纳米氧化铈的合成修饰及其在辐射防护与肿瘤光动力学治疗中的应用研究

摘要

目的：
　　纳米氧化铈(CNPs)属于镧系金属元素氧化物，其表面同时存在Ce4+和Ce3+的氧化价态且可相互转化，因此具有独特的催化活性及多种生物酶学模仿活性，能有效清除机体内多种活性氧及活性氮，被广泛应用于生物医学领域。然而，未经充分表面修饰的CNPs存在着体内易团聚，易被内皮网状系统(ERS)清除等缺点，从而限制了其临床应用，因此需要对CNPs表面进行生物相容性修饰。然而，大多数表面修饰物如聚乙二醇(PEG)由于缺乏内在亲和力而很难稳定的吸附于CNPs表面。因此，需要寻找一种锚定分子来“桥接”CNPs与表面修饰物，以此探索一种简单、有效的CNPs表面修饰方法。
　　正常生物组织暴露于电离辐射会产生大量自由基，损伤正常细胞及组织。研究报道，CNPs可以有效清除电离辐射诱导产生的多种自由基，降低细胞氧化应激水平，有望成为一种新型的放射防护剂。然而，未经充分表面修饰的CNPs抗辐射活性较低，且副作用较大。因此，有必要评价生物相容性修饰的CNPs对正常细胞的辐射防护作用，积极探索一种新型、有效、副作用小的放射防护剂。
　　光动力学治疗(PDT)是指进入特定组织的光敏剂(PSs)在特定波长光的激发下，与生物分子或氧分子发生光敏作用，产生大量单线态氧(1O2)等活性氧，从而光损伤细胞。作为一种新型非侵袭性治疗手段，PDT具有组织特异性强、副作用小等优点，在治疗良恶性实体瘤及克服肿瘤耐药方面具有其独特的优势。然而，大多数传统的PSs疏水性较高，肿瘤靶向性较弱。CNPs作为PSs的载药平台除具有载药量大，靶向性高，有效提高PSs的生物相容性，药效时间长等一般纳米材料的优点外，其独特的催化活性、协同抗肿瘤效应以及优秀的储氧功能亦可增强PDT效应，因此CNPs-PSs在恶性肿瘤及耐药性肿瘤的PDT治疗中具有巨大的潜力。然而，CNPs在PDT中的应用却很少被研究。因此，设计一种基于CNPs的PSs载药系统用于PDT肿瘤治疗及肿瘤耐药性的克服，并深入研究其机制，以此探索一种基于CNPs的新型、有效、靶向性高、副作用小PDT治疗方案，对指导临床肿瘤PDT的实施具有重要意义。
　　方法：
　　1、通过微乳液法或高温分解法合成CNPs，并以阿仑膦酸(AL)作为锚定分子，对CNPs表面进行琥珀酸(SA)或PEG修饰;分析修饰前后纳米颗粒的分散性、稳定性、表面电荷分布、SOD酶模仿活性及细胞毒性;测定修饰前后纳米颗粒在小鼠体内的血液循环滞留时间及脏器分布。
　　2、对比研究裸的CNPs及PEG化的CNPs(CNPs-AL-PEG)对60Coγ射线诱导的正常肝细胞增殖活性、细胞凋亡、细胞内ROS浓度、DNA损伤的影响;分析修饰前后纳米颗粒的细胞摄入量、亚细胞定位及对细胞内SOD2蛋白表达的影响。
　　3、通过共价链接将聚乙烯亚胺(PEI)嫁接到CNPs-AL-PEG上(PPCNPs)，并将光敏分子二氢卟吩(Ce6)共价键合到PEI氨基末端，合成多功能纳米载药系统(PPCNPs-Ce6);采用稳定性分析、X射线光电能谱(XPS)分析、荧光光谱分析、Zeta电位分析及1O2产生能力分析对材料进行化学表征;对PPCNPs-Ce6的细胞摄入量及亚细胞定位进行分析;通过细胞增殖活性分析、细胞凋亡检测、细胞内ROS浓度测定、溶酶体功能检测及透射电镜观察，研究PPCNPs-Ce6对宫颈癌细胞的黑暗化疗毒性或在660 nm光照条件下的PDT光损伤效应及其机制;采用肿瘤生长曲线及肿瘤及脏器病理研究PPCNPs-Ce6对荷瘤小鼠的光-化疗协同效应。
　　4、在PPCNPs-Ce6的基础上，链接肿瘤靶向性分子叶酸(FA)，合成靶向性多功能载药系统(PPCNPs-Ce6/FA);采用透射电镜观察、稳定性分析、XPS分析、荧光光谱分析、红外光谱分析、Zeta电位分析、1O2产生能力分析对材料进行化学表征;通过阿霉素(DOX)摄入量、细胞增殖活性研究及药物外排泵P糖蛋白(P-gp)表达分析，研究基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT对耐药性乳腺癌细胞耐药性的影响;分析PPCNPs-Ce6/FA的细胞摄入量、亚细胞定位及对耐药性乳腺癌细胞的PDT光损伤效应;通过细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3/-7酶及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达水平分析、溶酶体膜通透性检测（吖啶橙染色、凝集素穿孔实验）、活细胞成像、透射电镜观察、胞内ATP含量及Ca2+浓度检测，研究基于PPCNPs-Ce6/FA的PDT诱导耐药性乳腺癌细胞死亡的途径;活体动物成像、肿瘤生长曲线及肿瘤病理研究PPCNPs-Ce6/FA对荷瘤小鼠的肿瘤靶向性及PDT抗肿瘤效应;研究尾静脉注射PPCNPs-Ce6/FA对小鼠血常规、肝肾功及脏器病理的影响。
　　结果：
　　1、CNPs的合成及表面修饰:采用微乳液法及高温分解法合成的CNPs，粒径约为3-5 nm;以AL作为锚定分子，成功将SA及PEG修饰于CNPs表面，修饰后的CNPs分散性及稳定性显著提高;CNPs表面修饰能显著提高纳米颗粒表面Ce3+/Ce4+的比率，且随着修饰链长度的增加而升高，导致其SOD酶模仿活性显著提高，并降低对肝细胞的毒性;CNPs的PEG修饰能显著提高纳米颗粒在体内的血液循环滞留时间，改善组织分布，进而减少其在肝脏特别是脾脏中的蓄积。
　　2、PEG化的CNPs的辐射防护研究:CNPs-AL-PEG具有良好的分散性及稳定性，其表面Ce3+的浓度(46.4％)显著高于裸的CNPs(37.9％);CNPs及CNPs-AL-PEG都能有效降低电离辐射诱导的L-02细胞损伤及凋亡，但CNPs-AL-PEG的辐射保护效应(～86.7％)显著强于CNPs(～62.4％)，提示PEG修饰能有效提高CNPs的辐射防护效应;PEG修饰能显著增强CNPs对电离辐射诱导的O2·-等自由基的清除，促进细胞内SOD2酶的表达，从而减轻电离辐射对细胞DNA的损伤;PEG修饰显著降低细胞对CNPs的摄取（约400倍），CNPs-AL-PEG进入细胞后分散于胞浆，而裸的CNPs进入细胞后大量团聚并集聚于溶酶体，这是裸的CNPs毒性较高且放射防护效应较低的主要原因之一。
　　3、PPCNPs-Ce6对宫颈癌的光-化疗协同效应:PPCNPs-Ce6具有良好的稳定性及生物相容性，PSs加载效率较高（质量比Ce6/Ce:～40％）; PPCNPs-Ce6显著增加宫颈癌细胞Hela对PSs的摄入（＞10倍），并定位于细胞溶酶体;PPCNPs-Ce6能被660 nm近红外激光（NIR）激发而发生光敏反应，超低剂量PPCNPs-Ce6(＜1μM)下就能有效光损伤肿瘤细胞，与游离Ce6相比，其PDT效应显著提高;较低剂量PPCNPs-Ce6(3-10μM)在黑暗情况下就能损伤细胞溶酶体，促进细胞ROS的产生，诱导细胞细胞发生凋亡，对肿瘤细胞有显著的化疗毒性;基于PPCNPs-Ce6的同步光-化疗能显著降低抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长（肿瘤抑制率104.7％），可克服传统PDT组织穿透性差的缺点，且无明显毒副作用，实现了成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。
　　4、PPCNPs-Ce6/FA对耐药性乳腺癌的靶向光敏作用:PPCNPs-Ce6/FA稳定性及生物相容性高，PSs加载效率高;与PPCNPs-Ce6相比，耐药性乳腺癌MCF-7/ADR对PPCNPs-Ce6/FA的摄入进一步提高;PPCNPs-Ce6/FA进入细胞后选择性的定位于溶酶体，且能被660 nm NIR激发，产生大量ROS;基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT能破坏MCF-7/ADR细胞P-gp药物外排泵，促进细胞对DOX的摄入，从而发挥光-化疗协同效应;PPCNPs-Ce6/FA在660 nm光照激发下，超低剂量(＜1μM)就能对MCF-7/ADR细胞发挥优异的光损伤效应;基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性，光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA(1μM)会诱导细胞发生Oncosis方式的死亡，伴随着细胞溶酶体膜的破坏、胞膜起泡、细胞及细胞器肿胀、胞浆空泡化及能量的快速耗竭;裸鼠荷瘤实验证明PPCNPs-Ce6/FA具有优异的肿瘤靶向性，并能在NIR激发下显著抑制肿瘤的生长（肿瘤抑制率96％），发挥优异的抗肿瘤效应;适当浓度PPCNPs-Ce6/FA静脉全身给药对动物毒性较小，安全性高。
　　结论：
　　1、以AL作为锚定分子，成功将SA及PEG修饰于CNPs表面，修饰后的纳米颗粒稳定性、生物相容性及SOD酶模仿活性显著提高，细胞毒性显著降低。
　　2、PEG修饰有效改善CNPs的细胞摄取及亚细胞定位，提高纳米颗粒对辐射诱导的ROS的清除能力，促进细胞SOD2的表达，减轻辐射诱导的DNA损伤，从而增强CNPs对细胞的辐射防护效应。
　　3、基于CNPs的纳米载药系统(PPCNPs-Ce6)显著促进宫颈癌细胞对PSs的摄入，并定位于溶酶体，在特定波长光激发下超低剂量就能能有效发挥PDT杀伤肿瘤效应;同时在黑暗情况下，一定浓度PPCNPs-Ce6能有效发挥化疗毒性，从而实现成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。
　　4、PPCNPs-Ce6/FA进一步增强耐药性乳腺癌对PSs的摄入及光敏效应，基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT能有效克服肿瘤耐药性，其诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性，光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA会诱导细胞发生Oncosis。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 纳米氧化铈的合成与修饰

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 聚乙二醇化纳米氧化铈的抗辐射效应及机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 基于纳米氧化铈多功能载药系统在肿瘤光动力学治疗中的应用研究

第一节 基于纳米氧化铈的载药平台加载光敏剂对宫颈癌的协同光-化疗效应及机制研究

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

第二节 基于纳米氧化铈的载药系统对耐药性乳腺癌靶向性光动力学治疗及机制研究

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 纳米氧化铈的生物应用

攻读学位期间发表的论文

致谢