人线粒体DNA全序列扩增的方法以及用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒

摘要

本申请涉及生物技术领域，提供了一种人线粒体DNA全序列扩增的方法，包括：设计人线粒体DNA全序列扩增的单一对引物，所述单一对引物的序列如下：正向引物：5’‑CTAACCTGAATCGGAGGACAACC‑3’，反向引物：5’‑AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG‑3’；以人线粒体DNA为模板，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列。本申请提供的方法，采用一对引物把整个人线粒体扩增区域达到了16569bp，完整扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上所有可能的突变类型。与现有的技术相比，该方法提升了检测的范围，大幅度降低了漏检的可能性。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种人线粒体DNA全序列扩增的方法，以及用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒。

背景技术

线粒体存在于真核细胞中，是一种含有遗传物质(mitochondrial DNA，即mtDNA)的重要细胞器。与一般的核基因组DNA不同，人类mtDNA是一个双链环状超螺旋结构，全长16569bp，可以分为编码区和非编码区，其中编码区编码22种tRNA、2种rRNA和13种蛋白质，主要参与了细胞的能量代谢过程。mtDNA具有多种特点：(1)母系遗传，即母亲将她的mtDNA传递给子女，再由女儿将其传递给下一代，父亲不将其mtDNA传递给后代；(2)异质性，即某一细胞或组织内可同时含有多种类型的mtDNA基因组；(3)同质性，即异质性的细胞或组织经过多次分裂后，一个细胞或组织内的mtDNA具有相同的基因型；(4)多拷贝性，不同类型的细胞中含有mtDNA的拷贝数可以有很大的差异；(5)阈值效应，当异质性的个体含有致病性mtDNA突变时，野生型与突变型mtDNA比例的多少往往会决定疾病的临床表现，当mtDNA突变的水平达到或超过某个阈值时会有临床表现症状，症状的严重与突变mtDNA负荷的高低成正相关，从而造成阈值效应。阈值范围的突变负荷一般是在60％～80％之间，也可根据具体的mtDNA突变不同而产生变化。

在多数的线粒体遗传病中，mtDNA的点突变、碱基插入缺失、大片段的重复缺失等，是造成线粒体疾病的重要原因。到目前为止，与mtDNA突变有关的人类线粒体遗传病有100多种，例如MELAS综合征，肌阵挛癫痫破碎红纤维，Leigh综合征，Pearson综合征，Kearns-Sayre综合征，进行性眼外肌麻痹，Leber遗传性神经病，周围神经病、共济失调和视网膜色素变性，线粒体神经肠胃型脑病，肌病、乳酸中毒和铁粒幼细胞贫血，Alpers综合征，线粒体隐性共济失调综合征，wolfram综合征等。因此，线粒体基因的检测在线粒体疾病的确诊过程中具有非常重要的意义。

目前检测线粒体基因变异的技术手段有很多，比如southern-blot杂交技术、Gap-PCR技术及MLPA技术等，可这些技术多多少少都会有检测的变异类型单一、检测范围小、通量小、耗时长、通用性不强等缺点。通过测序检测线粒体变异的方法，目前主要可分为一代测序(Sanger测序)和二代测序(Next Generation Sequencing)两个类别。一代测序一个反应可以检测长达1kb左右的区间。由于线粒体长度在16kb以上，因此通过一代测序，通常需要20对以上的引物对分段进行扩增再分别进行检测。该方法不仅增加了成本、增加了对起始样本量的需求、增加了许多重复的操作，它的结果的读取主要依赖于人工肉眼逐位点的观察比较峰图，既费时费力也容易出错(目前有部分软件可以自动读图，但效果并不好，自动读取的结果易出错)。与一代测序相比，二代测序实现了更高程度的自动化处理，大大减少了人工读图的麻烦和错误；同时，如果多个样本同时进行检测时，检测成本和所耗时间和操作都降低了。目前，二代测序的建库方式，一般有两种方式，一是扩增建库，二是捕获建库。扩增建库是每200bp左右就设一对引物，利用多重PCR的原理，在两个反应管或多个反应管中将目标区域分段扩增出来。捕获建库也是隔几百bp设计一个杂交探针，通过多对的探针把目标区域分段拉下来。以上两种方式，都需要多对引物或探针(几十到数百)来实现目标区域的获得，这样不仅增加了用时、成本和操作难度以及对起始DNA样的需求，而且区域覆盖均一度可能较差、浪费部分测序容量、难以检测分析大片段的重复或缺失。

发明内容

本申请的目的在于提供一种人线粒体DNA全序列扩增的方法，以及用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒，旨在解决传统二代测序的建库方法使用多对引物扩增完整的线粒体DNA全序列存在的区域覆盖均一度较差、难以检测分析大片段的重复或缺失的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种人线粒体DNA全序列扩增的方法，所述方法包括：

设计人线粒体DNA全序列扩增的单一对引物，所述单一对引物的序列如下：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’；

以人线粒体DNA为模板，采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列。

优选的，所述采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增的步骤中，用于所述PCR扩增的反应体系中，以总体积为25-50μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

其中，所述引物为所述单一对引物，所述模板DNA的浓度为30-100ng/μl，所述引物的浓度为10μmol/L，所述TKS Gflex DNA Polymerase的浓度为1.25U/μl。

优选的，所述采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增，包括：在温度为94-98℃的条件下预热1-2min；

在温度为98℃的条件变性10-15sec；在温度为65-68℃的条件退火30-60sec；在温度为68℃的条件延伸10-14min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68-70℃的条件再延伸30-45min；

在温度为10-12℃的条件保温。

优选的，所述采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增的步骤中，用于所述PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

其中，所述模板DNA的浓度为30-100ng/μl，所述引物的浓度为10μmol/L，所述TKSGflex DNA Polymerase的浓度为1.25U/μl。

优选的，采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增，包括：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃的条件保温。

优选的，所述人线粒体DNA采用人类全基因组试剂盒

优选的，所述方法包括：

设计人线粒体DNA全序列扩增的单一对引物，所述单一对引物的序列如下：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’；

以人线粒体DNA为模板，采用所述单一对引物对所述人线粒体DNA进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列，其中，用于所述PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

其中，所述模板DNA的浓度为30-100ng/μl，所述引物的浓度为10μmol/L，所述TKSGflex DNA Polymerase的浓度为1.25U/μl。

所述PCR扩增的流程为：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃的条件保温。

第二方面，本申请提供一种用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒，包括单一对引物，且所述单一对引物的序列为：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’。

优选的，所述试剂盒还包括：ddH

优选的，所述试剂盒中，ddH

本申请提供的人线粒体DNA全序列扩增的方法，采用特定的单一引物对将人线粒体DNA扩增，扩增区域达到了16569bp，实现了人线粒体DNA的全序列扩增。本申请提供的方法，可以完整扩增整个环形线粒体DNA，并覆盖环形线粒体DNA上所有可能的突变类型。与现有的二代测序的建库技术相比，该方法提升了人线粒体DNA扩增产物的完整性和准确性，为二代测序提供了更为准确的样本，从而可以扩增检测的范围，大幅度降低了二代测序漏检的可能性。此外，本申请提供的方法，相对于多对引物扩增整个线粒体，在进行扩增时，单个样本仅需一个PCR反应的扩增时间(约6h)就能实现整个线粒体DNA的扩增，操作更简单快捷，省时省力，所需的反应体系成本也大为降低。

本申请提供的用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒，含有特定序列的单一引物对，该引物可以实现了人线粒体DNA的全序列扩增，使得单一样本检测时仅需一份DNA模板，减少了模板DNA的用量，特别适用于珍贵样本和难以取材的一些特殊样本的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1、实施例2提供的PCR产物的电泳图；

图2是本发明对比例1、对比例2提供的PCR产物的电泳图；

图3是实施例1单一对引物和对比例1三对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物测序质量报告；

图4是实施例1单一对引物和对比例1三对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库后二代测序获得的每碱基覆盖深度图；

图5是实施例1的PCR产物进行二代测序后，通过IGV软件查看的突变位点示意；

图6是实施例2的PCR产物进行二代测序后，通过IGV软件查看的突变位点示意图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

由于人类线粒体DNA具有双链环状超螺旋结构，且序列很长，全长16569bp，采用单一引物扩增的技术存在瓶颈。正是因为这个原因，目前二代测序的建库仍然基于多引物对来实现人线粒体DNA全序列的扩增，一直没有寻求到相关的单一引物对，来实现人线粒体DNA全序列的扩增。有鉴于此，

本申请实施例第一方面提供一种人线粒体DNA全序列扩增的方法，方法包括：

S01.设计人线粒体DNA全序列扩增的单一对引物，单一对引物的序列如下：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’。

对于人线粒体DNA全序列的扩增，引物的设计显得尤为重要。本申请实施例提供的单一引物对，具有上述序列，本申请实施例通过单一引物即可对实现人线粒体DNA全序列的扩增。其中，正向引物具有23个碱基，设计于人线粒体DNA位置为15750-15772bp(5’端到3’端)的碱基序列处；反向引物具有21个碱基，设计于线粒体位置为15729-15749bp(5’端到3’端)碱基序列处。此外，具有上述序列的引物对，避开了人线粒体DNA非编码区中的三个高变区。这三个高变区分别为：位置为16024-16365bp的第一高变区，位置为3-340bp的第二高变区和位置为438-574bp的第三高变区。通过避开上述三个高变区，可以降低多态性位点对扩增得到的序列的完整性和准确性的影响，从而提高扩增产物的准确性。另一方面，本申请实施例中，正向引物位置为线粒体DNA的15750-15772bp，反向引物位置为线粒体DNA的15729-15749bp，位置15749和15750是相连的碱基位置，正向引物和反向引物可以连接。在这种情况下，在扩增整个线粒体时，能够毫无间隙且不存在叠加区域的扩增出整个线粒体DNA。

S02.以人线粒体DNA为模板，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列。

在一些实施例中，人线粒体DNA采用人类全基因组试剂盒

本申请实施例中，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，包括：配置用于PCR扩增的反应体系。在一些实施例中，用于PCR扩增的反应体系中，以总体积为25-50μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

其中，引物为所述单一对引物，模板DNA的浓度为30-100ng/μl，引物的浓度为10μmol/L，TKS Gflex DNA Polymerase的浓度为1.25U/μl。

应当理解的时，反应体系的总体积不限于25-50μl，且当反应体系的总体积不为25-50μl时，上述各成分的含量参照上述含量范围比进行调整。

上述反应体系，对本申请实现单一引物对的全序列扩增，能够在使用少量模版DNA情况下，确保扩增出个整个线粒体DAN进行后续的二代测序分析。

示例性的，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增的步骤中，用于PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

在一些实施例中，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，包括以下流程：

在温度为94-98℃的条件下预热1-2min；

在温度为98℃的条件变性10-15sec；在温度为65-68℃的条件退火30-60sec；在温度为68℃的条件延伸10-14min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68-70℃的条件再延伸30-45min；

在温度为10-12℃的条件保温。

在这种PCR扩增条件下，能够使用尽可能少量的时间，扩增出整个人线粒体DNA。

示例性的，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，包括：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃的条件保温。

本申请实施例提供的人线粒体DNA全序列扩增的方法，采用特定的单一引物对将人线粒体DNA扩增，扩增区域达到了16569bp，实现了人线粒体DNA的全序列扩增。本申请提供的方法，可以完整扩增整个环形线粒体DNA，并覆盖环形线粒体DNA上所有可能的突变类型。与现有的二代测序的建库技术相比，该方法提升了人线粒体DNA扩增产物的完整性和准确性，为二代测序提供了更为准确的样本，从而可以扩增检测的范围，大幅度降低了二代测序漏检的可能性。此外，本申请实施例提供的方法，相对于多对引物扩增整个线粒体，在进行扩增时，单个样本仅需一个PCR反应的扩增时间(约6h)就能实现整个线粒体DNA的扩增，操作更简单快捷，省时省力，所需的反应体系成本也大为降低。

作为一种优选实施例，人线粒体DNA全序列扩增的方法包括：

设计人线粒体DNA全序列扩增的单一对引物，单一对引物的序列如下：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’；

以人线粒体DNA为模板，采用单一对引物对人线粒体DNA进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列，其中，用于PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

PCR扩增的流程为：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃的条件保温。

本申请实施例第二方面提供一种用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒，包括单一对引物，且单一对引物的序列为：

正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’

反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’。

在一些实施例中，试剂盒还包括：ddH

优选的，试剂盒中，ddH

使用本申请实施提供的试剂盒对模板DNA(待检测人线粒体DNA样本)进行检测时，ddH

本申请实施例提供的用于人线粒体DNA全序列扩增的试剂盒，含有特定序列的单一引物对，该引物可以实现了人线粒体DNA的全序列扩增，使得单一样本检测时仅需一份DNA模板，减少了模板DNA的用量，是被适用于珍贵样本和难以取材的一些特殊样本的检测。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

检测3例线粒体母系遗传性耳聋患者，包括：

(1)将收集到的3例线粒体母系遗传性耳聋患者分别标记为D1、D2、D3，按照人类全基因组试剂盒

(2)以人线粒体DNA为模板，采用单一对引物(正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’，反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’)对D1、D2、D3进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列。其中，单一对引物进行PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

单一对引物进行PCR扩增的流程为：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃保温。

将实施例1得到的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。图中，marker为λ-HindⅢdigest DNA分子量；D1、D2、D3代表3例线粒体母系遗传性耳聋样本。由图1可见，实施例1得到的PCR产物的扩增产物条带大小清晰。

对比例1

与实施例1的不同之处在于：步骤(2)中，同时使用三对引物对D1、D2、D3进行整个线粒体全序列的PCR扩增，得到的PCR产物。其中，三对引物分别为：

引物对1

F1：CCCACTCCCATACTACTAATCTCATC

R1：TAAGGAGAAGATGGTTAGGTCTACGG

引物对2

F2：TCTAGGTAACGACCACATCTACAACG

R2：TTTAGAAGGGCTATTTGTTGTGGG

引物对3

F3：CTATAACCACCCTAACCCTGACTTC

R3：TCAGTGTATTGCTTTGAGGAGGTAAG

将对比例1得到的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示。图中，marker为1kb DNA分子量；序号1、2、3代表线粒体母系遗传性耳聋样本D1；序号4、5、6代表线粒体母系遗传性耳聋样本D2；序号7、8、9代表线粒体母系遗传性耳聋样本D3。由图2可见，对比例1得到的PCR产物的扩增产物条带结果清晰。

将实施例1单一对引物和对比例1三对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库上机，经由Ion Torrent二代测序平台检测，然后再进行生物信息学分析，生成的测序质量报告，如图3所示。报告显示：经由本实施例1方法经单一对引物扩增的线粒体全序列建库进行测序的样本，线粒体DNA在测序深度上可以达到100％的覆盖度和大于99.9％的均一性。

将实施例1单一对引物和对比例1三对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库后二代测序获得的每碱基覆盖深度图如图4所示。由图可见：采用单一引物对扩增时(第1列和第3列拟合曲线图)比多引物对扩增(第2列和第4列拟合曲线图)在线粒体全长上测序时的均一性更好(曲线更平缓)且在多样本中的重复性很高(曲线形状基本一致)。

实施例1单一对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库后二代测序中耳聋家系样本检出完全的m.1555A>G突变，其中，PCR产物进行二代测序后，通过IGV软件查看的突变位点示意图如图5所示，符合该病的遗传模式和临床表型。由图可观测到在图中央位置(第一列纵向灰色显示区域)的m.1555A>G突变负荷在三个受检样本中均达到100％，与临床分析结果相匹配。由图1样本PCR产物电泳产生的条带大小及图5二代测序的分析结果，可以看出实施例1实现了人线粒体DNA全序列的扩增，且结果准确。

实施例2

检测3例Leber遗传性视神经病样本，包括：

(1)将收集到的3例Leber遗传性视神经病样本分别标记为L1、L2、L3，按照人类全基因组试剂盒

(2)以人线粒体DNA为模板，采用单一对引物(正向引物：5’-CTAACCTGAATCGGAGGACAACC-3’，反向引物：5’-AATGAGGAGGTCTGCGGCTAG-3’)对D1、D2、D3进行PCR扩增，得到人线粒体DNA全序列。其中，单一对引物进行PCR扩增的反应体系中，以总体积为25μl的体积为基准，包括如下体积比的下列成分：

单一对引物进行PCR扩增的流程为：

在温度为94℃的条件下预热1min；

在温度为98℃的条件变性10sec；在温度为65℃的条件退火30sec；在温度为68℃的条件延伸10min；按照变性、退火和延伸的流程重复30个循环；

在温度为68℃的条件再延伸30min；

在温度为12℃的条件保温。

将实施例2得到的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。图中，marker为λ-HindⅢdigestDNA分子量；L1、L2、L3代表3例Leber遗传性视神经病样本。由图1可见，实施例1得到的PCR产物的扩增产物条带大小清晰。

对比例2

与实施例2的不同之处在于：步骤(2)中，同时使用三对引物对D1、D2、D3进行整个线粒体全序列的PCR扩增，得到的PCR产物。

其中，三对引物分别为：

引物对1

F1：CCCACTCCCATACTACTAATCTCATC

R1：TAAGGAGAAGATGGTTAGGTCTACGG

引物对2

F2：TCTAGGTAACGACCACATCTACAACG

R2：TTTAGAAGGGCTATTTGTTGTGGG

引物对3

F3：CTATAACCACCCTAACCCTGACTTC

R3：TCAGTGTATTGCTTTGAGGAGGTAAG

将对比例1得到的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示。图中，marker为1kb DNA分子量；序号10、11、12代表Leber遗传性视神经病样本L1；序号13、14、15代表Leber遗传性视神经病样本L2；序号16、17、18代表Leber遗传性视神经病样本L3。由图2可见，对比例例1得到的PCR产物的扩增产物条带结果清晰。

将实施例2单一对引物和对比例2三对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库后二代测序获得的每碱基覆盖深度图如图4所示。由图可见：采用单一引物对扩增时(第1列和第3列拟合曲线图)比多引物对扩增(第2列和第4列拟合曲线图)在线粒体全长上测序时的均一性更好(曲线更平缓)且在多样本中的重复性很高(曲线形状基本一致)。

实施例2单一对引物扩增出线粒体全序列的PCR产物建库后二代测序中Leber遗传性视神经病样本检测出Leber遗传性视神经病存在的m.14495A>G突变，且样本中检测出的突变负荷情况符合Leber遗传性视神经病的遗传模式和临床表型。其中，PCR产物进行二代测序后，通过IGV软件查看的突变位点示意图见图6所示。由图可观测到在图中央位置(中央纵向灰色显示区域)Leber遗传性视神经病存在的m.14495A>G突变，且样本中检测出的突变负荷情况符合Leber遗传性视神经病的遗传模式和临床表型。由图2样本PCR产物电泳产生的条带大小及图6二代测序的分析结果，可以看出实施例2实现了人线粒体DNA全序列的扩增，且结果准确。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。