一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围

摘要

本发明公开了一种3‑溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，属于生物学技术领域，包括如下步骤：称取GMO0.889g，F1270.111g置于烧杯内，60℃恒温水浴；磁力搅拌至完全融化后加入3‑BP26.67mg，缓慢加入提前预热的纯水25ml至油相中作为前体溶液；将前体溶液在14900psi，9次循环下通过高压均质，既得乳白色3‑BP‑LCNP。本发明初步筛选了辅料、稳定剂、分散相用量以及药物用量对脂质立方液晶晶型的影响，并采用正交设计优化制剂处方工艺，粒径、包封率均符合要求，筛选的处方及制备工艺简单可行，制得的立方液晶纳米粒稳定性好。

说明书

技术领域

本发明涉及处方筛选及应用范围，特别是涉及一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，属于生物学技术领域。

背景技术

3-溴丙酮酸3-bromopyruvate，3-BP，分子量166.96，作用于糖酵解中的关键限速酶己糖激酶ⅡHKⅡ，作为强大的糖酵解抑制剂，因与体内细胞代谢产物乳酸、丙酮酸结构相似，使其可以借助转运乳酸、丙酮酸的蛋白如单羧酸转运蛋白MCT1转运进入肿瘤细胞，可以有效的减少肿瘤细胞内ATP的生成，切断肿瘤细胞的能量供应，通过饿死肿瘤细胞达到杀死肿瘤细胞的目的，但是由于结构简单及不明确的的副作用，3-BP长期使用安全性等仍需考察，临床使用仍然受限，因此对3-BP结构改造如形成药物共聚物、或者使用新型递药体系如脂质体、金纳米颗粒、微胶囊化、微纳米脂质等进行抗肿瘤研究，具有较大的意义。

脂质立方液晶纳米粒liquidcrystallinenanoparticles，LCNP是由一定浓度的两亲性脂质分散在水溶液中自发形成的含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层蜂窝状结构，两亲性脂质一般先自发形成热力学稳定的脂质双层，再重组成具有各种形状和结构的液晶体系，如层状液晶lamellar、立方液晶cubosomes、六角液晶hexagonal，立方液晶因其独特的双水道结构，可以包载不同极性、粒径的药物，使药物能够较少的受到机体和免疫系统的影响，立方液晶是自稳定体系，稳定性优于传统的纳米粒，而且载体材料安全、无毒、流动性好，可用于静脉注射等，针对3-溴丙酮酸所面临的问题，制备3-溴丙酮酸脂质立方液晶纳米制剂。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，使商品快速编码，方便使用编码。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称取GMO0.889g，F1270.111g置于烧杯内，60℃恒温水浴；

步骤2：磁力搅拌至完全融化后加入3-BP26.67mg，缓慢加入提前预热的纯水25ml至油相中作为前体溶液；

步骤3：将前体溶液在14900psi，9次循环下通过高压均质，既得乳白色3-BP-LCNP。

优选的，包括：色谱条件、溶液的制备、标准曲线的建立和样品质量的考察；

色谱条件为：色谱柱：ZOBARXSB-AQ4.6×150mm，5m；流动相：0.1％三氟乙酸-水：0.1％三氟乙酸-乙腈90：10，V/V；流速0.8mL/min；紫外检测波长204nm；进样量20μl；柱温：室温；

溶液的制备：

精密称取3-BP对照品适量，至10ml棕色量瓶中，加入适量流动相溶解并稀释定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的对照品储备液；

精密量取空白LCNP溶液1ml，置于10ml棕色容量瓶中，加入适量流动相，超声10min，定容至刻度即得空白脂质立方液晶溶液；

精密量取3-BP-LCNP溶液1ml，置于10ml棕色容量瓶中，加入适量流动相，超声10min，定容至刻度即得供试品溶液；

标准曲线的建立：取对照品储备液稀释成5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml和750μg/ml的对照品溶液，取20μl进样，记录色谱图，以峰面积(A)对质量浓度(C，μg/mL)进行线性回归；

样品质量的考察：对样品的专属性、精密度、稳定性、回收率、包封率和透析时间进行考察筛选得到3-溴丙酮酸脂质立方液晶。

优选的，在溶液的制备的过程中，溶液均用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样。

优选的，专属性的考察为取标准曲线的建立中的对照品和制备的供试品及空白脂质立方液晶溶液，进样并记录色谱图，观察辅料对3-BP的含量测定是否存在干扰。

优选的，精密度考察为将3-BP对照品分别配制成10μg/ml、90μg/ml和250μg/ml的低、中、高三种不同浓度的溶液，一天内重复进样6次，计算日内精密度；连续测定3天，计算日间精密度，计算其相对标准差。

优选的，稳定性考察为取同一份3-BP供试品溶液，室温条件下分别放置0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h，进样并记录峰面积；包封率为精密量取3-BP-LCNP1ml至透析袋中，室温下以纯水作为透析介质，透析4h，取样品超声破乳或透析液中游离3-BP续滤液进样，测得3-BP峰面积，计算其包封率；载药量计算公式：载药量％＝脂质立方液晶中所含药物重/脂质立方液晶的总重×100％。

优选的，回收率考察为将3-BP对照品加入至空白脂质立方液晶中，分别配制成25.3μg/ml、101.2μg/ml、253μg/ml的低、中、高三种不同浓度的溶液，每个样品平行进样3次，记录3-BP峰面积。

优选的，透析时间考察为精密量取3-BP-LCNP1ml至预处理好的透析袋中，室温下纯水作为透析介质，磁力搅拌；分别于第1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h取样并补足相应的体积，取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积。

优选的，回收率考察分为方法回收率和加样回收率，方法回收率精密量取3-BP对照品溶液，分别配制成低、中和高3种不同浓度的溶液；取1ml至预处理好的透析袋中，室温下以200ml纯水作为透析介质，透析4h；取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积；加样回收率量取3-BP对照品溶液适量，用空白LCNP定容至10ml，配制成低、中、高3种浓度，取1ml至预处理好的透析袋中，室温下以200ml纯水作为透析介质，透析4h，取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积。

3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法在进行抗肿瘤研究范围内应用。

本发明的有益技术效果：按照本发明的一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，本发明提供的一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，初步筛选了辅料、稳定剂、分散相用量以及药物用量对脂质立方液晶晶型的影响，并采用正交设计优化制剂处方工艺，由于注入法制备得到的立方液晶粒径较大，且不稳定、不均一，因此通过一定的外界能量如均质、超声、高速搅拌等制备的纳米粒不仅能够增加纳米粒在水中的分散程度，还可以提高药物包封率；同时通过单因素分别考察均质压力和均质次数对3-BP-LCNP的粒径和包封率的影响，选择最佳的制备工艺，在14900psi压力下，均质9次得到的3溴丙酮酸脂质立方液晶纳米粒的粒径稳定在192.7nm左右，包封率达到了70％以上，粒径、包封率均符合要求，筛选的处方及制备工艺简单可行，制得的立方液晶纳米粒稳定性好。

附图说明

图1为按照本发明的3-BP标准曲线图的一优选实施例的整体结构示意图；

图2为按照本发明的-BP(A)3-BP-LCNP(B)LCNP(C)的高效液相色谱图的一优选实施例的整体结构示意图；

图3为按照本发明的立方液晶偏光显微镜图的一优选实施例的整体结构示意图；

图4为按照本发明的不同均质压力下的粒径分布的一优选实施例的整体结构示意图；

图5为按照本发明的不同均质次数下的粒径分布的一优选实施例的整体结构示意图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例提供的3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称取GMO0.889g，F1270.111g置于烧杯内，60℃恒温水浴；

步骤2：磁力搅拌至完全融化后加入3-BP26.67mg，缓慢加入提前预热的纯水25ml至油相中作为前体溶液；

步骤3：将前体溶液在14900psi，9次循环下通过高压均质，既得乳白色3-BP-LCNP。

包括：色谱条件、溶液的制备、标准曲线的建立和样品质量的考察；色谱条件为：色谱柱：ZOBARXSB-AQ4.6×150mm，5m；流动相：0.1％三氟乙酸-水：0.1％三氟乙酸-乙腈90：10，V/V；流速0.8mL/min；紫外检测波长204nm；进样量20μl；柱温：室温；溶液的制备：精密称取3-BP对照品适量，至10ml棕色量瓶中，加入适量流动相溶解并稀释定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的对照品储备液；精密量取空白LCNP溶液1ml，置于10ml棕色容量瓶中，加入适量流动相，超声10min，定容至刻度即得空白脂质立方液晶溶液；精密量取3-BP-LCNP溶液1ml，置于10ml棕色容量瓶中，加入适量流动相，超声10min，定容至刻度即得供试品溶液；标准曲线的建立：取对照品储备液稀释成5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml和750μg/ml的对照品溶液，取20μl进样，记录色谱图，以峰面积(A)对质量浓度(C，μg/mL)进行线性回归；样品质量的考察：对样品的专属性、精密度、稳定性、回收率、包封率和透析时间进行考察筛选得到3-溴丙酮酸脂质立方液晶。在溶液的制备的过程中，溶液均用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样。

专属性的考察为取标准曲线的建立中的对照品和制备的供试品及空白脂质立方液晶溶液，进样并记录色谱图，观察辅料对3-BP的含量测定是否存在干扰。精密度考察为将3-BP对照品分别配制成10μg/ml、90μg/ml和250μg/ml的低、中、高三种不同浓度的溶液，一天内重复进样6次，计算日内精密度；连续测定3天，计算日间精密度，计算其相对标准差。稳定性考察为取同一份3-BP供试品溶液，室温条件下分别放置0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h，进样并记录峰面积；包封率为精密量取3-BP-LCNP1ml至透析袋中，室温下以纯水作为透析介质，透析4h，取样品超声破乳或透析液中游离3-BP续滤液进样，测得3-BP峰面积，计算其包封率；载药量计算公式：载药量％＝脂质立方液晶中所含药物重/脂质立方液晶的总重×100％。

回收率考察为将3-BP对照品加入至空白脂质立方液晶中，分别配制成25.3μg/ml、101.2μg/ml、253μg/ml的低、中、高三种不同浓度的溶液，每个样品平行进样3次，记录3-BP峰面积。透析时间考察为精密量取3-BP-LCNP1ml至预处理好的透析袋中，室温下纯水作为透析介质，磁力搅拌；分别于第1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h取样并补足相应的体积，取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积。回收率考察分为方法回收率和加样回收率，方法回收率精密量取3-BP对照品溶液，分别配制成低、中和高3种不同浓度的溶液；取1ml至预处理好的透析袋中，室温下以200ml纯水作为透析介质，透析4h；取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积；加样回收率量取3-BP对照品溶液适量，用空白LCNP定容至10ml，配制成低、中、高3种浓度，取1ml至预处理好的透析袋中，室温下以200ml纯水作为透析介质，透析4h，取续滤液20μl进样，记录3-BP峰面积。3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法在进行抗肿瘤研究范围内应用。

采用不同比例的处方GMO/F127，比例为9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1，wt％、纯水分为20、70、80和90，wt％，利用偏光显微镜进行立方液晶处方的初步筛选。采用正交设计L9，以3-BP占GMO比例、GMO/F127比例、分散相的用量、搅拌时间四因素，以包封率为评价指标，筛选3-BP-LCNP最优处方。

表1 3-BP-LCNP处方筛选正交设计因素表

均质压力将3-BP-LCNP放入高压均质机内，均质压力分别为7450、14900、22500psi，均质次数固定为9次，收集均质后3-BP-LCNP，测定粒径及包封率。

均质次数为将3-BP-LCNP放入高压均质机内，固定压力为14900psi，均质次数为3、6、9次，收集均质后3-BP-LCNP，测定粒径及包封率。

3-BP方法学结果是标准曲线：3-BP在5～750μg/mL内线性关系满足试验要求。标准曲线方程：A＝0.0464C-0.0719，R2＝0.9999。

3-BP色谱图(A)与3-BP-LCNP色谱图(B)的保留时间一致，空白LCNP色谱图(C)在此时间内无干扰峰出现，表明辅料对3-BP含量测定无干扰，专属性良好。

低、中、高三种浓度的3-BP的日内精密度RSD分别为1.3、3、2.17％，日间精密度RSD分别为0.8、1.63、2.12％，均小于4％，符合测定要求。样品24h内3-BP峰面积RSD小于2％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。低、中、高三个浓度的3-BP平均回收率分别为96.15％、97.96％、92.86％，回收率均在90％以上，满足试验要求

表2 3-BP回收率考察结果

透析时间考察是每小时取样结果显示，透析液中游离的3-BP含量为1.566、1.67、1.727、1.751、1.753、1.754、1.754μg/mL，随着透析时间的延长，游离药物量有所增加，但透析5h之后，透析液中含量基本不再增加，说明透析5h后，达到平衡状态，所以将透析时间定为5h。

方法回收率为低、中、高三个浓度的3-BP平均回收率分别为83.16％、90.24％、98.2％，回收率均大于80％，3-BP能自由透过透析膜，说明透析法可用于测定3-BP-LCNP的包封率。

表3 3-BP透析方法学方法回收率考察结果

加样回收率为3-BP低、中、高三个浓度的平均回收率分别为92.0％、90.03％、91.89％，回收率均大于90％，说明空白LCNP对透析法测定药物的包封率影响较小。

表4 3-BP透析方法学加样回收率考察结果

处方筛选结果是在偏光显微镜下，层状液晶因具有光学双折射性，呈十字花纹或油状花纹；立方液晶因其不具有光学双折射性，在偏光显微镜下呈暗视野。结果所示，当含水量为20％时大部分未形成立方液晶，少部分形成层状液晶；当含水量超过70％时都形成立方液晶，但是当含水量在40％-60％时，立方液晶呈现粘稠胶状，不利于静脉给药，因此选择在制备的过程中加入过量的水。

表5脂质立方液晶处方筛选

C:立方液晶；L:层状液晶；N:未形成液晶

正交试验设计结果显示(见表6)，影响因素由大到小的顺序依次为C分散相的用量>BGMO/F127比例>A3-BP占GMO比例>D搅拌时间，不同因素内各水平对结果的影响强弱为：A1>A3>A2,B1>B3>B2,C2>C3>C1,D3>D1>D2。根据正交试验方差分析结果，GMO/F127比例、分散相的用量、搅拌时间对处方包封率均有显著影响，通过正交试验获得的最佳处方为A1B1C2D3，即处方为：3-BP26.67mg、GMO0.889g、F1270.111g、预热的纯水25ml，即得到包封率为72.53％的制剂处方。

表6 3-BP-LCNP处方优化正交设计L9(34)结果表

表7 L9(34)正交试验方差分析结果

F

3-BP-LCNP应用范围，均质压力结果显示，当均质压力逐渐增高时，3-BP-LCNP的包封率和粒径逐渐降低。由表可知，3-BP-LCNP分散度与均质压力关联较小，考虑到过高的均质压力可能破坏立方液晶的结构，本试验选择14900psi作为最终的均质压力。

表8均质压力考察

均质次数结果显示，3-BP的包封率与均质次数关联较小，但是对3-溴丙酮酸的平均粒径影响较大，当逐渐增加均质次数时，立方液晶纳米粒的粒径逐渐下降。当均质次数超过6次时，粒径下降的幅度较小；当均质次数超过9次时，粒径分布集中。因此最终选择循环次数为9次作为最优制备工艺条件。

表9均质次数考察

综上所述，在本实施例中，按照本实施例的一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，本实施例提供的一种3-溴丙酮酸脂质立方液晶的制备方法及应用范围，本实验，初步筛选了辅料、稳定剂、分散相用量以及药物用量对脂质立方液晶晶型的影响，并采用正交设计优化制剂处方工艺。由于注入法制备得到的立方液晶粒径较大，且不稳定、不均一，因此通过一定的外界能量如均质、超声、高速搅拌等制备的纳米粒不仅能够增加纳米粒在水中的分散程度，还可以提高药物包封率。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。