路里。

饮料可以是零卡路里饮料，它每8盎司份具有小于约5卡路里。

在一个实施例中，该饮料仅包含天然甜味剂，即唯一类型的甜味剂是天然存在的。

II.纯化方法

本发明还扩展到纯化本发明的罗汉果苷的方法。

在一个实施例中，本发明是纯化本发明的罗汉果苷的方法，该方法包括(i)使包含含有本发明的罗汉果苷的源材料的溶液通过HPLC柱，并且(ii)将包含本发明的罗汉果苷的级分洗脱以提供包含本发明的罗汉果苷的纯化罗汉果苷组合物。HPLC柱可以是任何合适的HPLC制备型或半制备型柱。

如本文所用，术语“制备型HPLC”是指能够产生高(500或更多)微克、毫克、或克大小的产物级分的HPLC系统。术语“制备型”包括制备型柱和半制备型柱两者，但不旨在包括提供纳克至低微克范围的级分的分析柱。

如本文所用，“HPLC相容的检测器”是适于在HPLC系统中使用的一种检测器，该检测器能够在洗脱出化合物峰后提供一种可检测的信号。例如，当从该化合物洗脱出某化合物时能够生成信号的检测器是HPLC相容的检测器。在组分的吸光度广泛变化的情况下，可能有必要使用多于一个检测器。由于“不相容”的检测器不能检测出非所需峰，所以能够检测出所需组分的检测器不是“不相容”的检测器。

HPLC装置典型地包括至少以下部件：填充有合适的固定相的柱，流动相，在压力下迫使流动相通过该柱的泵，以及用于检测从该柱中洗脱出的化合物的存在的检测器。这些装置可以任选地包括用于提供梯度洗脱的构件，尽管使用本文描述的方法这不是必要的。用于进行HPLC分离的常规方法和设备是本领域中熟知的。

合适的固定相是其中洗脱出感兴趣的化合物的那些。优选的柱可以是而不限于正相柱(中性、酸性或碱性)、反相柱(具有任何长度的烷基链)、合成交联聚合物柱(例如，苯乙烯和二乙烯基苯)、尺寸排阻柱、离子交换柱、生物亲和性柱及其任何组合。固定相的粒度在从几pm到数百pm的范围内。

合适的检测装置包括但不限于质谱仪、UV检测器、IR检测器和光散射检测器。本文所述的方法使用这些检测器的任何组合。最优选的实施例使用质谱仪和UV检测器。

如本文所用，“源材料”是指通过本发明的方法纯化的材料。源材料含有本发明的罗汉果苷，其纯度低于由本发明的纯化方法提供的纯度。源材料可以是液体或固体。示例性源材料包括但不限于罗汉果苷混合物和罗汉果提取物(商业或制备的)。在一个实施例中，源材料源自生物转化(下文讨论)。

如本领域技术人员所理解的，在进行HPLC方法之前，必须使任何固体源材料进入溶液中。

在一个实施例中，代表性分析HPLC方案与用于纯化化合物的制备型或半制备型HPLC方案相关。

在另一个实施例中，通过对于给定的分析HPLC柱、溶剂体系和流速路线寻找一种代表性样品可以制定出用于纯化本发明的罗汉果苷的适当条件。在又一个实施例中，相关的制备型或半制备型HPLC方法可以应用于纯化本发明的罗汉果苷，其中对纯化参数加以修改或不必改变纯化参数。

在一些实施例中，洗脱剂(流动相)选自由以下项组成的组：水、乙腈、甲醇、2-丙醇、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、二甲基硫醚、吡啶、三乙胺、甲酸、三氟乙酸、乙酸、含有乙酸铵的水溶液、七氟丁酸及其任何组合。

在一个实施例中，HPLC方法是等度的。在另一个实施例中，HPLC方法是梯度的。在又一个实施例中，HPLC方法是逐步的。

在一个实施例中，在洗脱含有本发明的罗汉果苷的一种或多种级分之后，从HPLC柱中洗脱杂质。在另一个实施例中，在洗脱含有本发明的罗汉果苷的一种或多种级分之前，从HPLC柱中洗脱杂质。

该方法可以进一步包括从洗脱溶液中去除溶剂，即干燥。在一个实施例中，该方法进一步包括从洗脱溶液中部分去除溶剂，以提供包含本发明的罗汉果苷的浓缩物。在另一个实施例中，该方法进一步包括从洗脱溶液中去除基本上所有溶剂，以提供包含本发明的罗汉果苷的基本上干燥的组合物。

去除溶剂可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行，包括但不限于蒸发、蒸馏、真空干燥和喷雾干燥。

包含本发明的罗汉果苷的所得纯化级分可以通过其他方法进一步纯化以提高纯度。合适的方法包括但不限于结晶、色谱法、萃取和蒸馏。此类方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

源材料可以是一个级分或多个级分，该级分含有从至少一种先前方法或HPLC方案中收集到的本发明的罗汉果苷。在一个实施例中，合并来自相同的先前方法或HPLC方案的多个级分，并且任选地，在使源材料再次经受另一种方法之前，去除溶剂。在其他实施例中，合并来自不同的先前方法或HPLC方案的级分，并且任选地，在使源材料再次经受另一种方法之前，去除溶剂。

在一个实施例中，再次经受一种或多种另外的方法的源材料包括从一种或多种先前(并且任选不同的)方法获得的液体级分，这些液体级分与经由干燥从一种或多种先前(并且任选地不同的)方法获得的级分而获得的基本上干燥的材料混合。在另一个实施例中，再次经受一种或多种另外的方法的源材料包括经由干燥从一种或多种先前(并且任选地不同的)方法获得的级分而获得的基本上干燥的材料，其中使所述源材料进入溶液，之后使该溶液穿过下一个HPLC柱。

第二种和后续方法可以具有不同的HPLC方案(例如溶剂体系、柱、方法)和不同的洗脱后步骤(例如部分去除溶剂、完全去除溶剂、洗脱杂质、使用结晶或萃取)。

分离的材料可以经受2次、3次、4次或更多次的进一步方法，每次提供更高纯度水平的本发明的纯化罗汉果苷。

在一个实施例中，该方法提供了纯化的罗汉果苷组合物，该组合物包含本发明的罗汉果苷，其纯度为至少约80重量％或更高，例如，至少约85重量％、至少约90重量％、至少约95％重量或至少约97％或更高。在另一个实施例中，纯化提供了本发明的纯罗汉果苷，即按干重计＞99％。

IV.生物转化方法

本发明还提供了通过生物转化来制备本发明的罗汉果苷的方法。

用于制备本发明的罗汉果苷的生物催化方法包括使包含含有起始罗汉果苷的组合物的介质与生物催化剂接触，从而产生包含本发明的罗汉果苷(在本文中也称为“目标罗汉果苷”)的组合物。

如本文所用，“起始组合物”是指含有起始罗汉果苷(即要转化为本发明的罗汉果苷的罗汉果苷)的任何组合物。起始化合物可以是合成的或纯化的(部分或完全)、可商购的或制备的。起始罗汉果苷可以是分离和纯化的罗汉果苷、罗汉果苷混合物、含有罗汉果苷的提取物(即罗汉果提取物)或罗汉果汁。

起始罗汉果苷可以按干重计以至少约5重量％存在于起始组合物中，例如按干重计至少约10重量％，按干重计至少约20重量％，按干重计至少约30重量％，按干重计至少约40重量％，按干重计至少约50重量％，按干重计至少约60重量％，按干重计至少约70重量％，按干重计至少约80重量％，按干重计至少约90重量％，或按干重计至少约95重量％。

如本文所用，“介质”是指包含起始组合物和将起始罗汉果苷转化为本发明的罗汉果苷所需的任何其他物质的组合物(通常是水性的)。例如，介质可以包含水、起始组合物、缓冲剂和/或盐。

在一个实施例中，该介质包含一种或多种生物催化剂的共底物，共底物充当葡糖基供体，例如蔗糖，葡萄糖-1-磷酸、α-D-葡萄糖-1-氟化物、糊精和淀粉。淀粉可以来自任何合适的来源，例如小麦、玉米、马铃薯、木薯、西米、支链淀粉、麦芽糖、乳糖和部分水解的淀粉。

如本文所用，“生物转化”、“生物催化”或“生物催化的”是指天然或遗传工程化的生物催化剂，诸如酶或包含能够对有机化合物进行单步或多步化学转化的一种或多种酶或酶裂解物的细胞的使用。在一个具体实施例中，化学转化是自然发生的或者不是自然发生的。生物催化过程包括发酵、生物合成和生物转化过程。分离的酶生物催化法和全细胞生物催化法都是本领域已知的。在一个具体实施例中，生物催化以商业规模进行。

生物催化剂可以部分或完全是生物来源的，例如动物、植物和微生物来源。生物催化剂蛋白酶可以是天然存在的或重组的蛋白质。该蛋白酶可以是从天然存在的来源分离的或者可以是体内产生的，例如，使用用包含编码该蛋白质的基因的载体转化的微生物产生的。在一个具体实施例中，该蛋白质是体内产生的异源天然存在的蛋白质。在另一个具体实施例中，该蛋白质是体内产生的异源重组蛋白质。

合适的酶包括但不限于糖基转移酶，诸如葡糖基转移酶。这些酶可引起一种或多种代谢转化。替代性地，生物转化可以包含一种或多种酶，例如两种、三种、四种或以多酶级联形式提供酶。

在一个具体实施例中，该酶是稳定的，并且更特别地，在不存在固定的情况下是稳定的。在另一个实施例中，该酶是选择性的并且具有广泛的操作范围。

生物转化方法可以包括共底物。共底物将根据酶而变化。在一个具体实施例中，该酶是葡糖基转移酶，并且共底物是尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)。UDP-葡萄糖由焦磷酸根、戊糖基、葡萄糖和核碱基尿嘧啶组成。

起始罗汉果苷是生物催化剂向其添加一个或多个葡萄糖单元的罗汉果苷，从而产生本发明的罗汉果苷。起始罗汉果苷选自罗汉果苷V和罗汉果苷IIIE。

在一个实施例中，起始罗汉果苷是罗汉果苷V，并且本发明的罗汉果苷选自由以下项组成的组：CC-00371、CC-00367、CC-00436、CC-00417和CC-00458。本发明的罗汉果苷的特性取决于所使用的生物催化剂。

制备CC-00371的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物并任选地包含共底物的介质与β-半乳糖苷酶或其变体接触，以产生包含CC-00371的组合物。在一个具体实施例中，β-半乳糖苷酶是来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的变体。在一个更具体的实施例中，该变体在蛋白质序列中具有单个突变，其中位置387处的谷氨酸变为甘氨酸(EC:3.2.1.23；UniProtKB-P22498)(SEQ.ID 1)。共底物可以是α-D-葡萄糖-1-氟化物。

制备CC-00367的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物并任选地包含共底物的介质与β-半乳糖苷酶或其变体接触，以产生包含CC-00367的组合物。在一个具体实施例中，β-半乳糖苷酶是来自链霉菌属(Streptomyces)的变体。在一个更具体的实施例中，该变体在蛋白质序列中具有单个突变，其中位置383处的谷氨酸变为丙氨酸(EC:3.2.1.21；UniProtKB-Q59976)(SEQ.ID 2)。共底物可以是α-D-葡萄糖-1-氟化物。

制备CC-00436的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物并任选地包含共底物的介质与葡聚糖葡聚糖酶接触，以产生包含CC-00436的组合物。共底物可以是淀粉，例如来自玉米淀粉的糊精-10。

制备CC-00417的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物并任选地包含共底物的介质与葡聚糖蔗糖酶接触，以产生包含CC-00417的组合物。在一个具体实施例中，葡聚糖蔗糖酶来自柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)DSM 20188。在一个更具体的实施例中，葡聚糖蔗糖酶作为裂解物提供。共底物可以是蔗糖。

制备CC-00458的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物的介质与葡糖基转移酶、葡萄糖供体和葡萄糖供体再循环催化剂接触。葡萄糖基转移酶可以是例如UDP糖基转移酶(UGT)。UGT可以是例如UGT-1或UGT-2。UGT可以源自病毒、古细菌、细菌或真核生物。在一个具体实施例中，UGT是由细菌例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)产生的UGT-2。

葡萄糖供体可以是核苷二磷酸糖、核苷一磷酸糖和脂磷酸。在一个具体实施例中，葡萄糖供体是UDP-葡萄糖(UDP-Gluc)。

在一个具体实施例中，制备CC-00458的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物的介质与UDP-糖基转移酶(UGT)、UDP-葡萄糖(UDP-Gluc)、UDP-葡萄糖再循环催化剂和蔗糖接触以提供包含CC-00458的组合物。在一个具体实施例中，UGT是UGT-2，优选BcGT-1，这是一种由蜡样芽孢杆菌产生的UGT(Uniprot参考：Q739H3)。UDP-葡萄糖再循环催化剂可以是蔗糖合酶，优选源自拟南芥(A.thaliana)的蔗糖合酶(例如AtSUS)。

在另一个实施例中，起始罗汉果苷是罗汉果苷IIIE，并且本发明的罗汉果苷选自CC-00434、CC-00478、CC-00483和CC-00485。

制备CC-00434的方法包括使包含含有罗汉果苷IIIE的组合物并任选地包含共底物的介质与环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)或葡聚糖葡聚糖酶接触，以产生包含CC-00434的组合物。在一个具体实施例中，CGTase源自浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)，例如EC 2.4.1.19(Amano)。共底物可以是淀粉，例如可溶性淀粉。

制备CC-00478和CC-00485的方法包括(i)使包含含有罗汉果苷IIIE的组合物并任选地包含共底物(例如蔗糖)的介质与葡聚糖蔗糖酶接触以提供第一反应混合物，并且(iii)将葡聚糖酶添加到反应混合物中以产生包含CC-00478和/或CC-00485的组合物。在一个具体实施例中，监测第一反应混合物中蔗糖的消耗。一旦耗尽或消耗了一定量的蔗糖，就添加葡聚糖酶。

制备CC-00483的方法包括使包含含有罗汉果苷IIIE的组合物的介质与葡糖基转移酶、葡萄糖供体和葡萄糖供体再循环催化剂接触。在一个具体实施例中，制备CC-00485的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物的介质与UDP-糖基转移酶(UGT)、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖再循环催化剂和蔗糖接触以提供包含CC-00483的组合物。在一个具体实施例中，UGT是UGT-2，优选BcGT-1，这是一种由蜡样芽孢杆菌产生的UGT(Uniprot参考：Q739H3)。UDP-葡萄糖再循环催化剂可以是蔗糖合酶，优选源自拟南芥的蔗糖合酶(例如AtSUS)。

在另一个实施例中，起始罗汉果苷是罗汉果苷IV，并且本发明的罗汉果苷选自CC-00467、CC-00468和CC-00464。

制备CC-00467、CC-00468和/或CC-00464的方法包括使包含含有罗汉果苷IV的组合物的介质与葡糖基转移酶、葡萄糖供体和葡萄糖供体再循环催化剂接触。在一个具体实施例中，制备CC-00485的方法包括使包含含有罗汉果苷V的组合物的介质与UDP-糖基转移酶(UGT)、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖再循环催化剂和蔗糖接触以提供包含CC-00467、CC-00468和/或CC-00464的组合物。在一个具体实施例中，UGT是UGT-2，优选BcGT-1，这是一种由蜡样芽孢杆菌产生的UGT(Uniprot参考：Q739H3)。UDP-葡萄糖再循环催化剂可以是蔗糖合酶，优选源自拟南芥的蔗糖合酶(例如AtSUS)。

本文所用的生物催化剂可以以全细胞悬液形式、粗裂解物形式、纯化形式或其组合的形式提供。在一个实施例中，生物催化剂以纯化形式提供，即作为纯化的酶提供。在另一个实施例中，该生物催化剂以粗裂解物的形式提供。在再另一个实施例中，该生物催化剂以全细胞悬液的形式提供。

在一个具体实施例中，生物催化剂是固定化的酶。固定方法可以变化，并且包括例如固定到固体支持物上、包封或交联。固体支持物可以是例如合成树脂、生物聚合物或无机固体。

在另一个实施例中，该生物催化剂以一个或多个细胞的形式提供，即生物催化剂与一个或多个细胞缔合。生物催化剂可位于细胞表面上、细胞内部或既位于细胞表面上又位于细胞内部。在一个具体实施例中，以多细胞生物催化剂的形式提供生物催化剂。

在另一个实施例中，该生物催化剂以微生物的形式提供，即生物催化剂与微生物缔合。该微生物可以是具有必需的生物催化剂/酶的任何微生物。合适的微生物包括但不限于，大肠杆菌(E.coli)、荚膜醋酸菌(Acetobacter capsulatus)、柠檬明串珠菌、酵母菌属的种(Saccharomyces sp.)、曲霉菌属的种(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属的种(Pichiasp.)、芽孢杆菌的种(Bacillus sp.)、耶氏酵母属的种(Yarrowia sp.)等。

在一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是游离的(即不是固定的)。

在另一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是固定的。例如，可将微生物固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。适合用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括衍生的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。可以例如通过共价附着、吸附、交联、捕获或封装将微生物固定至固体支持物。

在再另一个实施例中，该生物催化剂由微生物分泌进入反应介质中。

本发明的反应典型地在约20℃至约70℃，例如约23℃至约40℃，或约30℃的温度下进行。

本发明的反应典型地在约3至约9，例如约5至约8的pH范围内进行。

在一个具体实施例中，本发明的方法提供了包含按重量计约1％或更高，例如按重量计约5％或更高、约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高或约90％或更高的量的本发明的罗汉果苷的组合物。

包含本发明的目标罗汉果苷的组合物包含反应副产物、过量试剂、未反应的起始原料和其他不希望的材料。因此，在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括将本发明的罗汉果苷与组合物中的这些不希望的材料中的至少一些分离，以提供分离的罗汉果苷组合物。可以使用任何合适的分离方法，例如裂解、结晶、通过膜分离、离心、萃取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体实施例中，分离可以通过离心来实现。

在一个实施例中，在转化进展的同时连续地将本发明的罗汉果苷从该介质中移除。在另一个实施例中，在反应淬灭(不一定完成)后，将本发明的罗汉果苷与介质分离。

分离可产生具有比所需的低的本发明罗汉果苷含量的组合物和/或该组合物可含有另外的组分，例如不期望的(在特性或含量上)和/或残留的反应产物。在一个实施例中，分离的罗汉果苷组合物包含按干重计纯度为至少约50％或更高，例如约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高的本发明的罗汉果苷。

可以将本发明组合物的分离的罗汉果苷进一步纯化以提供本发明组合物的纯化罗汉果苷组合物。如本文关于生物转化所用，术语“纯化的”是指以干重计具有至少约80％的本发明的罗汉果苷的组合物。在一个实施例中，纯化组合物含有按重量计至少约90％的本发明的罗汉果苷，例如按重量计至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

在示例性实施例中，纯化提供了本发明的纯罗汉果苷，即按干重计＞99％。

纯化可以通过本领域技术人员已知的任何手段实现，这些手段包括但不限于，结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体实施例中，使用HPLC。在一个更具体的实施例中，使用制备型HPLC。制备型HPLC可以重复进行，直到获得所需纯度。可以使用本文“纯化方法”部分中描述的任何纯化方法。

V.使用方法

本发明的罗汉果苷和组合物可用于赋予消费品甜度。

在一个方面，本发明是一种制备甜化消费品的方法，该方法包括(i)提供消费品并且(ii)将至少一种本发明的罗汉果苷添加到该消费品中以提供甜化消费品。

在一个具体实施例中，制备甜化消费品的方法包括(i)提供未甜化的消费品并且(ii)将至少一种本发明的罗汉果苷添加到该未甜化的消费品中以提供甜化消费品。

在一个具体实施例中，本发明是一种制备甜化饮料的方法，该方法包括(i)提供饮料并且(ii)将至少一种本发明的罗汉果苷添加到该饮料中以提供甜化饮料。

在一个具体实施例中，本发明是一种制备甜化饮料的方法，该方法包括(i)提供未甜化的饮料并且(ii)将至少一种本发明的罗汉果苷添加到该未甜化的饮料中以提供甜化饮料。

在上述方法中，本发明的罗汉果苷可以按原样提供，即以化合物的形式提供，或以组合物的形式提供。本发明的罗汉果苷的量，当添加到消费品(例如饮料)中时，可有效地提供等于或高于其甜度识别阈值的浓度。

本发明还包括制备甜化组合物(例如甜化消费品)和风味增强组合物的方法，其方式是将本发明的至少一种罗汉果苷或包含该罗汉果苷的组合物添加到此类组合物/消费品中。

实例

实例1：CC-00401的纯化和表征

表1：用于初级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表2：初级处理的制备型HPLC方法条件

表3：峰ID：3502-149-2-F1(批号IN-SSB-C-60-1)二级处理的制备型HPLC方法条件

表4：峰ID：3502-149-2-F1A(批号IN-SSB-C-62-1)三级处理的制备型HPLC方法条件

除非另有说明，否则所有溶剂比均以体积百分比(v/v)列出。

三级处理：使用表4中描述的制备型HPLC方法条件处理大约800mg的峰ID：3502-149-2-F1-A(批号IN-SSB-C-62-1)。合并从第三次处理中收集到的峰ID：3502-149-2-Fl-A8(批号IN-SSB-C-64-8)的级分(目标级分保留时间范围：19至20min)，并冻干进行分离。峰ID：3502-149-2-F1-A8(批号IN-SSB-C-64-8)的最终产量为80mg，纯度为98.1％(面积％)。

选择在m/z 1447.7处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表5.

C-3处的糖苷的

表6.

C-24处的糖苷的

表7.

确定CC-00401的结构为罗汉果苷-3-O-{[(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(l→6))]-β-D-吡喃葡萄糖苷}-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[P-D-吡喃葡萄糖基-(l→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷}。CC-00401是罗汉果苷VI的异构体，其糖单元的连键有所不同。

实例2：CC-00403的纯化和表征

用于分离CC-00403的材料是罗汉果提取物(批号CDC-A-12-1)：来自GLG的MonkGold MV40(批号GLG-MV40-2015112204)。

表8：用于多个过程的级分分析和最终纯度评价的分析HPLC条件

表9：初级处理的制备型HPLC方法条件

表10：二级处理的制备型HPLC方法条件

表11：三级处理的制备型HPLC方法条件

表12：四级处理的制备型HPLC方法条件

选择在m/z 1447.7处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表13.

C-3处的糖苷的

表14.

C-24处的糖苷的

表15.

确定CC-00403的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物是罗汉果苷VI的异构体，其葡萄糖单元(GlcVII)的连键有所不同，该葡萄糖单元经由1→6糖键附接至GlcII，因此在结构中带有三个1→6糖键。

实例3：CC-00436的制备、纯化和表征

使来自荚膜醋酸菌ATCC 11894的冷冻干燥细胞在装有3g/L酪蛋白蛋白胨(胰消化液)、25g/L甘露醇、5g/L酵母提取物和15g/L琼脂的皮氏培养皿(Petri-dish)中生长。挑选选定的细胞，并使其在装有200mL以下培养基的1L摇瓶中生长：3g/L酪蛋白蛋白胨(胰消化液)、5g/L酵母提取物和1％甘油。30h后，将预培养物用于在14个装有400mL相同培养基的摇瓶中开始生产(使用预培养物的3体积％)。40h后(OD600＝3.3；pH＝4.36)，收获细胞(细胞湿重29g)并于-20℃下储存。将细胞悬浮于200mL的pH 4.8的10mM乙酸钠缓冲液中并进行机械裂解。将上清液于-20℃下储存。

在1L的Schott烧瓶中，引入390mL水、60mL的pH 4.8的0.1M乙酸钠缓冲液、60mL的10mM罗汉果苷V水溶液、30g糊精-10(来自玉米淀粉)。将反应混合物在40℃下搅拌15min，然后通过添加60mL糊精葡聚糖酶制剂(总体积600mL)使反应开始。

定时取100μL等分试样，然后添加75μL的2N H

24h后，通过添加2N HC1直至达到pH 3来淬灭反应。添加600mL乙醇，并将获得的悬浮液在-20℃下放置过夜。离心后，在减压下将上清液的体积减少至250mL。用水将体积调节至600mL，并添加30g的Diaion HP-20。搅拌1h后，将悬浮液过滤并将树脂用100mL水洗涤两次，每次1h。用3个100mL的80％乙醇进行解吸。将合并的乙醇相蒸发至干。

表16：用于初级和二级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表17：用于最终纯度分析的分析HPLC条件

表18：用于初级制备型HPLC方法的条件。

表19：用于二级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1447.7处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表20.

表21.

C-24处的糖苷的

表22.

确定CC-00436的结构为罗汉果苷-3-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物与罗汉果苷V有关，但与它的不同之处在于另一个葡萄糖单元(GlcVII)通过1→6α-糖键附接于GlcV。随后从罗汉果提取物中分离出该化合物(TATE和LYLE；标识号：3502-149-1)，并通过将其NMR数据与生物转化化合物的数据进行比较来确认其结构。

实例4：CC-00367的制备、分离和表征

将1.287g的罗汉果苷V和1.82g的α-D-葡萄糖-1-氟化物(卡博森斯(Carbosynth)；MG09102)溶解在70mL的pH 7.5的142mM磷酸钾缓冲液中。在35℃下，向该澄清溶液中添加30mL的β-半乳糖苷酶(来自链霉菌属的种的变体，蛋白质序列中有单个突变，其中位置383处的谷氨酸变为丙氨酸；EC:3.2.1.23；UniProtKB-Q59976)(SEQ.ID 2)，分为三份添加(反应开始时添加第一份，反应6h后添加第二份，反应22h后添加第三份)。

SEQ.ID 2：

定时取125μL样品，并用125μL的80％MeOH淬灭。将100μL该淬灭溶液用900μL的50％MeOH稀释，并以13000rpm离心5min。通过HPLC分析该溶液的上清液。30h后，将100mL乙醇添加到反应混合物中。在-20℃下放置过夜后，将悬浮液离心并将上清液减压蒸发至大约50mL。用水将体积重新调节至100mL，并添加15g的Diaion HP-20树脂。将悬浮液搅拌1h后，通过过滤回收珠粒，并用50mL水洗涤两次(接触时间1h/次洗涤)。随后，将珠粒用50mL的80％乙醇处理3次(接触时间1h/次洗涤)。将合并的乙醇相减压蒸发至干，提供批号GM-3502-024。

表23：用于初级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表24：用于最终纯度分析的分析HPLC条件

表25：用于初级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1447.0处的[M-H]

C-3处的糖苷的

表26.

C-24处的糖苷的

表27.

C-3处的糖苷的

表28.

确定CC-00367的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4))-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物与罗汉果苷V有关，但与它的不同之处在于另一个葡萄糖单元(GlcVII)通过1→4糖键附接于GlcIII。随后从罗汉果提取物中分离出该化合物，并通过将其NMR数据与生物转化化合物的数据进行比较来确认其结构。

实例5：CC-00371的制备、纯化和表征

将1.287g的罗汉果苷V和0.182g的α-D-葡萄糖-1-氟化物(卡博森斯；MG09102)溶解在90mL的pH 7.0的110mM磷酸钾缓冲液中。在35℃下，向该澄清溶液中添加10mL的β-半乳糖苷酶(来自于硫磺矿硫化叶菌的变体；在蛋白质序列中具有单个突变，其中位置387处的谷氨酸变成甘氨酸(EC:3.2.1.23；UniProtKB-P22498)(SEQ.ID 1))。

SEQ.ID 1：

定时取125μL样品，并用125μL的80％MeOH淬灭。将100mL该淬灭溶液用900μL的50％MeOH稀释，并以13000rpm离心5min。通过HPLC分析该溶液的上清液。30h后，将100mL乙醇添加到反应混合物中。在-20℃下放置过夜后，将悬浮液离心并将上清液减压蒸发至大约50mL。用水将体积重新调节至100μL，并添加15g的Diaion HP-20树脂。将悬浮液搅拌1h后，通过过滤回收珠粒，并用50mL水洗涤两次(接触时间1h/次洗涤)。

随后，将珠粒用50mL的80％乙醇处理3次(接触时间1h/次解吸)。将合并的乙醇相减压蒸发至干，提供批号GM-3502-038。

表29：用于初级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表30：用于次级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表31：用于三级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表32：用于四级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表33：用于最终纯度分析的分析HPLC条件

表34：用于初级制备型HPLC方法的条件。

表35：用于二级制备型HPLC方法的条件。

表36：用于三级制备型HPLC方法的条件。

表37：用于四级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1447.0处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表38.

C-3处的糖苷的

表39.

C-24处的糖苷的

表40.

确定CC-00371的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3))-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物与罗汉果苷V有关，但与它的不同之处在于另一个葡萄糖单元(GlcVII)通过1→3糖键附接于GlcII。

实例6：CC-00417的制备、纯化和表征

使柠檬明串珠菌DSM 20188细胞在23℃下在培养基中生长，该培养基由以下组成：

40g/L蔗糖

20g/L酵母提取物(BIOKAR)

7.82g/L的KH

10.02g/L的K

0.2g/L的MgSO

0.01g/L的MnSO

0.02g/L的CaCl

0.01g/L的FeSO

离心后，将细胞团块冷冻储存并机械裂解。离心后，分离裂解物并于-20℃下储存。

DS-DSM 20188的活性测试

通过在30℃下在0.02g/L CaCl

DSM 20188葡聚糖蔗糖酶催化的罗汉果提取物MV55：样品41604_S14N2的转化

在500mL的Schott瓶中添加15mL的pH 5.2的1.0M乙酸钠缓冲液、30mL的0.5g/LCaCl

表41：用于初级过程中的级分分析和最终纯度分析的分析HPLC条件

表42：用于初级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1447.6处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表43.

C-3处的糖苷的

表44.

C-24处的糖苷的

表45.XH和13C NMR(500和125MHz，CD

确定CC-00417的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-[a-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物与罗汉果苷V相比含有一个另外的葡萄糖单元(GlcVII)，该葡萄糖单元通过1→6α-连键附接到GlcII，从而在结构中带有三个1→6糖键。

实例7：CC-00434的制备、纯化和表征

将罗汉果苷IIIE(500mg)和可溶性淀粉(2.5g)在50mL乙酸钠缓冲液(pH5)和酶(20mL；CGT“Amano”)中的混合物在约50℃下搅拌1天。将反应混合物在80℃下加热30min，并冷却至室温。过滤固体，并将滤液冷冻干燥，得到粗产物(批号GM-3502-156)，将粗产物使用制备型HPLC纯化。

表46：用于初级和二级过程中的级分分析的分析HPLC条件

表47：用于最终纯度分析的分析HPLC条件

表48：用于初级制备型HPLC方法的条件。

表49：用于二级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1285.6处的[M-H]

ID和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表50.

C-3处的糖苷的

表51.

C-24处的糖苷的

表52.

确定CC-00434的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[(α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4))-(α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4))-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。该化合物与罗汉果苷IIIE有关，但与它的不同之处在于有两个另外的葡萄糖单元(GlcVII和GlcVIII)通过1→4糖键附接于GlcIII。

实例8：CC-00478的制备、纯化和表征

从来自于罗汉果苷IIIE的生物转化的罗汉果苷混合物中分离出CC-00478和CC-00485。

介质的所有材料均购自飞世尔科技公司(Fisher Scientific)；基因和载体由通用基因公司(Gene Universal Inc.)合成并提供；TunerTM DE3感受态细胞-Novagen购自密理博西格玛公司(Millipore Sigma)；葡聚糖酶购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。

葡聚糖蔗糖酶表达菌株的构建

将基因dexYG(GenBank：DQ345760.1)克隆到具有克隆位点BamHI和Hindlll的载体pET-28a(+)中。然后将质粒pET-28a(+)-dexYG转化到TunerTM DE3感受态细胞中，以获得重组大肠杆菌BL21 Tuner DE3/pETdex。

将大肠杆菌BL21 Tuner DE3/pETdex的细胞在具有抗性50ug/ml卡那霉素的10mlLB培养基中于37℃、220rpm孵育过夜。然后将培养物转移到1L发酵培养基

将细胞重悬于320ml 50mM pH 5.5的乙酸钠缓冲液中，分成8支管，每管40mL。然后将细胞在冰上超声处理，开启3s/关闭3s，持续30min。将裂解物于13000rpm、4℃下离心40min。将上清液用于酶反应。

葡聚糖蔗糖酶反应：

蔗糖8g、罗汉果苷IIIE 2g、0.1M CaCl

葡聚糖酶反应：

对于每2g罗汉果苷IIIE，添加2.5ml葡聚糖酶(购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))，30℃，180rpm，2天。通过TLC和MALDI-TOF监测反应。反应完成后，将反应混合物煮沸10min并以12000rpm离心40min。收集上清液，蒸发并通过硅胶色谱法(3EtOAc/1MeOH)纯化。

表53：所有级分分析和最终纯度分析的分析HPLC条件。

表54：用于初级制备型HPLC方法的条件。

表55：用于二级制备型HPLC方法的条件。

选择在m/z 1123.0处的[M-H]

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表56.

C-3处的糖苷的

表57.

C-24处的糖苷的

表58.

￥在73.8ppm处有三个碳共振(73.75ppm和73.82ppm；两个碳共振在73.82ppm处重叠)，因此不能明确地指定化学位移。

确定CC-00478的结构为罗汉果苷-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖苷]-24-O-{[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。

实例9：CC-00485的制备、纯化和表征

如实例8所述，从来自于罗汉果苷IIIE的生物转化的罗汉果苷混合物中分离出CC-0485。

表59：所有级分分析和最终纯度分析的分析HPLC条件。

表60：用于初级制备型HPLC方法的条件。

表61：用于二级制备型HPLC方法的条件。

通过注入CC-00485的样品获得的ESI-TOF质谱显示出在m/z1123.5056处的[M-H]

选择在m/z 1123.6处的[M-H]

进行一系列NMR实验，包括

1D和2D NMR数据表明糖苷的中心核是三萜。苷元的

表62.

C-3处的糖苷的

表63.

C-24处的糖苷的

表64.

确定CC-00485的结构为罗汉果苷-3-O-{[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-P-D-吡喃葡萄糖苷}-24-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。

实例10：CC-00467的制备、纯化和表征

将601.6mg的罗汉果苷IV(最终浓度为1.0mM)溶解在含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.0、3mM MgCl

表65：用于多个过程的级分分析和最终纯度评价的分析HPLC条件

表66：#GM-3604-022-2初级处理的制备型HPLC方法条件

表67：峰ID：GM-3 604-022-2-P11(批号IN-SSB-C-116-11)二级处理的制备型HPLC方法条件

通过注入CC-00467的样品获得的ESI-TOF质谱显示出在m/z 1285.6426处的[M-H]

选择在m/z 1285.6处的[M-H]

进行一系列NMR实验，包括

苷元的

表68.

表69中提供了C-3糖苷的

表69.

表70中提供了C-24糖苷的

表70.

确定CC-00467的结构为罗汉果苷-3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}-24-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}。

实例11：CC-00483的制备、纯化和表征

将483.8mg的罗汉果苷Ille(最终浓度为1.0mM)溶解在含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.0、3mM MgCl

24h后，将反应混合物用2N H2SO4酸化，以达到3.0的最终pH。添加500mL乙醇，并将所得悬浮液在4℃下储存过夜。以10000×g*离心10min后，分离上清液并减压蒸发至200mL。用水将浓缩物的体积调节至500mL，并添加20g的Diaion HP-20树脂，并将所得混合物搅拌1h。通过与200mL水一起搅拌1h，将树脂洗涤两次。通过3次与200mL的80％乙醇一起搅拌1h进行解吸。将合并的解吸相蒸发至干，以提供蜡状固体。

表71：制备型HPLC方法条件

表72：用于多个过程的级分分析和最终纯度评价的分析HPLC条件

进行NMR光谱分析(图2和图3)以解析CC-00483的结构。

实例12：CC-00468的制备、纯化和表征。

从实例10的反应产物中分离出CC-00468。使用实例10中所述的分析和制备方法，通过HPLC纯化反应产物。使用初级制备型HPLC方法获得的目标级分的保留时间为20.50至21.50min。二级制备型HPLC方法中的目标级分的保留时间为30.50至32.00min。最终产量为2.5mg，纯度为96.8％(面积％)。合并从备型处理中收集的级分，并使用Labconco冷冻干燥器将其冻干(收集器温度在真空下保持为-44℃)。

进行NMR光谱分析(图4和图5)以解析CC-00468的结构。

实例13：CC-00464的制备、纯化和表征

从实例10的反应产物中分离出CC-00464。使用实例10中所述的分析和制备方法，通过HPLC纯化反应产物。使用初级制备型HPLC方法获得的目标级分的保留时间为12.21至13.00min。二级制备型HPLC方法中的目标级分的保留时间为15.30至16.30min。最终产量为5.4mg，纯度为98.9％(面积％)。合并从备型处理中收集的级分，并使用Labconco冷冻干燥器将其冻干(收集器温度在真空下保持为-44℃)。

进行NMR光谱分析(图6和图7)以解析CC-00464的结构。

实例14：CC-00458的制备、纯化和表征

将652.2mg的罗汉果苷V(最终浓度为1.0mM)溶解在含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.0、3mM MgCh、0.25M蔗糖、0.25mM UDP-葡萄糖，10体积％的UGT-2/BcGT-l裂解物和1体积％的AtSUS裂解物(表达拟南芥蔗糖合酶)的反应混合物中。最终体积为500mL。将反应混合物在30℃下磁力搅拌，同时定时取500μL样品。将这些样品用40μL的2N H2SO4和460μL的80％甲醇淬灭。以13000g离心2min后，通过HPLC分析样品。

24h后，将反应混合物用2N H

使用实例10中所述的分析方法和初级制备方法，通过HPLC纯化反应产物。使用初级制备型HPLC方法获得的目标级分的保留时间为14.00至15.00min。表73中示出了所用的二级制备型HPLC方法。

表73：二级处理的制备型HPLC方法条件

进行NMR光谱分析(图8和图9)以解析CC-00458的结构。

最终产量为3.0mg，纯度为76.9％(面积％)。合并从备型处理中收集的级分，并使用Labconco冷冻干燥器将其冻干(收集器温度在真空下保持为-44℃)。

实例15：CC-00367和CC-00371的感官评价

制备以下模拟饮料样品：

表74.

由经过培训的感官小组进行味道测试。在约4℃下提供样品。指示专家组成员喝1小口样品，在口腔中保持5s，吐出并评价给定的属性。在每个样品之间设置5min的间歇，并且指示专家组成员用至少1口无盐饼干和2小口滤过水来净化他们的味觉。在每个环节中，对于每个专家组成员而言样品是随机化的。

评价以下属性：

·甜味强度：5s内在口腔中的最大甜度水平

·苦味强度：5s内在口腔中的最大苦味水平

·总体最大甜味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·总体最大苦味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·甜味存留强度：品尝样品后1min的甜味强度

·苦回味强度：品尝样品后1min的苦味强度

使用方差分析(ANOVA)(样品为固定效应而专家组成员为随机效应)来确定在90％和95％置信度下(双尾)，对于每种属性而言样品间的显著性。使用Fishers LSD确定平均得分之间的显著性差异。

结果示于表75中，并在图1中进行了描绘：

表75.

*使用三因素方差分析(3-way ANOVA)(专家组成员、样品、专家组成员*样品)在p<0.05时针对每种属性对甜味剂进行比较

*在列中，在其旁边带有不同大写字母的均值在p<0.05时有显著性差异

实例16：CC-00401和CC-00403的感官评价

制备以下模拟饮料样品：

表76.

由经过培训的感官小组进行味道测试。在约4℃下提供样品。指示专家组成员喝1小口样品，在口腔中保持5s，吐出并评价给定的属性。在每个样品之间设置5min的间歇，并且指示专家组成员用至少1口无盐饼干和2小口滤过水来净化他们的味觉。在每个环节中，对于每个专家组成员而言样品是随机化的。

评价以下属性：

·甜味强度：5s内在口腔中的最大甜度水平

·苦味强度：5s内在口腔中的最大苦味水平

·总体最大甜味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·总体最大苦味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·甜味存留强度：品尝样品后1min的甜味强度

·苦回味强度：品尝样品后1min的苦味强度

使用方差分析(ANOVA)(样品为固定效应而专家组成员为随机效应)来确定在90％和95％置信度下(双尾)，对于每种属性而言样品间的显著性。使用Fishers LSD确定平均得分之间的显著性差异。

结果示于表77中：

表77：在4℃下CC-00401、CC-00403和7％蔗糖的甜度和苦味感知均值表。

*总体最大甜度和苦味包括在口腔中的甜味和苦味强度得分(如果属性在口腔中时达到峰值)；标准偏差

实例17：CC-00436的感官评价

制备以下模拟饮料：

表78.样品说明

由经过培训的感官小组进行味道测试。在约4℃下提供样品。指示专家组成员喝1小口样品，在口腔中保持5s，吐出并评价给定的属性。在每个样品之间设置5min的间歇，并且指示专家组成员用至少1口无盐饼干和2小口滤过水来净化他们的味觉。在每个环节中，对于每个专家组成员而言样品是随机化的。

评价以下属性：

·甜味强度：5s内在口腔中的最大甜度水平

·苦味强度：5s内在口腔中的最大苦味水平

·总体最大甜味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·总体最大苦味强度：从喝一小口时到1分钟所经历的最大甜味强度

·甜味存留强度：品尝样品后1min的甜味强度

·苦回味强度：品尝样品后1min的苦味强度

表79：在4℃下CC-00436和5％蔗糖的甜度和苦味感知均值表。

*总体最大甜度和苦味包括在口腔中的甜味和苦味强度得分(如果属性在口腔中时达到峰值)；标准偏差。