甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法

摘要

本发明公开了甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法，利用克隆的甘蓝型油菜BnMAPK2基因的全长编码序列，成功构建了35S启动子驱动的过表达载体。通过农杆菌侵染法遗传转化植物，获得阳性转基因植株。对转基因植株的农艺性状调查显示，超量表达甘蓝型油菜BnMAPK2基因能改良植物的农艺性状并提高对重金属镉的耐受性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用，还涉及一种改良植物农艺性状和/或提高镉耐受性的方法。

背景技术

油菜与大豆、向日葵和花生并称为世界四大油料作物，也是我国播种面积最大、地区分布最广的油料作物。我国菜籽油产量占国产植物油总产的40％左右，菜籽油营养特性鲜明，脂肪酸构成合理，富含甾醇、维生素E等多种功能型物质，是大宗食用植物油中营养结构最全面的油，对于改善人民生活水平和身体健康大有裨益。甘蓝型油菜(Brassicanapus)作为我国广泛种植的栽培种，气候、环境、病害、虫害及倒伏等问题已经严重制约其产量及品质，尤其是低温、干旱、渍害、涝害、重金属等非生物胁迫及菌核病、霜霉病等，制约油料产业的发展。

植物中的MAPKs级联将外源刺激转入胞内并引发一系列的胞内应答,参与调控基因表达、生长发育、细胞分裂、分化及凋亡等过程,尤其在翻译后修饰上具有重要意义。植物中JA、ABA、生长素、ET和细胞分裂素的合成与代谢都与MAPKs有关。近年来MAPKC族基因中的MAPK2基因的研究主要集中在响应生物与非生物胁迫中的作用：Mizoguchi T等研究发现拟南芥AtMAPK1与AtMAPK2在功能上冗余,响应盐胁迫、损伤、ROS、JA、ABA,并参与生长素介导的细胞扩增等；王伟威等研究表明，大豆在干旱诱导条件下,大豆叶片中MAPK2基因表达量下降；潘月云等研究了MeMAPK2基因在干旱、激素、病原菌处理下的表达情况,结果表明该基因的表达受到明显的诱导，并且在干旱、ABA和JA诱导条件下表达量增加。这些物种中的MAPK2基因均可以响应各种不同的逆境胁迫信号转导，并且MAPK2基因的表达模式不同。目前来说，甘蓝型油菜中MAPK2基因在植物生长发育、重金属胁迫环境下的作用尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供甘蓝型油菜BnMAPK2基因的用途，在改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的应用；本发明还提供了一种改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、甘蓝型油菜BnMAPK2基因在改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的应用，所述甘蓝型油菜BnMAPK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述植物为十字花科植物。

优选的，所述农艺性状为抽薹期、茎长5cm日期、茎长10cm日期、茎长15cm日期、植株高度、主花序有效长度、主花序角果数、总分支数、总角果数。

2、一种改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性方法，通过在植物中超量表达甘蓝型油菜BnMAPK2基因，所述甘蓝型油菜BnMAPK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述过量表达甘蓝型油菜BnMAPK2基因的方法是克隆甘蓝型油菜BnMAPK2基因，然后构建植物过表达载体，再将获得的植物过表达载体通过农杆菌介导转化植物，筛选转基因植株，获得农艺性状改良和/或植物镉耐受性提高的植株。

优选的，所述克隆甘蓝型油菜BnMAPK2基因是以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR扩增获得。

优选的，所述植物过表达载体由SEQ ID NO.1所示序列与pCAMBIA1300植物表达载体连接而得。

本发明的有益效果在于：本发明利用克隆的BnMAPK2的全长编码序列(CodingSequences，CDS)，成功构建了35S启动子驱动的过表达载体pCAMBIA1300-BnMAPK2。通过农杆菌侵染法遗传转化植物，获得阳性转基因植株。对转基因株系农艺性状考察分析表明，与野生型植株相比，超量表达转基因株系在镉胁迫下耐受性显著提高。在50μM、100μM CdCl

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为BnMAPK2转基因拟南芥植株的PCR鉴定结果(编号1-37为转基因拟南芥，编号38-41为野生型拟南芥，编号42-43为转化有重组质粒的农杆菌)。

图2为转基因拟南芥各株系中BnMAPK2基因的相对表达量(WT为野生型，编号30、23、31、32、17、24、13、12、19、5、25、16、41为转基因株系)。

图3为BnMAPK2转基因拟南芥株系的抽薹期照片(WT为野生型，编号OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13为转基因株系)。

图4为BnMAPK2转基因拟南芥株系的抽薹期、茎长5cm、10cm、15cm天数折线图(A：抽薹期天数；B：茎长5cm的天数；C：茎长10cm的天数；D：茎长5cm的天数；WT为野生型，编号OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13为转基因株系，*表示T检验P<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图5为BnMAPK2转基因拟南芥株系照片(WT为野生型，OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13为转基因株系)。

图6为BnMAPK2转基因拟南芥株系的株高、主花序有效长、主花序角果数折线图(A：株高；B：主花序有效长；C：主花序角果数；WT为野生型，OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13为转基因株系，*表示T检验P<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图7为BnMAPK2转基因拟南芥株系的总分枝数和总角果数(A：分枝数；B：总角果数；WT为野生型，OEMAPK2为转基因株系OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13的平均值，*表示T检验P<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图8为BnMAPK2转基因拟南芥在镉胁迫下的种子萌发照片(A：对照组；B：50μmCdCl

图9为BnMAPK2转基因拟南芥在镉胁迫下的幼苗根长、种子萌发率(A：萌发图片；B：萌发率；C：根长；Control为不含氯化镉的对照，WT为野生型，OEMAPK2-9、OEMAPK2-13、OEMAPK2-25为转基因株系，*表示T检验P<0.05，**表示T检验P<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图10为BnMAPK2转基因拟南芥在镉胁迫下的长势及叶绿素含量(A：长势；B：叶绿素Ⅱ含量；Control为没有经过镉处理的对照，WT为野生型，OEMAPK2-9、OEMAPK2-13、OEMAPK2-25为转基因株系，*表示T检验P<0.05，**表示T检验P<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图11为镉胁迫下转基因拟南芥MDA含量及抗氧化酶(SOD/POD/CAT)酶活(A：MDA含量；B：POD活性；C：SOD活性；D：CAT活性；Control为没有经过镉处理的对照，OEMAPK2-9、OEMAPK2-13、OEMAPK2-25为转基因株系，*表示T检验P<0.05，**表示T检验P<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

图12为BnMAPK2转基因拟南芥中抗镉胁迫相关基因相对表达量(A：AtGSH1；B：AtGSH2；C：AtPCS1；D：AtPCS2；Control为没有经过镉处理的对照，OEMAPK2-9、OEMAPK2-13、OEMAPK2-25为转基因株系，*表示T检验P<0.05，**表示T检验P<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、BnMAPK2超量表达载体构建

利用已知的拟南芥AtMAPK2基因序列搜索白菜基因组数据库，预测可能的BnMAPK2基因，同时搜索GenBank EST和GSS数据库。提取甘蓝型油菜中油821株系混合组织器官的总RNA并反转录cDNA，通过RECA方法合成目的基因5’RACE序列和3’RACE序列。根据数据库中的cDNA和EST序列设计RACE引物，分别采用FMPK2-51(SEQ ID NO.5)+RACE 5P(SEQ ID NO.7)、FMPK2-52(SEQ ID NO.6)+RACE 5P(SEQ ID NO.7)、FMPK2-31(SEQ ID NO.4)+RACE 3P(SEQID NO.9)(表1)引物进行第一次扩增，分别获得FMPK2-51’R、FMPK2-52’R及FMPK2-31’R产物。PCR扩增条件为：94℃预变性5min→35个扩增循环(94℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸2min)→72℃延伸10min。再采用FMPK2-52(SEQ ID NO.6)+RACE 5NP(SEQ ID NO.8)(表1)引物，以FMPK2-51’R及FMPK2-52’R产物为模板；采用FMPK2-31(SEQ ID NO.4)+RACE 3NP(SEQ ID NO.10)(表1)引物，以FMPK2-31’R为模板，进行第二次扩增，扩增条件同第一次扩增。随后进行回收、纯化、测序、鉴定及拼接获得BnMAPK2的cDNA全长序列。

通过RECA技术获得大小约为1500bp的两个基因，分别命名为BnMAPK2-1和BnMAPK2-2。生物信息学分析表明：BnMAPK2-1全长约1516bp，开放阅读框为1110bp，编码370个氨基酸，等电点为6.36；BnMAPK2-2全长约1463bp，开放阅读框为804bp，编码268个氨基酸，等电点为6.22。均为疏水性蛋白。BnMAPK2-1和BnMAPK2-2核苷酸序列碱基含量相似度为88.3％。Blastp分析表明，BnMAPK2基因的氨基酸序列与其它已登录植物的MAPK2基因同源性很高，其中与拟南芥、葡萄、水稻的同源性分别为95％、85％、84％，BnMAPK2-2基因与拟南芥基因AtMPK1、AtMPK2的一致性分别达到84％、87％，由此推定所获得的基因即为甘蓝型油菜MAPK基因。选择BnMAPK2-1序列(SEQ ID NO.1)为用于基因克隆、植物表达载体构建的BnMAPK2片段。

表1甘蓝型油菜BnMAPK2基因克隆所用引物

以甘蓝型油菜中油821株系cDNA为模板，设计特异引物FMPK2OF(SEQ ID NO.2)+RMPK2OF(SEQ ID NO.3)(表1)，在pfu高保真酶作用下扩增BnMAPK2片段，PCR产物加dA后连接至pGEM-T easy载体，PCR检测后送深圳华大基因公司测序。采用载体自带BamHI和EcoRI位点，对测序正确的重组T载体及pCAMBIA1300表达载体同时进行双酶切，并将回收纯化后的基因片段连接至回收纯化的pCAMBIA1300骨架上，获得重组载体pCAMBIA1300-BnMAPK2。将重组载体转化大肠杆菌(DH5a)后，挑取阳性克隆进行菌体PCR检验及酶切验证，送深圳华大基因公司测序。

实施例2、转化拟南芥野生型植株及超量表达BnMAPK2的拟南芥转基因株系的获得

将重组载体转化农杆菌后，采用浸花法通过携带重组载体pCAMBIA1300-BnMAPK2的农杆菌介导，转化野生型拟南芥，22℃黑暗条件培养24h，取出拟南芥苗常规培养。单株收取T

选取其中13株提取幼嫩叶片RNA进行PCR鉴定，反转录法得到合格的cDNA，以AtACT2为参考基因，用引物qMPK2-1F(SEQ ID NO.11)+qMPK2-1R(SEQ ID NO.12)(表1)通过实时荧光定量的方法检测转基因拟南芥中BnMAPK2的表达量。结果显示(图2)，转基因植株中BnMAPK2表达量均明显高于野生型；其中，超量表达植株BnMAPK2的表达量最低的为OEMAPK2-30号植株，表达量(0.0735)是野生型(0.018)的4.1倍；表达量最高的是OEMAPK2-41号株系，表达量(9.25)是野生型的513.9倍。

实施例3、超量表达BnMAPK2的拟南芥转基因株系的农艺性状考察

参照拟南芥TAIR10数据库操作手册的播种方法，将BnMAPK2超量表达拟南芥5个株系(OEMAPK2-25、OEMAPK2-5、OEMAPK2-9、OEMAPK2-12、OEMAPK2-13)及野生型拟南芥(WT)的种子消毒，春化后播种在灭菌过的培养土上。在生育期，观察并记录不同转基因拟南芥株系和野生型拟南芥株系的生长发育情况，包括：出苗期、四叶期、八叶期、十叶期、抽薹期和茎长5cm、10cm、15cm的日期，并对抽薹期和成熟后的植株进行拍照，对比分析。待拟南芥种子成熟收获时，再统计并记录其农艺性状，包括：植株高度、主花序有效长、主花序荚果数、总分支数、总荚果数。如图3所示，与野生型拟南芥相比，超量表达株系的植株抽薹期明显提前。并且，BnMAPK2基因超量表达5个拟南芥株系的抽薹时间与野生型拟南芥存在显著差异(图4，A)，表明BnMAPK2在拟南芥中超量表达缩短了拟南芥的抽薹期，在促进拟南芥抽薹开花的过程中具有正向调控作用。

拟南芥抽薹开花之后，进入快速生长发育期。比较野生型拟南芥和BnMAPK2基因超量表达的5个拟南芥株系的茎长至高度5cm、10cm、15cm的天数可知：5个超量表达拟南芥株系茎长5cm的天数较野生型显著缩短(图4，B)；5个超量表达拟南芥株系茎长10cm的天数较野生型显著缩短(图4，C)；5个超量表达株系的茎长15cm的天数与野生型相比也显著缩短(图4，D)。从上述分析可知，在拟南芥抽薹之后，BnMAPK2基因的超量表达能显著缩短茎长5cm、10cm和15cm的天数，加快了拟南芥在生长发育后期的生长进程。

在相同种植条件下，BnMAPK2基因超量表达的5个拟南芥株系的植株高度，与野生型拟南芥相比均显著增高(图5、图6，A)。这些结果表明，BnMAPK2基因超量表达能促进拟南芥植株的生长，从而提高植株高度。

此外，BnMAPK2基因超量表达的5个拟南芥株系的主花序有效长和主花序角果数都显著优于野生型拟南芥(图6，B、图6，C)，说明BnMAPK2基因超量表达能显著提高拟南芥主花序有效长和主花序角果数。

统计BnMAPK2基因超量表达拟南芥株系的总分支数和总荚果数，结果显示：转基因拟南芥平均分枝数(4.02)较野生型植株平均分枝数(3.41)增加17.89％，并且达到显著水平(图7，A)；转基因拟南芥总荚果数(72.03)较野生型(58.29)增加23.57％，且达到显著水平(图7，B)。

实施例4、超量表达BnMAPK2的拟南芥转基因株系镉耐受性考察

1镉胁迫下的种子萌发率及根系长度

利用氯化镉(CdCl

为考察镉胁迫对转基因及野生型植株根系的影响，在1/2MS固体培养基上生长5天后，选取根长相同的BnMAPK2转基因和野生型拟南芥幼苗，分别移栽到含不同氯化镉浓度的1/2MS固体培养基上，CdCl

2镉胁迫下拟南芥幼苗表型和生理变化

为了更进一步探究镉胁迫对苗期植株的生长影响，将长势一致的3周龄的野生型和BnMAPK2转基因拟南芥幼苗，采用更高浓度CdCl

采用100μM、200μM的CdCl

此外，我们对拟南芥中相应的抗逆生理指标的测定结果显示：BnMAPK2转基因株系OEMAPK2-9(36.45umol·g

3镉胁迫应答相关基因表达分析

为查看镉胁迫下转基因拟南芥中与镉胁迫应答相关基因(AtGSH1、AtGSH2、AtPCS1及AtPCS2)的表达情况，我们对镉胁迫应答相关基因表达量进行了实时荧光定量分析。结果显示，未处理的野生型和转基因拟南芥中镉胁迫应答相关基因的表达量无显著差异，在镉胁迫处理后除AtGSH1外，OEMAPK2-9、OEMAPK2-13、OEMAPK2-25转基因株系的AtGSH2(1.91/1.86/1.98)、AtPCS1(3.89/3.56/3.76)和AtPCS2(1.45/1.37/1.51)的表达量均显著高于野生型植株(AtGSH2：1.58，AtPCS1：1.68，AtPCS2：0.96)(图12)。在镉处理条件下，BnMAPK2超量表达的拟南芥株系中，与镉胁迫应答相关的4个基因AtGSH1、AtGSH2、AtPCS2和AtPCS1的表达上调，表明在镉胁迫条件下BnMAPK2的表达模式与AtGSH1、AtGSH2、AtPCS2和AtPCS1相同，MAPK2基因对GSH2、PCS2和PCS1基因存在协同作用，在提高植株耐镉胁迫能力上扮演着重要角色。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120>甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1516

<212> DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

acacaacttc taaaatggta ataaacaaga aagtacagag tcaacggtca gaacgttgac 60

caaatctctc tctcgctctc cacccgaatc tcaccggcga tcgtggtttg ctcaccgaca 120

aatctgaatc gtatccaata ctcacagtgg aagaatggcg actccggttg atccaccaaa 180

tggagttagg aaccaaggga agcattactt ctctatgtgg caaacactct tcgagatcga 240

caccaaatac gttcccatca aacccatagg ccgtggcgcg tacggtgttg tctgctcttc 300

cgttaacaga gagactaacg agagagtagc gatcaagaag atccacaatg tgtttcagaa 360

caggatcgat gcgttgagga cacttcgtga actcaagcta ctacgtcatc ttcgacatga 420

caatgtgatt gctcttaaag atgtaatgat ggctaatcat aaaagaacct ttaaagatgt 480

gtatcttgtt tacgagctca tggacactga tcttcaccag attatcaagt cttctcaagt 540

gttgagtaat gaccattgcc aatacttctt gttccagctg cttcgagggc tgaagtatat 600

tcattcagcc aacattctcc atcgggattt gaaaccaggt aacctcctcg tgaacgcaaa 660

ctgcgactta aagatatgtg actttggttt ggcgcgcacg agcaacacca aaggtcagtt 720

catgactgag tatgttgtga ctcgatggta ccgagcacca gagcttctcc tctgctgtga 780

caactacgga acctccatcg atgtctggtc ggtgggatgc atattcgccg agcttcttgg 840

aagaaaaccg atattcccgg ggacagaatg tcttaaccag attaagctca tcattaacat 900

tttggggagc cagagagagg aagatctcga gtttatcgat aacccaaaag ccaaaagata 960

catagagtct ctcccttact caccggggat atcattctct cgtctttact cgaatgcgca 1020

tgttctagcc attgatctgc ttcagaagat gctcgttctt gacccttcca agaggattag 1080

tgttgcggaa gcgcttcagc atccgtacat ggcgcctttg tacgacccaa atgccaatcc 1140

tcctgctcaa gttcctattg atctcgatgt agatgaagat gaggatttgg gggcggagat 1200

gataagagag ttgatgtggg aggaaatggt tcattatcat ccagaaactg ttaactctga 1260

gctctgatct taagtattat gaaggtaact ttcagagaga tctttcaact attttttaat 1320

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ggatataaac taaaatgtct gtaacatttg tacataagag ttctgttttc tttatcatat 1500

tatgtcttta aaattt 1516

<210> 2

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgactc cggttgatcc 20

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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tcagagctca gagttaacag tttctggatg 30

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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gatgctcgtt cttgaccctt cca 23

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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catgcgcgct aaaccaaagt cac 23

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<212> DNA

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gtattggcaa tggtcattac tcaacac 27

<210> 7

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<212> DNA

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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gctgtcaacg atacgctacg taacg 25

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<213>人工序列(Artificial Sequence)

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ctccgcggct tggcaatcta aagataaata gcaaggaggc 40

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<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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tcttccttca gacaagttat gcaataacat 30