轻度或重度牙周炎的诊断

摘要

公开了一种用于评估患有牙周炎的人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的体外方法。该方法基于见解以确定两种生物标志物蛋白质的选择。因此，在患有牙周炎的患者的唾液样本中，测量蛋白质丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶‑9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb‑β)中的至少一种；或基质金属蛋白酶‑9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种的浓度。基于所测量的浓度，确定反映所述蛋白质的联合浓度的值。将该值与以相同方式反映与重度牙周炎相关的联合浓度的阈值进行比较。该比较允许评估测试值是指示所述患者中存在重度牙周炎还是轻度牙周炎。由此，典型地，反映联合浓度低于阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者中的轻度牙周炎，并且反映联合浓度等于或高于阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者中的重度牙周炎。

说明书

技术领域

本发明属于口腔护理领域，并且涉及牙周疾病的基于唾液的诊断。具体而言，本发明涉及一种用于区分轻度牙周炎和重度牙周炎的试剂盒和方法。

背景技术

齿龈炎或牙龈炎是一种非破坏性的牙周疾病，主要由牙齿表面附着的牙齿细菌生物被膜或牙菌斑引起，这种附着引发周围组织的炎性反应。牙龈炎是一种可逆的齿龈组织感染和炎症，可通过适当的口腔卫生措施和牙科专业干预予以解决。如果没有检测到或解决，牙龈炎通常会导致牙齿周围组织(即牙周组织)的炎症，这种情况被定义为导致组织破坏和齿槽骨丧失的牙周炎，并且最终导致牙齿丧失。在齿龈疾病的发展过程中，通常会出现与其相关的临床迹象和症状，例如齿龈肿胀、颜色从粉红色变为暗红色、齿龈出血、口腔异味以及齿龈变得触摸起来更疼或更痛。

牙周炎是一种由口腔微生物引起的慢性多因素炎性疾病，并且其特征是硬(骨)组织和软(牙周膜)组织逐渐破坏，最终导致牙齿松动和丧失。这与牙龈炎不同，牙龈炎是一种可逆的齿龈组织感染和炎症。炎性牙周炎是人类最常见的慢性疾病之一，也是成年人牙齿丧失的主要原因。牙周炎不仅对口腔健康造成了严重的负面影响，也有越来越多的证据表明，牙周炎具有系统性后果，并且是多种系统性疾病的风险因素，包括心脏病(例如动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿性关节炎和呼吸道感染。

因此，从口腔和整体健康角度来看，牙周疾病的早期和准确诊断非常重要。

牙周疾病在一般牙科实践中的诊断仍然很差，导致治疗干预率相对较低，并导致大量的未得到治疗的病例。目前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织状况(颜色、肿胀、探测时的出血程度、探测袋深度；和根据口腔x射线的骨损失)的不精确的、主观临床检查。这些常规方法非常耗时，并且所使用的一些技术(袋深度、x射线)反映了历史事件，例如过去的疾病活动，而非当前的疾病活动或对另外疾病的易感性。因此，需要更客观、更快速、准确、更易于使用的诊断，该诊断最好也可以由非专业人员进行。由此，需要测量当前的疾病活动，以及可能地对象对另外牙周疾病的易感性。

长期以来，人们一直主张将唾液或口腔流体作为口腔和一般疾病的诊断流体，并且随着微型生物传感器(也称为芯片实验室)的出现，用于快速座椅侧测试的护理点诊断获得了更大的科学和临床兴趣。特别是对于牙周疾病的检测，与组织炎症和分解相关的炎性生物标志物可能由于接近而容易最终存在唾液中，这表明唾液具有检测牙周疾病的强大潜力。事实上，这一领域因此获得了广泛关注，并取得了令人鼓舞的成果。例如，Kido等人(Jperioont Res 2012；47：488-499)在来自健康部位和牙周炎部位的牙龈沟液(GCF)样本中确认出104种蛋白质，64种仅包含在来自健康部位的GCF中，并且63种仅包含在牙周炎部位的GCF中。然而，尚未出现明确的测试。

生物标志物代表支持临床表现的生物指标，因此是用来诊断牙周疾病临床结果的客观措施。最终，经证实的生物标志物可用于评估未来疾病的风险，在最早阶段识别疾病，识别对初始治疗的反应，并允许实施预防策略。

先前开发唾液生物标志物护理点检测的限制因素包括缺乏适于座椅侧应用的技术，以及无法分析各个样本中的多种生物标志物。此外，在这样的测试中选择包括哪些生物标志物尚未在文献中得到充分阐述，也未在实际测试中得到实施。

此外，牙周炎可以表现为该疾病从轻度形式到重度形式的所有严重程度。为了方便评估病情的严重程度，牙医通常将牙周炎患者分为两组——轻度牙周炎患者和重度牙周炎患者。然而，进行这种评估的现有方法涉及劳动密集型过程，牙医不会对每个患者和/或每次就诊者常规地执行这个过程，并且消费者不可能执行这个过程(自我诊断)。

希望提供一种更简单的方法，并且特别是仅需要从患者(并且可能由患者他或她自己)提取少量唾液样本的方法。希望将该样本输入体外诊断设备，该设备将允许基于测量结果对唾液样本进行分类，使得其能够返回患者被分类为轻度牙周炎或重度牙周炎的可能性的指示。

发明内容

为了更好地解决前述需求，本发明在一个方面涉及一种用于评估人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的体外方法，该方法包括在来自所述人类患者的唾液样本中检测蛋白质的浓度：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

确定反映为所述蛋白质确定的联合浓度的测试值；以及将测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关的联合浓度的阈值进行比较，以评估该测试值是否指示所述患者的轻度牙周炎或重度牙周炎。

另一方面，本发明给出了蛋白质的用途：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

在人类患者的唾液样本中，作为用于评估患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的生物标志物。

可选地，患者的年龄也被用作生物标志物。

在另一方面，本发明在于一种用于评估人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统，该系统包括：

-检测装置，其能够并适于检测人类患者的唾液样本中的蛋白质：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

和

-处理器，其能够并适于根据所确定的所述蛋白质的浓度确定患者患有轻度牙周炎或重度牙周炎的指示。

该系统可选地包含与接口(尤其是图形用户界面)的数据连接，该接口能够呈现信息，优选地还能够输入诸如对象年龄的信息，以及可选地其他信息，例如性别和/或BMI(身体质量指数)，所述接口是系统的一部分或远程接口。

可选地，一个或多个前述项目(尤其是处理器)能够“在云上”起作用，即，不是在固定机器上，而是通过基于互联网的应用。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测人类患者唾液样本中牙周炎的至少两种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种，通常为三种或四种检测试剂，以用于检测：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

通常使用三种或更多种检测试剂，例如四种检测试剂，每种试剂结合不同的生物标志物。在一个实施例中，第一检测试剂用于检测PK，第二检测试剂用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的一种，第三检测试剂用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中不同的一种。可选的第四种检测试剂可用于检测与基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)的组不同的另一种蛋白。在另一个实施例中，试剂盒包含至少两种检测试剂，其中第一种检测试剂用于检测MMP9，第二种检测试剂用于检测S100A8或S100A9。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于检测人类患者唾液样本中牙周炎的至少三种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测丙酮酸激酶(PK)的检测试剂以及用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少两种的检测试剂。

在又一方面，本发明提供了一种体外方法，用于确定在从第一时间点t

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

并且比较浓度，其中该浓度的任何一种、两种或所有三种的差异反映了状态的变化。

在另一方面，本发明提供了一种诊断人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，包括在人类患者的唾液样本中检测蛋白质：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

以及基于所述样本中所述蛋白质的浓度评估患者是否存在轻度牙周炎或重度牙周炎。可选地，该方面的方法包括治疗患者牙周炎的进一步步骤。

在又一方面，本发明提供了一种在患有轻度或重度牙周炎的人类患者中检测蛋白质的方法：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

包括：

(a)从人类患者处获取唾液样本；和

(b)通过使样本与一种或多种用于结合所述蛋白质的检测试剂接触，并检测每种蛋白质与该一种或多种检测试剂之间的结合，来检测样本中是否存在所述蛋白质。通常，存在用于检测PK的第一检测试剂、用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的一种的第二检测试剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中不同的一种的第三检测试剂。在另一实施例中，第一检测试剂用于检测MMP9，并且第二检测试剂用于检测S100A8或S100A9。

附图说明

图1示意性地代表了用于本公开所述方法的系统。

具体实施方式

总的来说，本发明基于这样一种明智的见解，即在患有牙周炎的人类患者的唾液样本中，只有两种蛋白质可作为生物标志物，以用于将所述牙周炎分为两类中的任一类，一类为重度牙周炎，另一类为轻度或中度(即，非重度，除非另有说明，否则上文和下文中术语“轻度牙周炎”将包括中度牙周炎)。后一类在下文中统称为轻度牙周炎。

所确定的蛋白质生物标志物为丙酮酸激酶(PK)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)、血红蛋白亚基β(Hb-β)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。根据本发明，这些蛋白质的下列组合用于诊断牙龈炎：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

对象的年龄可以可选地作为额外的标志物。

丙酮酸激酶(PK)催化糖酵解的最后一步。丙酮酸激酶有四种组织特异性同功酶，每一种都具有不同组织所需的特定动力学性质。

MMP是一族负责降解细胞外基质成分(如胶原、蛋白多糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白)的酶。它们在牙周膜(PDL)重塑中起着重要作用，无论是在生理条件下还是在病理条件下。MMP-9，也称为92kDa IV型胶原酶、92kDa明胶酶或明胶酶B(GELB)，是一种基质蛋白，是属于参与细胞外基质降解的锌金属蛋白酶家族的一类酶。

S100钙结合蛋白A8(S100A8)是一种钙和锌结合蛋白，在炎性过程和免疫应答的调节中发挥显著的作用。其可诱导中性粒细胞趋化和粘附。

血红蛋白(Hb)是几乎所有脊椎动物的红细胞和一些无脊椎动物的组织中的含铁氧转运金属蛋白。血红蛋白-β(也称为β珠蛋白、HBB、β珠蛋白和血红蛋白亚基β)是一种珠蛋白，与α珠蛋白(HBA)一起构成成年人最常见形式的血红蛋白，HbA。Hb-β通常有146个氨基酸长，并且分子量为15,867Da。正常成人HbA是由两条α链和两条β链组成的异四聚体。Hb-β由人类11号染色体上的HBB基因编码。

S100钙结合蛋白A9(S100A9)，也称为钙粒蛋白B，是一种钙和锌结合蛋白，在炎性过程和免疫应答的调节中发挥显著的作用。其可诱导中性粒细胞趋化、粘附，可通过激活SYK、PI3K/AKT和ERK1/2促进吞噬作用来增强中性粒细胞的杀菌活性，并可通过MAPK依赖机制诱导中性粒细胞脱颗粒。

上述蛋白质是本领域已知的。本领域技术人员知晓其结构以及在水性样本(例如唾液样本)中检测它们的方法。下文中，上述蛋白质生物标志物合称为“本发明的生物标志物组”。

示例中的表1提供了根据本发明的10种特别优选的组合。

在一个实施例中，本发明的生物标志物组包括或由本发明中确定的两种、三种、四种或五种蛋白质生物标志物组成，即PK、MMP9、S100A8、Hb-β和S100A9。优选地，本发明的生物标志物组由不超过本发明中确定的蛋白质生物标志物中的四种组成，例如PK+Hb-β、S100A8和/或MMP9；或MMP9、S100A8和S100A9。除了本发明的生物标志物组以外，其他生物标志物和/或数据，例如人口数据(例如年龄、性别)可被包括在用于确定牙周炎类型的一组数据中。

一个额外的蛋白质生物标志物的例子是基质金属蛋白酶-8(MMP8)。另一个示例性的额外蛋白质生物标志物是抑制蛋白。肝细胞生长因子(HGF)是另一种可能的额外蛋白质生物标志物。游离轻链λ(FLC-L)是另一种可选的额外蛋白质生物标志物。另一个示例性的额外蛋白质生物标志物是α-1-酸性糖蛋白(A1AGP)。这些蛋白质包含在下表1中的优选生物标志物组中的一些中。这些蛋白质均为本领域已知的。

MMP-8，也称为中性粒细胞胶原酶或PMNL胶原酶(MNL-CL)，是一种存在于大多数哺乳动物结缔组织中的胶原蛋白酶。

抑制蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，参与大多数细胞中发现的肌动蛋白细胞骨架的动态周转和重组。这对于肌动蛋白微丝在空间和时间上的受控生长非常重要，这是细胞运动和细胞形状变化中的重要过程。人抑制蛋白-1在被表达时通常有140个氨基酸长，但通常被进一步处理成成熟形式。

肝细胞生长因子(HGF)是一种旁分泌细胞生长、运动和形态形成因子。其由间充质细胞分泌，并且主要靶向并作用于上皮细胞和内皮细胞，但也作用于造血祖细胞。已经证明HGF在肌肉生成和伤口愈合方面发挥着主要作用。其刺激有丝分裂、细胞运动和基质侵入的能力使其在血管生成、肿瘤发生和组织再生中发挥核心作用。HGF刺激上皮细胞生长，并且阻止结缔组织附着再生。众所周知，HGF是指示各种疾病中疾病活动的血清标志物。

游离轻链蛋白是免疫球蛋白轻链。它们与免疫球蛋白重链无关。与典型的完整免疫球蛋白分子不同，游离轻链蛋白不与免疫球蛋白重链共价连接，例如，游离轻链不与重链二硫键连接。通常，游离轻链包括约220个氨基酸。通常，游离轻链蛋白包括可变区(通常称为轻链可变区，V

α-1-酸性糖蛋白(A1AGP)是一种主要由肝脏合成的血浆α-球蛋白糖蛋白。有时也被称为乳清酸。它作为血液中的转运蛋白，作为带中性电荷的碱性脂类化合物的载体。它还被认为调节血细胞和内皮细胞之间的相互作用。

优选的扩展生物标志物组包括或由以下各项组成：

MMP8+MMP9+FLCλ+PK

MMP8+Hb-β+PK+S100A8

HGF+MMP9+PK+S100A8

MMP 9+A1AGP+PK+Hb-β

抑制蛋白+MMP9+PK+S100A8

当可选地包括其他生物标志物时，生物标志物的总数(即本发明的生物标志物组加上其他生物标志物)通常为4、5或6。

然而，本发明的一个可取的优点是，可以通过测量优选不超过四个生物标志物，并且更优选仅测量三个生物标志物来确定患者的牙周炎分类，其中表1(下文)的生物标志物组是优选的。特别地，该确定不需要涉及使用其他数据，这有利地提供了简单且直接的诊断测试。

根据需要，该方法仅需要从对象提取少量唾液样本，例如液滴大小。样本的大小通常为0.1μl至2ml，例如1-2ml，其中较小的量，例如0.1至100μl可用于体外设备处理，并且因此也可以采集更大的样本，例如高达20ml，例如7.5至17ml。

将该样本输入体外诊断设备，该设备测量至少两种相关蛋白的浓度，并且该设备返回诊断结果，基于患轻度牙周炎或重度牙周炎的可能性对对象进行分类。

本发明的易于使用将使得有可能定期(例如，作为定期牙科检查的一部分或甚至在家中)对大多数患有牙周炎或具有患牙周炎高风险的牙科患者进行测试。这尤其允许在轻度牙周炎发展为重度牙周炎之前检测其存在，从而能够实现更及时地采取口腔护理措施以防止牙周炎发展。或者，例如，对于已知具有牙周炎高风险的患者，并且首次进行测试，该方法允许识别牙周炎是轻度的还是重度的。此外，该方法可在先前诊断患有重度牙周炎的患者的治疗后应用，以检查牙周炎是否已经改善从而变为轻度。在另一种情况下，表明先前患有轻度牙周炎的患者在治疗方案开始后没有改善或实际上恶化，可能导致牙医或患者决定改变治疗计划以帮助加快康复过程。特别地，该方法也适于自诊断，由此，取样并将其输入设备的步骤可由患者他或她本人进行。

当实施本发明以确定牙周炎是轻度的还是重度的时，通常可以知道患者患有牙周炎。因此，在某些实施例中，该方法用于评估已知患有牙周炎的人类患者是患有轻度牙周炎还是重度牙周炎。

本发明的方法通常包括通过使用一种或多种检测试剂检测构成本发明生物标志物组的前述至少两种蛋白质，以及可选的其他生物标志物蛋白质。

根据本发明测试的“唾液”可以是未稀释的唾液，其可以通过吐唾沫或擦拭获得，或者稀释的唾液，其可以通过用流体冲洗口部获得。稀释的唾液可通过患者用无菌水(例如5ml或10ml)或其他合适的流体冲洗口部或漱口几秒钟，然后吐入容器中获得。稀释的唾液有时被称为口腔冲洗液。

“检测”指测量、量化、评分或测定生物标志物蛋白质的浓度。评估生物化合物(包括生物标志物蛋白质)的方法在本领域中是已知的。已经认识到，检测蛋白质生物标志物的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员将能够选择测定特定生物标志物蛋白质的适当方法。

与蛋白质生物标志物相关的术语“浓度”被赋予其通常含义，即一个体积中蛋白质的丰度。蛋白质浓度通常以质量/体积计量，最通常为mg/ml或μg/ml，但有时低至pg/ml。另一种测量方法是摩尔浓度(或摩尔浓度)，mol/L或“M”。可以通过检测已知、确定或预定体积的样本中的蛋白质的量来确定浓度。

确定浓度的替代方法是确定样本中蛋白质生物标志物的绝对量，或确定样本中生物标志物的质量分数，例如生物标志物相对于样本中所有其他蛋白质总量的量。

“检测试剂”是与感兴趣的蛋白质生物标志物特异性(或选择性)结合、相互作用或检测感兴趣的蛋白质生物标志物的试剂或化合物。这种检测试剂可包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体。

当提及检测试剂时，短语“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)免疫反应性”指的是确定蛋白质和其他生物制品的异质群体中存在蛋白质生物标志物的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的检测试剂(例如，抗体)与特定的蛋白质结合的程度至少是背景的两倍，并且基本上不会以显著量结合样本中存在的其他蛋白质。在这种条件下的特定结合可能要求选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。多种免疫测定程式可用于选择对特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)通常用于选择与某一蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(有关可用于确定特定免疫反应性的免疫测定程式和条件的描述，请例如参见Harlow&Lane的《抗体，实验室手册》(1988年))。典型地，特定或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景的多于10倍直至100倍。

“抗体”指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性结合并识别表位(例如，抗原)。识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因、α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体存在，例如作为完整的免疫球蛋白或作为通过用各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段。这包括例如Fab’和F(ab)’2片段。本文中使用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分指免疫球蛋白重链中包括一个或多个重链恒定区域CH1、CH2和CH3，但不包含重链可变区的部分。该抗体可以是双特异性抗体，例如具有特异性结合第一抗原的第一可变区和特异性结合不同的第二抗原的第二可变区的抗体。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需检测试剂的数量。

诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”是指测试呈阳性的患病个体的百分比(“真实阳性”的百分比)。测定未检测到的患病个体为“假阴性”。未患病且测定中的测试呈阴性的对象被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为无疾病的人检测呈阳性的比例。

本发明的一个或多个生物标志物蛋白质可以通过任何方式在样本中检测。生物标志物检测的优选方法为基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定，包括但不限于使用蛋白质印迹(Western blots)、放射免疫测定、ELISA、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这种测定是常规的，并且在本领域中是众所周知的。示例性的免疫测定在下文中简要描述(但并非旨在作为限制)。

免疫沉淀方案通常包括在裂解缓冲液中裂解细胞群，所述裂解缓冲液例如是补充了蛋白磷酸和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或氚核(Triton)X-100、1％去氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaC1、pH7.2的0.01M磷酸钠、1％抑肽酶(Trasylol))，向细胞裂解液中加入感兴趣的抗体，在4℃培养一段时间(例如1-4小时)，向细胞裂解液中加入蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠，在4℃下培养约一小时或更长时间，洗涤裂解缓冲液中的所述珠，并将该珠重新悬浮在SDS/样本缓冲液中。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如蛋白质印迹分析进行评估。本领域技术人员将知晓可被修改以增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如，用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解液)。

蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样本，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％-20％的SDS-PAGE，这取决于抗原的分子量)中进行蛋白质样本的电泳，将蛋白质样本从聚丙烯酰胺凝胶转移至膜，例如硝酸纤维素、PVDF或尼龙，在封闭溶液(例如，含有3％BSA的PBS或无脂牛奶)中封闭该膜，在洗涤缓冲液(例如，洗涤液(PBS-Tween)20)中洗涤该膜，用在封闭缓冲液中稀释的一级抗体(感兴趣的抗体)封闭该膜，在洗涤缓冲液中洗涤该膜，用与在封闭缓冲液中稀释的酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)结合的二级抗体(其识别一级抗体，例如抗人抗体)封闭该膜，在洗涤缓冲液中洗涤该膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将知晓可以被修改以增加检测到的信号并降低背景噪声的参数。

ELISA通常包括制备抗原(即感兴趣的生物标志物蛋白质或其片段)、用抗原覆盖96孔微量滴定板的孔、向孔中加入与可检测化合物(例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶))结合的感兴趣的抗体并培养一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体无需与可检测化合物结合；相反，可以向孔中加入与可检测化合物结合的第二抗体(其识别感兴趣的抗体)。此外，可以用抗体覆盖孔，而不是用抗原覆盖孔。在这种情况下，在将感兴趣的抗原加入已覆盖的孔后，可以添加与可检测化合物结合的第二种抗体。本领域技术人员将知晓可被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其他变型。

由于使用了多种标志物，因此基于这些生物标志物的联合浓度(以及可选的年龄)确定阈值。该阈值决定了患者是被分类为具有轻度牙周炎还是重度牙周炎。本发明反映了这样一种见解，即基于上述生物标志物组合的测量，可以足够准确地检测出牙周炎是轻度的还是重度的。

这一见解支持了本发明的另一方面，即蛋白质的用途：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

作为患有牙周炎的人类患者的唾液样本中的生物标志物，用于评估该患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎。

这种用途可以按照上文和下文基本描述的方法实施。

本发明的方法包括确定反映针对所述蛋白质测量的联合浓度的测试值。联合浓度值可以是通过输入所确定的浓度并对这些值进行算术运算而获得的任何值。例如，这可以是浓度的简单相加。它还包括将每一浓度乘以反映这些浓度的期望权重的因子，然后将结果相加。它还可以包括将浓度相互相乘，或相乘、除、减、取指数和相加的任何组合。这可还包括将浓度升高至几次幂。

可选地，测试值反映结合对象年龄确定的所述一个或多个蛋白质的联合浓度的浓度。

将所得的联合浓度值与阈值进行比较，该阈值以同样的方式反映与存在重度牙周炎相关的联合浓度。该比较允许评估测试值是否指示接受唾液测试的患者中存在重度牙周炎还是轻度牙周炎。

阈值可以是例如联合浓度值，该阈值以相同的方式基于在与存在重度牙周炎相关的参考样本中(即，在被诊断为患有重度牙周炎的患者中)确定的相同蛋白质的浓度被获得。因此，典型地，反映相同或更高的联合浓度的值表明受试患者中存在重度牙周炎。类似地，反映测试的牙周炎患者的唾液中较低的联合浓度的值表明牙周炎为轻度或中度(即，非重度)。然而，应当理解，也可以计算阈值(例如通过使用负乘数)，使得指示重度牙周炎的测试值低于阈值，而指示轻度牙周炎的测试值高于阈值。

阈值也可以基于测量一组样本中的当前生物标志物蛋白质的浓度来确定，包括已知诊断为重度牙周炎和非重度(轻度和/或中度)牙周炎的患者。由此，可以对测得的浓度值进行统计分析，可能包括机器学习方法，从而能够以所需的敏感性和特异性区分被分类为具有轻度或中度牙周炎的患者和被分类为患有重度牙周炎的患者。由此，可以获得期望的阈值。基于该阈值，待测样本可以进行相同的浓度测量，然后以和获得阈值的相同方式处理浓度值，从而确定可以与阈值进行比较的联合浓度值，从而允许将被测样本分类为具有轻度或重度牙周炎。

在一个有趣的实施例中，联合浓度值以如下分数的形式获得。每一次测量均被分配一个数值(例如以ng/ml为单位的蛋白质浓度值)，并且这些值被以线性或非线性组合用于计算0至1之间的分数。在基于上述一组对象确定阈值的情况下，通常使用S型(sigmoid)函数计算0至1之间的分数，该函数以联合浓度作为输入(详见下文)。

当分数超过某一阈值时，该方法表明患者患有重度牙周炎。阈值可基于所需的敏感性和特异性进行选择。

应当理解，根据本发明，在对对象进行“轻度或重度牙周炎分类”时，这是针对可被认为患有牙周炎的对象。这可以从例如先前进行的牙周炎诊断(尽管可能无法区分其程度)中得知，也可以从例如对象的口腔健康状况记录中推定。

本领域公认的临床定义基于以下内容：

完整口部牙龈指数将基于在0至4尺度上分等级的洛宾改进牙龈指数(MGI)进行记录，其中：

-0＝无炎症，

-1＝轻度炎症；颜色的轻微变化并非整个边缘或乳头状牙龈单元的任何部分的肌理几乎无变化，

-2＝轻度炎症；但涉及整个边缘或乳头状单元，

-3＝中度炎症；边缘或乳头状单元光亮、泛红、浮肿和/或肥大，

-4＝严重炎症；边缘或乳头状牙龈单元明显的泛红、浮肿和/或肥大、自发出血、充血或溃疡]。

探测深度将被使用手动UNC-15牙周探针记录至最接近的毫米。探测深度是指从探针尖端(假设位于袋的底部)到游离牙龈边缘的距离。

将使用手动UNC-15牙周探针将牙龈萎缩记录到最接近的毫米。牙龈萎缩是从游离牙龈边缘到牙骨质-牙釉质连接处的距离。牙龈萎缩将被显示为正值，并且牙龈增生将被显示为负值。

临床附着丧失将按照每个部位的探测深度+萎缩的和计算。

探测结束后，将对每个部位进行探测时出血评估，如果在探测的30秒内发生出血，则该部位将被赋予的分数为1分，否则被赋予的分数为0分。

由此产生的对象组(患者组)定义如下，其中轻度-中度牙周炎组和重度牙周炎组与本发明相关：

-健康组(H)：所有部位PD≤3mm(但在最后一颗恒磨牙的远端允许高达4mm的袋)，没有部位发生邻间附着丧失，在≤10％的部位中GI≥2.0，％BOP分数≤10％；

-牙龈炎组(G)：在>30％的部位中GI≥3.0，没有部位发生邻间附着丧失，没有部位具有PD>4mm，％BOP分数>10％；

-轻度-中度牙周炎组(MP)：在≥8颗牙齿处邻间PD为5-7毫米(相当于约2-4毫米CAL)，％BOP分数>30％；

-重度牙周炎组(AP)：在≥12颗牙齿处邻间PD≥7mm(相当于约≥5mm CAL)，％BOP分数>30％。

在一个实施例中，本发明的方法利用了图1中示意性表示的系统。该系统可以是其内集成有各种设备部件(单元)的单个装置。该系统还可以将其各种部件或这些部件中的其中一些作为单独的装置。图1所示的部件是测量设备(A)、图形用户界面(B)和计算机处理单元(C)。

如上所述，本发明的系统包括到接口的数据连接，由此接口本身可以是系统的一部分，或者可以是远程接口。后者指的是使用不同装置(优选是手持装置，例如智能手机或平板电脑)以提供实际接口的可能性。在这种情况下，数据连接优选包括无线数据传输，例如通过Wi-Fi或蓝牙(Bluetooth)，或通过其他技术或标准。

测量设备(A)被配置为接收唾液样本，例如通过将一滴唾液放在可插入设备(A)的盒(A1)上。该设备可以是能够从同一唾液样本中确定至少以下蛋白质的浓度的现有设备：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

测量设备(A)应能够接收唾液样本，例如通过将一滴唾液放在可插入设备(A)的盒(A1)上。该设备可以是能够从同一唾液样本中确定至少以下蛋白质的浓度的现有设备：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

处理单元(C)从部分(A)接收蛋白质浓度的数值。单元(C)配有软件(通常为嵌入式软件)，允许其计算0至1之间的分数(S)。软件还包括阈值(T)的数值。如果计算的值(S)超过(T)，则单元(C)将向图形用户界面(GUI)(B)输出“重度牙周炎”的指示(I)，否则它将输出“轻度牙周炎”。另一实施例可以使用(S)的特定值来指示做出指示(I)的确定性。这可以是概率分数，由此0.5是可能的阈值，例如，分数S＝0.8表示重度牙周炎的概率。有趣的选项包括：

基于分数S，可以直接指示确定性，即S＝0.8表示重度牙周炎的80％确定性；

-基于分数S，可以做出二进制或三进制指示：

-S轻度牙周炎，S≥T->重度牙周炎；

-S轻度牙周炎，R1≤S不确定，

-S≥R2->重度牙周炎；

另外，可对这种二进制或三进制指示附上确定性。该确定性将由分数S与所选阈值(T、R1、R2)之间的距离决定。

分数的具体计算可通过例如应用以下公式的S型(sigmoid)函数来实施：

其中N是所使用的蛋白质/生物标志物的数量。c

系数c

-选择N1个患有重度牙周炎的对象(例如牙科医生使用当前标准确定的对象)和N2个患有轻度牙周炎的对象。

无轻度牙周炎的对象被认为具有的分数S＝0，有重度牙周炎的对象被认为具有的分数为S＝1。

-从每名对象处提取唾液样本，并确定上述生物标志物组合的蛋白质浓度。

-对蛋白质浓度和分数执行逻辑回归。

*其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支持向量机)可用于训练分类器，该分类器基于蛋白质浓度预测对象是患有牙龈炎还是具有健康口腔状况。

尤其是，该程序(在示例中)已通过对患有轻度牙周炎或重度牙周炎的对象(通过牙科专业人员根据当前标准(例如美国牙周学会标准)进行的临床评估确定)进行的临床研究而得以应用。各种生物标志物组合的表现通过留一法(Leave-1-out)交叉验证进行评估，得到本发明的优选生物标志物组合。

参照前述系统，本发明还在另一方面提供了一种用于评估人类患者是患有轻度牙周炎还是重度牙周炎的系统，该系统包括：

-检测装置，其能够并适于在人类患者的唾液样本中检测蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

如上所述，这些装置是已知的，并且本领域技术人员容易获得；通常，提供用于在其中接收对象口腔样本的容器，该容器设置有检测装置；

-处理器，其能够并适于根据所确定的所述蛋白质的浓度确定患者患有轻度牙周炎或重度牙周炎的指示。

可选地，该系统包括能够呈现信息的用户接口(或与远程接口的数据连接)，特别是图形用户界面(GUI)；图形用户界面(GUI)是一种允许用户通过图形图标和可视指示符(例如二级符号)而非基于文本的用户接口、键入的命令标签或文本导航(本发明不排除任何这些接口类型)与电子设备进行交互的用户接口类型；图形用户界面(GUI)是众所周知的，并且通常用于手持移动设备，例如MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机和小型家用、办公和工业控制设备；如上所述，可选地还可以选择接口，以便能够输入信息，例如对象的年龄、性别、BMI(身体质量指数)。

本发明还单独地或作为前述系统的一部分提供了一种用于检测人类患者唾液样本中针对牙周炎的至少两种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种用于检测以下各项的检测试剂：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

·通常，试剂盒包括三种检测试剂，每种试剂针对不同的生物标志物，其中第一种检测试剂用于检测PK，第二种检测试剂用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的一种，第三种检测试剂用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的不同一种。在另一个实施例中，试剂盒包含至少两种检测试剂，其中第一种检测试剂用于检测MMP9，并且第二种检测试剂用于检测S100A8或S100A9。在本实施例中，可以存在第三检测试剂，用于检测S100A8和S100A9中的另一个。如上文参照本发明的方法所述，试剂盒可包含更多的检测试剂，例如特别是针对抑制蛋白(Profilin)、A1AGP、FLC-λ、HGF或MMP8、和/或其他蛋白质的检测试剂。在优选实施例中，试剂盒中提供的检测试剂由用于选择构成本发明3-生物标志物或4-生物标志物组的三种蛋白质的检测试剂组成，如上所述。在进一步的实施例中，为以下示例中表1中举例说明的组合中存在的每种生物标志物蛋白质提供单独的检测试剂。

优选地，所述试剂盒包含固体支持物，例如芯片、微量滴定板或包括所述检测试剂的珠或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，例如蛋白芯片(ProteinChip

试剂盒还可提供针对未结合的检测试剂或针对所述生物标志物(夹层型测定)的洗涤溶液和/或检测试剂。

在一个有趣的方面，本发明的生物标志物组的识别被应用于随着时间的推移监测人类患者的牙周炎状态。因此，本发明还提供了一种体外方法，用于确定在从第一时间点t

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

以及比较浓度，由此优选至少两个、并且更优选三个浓度的差反映了状态的变化。这种差可被视为浓度差，从而允许直接比较，而无需首先生成0和1之间的数字或任何其他分类。应当理解，在两个时间点接收的测量值也可以以与上述确定轻度或重度牙周炎时相同的方式进行处理。

本发明还提供了一种诊断人类患者是患有轻度牙周炎还是重度牙周炎的方法，包括在患者的唾液中检测蛋白质的存在：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。

基于所述样本中所述蛋白质的浓度评估患者中是存在轻度牙周炎还是重度牙周炎。可选地，该方面的方法包括治疗患者中的牙周炎的另外步骤。该可选的治疗步骤可包括给予已知的治疗剂或牙科手术，或治疗剂和牙科手术的组合。已知的治疗剂包括施用含抗微生物剂的药剂，例如漱口水、芯片、凝胶或微球。用于治疗牙周炎的典型抗微生物剂是氯己定。其他治疗剂包括抗生素(通常为口服抗生素)和酶抑制剂(如强力霉素)。已知的非外科手术治疗方法包括刮治和根面平整(SRP)。已知的外科手术包括手术袋缩小、皮瓣手术、齿龈移植或骨移植。

本发明还提供了一种在患有轻度或重度牙周炎的患者中检测蛋白质的方法：

丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或者

基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种；

包括：

(a)从人类患者获取唾液样本；和

(b)通过将唾液样本与用于检测蛋白质的第一、第二和第三检测试剂接触并检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合，检测所述蛋白质是否存在于唾液样本中。

将参考以下非限制性示例进一步说明本发明。

示例

在对79名对象进行的临床研究中，其中41名被诊断为轻度牙周炎(包括中度牙周炎)，并且38名被诊断为重度牙周炎，获得了ROC(接受者-操作者-特征)曲线下面积(AUC)值。

在统计学中，接受者操作特性曲线或ROC曲线是一个图形图，该图说明了二进制分类器系统在其区分阈值变化时的性能。通过在各种阈值设置下相对于假阳性率(FPR)绘制真阳性率(TPR)来建立该曲线。在机器学习中，真阳性率也称为敏感性、召回或检测概率

-0.90-1＝优秀(A)

-0.80-0.90＝良好(B)

-0.70-0.80＝一般(C)

-0.60-0.70＝差(D)

-0.50-0.60＝不及格(F)

基于前述内容，在前述临床研究的结果中，大于0.75的ROC AUC值被认为代表提供根据本发明的诊断测试的理想准确性。

被探究的蛋白质生物标志物包括：

MMP8

MMP9

IL-1β

HGF

游离轻链(FLC)κ(kappa)

游离轻链(FLC)λ(lambda)

A1AGP

Hb-β

HB-δ

角蛋白(Keratin)4

抑制蛋白(Profilin)

丙酮酸激酶

S100A8

S100A9

此外，在所采用的逻辑回归中，我们将κ+λ、κ-λ、κ/λ视为额外的预测器。

此外，我们还将年龄作为预测器。

这产生了总共4204个可能的非冗余组，最多具有4个蛋白质生物标志物(不考虑仅具有年龄的组)。这里的非冗余指不考虑包括例如κ+λ和κ-λ作为预测器的组，因为在逻辑回归中，其给出的结果与包括κ和λ作为预测器的对应组相同。

请注意，在不限制组中蛋白质标记物数量的情况下，鉴于上述预测器，会产生98302个可能的非冗余组(不考虑仅具有年龄的组)。

从我们的研究中，共确定出184个组，最多具有4种蛋白标志物，这些组的AUCLOOCV值大于0.75，可用于将重度牙周炎和轻度牙周炎进行分类。本发明的优选生物标志物组覆盖(至少)这些184个已确定的组。此外，在这184个组中：

2个仅具有两种蛋白质标志物

27个有三种蛋白质标志物

155个具有四种蛋白质标志物

仅包含两种蛋白质标志物的两个组为：

丙酮酸激酶+MMP9(AUC LOOCV＝0.759)

丙酮酸激酶+MMP 9+年龄(AUC LOOCV＝0.788)

这些组被突出显示为本发明的优选实施例。

这些数据表明，即使是两种蛋白质生物标志物(在特定的组合中)也可以提供大于0.75的AUC LOOCV值，以用于区分轻度和重度牙周炎：

10个表现最佳的组的AUC LOOCV值约为0.79，如下表1所示。从所确定的所有生物标志物和生物标志物组中总结出代表具有在两种和四种之间的蛋白质生物标志物的组的最佳ROC AUC值的数据。

表1

该表中的每个生物标志物组合被突出显示为本发明的优选组合。可以看出，这些组中的三个组具有三种蛋白质标志物，而七个组具有四种蛋白质标志物。所有组均使用年龄作为额外的预测器，根据本发明可以使用也可以不使用年龄。这些前10名的组可总结为显示出对丙酮酸激酶以及MMP9或S100A8中的至少一种的偏好。

尽管本发明已在附图和前述描述中详细说明和描述，但该说明和描述应被视为说明性或示例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。

例如，可以在不同的单元中提供针对不同生物标志物的检测试剂。或者，方便地，本发明的试剂盒可包括用于所有实施例中使用的蛋白质生物标志物(即PK或MMP9)的固定检测试剂组，以及包括用于另外生物标志物(例如MMP9、S100A8、Hb-β和S100A9)中任一个的检测试剂的灵活模块。

通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的发明时可以理解和实现所公开实施例的其他变化。在权利要求中，“包括”一词不排除其他元素或步骤，不定冠词“一”或“一个”不排除复数。本发明的某些特征在相互不同的从属权利要求中被列举的事实本身并不表示这些特征的组合不能被有利地使用。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。

综上所述，我们在此公开了一种体外方法，用于评估患有牙周炎的人类患者是患有轻度牙周炎还是重度牙周炎。该方法基于见解来确定三种生物标志物蛋白质的选择。因此，在患有牙周炎的患者的唾液样本中，测量蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和血红蛋白亚基β(Hb-β)中的至少一种；或基质金属蛋白酶-9(MMP9)以及S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少一种。基于所测量的浓度，确定反映所述蛋白质的联合浓度的值。将该值与以相同方式反映与重度牙周炎相关的联合浓度的阈值进行比较。该比较允许评估测试值是指示所述患者中存在重度牙周炎还是轻度牙周炎。因此，典型地，反映联合浓度低于阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者中的轻度牙周炎，并且反映联合浓度等于或高于阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者中的重度牙周炎。