一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在制备治疗急性肾损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，所述急性肾损伤为顺铂在用于治疗实体癌时诱导的急性肾损伤。本发明提供的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶能够产生多种抗氧化模拟酶活性，在生理环境下能够发挥高效的过氧化氢酶活性，并通过作用Nrf2/Keap1通路有效降低ROS水平，抑制细胞凋亡，对顺铂导致的急性肾损伤发挥重要的保护和治疗作用，为临床上顺铂实现低毒性的抗肿瘤应用开发更有潜力的纳米材料。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物材料的应用，具体地涉及一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。

背景技术

药源性肾损伤是指在使用某种或几种药物后，由药物本身或其代谢产物引起的肾脏损伤。药源性肾损伤可表现为目前所知的任何类型急性或慢性肾脏疾病。急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是指突然发生的肾功能下降，可伴有少尿或无尿，是由肾小球、肾小管、肾间质或血管等病变引起的肾功能在短期内急剧地下降或丧失的临床综合征，表现为体内水电解质失衡、代谢产物累积无法排除、出现低镁血症等症状。它的主要病因是缺血，肾脏有毒物质不断累积所致肾病，其病理学特征主要表现为肾小管损伤。

顺铂(Cisplatin，简称CP)是临床上常见的一线、高效的抗癌药物，用于治疗多种实体癌包括卵巢癌、睾丸癌、肺癌、头颈癌等。此外，顺铂还与其他药物联用，比如多西他赛，增强抗肿瘤疗效。临床调查表明，由于顺铂具有剂量依赖性急性肾毒性作用，它的临床应用受到极大的限制。顺铂过量之后会出现急性肾功能衰竭，其特征是体内血清肌酐和尿素氮水平急剧升高。临床上癌症病人注射顺铂之后产生急性肾损伤的概率在20-35％之间，少数患者可发生威胁生命的暴发性或重症肾功能衰竭，是药物肾毒性临床监测和防治的重点。临床上及临床试验中均没有有效对抗顺铂肾损伤的药物，因此，开发新型的靶向药物，对顺铂引起的肾脏损伤治疗具有重要意义。

顺铂引起肾脏损伤通过多种机制发生，包括抑制蛋白质合成和线粒体损伤等。此外，顺铂还通过死亡受体途径、内质网应激来引起细胞凋亡。此外，顺铂也会同时激活cdk2和p21表达，以及发生DNA损伤。

近年来，有研究证明线粒体的中心作用和顺铂诱导的急性肾衰竭中细胞凋亡的加强，突出了针对顺铂诱导的肾毒性的治疗策略从线粒体氧化应激出发。线粒体功能障碍通过膜电化学电位的下降和线粒体钙摄取的显著降低得到证实。线粒体抗氧化防御系统耗尽，如GSH和NADPH水平降低，GSH/GSSG比率降低和GSSG水平升高。此外，顺铂诱导线粒体脂质的氧化损伤，包括磷脂和线粒体蛋白的氧化，如巯基蛋白浓度显著降低和羰基化蛋白水平增加。同时，它们会干扰线粒体电子传递链(ETC)，从而导致电子从链中泄漏，最后导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)形成。顺铂过量后代谢产生过量的NAPQI形成耗尽细胞谷胱甘肽(GSH)，加合蛋白质包括线粒体蛋白质，并诱导线粒体氧化应激和功能障碍。线粒体蛋白质会导致核DNA片段化和坏死细胞的死亡以及随后产生的炎症反应，包括促炎细胞因子的释放和免疫细胞的活化。今年很多文献表明，由于肾近端细胞膜上OCT2表达丰富，顺铂被积聚到肾小管细胞中，进而导致细胞内ROS和炎性因子大量产生，均有助于肾小管细胞死亡和随后发生急性肾损伤，同时氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1等表达上调。

纳米酶是以纳米材料为基础的人工酶，因其独特的物理化学性质，已被广泛应用于医药研究领域。超小氧化铈纳米粒酶体结构中存在氧空穴，表面同时存在三价和四价铈离子，具有多种可调控的酶活性，是一种具有广阔应用前景的纳米酶。顺铂在肿瘤化疗过程中，往往会导致肾脏部位ROS含量的上升，造成严重的急性肾损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶的应用，应用在制备治疗急性肾损伤药物中，可以在不影响顺铂原本抗肿瘤效果的情况下，对其导致的急性肾损伤发挥保护和治疗作用。

本发明提供如下技术方案：

一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。

进一步的，所述急性肾损伤为顺铂在用于治疗实体癌时诱导的急性肾损伤。

进一步的，所述急性肾损伤为肾损伤肾功能、肾小管细胞凋亡或肾脏氧化损伤。

进一步的，所述实体癌为卵巢癌、睾丸癌、肺癌或头颈癌。

进一步的，所述实体癌为卵巢癌。

进一步的，所述超小型氧化铈纳米酶尺寸为1-10nm，磷脂聚乙二醇修饰后尺寸为10-30nm。

本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶是一种纳米酶，其酶活性可随外界环境的改变而改变。在肾脏部位，超小型氧化铈纳米酶能够高效的清除顺铂药物产生的ROS，减少细胞凋亡，实现治疗顺铂引起的急性肾损伤的作用。其次，磷脂聚乙二醇无毒无刺激性，具有很高的生物安全性，并可延长超小型氧化铈纳米酶的体循环时间，提高治疗效率。

本发明中所述超小型氧化铈纳米酶的尺寸为1～10nm，磷脂聚乙二醇修饰后尺寸为10-30nm。超小型氧化铈纳米酶在其酶体结构中存在大量的氧空穴，在生理pH环境下，其表面同时存在的Ce

本发明中所述超小型氧化铈纳米酶在HK-2细胞中能够表现出强过氧化氢酶活性，可有效清除顺铂引起的过高的ROS(Reactive oxygen species，活性氧)，进而能够有效抑制顺铂引起的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2的凋亡。所述超小型氧化铈纳米酶通过靶向调控Nrf2/Keap1通路降低人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2内的ROS水平。

具体地，本发明中所述超小型氧化铈纳米酶能够作用于ROS相关通路，即Nrf 2/Keap1通路，通过激活该信号通路以及其下游靶基因的表达，从而实现降低ROS水平的目标。

同时，本发明中所述超小型氧化铈纳米酶有效抑制了肾脏部位细胞的凋亡。即，所述超小型氧化铈纳米酶用于减轻顺铂引起的肾组织中的细胞凋亡。

所述超小型氧化铈纳米酶不会干扰顺铂原本对卵巢癌的治疗效果。本发明中所述超小型氧化铈纳米酶在肿瘤酸性条件下，表现出弱过氧化氢酶活性，不会降低顺铂在肿瘤部位产生的ROS，因而不会影响顺铂原来的抗肿瘤效果。

本发明通过动物实验和体外细胞实验两个方面发现氧化铈纳米酶对于减轻顺铂引起的急性肾损伤相关病症的药物中的用途，为临床上顺铂实现低毒性的抗肿瘤应用开发更有潜力的纳米材料。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶具有极好的形态结构，粒径均一可控，能够有效地进入肾脏部位，发挥治疗作用。

(2)本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶通过作用Nrf2/Keap1通路，能够显著地清除细胞中过高的ROS，抑制细胞凋亡。

(3)本发明中的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶因其酶活性的可控性，在保护急性肾损伤的同时不会干扰顺铂药物的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为实施例1中制备的超小型氧化铈纳米酶的透射电子显微镜(TEM)图；

图2为实施例1中制备的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶的动态光散射粒度分布图；

图3为实施例1中制备的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在不同pH条件下的过氧化氢酶活性；

图4为利用磺酰罗丹明B比色法(Sulforhodamine B，SRB)，磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶抑制顺铂诱导的HK-2细胞死亡的细胞存活率定量分析结果图；

图5为利用血液生化仪，检测氧化铈纳米酶对AKI小鼠的血清尿素氮(Serum ureanitrogen，BUN)和肌酐(Creatine，Cre)的抑制作用；

图6为苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色，检测氧化铈纳米酶对AKI小鼠肾脏结构的保护作用；

图7为利用Western blot，检测氧化铈纳米酶对凋亡蛋白Cleavd-PARP和Cleaved-caspase 3表达的抑制效应；

图8为利用Annexin V/PI双染法，流式细胞仪检测氧化铈纳米酶对顺铂引起的细胞凋亡的抑制作用；

图9为利用TUNEL染色法，检测氧化铈纳米酶对顺铂引起的凋亡的抑制作用；

其中，白色实线表示肾脏和背景的界限，白色虚线表示肾脏皮质和髓质的界限；

图10为利用ROS检测试剂盒，检测氧化铈纳米酶对HK-2细胞内ROS含量变化的效应图；

图11为利用SiRNA技术和Western blot，体外考察敲除Nrf2之后对氧化铈保护顺铂引起肾损伤的氧化应激相关的蛋白(Nrf2、Keap1和DJ-1及凋亡相关的蛋白(Cleavd-PARP和Cleaved-caspase 3)的结果图；

图12为利用实时荧光定量PCR法，检测氧化铈纳米酶对顺铂引起抗氧化基因NQO1上调的结果图；

图13为卵巢癌荷瘤裸小鼠给予顺铂或(和)氧化铈纳米酶后，考察其对不同时间相对肿瘤体积(Relative tumor volume，RTV)变化的结果图；

图14为卵巢癌荷瘤裸小鼠给予顺铂或(和)氧化铈纳米酶10天，考察其对肿瘤重量的结果图；

图15为卵巢癌荷瘤裸小鼠给予顺铂或(和)氧化铈纳米酶12天，考察其对裸小鼠生存率的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。本发明实施例中采用的表征方法和步骤如下：

SRB法：受试物等作用细胞24h后，弃去培养液，每孔加入4℃预冷的10％三氯醋酸(TCA)溶液固定细胞，置于4℃冰箱进行固定2h以上或过夜，培养板各孔用自来水或去离子水(D3W)洗涤5遍以上，去除多余的三氯醋酸，放入60℃烘箱干燥30min后，每孔加入1％乙酸配制的SRB溶液(4mg/ml)，室温放置20min-30min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍以上，目的是洗净未结合的SRB染料。再放入60℃烘箱干燥30min后，每孔加入70-80μl pH＝10.5的10mM Tris-base(三羟甲基胺基甲烷)溶液进行溶解，在平板振荡器上振荡10min，酶标仪测定吸光度OD值。

苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining)：肾脏取材采用横切，石蜡包埋肾脏，切片厚度为3μm，再进行HE染色。⑴将石蜡切片经环保透明剂Ⅰ脱蜡15min和环保透明剂Ⅱ脱蜡12min；⑵放入100％、95％、90％、80％等各级乙醇中脱水，约5min；⑶蒸馏水中5min；⑷苏木精中染色约2.5min，自来水冲洗约15min；⑸切片放入0.5％的盐酸乙醇中分色，见切片变红，颜色较浅即可；⑹水洗5min，氨水返蓝；⑺梯度脱水，70％乙醇2min，80％乙醇2min，90％乙醇2min，90％乙醇2min；95％乙醇2min；⑻用0.5伊红乙醇对比染色2s；⑼无水乙醇Ⅰ3min，无水乙醇Ⅱ5min；⑽环保透明剂透明完成后封片。

Western blot：通过在含有50mM Tris-HCl，150mM氯化钠，2mM EDTA，2mM乙二醇四乙酸(EGTA)，1％Triton-X 100的裂解缓冲液中匀化冷冻组织，对小鼠组织裂解物中的蛋白质进行免疫印迹分析。和蛋白酶抑制剂(pH 7.4)，然后离心(10000转，4℃)30分钟，获得上清液，并使用BCA蛋白质分析试剂盒(Yeasen Biotech，Hong Kong，中国)。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离蛋白质并转移至PVDF膜(Millipore，Massachusetts，USA)，然后用以下一抗检测：抗Nrf2(1：1000，ab62352，Abcam，Cambridge，英国)，anti-Keap1(1：1000，ab119403)anti-DJ-1(1：1000，sc-55572，Santa Cruz，Dallas，Texas，USA)，抗Cleaved-caspase 3(1：1000，9661L，Cell Signaling Technology)和抗GAPDH(1：1000，sc-1615)。

Annexin V/PI双染：将细胞及细胞上清收集至15ml离心管中，离心(1.8×10

TUNEL(TdT-msdiated dUTP Nick-End Labeling)染色：石蜡包埋切片后采用TUNEL法检测凋亡细胞，具体操作按说明书进行。TUNEL法检测细胞凋亡步骤如下：1)切片常规脱蜡，二甲苯浸洗，每次5min，共2次；梯度乙醇浸洗，每次3分钟，共1次；2)PBS漂洗2次，用proteinase K工作液处理组织15～30分钟；3)PBS漂洗2次，加入制备TUNEL反应混合液(处理组用50μL TdT+450μL荧光素标记的dUTP液混匀，阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μL DNase I，反应10分钟，后面步骤同处理组；4)加50μL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液)于标本上加盖玻片在暗湿盒中37℃反应1小时；5)PBS漂洗3次，加50μL converter-POD于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃反应30分钟；6)PBS漂洗3次，加50μL DAB底物，反应10分钟；7)PBS漂洗3次，苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在Leica光学显微镜下观察TUNEL染色，每张切片在400倍视野下选取3个视野，计数TUNEL阳性细胞数和正常细胞数，计算细胞凋亡率。

ROS试剂盒检测：将HK-2细胞在6孔共聚焦板(每孔2×10

RNA提取和RT-PCR。采用Trizol试剂提取已处理细胞中的RNA，于260/280nm测定吸光度值以确定样本纯度和浓度根据试剂说明书将RNA反转录成cDNA。应用Primer5.0软件设计NQO1mRNA的特异性引物，以GAPDH作为内参，引物由上海尚亚公司合成。使用SYBR GreenSupermix(Bio-Rad，Hercules，California，USA)和20μL反应混合物进行定量RT-PCR。PCR反应在Quant Studio 6Flex实时PCR系统(Applied Biosystems，Carlsbad，California，USA)上进行，具有以下程序：步骤1，95℃持续3分钟以活化Taq聚合酶；步骤2，95℃、3秒使DNA变性；步骤3，60℃进行退火/延伸31秒，步骤2-3进行39个循环。通过2-ΔΔCt方法定量相对mRNA水平，并将所有数据标准化为GAPDH(内参对照)。

实施例1：磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶的合成

(1)超小型氧化铈纳米酶的合成：

将0.4g醋酸铈水合物和3.2g油胺加入到15ml二甲苯中，以2摄氏度每分钟的升温速度升至90摄氏度，共搅拌4小时形成络合物；将1ml去离子水注射到惰性气体保护反应体系中，老化三小时，无水乙醚沉淀，离心得到超小型氧化铈纳米酶。

结果如图1所示，对超小型氧化铈纳米酶用透射电镜进行形貌表征，粒径约为1～10nm。

(2)磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶的合成：

将0.01g磷酸聚乙二醇和1ml超小型氧化铈纳米酶加入到5ml氯仿，于水浴超声锅中超声3min。将上述混合液50摄氏度旋蒸2小时后，加入1ml去离子水水化，得到磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶。

结果如图2所示，对磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶进行形貌表征，粒径约为10～30nm。

结果如图3所示，超小型氧化铈纳米酶在正常生理pH条件下具有强过氧化氢活性，在酸性条件下具有弱过氧化氢活性。

实施例2：氧化铈纳米酶对顺铂引起的HK-2损伤的影响

药物的制备：选用实施例1制备得到的磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶分散到水溶液中，得到最终超小型氧化铈纳米酶浓度为8.3mg/ml。

细胞模型建立：在HK-2细胞中加入含顺铂的细胞培养液，用细胞培液重新分散得到浓度为200mM的药物。

组别设置：

a.对照组：正常细胞给予新鲜的培养液。

b.模型组：在HK-2细胞中仅加入含顺铂的细胞培养液并使之终浓度为10μM。

c.治疗组：在HK-2细胞中加入含200mM顺铂的同时加入不同浓度梯度的氧化铈的细胞培养液，并使氧化铈的终浓度分别为0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM。

作用24小时后，用SRB法定量细胞活性，氧化铈抑制顺铂诱导的肾小管细胞HK-2死亡的结果如图4所示，顺铂具有明显的促进肾小管细胞HK-2死亡的作用，细胞活性仅为38.4％。给予氧化铈后肾小管细胞死亡有所抑制，细胞活性超过78.5％，证明其具有明显抑制顺铂诱导的肾小管细胞死亡的作用。

实施例3：氧化铈纳米酶对顺铂诱导的急性肾损伤的影响

取20-22g雄性ICR小鼠，采用顺铂药物诱导建立AKI模型。首先将小鼠随机分成4组，空白对照组、顺铂模型组、顺铂模型组+氧化铈0.5m/kg给药组、顺铂模型组+氧化铈1.5m/kg给药组，每组6只。腹腔注射15mg/kg顺铂，同时尾静脉注射0.5mg/kg或1.5mg/kg氧化铈纳米酶。给药第三天解剖，摘眼球采血收集血清，解剖，心脏灌流，摘取小鼠肾脏，用于石蜡包埋、HE染色和TUNEL染色。

结果如图5和图6所示，顺铂诱导血清尿素氮、肌酐显著升高和肾小管坏死、脱落等病变增加，给予氧化铈能够降低尿素氮、肌酐的水平和改善肾脏结构，且具有剂量依赖性。结果如图9所示，顺铂诱导TUNLE阳性凋亡细胞增加，给予氧化铈纳米酶能够显著降低凋亡细胞比例。

实施例4：氧化铈纳米酶在体外对顺铂诱导的肾小管细胞HK-2凋亡的影响

体外应用HK-2细胞(人正常肾小管细胞系)，同时给予5μM顺铂和50μM氧化铈纳米酶孵育细胞24h。利用Western blot检测Cleaved-PARP和Cleaved-caspase 3，利用AnnexinV/PI双染经流式细胞术检测晚期凋亡细胞比例。

结果如图7和图8所示，顺铂诱导Cleaved-PARP和Cleaved-caspase 3蛋白显著增加和晚期凋亡细胞比例显著增加，给予氧化铈能够降低Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3蛋白水平和降低阳性凋亡细胞的比例，且与动物结果具有一致性。

实施例5：氧化铈纳米酶在体外对顺铂诱导的肾小管细胞HK-2氧化损伤及Nrf2/Keap1信号通路的影响

体外应用HK-2细胞(人正常肾小管细胞系)，同时给予5μM顺铂和50μM氧化铈纳米酶孵育细胞24h，同时也设置空白对照(Vehicle)和单给氧化铈纳米酶组。利用ROS试剂盒检测HK-2细胞内ROS水平；利用Western blot检测Nrf2、Keap1、DJ-1、Cleaved-PARP和Cleaved-caspase 3；利用实时荧光定量PCR仪检测NQO1的mRNA水平。

结果如图10所示，顺铂诱导HK-2细胞内ROS含量显著增加，给予氧化铈能够降低过高的ROS水平。

结果如图11和图12所示，顺铂诱导DJ-1降低、Cleaved-PARP和Cleaved-caspase 3蛋白显著增加，敲除Nrf2之后，再给予氧化铈后不能逆转该变化趋势，同时Nrf2下游靶基因NQO1的mRNA水平仍保持在较低水平，不能很好地继续发挥保护作用。由此可见，Nrf2在氧化铈纳米酶保护肾损伤中是关键蛋白。

实施例6：氧化铈纳米酶不干扰顺铂治疗卵巢癌的效应

(1)模型制备：将ES-2细胞(1×10

(2)分组与给药：待裸鼠体内瘤块长到75-100mm

(3)数据采集：给药10天后处死裸鼠，剥离各组裸鼠的瘤块，肿瘤块称重。

计算肿瘤体积V、相对肿瘤体积RTV等，做统计学检测。

计算公式如下：a.V＝1/2×D×d

结果如图13、图14和图15所示，顺铂具有显著的对抗卵巢癌的作用，同时联用氧化铈纳米酶不会影响相对肿瘤体积RTV和肿瘤重量。同时顺铂在治疗癌症时由于剂量过大会导致小鼠死亡，而氧化铈纳米酶能够显著提高小鼠的存活率，由0％升至75％。

以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。