治疗和预防微生物感染

摘要

本发明提供了用于治疗或预防微生物(例如，细菌)感染的方法以及用于进行这些方法的方式。具体而言，使得需要快速和持久治疗的感染的治疗变得可能，诸如用于治疗急性病况，诸如败血病、败血症、SIRS或败血性休克。本发明例如对于治疗微生物、诸如用于环境、食品和饮料用途特别有用。本发明尤其涉及控制工业或家用系统中的基底或流体的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法。本发明也可用于在接受疾病或病况的治疗、诸如移植或癌症、病毒感染或自身免疫性疾病的治疗的受试者中治疗致病性细菌感染。

说明书

技术领域

本发明提供了用于治疗或预防微生物(例如细菌)感染的方法和进行这些方法的方式。具体而言，使得需要快速或持久疗法的感染的治疗变得可能，诸如用于治疗急性病况，诸如败血病、败血症、SIRS或败血性休克。本发明例如对于处理微生物用于环境、食品和饮料用途也是特别有用的。本发明尤其涉及在工业或家庭系统中控制基底或流体的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法。

本发明也可用于在接受疾病或病况的治疗、诸如移植或癌症、病毒感染或自身免疫性疾病的治疗的受试者中治疗致病性细菌感染。

背景

败血病是急性和严重的血流感染。其也被称为菌血症或血液中毒。当机体中别处(诸如肺部或皮肤中)的细菌感染进入血流时，发生败血病。这是危险的，因为细菌及其毒素可以通过血流携带至受试者的整个身体。败血病可以快速变得威胁生命。其必须快速治疗，诸如在医院中。如果其不治疗，则败血病可以进展为败血症。

败血病和败血症是不同的。败血症是败血病的严重并发症。败血症是当全身发生炎症的情况。该炎症可以引起血液凝块并阻止氧气到达重要器官，导致器官衰竭。美国国立卫生研究院(NIH)估计，每年超过100万美国人患有严重的败血症。这些患者中的28%至50%可能死于该病况。当炎症在极低的血压下发生时，其被称为败血性休克。在许多情况下，败血性休克是致命的。

使用免疫抑制药物的群体(更多人具有慢性疾病)的平均年龄的增加以及所进行的侵入性手术的数量的增加，已经导致败血症的发生率增加。超过65岁的人，特别是具有健康问题的那些，甚至比任何其他组更易患败血症。根据在2006年发表的一项研究，尽管65岁和更年长的人占美国人口的约12%，但他们占医院中的败血症病例的65%。

败血病是由机体的一部分中的感染引起。这种感染通常是急性的。许多类型的细菌可以导致败血病。经常无法确定确切的感染源。导致败血病的最常见感染是：

• 尿路感染

• 肺部感染，诸如肺炎

• 肾脏感染

• 腹部区域中的感染

来自这些感染的细菌进入血流并快速繁殖，引起急性感染和直接症状。

由于其他某事(诸如手术)已经在医院中的人处于发展败血病的更高风险中。在医院中的同时可能发生继发感染。这些感染经常更危险，因为细菌可能已经对抗生素抗性。如果受试者发生以下情况，存在发展败血病的更高风险：

• 具有严重的伤口或烧伤

• 非常年轻或非常年老

• 具有受损的免疫系统，其可能由于疾病诸如HIV或白血病而发生

• 具有尿路或静脉内导管

• 使用机械通风

• 正接受减弱免疫系统的药物治疗，诸如化学疗法或类固醇注射

败血病的症状通常非常快速地开始。甚至在疾病的最初阶段，人也看起来非常病态。它们可以在损伤、手术或另一种局部(例如，局限于一个位置)感染、如肺炎之后。最常见的初始症状是：

• 发冷

• 体温升高(发烧)

• 非常快的呼吸

• 心率快

随着败血病进展，在没有适当治疗的情况下，将开始出现更严重的症状。这些包括：

• 混乱或无法清晰思考

• 恶心和呕吐

• 出现在皮肤上的红点

• 尿体积减少

• 血流不足(休克)

已经开始影响器官或组织功能的败血病是急性医疗紧急情况。其必须在医院快速治疗。许多具有败血病的患者被送往医院的ICU用于治疗和康复。建议决不采取“等待和观察”方法或尝试在家中解决问题。如果受试者正显示败血病的体征，立即去医院是至关重要的。

败血病具有许多严重的并发症。如果不治疗或如果治疗延迟过长，则这些并发症可能是致命的。

败血病的一种并发症是血压的严重下降。这被称为败血性休克。由血流中的细菌释放的毒素可以引起极低的血流量，这可以导致器官或组织损伤。败血性休克是急性医疗紧急情况。具有败血性休克的人通常在医院的重症监护室(ICU)中进行护理。如果处于感染性休克中，则可能需要将患者放在呼吸机或呼吸仪器上。

败血病的另一种并发症是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这是一种危及生命的病况，其阻止足够的氧气到达您的肺部和血液。根据美国国家心肺血液研究所(NHLBI)，ARDS在约三分之一的病例中是致命的。其经常导致一定水平的永久性肺损伤。其还可以损害脑部，其可以导致记忆问题。

当机体对感染具有强烈的免疫应答时，发生败血症。这导致遍及机体的广泛炎症。如果其导致器官衰竭，其被称为严重败血症。具有慢性疾病、诸如HIV或癌症的人处于败血症的更高风险中。这是因为它们具有减弱的免疫系统并且不能独自抵抗感染。败血症每年在全球引起数百万例死亡，并且是已经住院的人中最常见的死亡原因。全世界败血症的发病率估计为每年1800万例。在美国，败血症影响1,000人中的近似3人，并且严重的败血症每年促成超过200,000例死亡。败血症发生在所有住院病例中的1-2%，并且占ICU病床利用率的多达25%。

早期诊断对于适当地管控败血症是必要的，因为快速疗法的开始对于减少由于严重败血症死亡是关键的。在怀疑败血症的前三小时内，诊断研究应当包括白血细胞计数，测量血清乳酸盐，和在开始抗生素之前获得适当的培养物，只要这不使其使用延迟超过45分钟。

导致败血症的最常见的主要感染源是肺部、腹部和尿路。通常，所有败血症病例中的50%开始于肺部中的感染。

治疗的速度是必不可少的。应当采取两组血液培养(有氧和无氧)，而不延迟抗生素的起始。如果怀疑来自这些部位的感染，可以采集来自其他部位、诸如呼吸道分泌物、尿液、伤口、脑脊液和导管插入部位的培养物(原位超过48小时)。在严重的败血症和败血性休克中，广谱抗生素(通常是两种，具有广泛覆盖范围的β-内酰胺抗生素，或与氟喹诺酮、大环内酯或氨基糖苷组合的广谱碳青霉烯)是常规的。然而，不建议将抗生素的组合用于治疗没有休克的败血症和在免疫受损的人中治疗，除非该组合用于拓宽抗细菌活性。抗生素的施用在确定人的存活中是重要的。一些人建议在做出诊断的一小时内给予它们，指出抗生素施用每延迟一小时，死亡率存在相关的6%增加。

早期目标定向疗法(EGDT)是一种在诊断后最初的6小时期间管控严重败血症的方法。这是一种逐步方法，其生理目标是优化心脏的前负荷、后负荷和收缩力。其包括给予早期抗生素。

新生儿败血症可能难以诊断，因为新生儿可能是无症状的。如果新生儿显示提示败血症的体征和症状，则立即开始抗生素，并且或者将其改变为靶向通过诊断测试鉴定的特定生物体，或者在已经排除症状的感染性原因后停止。

近似20–35%的具有严重败血症的人和30–70%的具有败血性休克的人死亡。败血症存活运动(SSC)是一项将专业组织召集在一起以降低败血症死亡率的全球倡议。在入院/诊断的两小时内施用抗生素。败血性休克发作后患者每拒绝抗生素疗法一小时，患者存活的机会就减少7.9% (Survivesepsis.org 2005)。

因此，需要快速治疗急性微生物感染，诸如与败血病、败血症或败血性休克相关的细菌感染。如果治疗可持久许多小时，这也是有利的。对于控制工业和家庭系统中的基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损，快速且持久处理微生物也是期望的。

在某些情况下，急性细菌感染可能危及健康或甚至危及生命。例如，在癌症患者、移植患者或其他受试者中可能是这种情况。治疗细菌感染的需求可能变得迫切，并且确实成为医学护理中立即关注的焦点。提供以不会不利地损害患者也需要对其应答的癌症或其他单独疗法的效力的方式治疗此类致病性细菌感染的方法也是有用的。

发明概述

本发明提供了通过使用微生物基因组的可编程核酸酶切割的作用的解决方案；这不同于通过β-内酰胺和其他用于治疗感染的常规抗生素的代谢抑制剂和其他作用机制。靶向的切割提供了选择性杀死微生物或减少生长或增殖以治疗或预防感染。此外，发明人已经令人惊讶地发现，在一些实施方案中，可以非常快速地(例如，在15分钟内)实现大量杀死(杀死几个log)，并且可以实现持续的作用(例如，在开始治疗后持续超过1小时，和甚至约3小时)。因此，本发明提供了以下配置。

在第一种配置中，

用于治疗受试者的微生物感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

在第二种配置中，

用于在治疗受试者的微生物感染的方法中与可编程核酸酶一起使用的多种病毒(例如，噬菌体或用于产生噬菌体的噬菌粒)，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和病毒，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；

其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；

其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

在第三种配置中，

包含用于在治疗受试者的微生物感染的方法中对可编程核酸酶进行编程的多种核酸的组合物，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和所述核酸，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；

其中每种核酸编码RNA用于在受试者中表达RNA，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

在第四种配置中，

包含用于治疗方法中的根据本发明的核酸酶的CRISPR/Cas系统，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)，且所述系统包含一个或多个指导RNA或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述微生物的基因组包含的靶标位点。

在第五种配置中，

治疗受试者的微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

在第六种配置中，

治疗受试者的微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和多种病毒，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

在第七种配置中，

治疗受试者的微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和多种核酸，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；其中每种核酸编码RNA用于在受试者中表达RNA，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

在第八种配置中，

本发明的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施如本文所定义的治疗方法的组合物中的用途，其中所述受试者是除了人或动物以外的生物体。

在第九种配置中，

本发明的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施基底的微生物感染的离体或体外处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述基底的急性微生物感染。

在第十种配置中，

可编程核酸酶在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述基底的急性微生物感染。

在任何配置中：例如，所述感染是急性感染。例如，所述感染是迅速治疗的急性感染。例如，所述感染被迅速治疗 - 例如，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，将所述感染减少至少100倍。例如，所述治疗是持久性的 - 例如，在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续至少30分钟。而且，任选地，在所述治疗开始后，将感染减少至少100倍或1000倍维持至少60分钟(例如，至少120分钟)。下面提供例举，其令人惊讶地表明这些，诸如在治疗开始后约3小时持续的快速杀死。例如，所述方法提高受试者的存活率，或提高患有所述第一物种或菌株的微生物的感染的人或人患者中的存活率。

本发明还提供了对于经历癌症或其他分开疗法的受试者中的致病性细菌感染的有效治疗的需求的解决方案，所述癌症或其他分开疗法也必须是有效的。因此，本发明进一步提供了:-

在第十一种配置中，

用于治疗人或动物受试者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用可编程核酸酶实施，所述可编程核酸酶被编程以切割所述靶标位点，其中所述受试者正患有除了致病性细菌感染以外的另外的疾病或病况，且所述方法包括将疗法施用于所述受试者用于治疗或预防另外的疾病或病况，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述疗法对于治疗或预防所述疾病或病况是有效的。

在第十二种配置中，

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的。

在第十三种配置中，

用于本发明的方法中的可编程核酸酶。

在第十四种配置中，

包含用于第11或第12种配置的方法中的根据第13种配置的核酸酶的CRISPR/Cas系统，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)，且所述系统包含一个或多个指导RNA(gRNA)或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点。

在第十五种配置中，

指导RNA或编码指导RNA的DNA，其用于治疗致病性细菌感染的系统或方法中。

在第十六种配置中，

包含指导RNA或DNA的核酸载体。

在第十七种配置中，

药物组合物，其包含编码所述核酸酶的第一核酸载体(或其多个)和编码所述指导RNA的第二核酸载体(或其多个)。

附图简述

图1. 携带CGV系统的大肠杆菌(EHEC) ATCC43888菌株的时间-杀死曲线。(a) CRISPR诱导在30分钟内杀死99.98%的群体(黑线)。不存在诱导的情况下的生长以虚线显示。在时间点0诱导CRISPR，并监测，直至60分钟。(b)诱导30分钟后，携带CGV系统的大肠杆菌ATCC43888的LB琼脂板上的滴点(5μl)的稀释系列(10

图2. 大蜡螟幼虫中的靶标菌株大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的CRISPR杀死。向大蜡螟幼虫在最后的左腹足后递送细菌的注射。注射后近似1 h，在最后的右腹足后施用CRISPR诱导剂。将幼虫在37℃下孵育2 h并处死。在对照组中也注射携带脱靶单一指导RNA质粒的对照细菌。

图3. 大蜡螟中的大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的CRISPR-杀死曲线。向大蜡螟幼虫在最后的左腹足后递送细菌的注射。注射后近似1 h，在最后的右腹足后施用CRISPR诱导剂。将幼虫在37℃下孵育，并在诱导后0、1、2 h处死。

图4. 被大肠杆菌(EHEC) ATCC43888感染的大蜡螟幼虫的Kaplan-Meier存活曲线。与携带脱靶单一指导RNA质粒的脱靶对照(虚线)相比，CRISPR诱导显著提高幼虫的存活率(黑线)。

图5. 携带靶向

图6. 携带靶向

图7：转接合体艰难梭菌的完全杀死。显示使用gRNA编码CRISPR阵列完全精确地杀死艰难梭菌，所述gRNA编码CRISPR阵列通过接合质粒作为载体从益生菌载体细菌物种递送。含有载体的载体细菌(大肠杆菌供体菌株)与艰难梭菌交配，其在递送设计的阵列后被杀死。这利用艰难梭菌的内源性Cas3机制。实现了艰难梭菌细胞的100%杀死，并且显示于该图中。

图8：ICI疗法期间的抗生素治疗具有致命的结果：来自纪念斯隆·凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Ketterin Cancer Center)的验证群组的总体存活率的Kaplan Meier曲线，包括用抗PD-L1/抗PD-1 mAb治疗的n = 239个晚期NSCLC患者，其在注射免疫检查点阻断前两个月接受(ATB, n=68)或未接受(无ATB，n=171)抗生素(ATB)。不存在抗生素治疗的中间总体存活期为21.9个月，相比之下用抗生素治疗的总体存活期为9.8个月。因此，用经典抗生素治疗的患者中的中值总体存活期为未接受抗生素治疗的患者的中值总体存活期的<50%(或短>12个月)。

图9A和9B：肠道微生物组调节黑色素瘤患者中的抗PD-1抑制的效力(来自Gopalakrishnan等人,

详述

本发明的方法不同于常规的抗生素方法。本发明利用使用编程的核酸酶靶向切割微生物基因组，而常规抗生素对于其活性依赖于代谢过程和细胞复制周期 - 以及对它们的抑制。通过反而聚焦于核酸酶切割，本发明令人惊讶地实现非常快速和有效的微生物杀死，其也是显著持久的。这在下面用不同的微生物、不同的核酸酶和不同的递送方法的实验中进行证明。通常，许多次令人惊讶地观察到99-100%杀死，并且非常快速地实现3-4个log的杀死，而且具有持久的持续时间。

本发明提供了用于治疗或预防微生物(例如，细菌)感染的方法以及用于进行这些方法的方式。具体而言，使得需要快速疗法的感染的治疗变得可能，诸如用于治疗急性病况，诸如败血病、败血症、SIRS或败血性休克。如本文所解释，快速应答对于解决许多环境下的微生物感染是至关重要的。对于许多感染情况(诸如需要入院的急性感染)，速度是至关重要的。本发明的益处可以是以下中的一种或多种：受试者中感染的传播、严重程度或进展的减少；感染的症状(例如败血症或败血性休克)的发展、严重程度或进展的减少；和人或动物患者中的存活可能性的增加。

本发明使用微生物基因组的可编程核酸酶切割。与用常规抗生素所看到的几种不同物种的更广谱微生物杀伤相反，靶向的切割提供了选择性微生物杀死或生长或增殖的减少以治疗或预防感染。选择性杀死有利于使有益微生物不被治疗靶向，这可能对患者有益。此外，发明人已令人惊讶地发现，在一些实施方案中，可以非常快速地(例如，在15分钟内)实现实质性的杀死(杀死几个log)，并且可以实现可持续的效果(例如，持续超过1小时)。如下所例举，发明人令人惊讶地可以显著实现持续约2-3小时的快速和持久的杀死。

因此，本发明提供了以下方面：-

用于治疗受试者的微生物感染(例如，急性细菌感染)的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

另一个方面提供了：用于快速治疗受试者的急性微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且快速治疗所述受试者的急性微生物感染。

另一个方面提供了：用于治疗受试者的微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和将所述核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

另一个方面提供了：用于快速治疗受试者的急性微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和将所述核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且快速治疗所述受试者的急性微生物感染。

另一个方面提供了：用于持久地治疗受试者的微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此持久地杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

另一个方面提供了：用于持久地治疗受试者的微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此持久地杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和将所述核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染。

另一个方面提供了：用于持久地治疗受试者的急性微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此持久地杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和将所述核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的急性微生物感染。

令人惊讶地，如下所例举，在细菌第一次暴露于编程的核酸酶后约3小时，观察到了使用核酸酶的几个log (例如3或4个log)的持久作用(与常规抗生素杀死的常规方式相反)。因此，本发明的该方面使得较不频繁地暴露于编程的核酸酶(即，较不频繁地施用编程的核酸酶、可编程的核酸酶和/或用于对核酸酶进行编程的核酸)的给药方案变得可能。例如，在第一时间(T1)和第二时间(T2)将用于对核酸酶进行编程的Cas和gRNA(或编码gRNA的DNA)与可编程核酸酶(例如，Cas 9或Cas3)一起施用于所述受试者；或在T1和T2施用gRNA(或编码gRNA的DNA)，用于对所述第一物种或菌株的细菌的内源Cas核酸酶(例如，Cas9或Cas3)进行编程，其中编程的内源Cas切割细菌的基因组以杀死所述细菌或减少生长或增殖，因此治疗所述感染。这种较不频繁的给药对于健康护理从业者和患者是方便的，并且提供了经济的疗法。因此，任选地，在T1和T2将所述核酸酶和/或核酸施用于所述受试者，

其中T2是T1之后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或24小时。例如，T2是T1之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或24小时。例如，T2是T1之后2-7小时。例如，T2是T1之后1小时。例如，T2是T1之后2小时。例如，T2是T1之后3小时。例如，T2是T1之后4小时。例如，T2是T1之后5小时。

任选地，在T1和T2向所述受试者施用核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或对核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，其中T2是 T1之后至少1小时(例如，1、1.5、2、2.5或3小时)。

另一个方面提供了：用于治疗受试者的微生物(例如，细菌)感染的方法中的Cas核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶是用指导RNA(gRNA)可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括向所述受试者施用所述核酸，其中所述核酸是gRNA或编码gRNA的DNA，由此对所述核酸酶进行编程以识别和切割由所述受试者包含的微生物的靶标位点，由此切割所述微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染，其中所述方法包括在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者施用所述核酸，由此在T1和T2将所述受试者暴露于编程的核酸酶，且其中T2是T1之后不少于1小时。

任选地，T2是T1之后不少于2小时；任选地，T2是T1之后不少于3小时；任选地，T2是T1之后不少于4小时；任选地，T2是T1之后不少于5小时；任选地，T2是T1之后不少于6小时；任选地，T2是T1之后不少于7小时；任选地，T2是T1之后不少于8小时；任选地，T2是T1之后不少于9小时；任选地，T2是T1之后不少于10小时；任选地，T2是T1之后不少于11小时；任选地，T2是T1之后不少于12小时；任选地，T2是T1之后不少于13小时；任选地，T2是T1之后不少于14小时；或任选地，T2是T1之后不少于24小时。另外或可替代地：任选地，T2是T1之后不超过7小时；任选地，T2是T1之后不超过12小时；任选地，T2是T1之后不超过24小时；任选地，T2是T1之后2-7小时；任选地，T2是T1之后24小时；任选地，T2是T1之后7小时；任选地，T2是T1之后6小时；任选地，T2是T1之后5小时；任选地，T2是T1之后4小时；任选地，T2是T1之后3小时；任选地，T2是T1之后2小时；任选地，T2是T1之后1小时。例如，T2是T1之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或24小时。例如，T2是T1之后1-7小时；或T2是T1之后2-7小时；或T2是T1之后3-7小时；或T2是T1之后4-7小时；或T2是T1之后5-7小时；或T2是T1之后6-7小时。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少1000倍。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少10000倍。

任选地，所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。任选地，所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少100倍立即持续30分钟。任选地，所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少1000倍立即持续30分钟。任选地，所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少10000倍立即持续30分钟。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍；且其中在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少100倍立即持续30分钟。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少1000倍；且其中在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少1000倍立即持续30分钟。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少10000倍；且其中在所述治疗的前30分钟后，感染减少至少10000倍立即持续30分钟。

任选地，所述方法包括在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，所述方法包括在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少1000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少1000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，所述方法包括在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少10000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少10000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少1000倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少1000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少10000倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少10000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前15分钟，使所述感染减少至少10000倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少10000倍维持至少45分钟。这在下面例举。

在一个实例中，持久地治疗所述感染，其中在开始治疗后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。在一个实例中，持久地治疗所述感染，其中在开始治疗后，使所述感染减少至少1000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。在一个实例中，持久地治疗所述感染，其中在开始治疗后，使所述感染减少至少10000倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

任选地，到所述治疗的前30或45分钟，所述感染减少至少100,000倍。任选地，到所述治疗的前30或45分钟，所述感染减少至少100,000倍，且维持所述减少，直至所述治疗的第60分钟。

任选地，到所述治疗的前30或45分钟，所述感染减少至少1000,000倍。任选地，到所述治疗的前30或45分钟，所述感染减少至少1000,000倍，且维持所述减少，直至所述治疗的第60分钟。

任选地，到所述治疗的前15分钟，所述感染减少至少100倍。任选地，到所述治疗的前15分钟，所述感染减少至少1000倍。任选地，所述感染到所述治疗的前15分钟减少至少100倍，且到所述治疗的前30分钟减少至少1000倍。

例如，使所述减少维持至少另外15分钟，例如，到所述治疗的前15分钟，所述感染减少至少100倍或至少1000倍，且从所述治疗的第15-30分钟或第15-45分钟或所述治疗的第15-60分钟维持所述减少。

例如，到所述治疗的前15分钟，在前15分钟内，所述感染减少至少100倍或至少1000倍或至少10000倍，且从所述治疗的第15-30分钟或第15-45分钟维持所述减少。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少1000倍。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少10000倍。

任选地，所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟，例如，在所述治疗的前30分钟后，所述减少可以持续至少60分钟。如果在时间零(T0)施用所述治疗，则感染的减少可以在T0之后计数的60分钟存在，并且实际上可以在该60分钟之后持续存在。例如，在图1(a)、5(a)和6(a)中，在T0之后60-180分钟看到减少。任选地，在所述治疗的前30分钟后，感染的减少持续至少30分钟。

在一个实例中，所述感染减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，例如，在治疗的前15分钟内。在一个实例中，所述感染减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，例如，在治疗的前30分钟内。

为了确定靶标微生物的杀死或生长或增殖的减少，可以例如确定(i)在临开始治疗前取自受试者的样品(例如，血液、肠或叶样品)和(ii)在治疗30分钟时取自受试者的样品(与(i)的样品相同类型的，例如分别为血液、肠或叶样品)中的第一物种或菌株的微生物数目的差异。例如，如果微生物是细菌，则可以评价样品的菌落形成单位(CFU)/ml样品的差异，例如，当样品已铺板在各自的petri皿中的琼脂上并在相同条件下孵育时。另一个实例可以使用样品中的微生物的显微镜计数，或技术人员已知的其他常规方法。

在一个实例中，到所述治疗的前30、60、90或120分钟(例如，到前30分钟；或到前120分钟)，实现微生物的至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%杀死。例如，在所述受试者是人或动物的情况下，通过将在临开始治疗前采集的血液样品中的微生物(例如，细菌)的发生率(例如，通过琼脂板上的标准菌落计数)与在所述治疗的前15或30分钟后采集的样品进行比较来确定杀死。在一个实例中，到所述治疗的前0.5、1或2小时，实现所述微生物的至少80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%杀死。在一个实例中，到所述治疗的前30分钟，实现所述微生物的至少99%杀死。在一个实例中，到所述治疗的前2小时，实现所述微生物的至少99%杀死。在一个实例中，实现100%杀死。这些在下面例举。在一个实施方案中，杀死少于100%的微生物。

下面显示细菌中的杀死的工作实例。令人惊讶地，使用编程的核酸酶以靶向所选细菌，特异性切割导致靶标细菌的快速杀死-可以在非常短的时间间隔内观察到至少3或4个log的杀死(即，1000或10,000倍杀死)，并且令人惊讶地，这些持续至少一小时。任选地，到所述治疗的前15、30或45分钟，所述感染减少至少1000倍。任选地，到所述治疗的前15、30或45分钟，所述感染减少至少1000倍，且维持所述减少，直至所述治疗的第60、第120或第180分钟。任选地，到所述治疗的前15、30或45分钟，所述感染减少至少10,000倍。任选地，到所述治疗的前15、30或45分钟，所述感染减少至少10,000倍，且维持所述减少，直至所述治疗的第60、第120或第180分钟。参见，例如，图5a中的例举。

在一个实例中，到开始治疗后24小时，实现100%杀死。

在一个实例中，所述感染减少至少1000倍，持续2小时或更长时间(例如，持续2-3小时)。还任选地，到所述治疗的前15或13分钟，所述感染减少至少1000倍。

在一个实例中，所述感染减少至少10,000倍，持续2小时或更长时间(例如，持续2-3小时)。还任选地，到所述治疗的前15或13分钟，所述感染减少至少10,000倍。

在一个实例中，所述感染减少至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%，持续1小时；或持续1小时或更长时间；或持续2小时或更长时间(例如，持续2-3小时)。任选地，所述感染减少至少90%，持续1小时；或持续1小时或更长时间；或持续2小时或更长时间(例如，2-3小时)，且任选地到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)。任选地，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间，且到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)。任选地，到所述治疗的前15或13分钟，所述感染减少至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。任选地，到所述治疗的前15或13分钟，所述感染减少至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%；且其中所述减少维持1小时或更长时间(例如，持续2小时或更长时间；或持续3小时或更长时间；或持续约2小时；或持续2小时；或持续约3小时；或持续3小时)。提供以下例举，其中所述细菌是大肠杆菌。

任选地，所述受试者是人或动物，且所述微生物是细菌(例如，大肠杆菌或艰难梭菌)，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述细菌对所述受试者的血液感染减少至少100倍。任选地，所述受试者是人或动物，且所述微生物是细菌(例如，大肠杆菌或艰难梭菌)，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述细菌对所述受试者的血液感染减少至少1000倍。任选地，所述受试者是人或动物，且所述微生物是细菌(例如，大肠杆菌或艰难梭菌)，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述细菌对所述受试者的血液感染减少至少10,00倍。任选地，所述大肠杆菌是EHEC大肠杆菌。

任选地，编程的核酸酶(例如，Cas9或Cas3)能够切割由大肠杆菌(EHEC)ATCC43888包含的靶标位点。任选地，编程的核酸酶(例如，Cas9或Cas3)能够切割由大肠杆菌Nissle包含的靶标位点。任选地，本发明杀死产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的大肠杆菌和/或克雷伯氏菌(例如，肺炎克雷伯氏菌)。因此，本发明可以用于治疗或预防受试者、例如人中的ESBL细菌感染。例如，所述感染是尿路感染(UTI)或败血病。在一个实例中，所述细菌对头孢菌素、青霉素、氟喹诺酮、甲氧苄啶和四环素中的一种或多种或全部是抗性的。在一个实例中，所述细菌是碳青霉烯抗性的大肠杆菌或克雷伯氏菌。

任选地，在临治疗前，所述受试者的血液被10

下面的工作实例显示使用本发明的方法在体内模型中提高的存活率。因此，在一个实例中，本发明的方法用于通过治疗受试者的急性微生物感染来提高受试者的存活率。在一个实例中，本文中的编程的核酸酶能够实施大蜡螟(

所述核酸酶可以是例如DNA酶(例如，Cpf1、Cas9或Cas3)或RNA酶(例如，Cas13b)。在一个实例中，所述核酸酶是1类核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是2类核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是I型核酸酶，例如，IA、IB、IC、ID、IE、IF或IU型核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是II型核酸酶，例如，IIA，IB或IC型核酸酶，例如，Cas9、spCas9或saCas9。在一个实例中，所述核酸酶是III型核酸酶，例如，IIIA、IIIB、IIIC或IIID型核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是IV型核酸酶，例如，IVA或IVB型核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是V型核酸酶，例如cpf1。在一个实例中，所述核酸酶是VI型核酸酶，例如，Cas13，例如，Cas13a、b、c或d。

例如，所述核酸酶是IA型Cas3。

例如，所述核酸酶是IB型Cas3，例如，梭菌(例如，艰难梭菌) Cas3。

例如，所述核酸酶是IC型Cas3。

例如，所述核酸酶是ID型Cas3。

例如，所述核酸酶是IE型Cas3，例如大肠杆菌或假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)Cas3。

例如，所述核酸酶是IF型Cas3，例如，假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌) Cas3。

例如，所述核酸酶是IU型Cas3。

在一个实例中，所述核酸酶是Cas6，例如Cas6f。

在一个实例中，所述核酸酶是分离或重组的核酸酶。例如，所述核酸酶是合成的或非天然存在的核酸酶。在一个实例中，所述核酸酶是切口酶。

在一个实例中，所述核酸酶是离体的，例如体外的。在一个实例中，所述核酸是离体的。在一个实例中，本文的指导RNA或编码指导RNA的DNA是离体的，例如，体外的。

任选地，所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cpf1、CasX、CasY、Cas13b、Cas 3或9)，大范围核酸酶，TALEN(转录激活因子样效应子核酸酶)或锌指核酸酶。在一个实例中，所述Cas是链球菌(例如，化脓性链球菌或金黄色链球菌) Cas9，梭菌(例如，艰难梭菌)，沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)或大肠杆菌Cas3。例如，所述Cas是spCas。在一个实例中，所述Cas9与可与Cas一起操作的tracrRNA或编码tracrRNA的DNA组合。例如，所述tracrRNA是与Cas相同物种的，例如，化脓性链球菌tracrRNA或编码此的DNA。

在一个实例中，所述核酸酶是由包含SEQ ID NO:9或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的序列的核酸编码的Cas 3。任选地，所述细菌也是梭菌(例如，艰难梭菌)细菌；或表1中显示的任何梭菌。这在下面例举。

在一个实例中，所述核酸酶是由包含SEQ ID NO:10或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的序列的核酸编码的Cas 9。在一个实例中，所述核酸酶是Cas 9，其包含SEQ ID NO:11或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的序列。任选地，所述细菌也是梭菌(例如，艰难梭菌)细菌；或表1中显示的任何梭菌。任选地，所述细菌也是大肠杆菌(例如，EHEC)。这在下面例举。

任选地，所述方法包括向所述受试者施用RNA或编码RNA用于在所述受试者表达所述RNA的核酸(例如，DNA)，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

任选地，将所述核酸酶与所述RNA或核酸同时或依次施用于所述受试者。

任选地，在向所述受试者施用所述RNA或核酸之前，所述受试者包含核酸酶。例如，所述核酸酶是Cas核酸酶，其为所述受试者包含的第一物种或菌株的细菌细胞的内源Cas核酸酶。因此，在该实施例中，可以将所述RNA或核酸施用于受试者并引入细菌中用于细菌包含的内源Cas进行编程，由此形成切割细菌的基因组中的靶标位点的编程的Cas核酸酶，由此杀死细菌或减少细菌的生长或增殖，因此治疗或预防感染。

任选地，将多种病毒(例如，噬菌体或噬菌粒)施用于所述受试者，其中每种病毒包含核酸的拷贝(例如，一个或多个，例如多个拷贝)，其中所述病毒感染由所述受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。例如，本文的病毒是感染(或能够感染)第一物种或菌株的细菌的噬菌体或噬菌粒。

任选地，施用的病毒：由所述受试者包含的微生物的比率为10至150。例如，所述微生物是细菌，且所述比率为10至100，即感染复数(MOI)为1至100 (例如，其中所述病毒能够复制，例如，是噬菌体而不是噬菌粒)，例如，10至100。可以例如使用在临治疗前来自人或动物受试者的样品(例如，血液或肠道样品)和测定微生物的数目(例如，每ml血液或肠道样品的细菌)来确定所述比率。然后可以根据使用样品的测定来算出待施用的病毒的量。

任选地，所述微生物是细菌。或者，所述微生物是古细菌。或者，所述微生物是病毒。或者，所述微生物是真菌。或者，所述微生物是藻类。或者，所述微生物是原生动物。

在一个实例中，所述受试者是人，且所述感染是医院感染。在一个实例中，所述受试者是植物、酵母、原生生物或变形虫。

任选地，所述受试者是人(例如，成人、儿童、新生儿、学步儿童、青少年、男性或女性)或动物(例如，狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、鲑鱼、鸡、火鸡、猪、伴侣动物或家畜动物)。

在一个实例中，所述受试者是人或动物，且：任选地，所述感染是肺部、腹部或尿路的感染。在一个实例中，所述受试者患有尿路感染、肺部感染，诸如肺炎、肾感染或腹部感染。在一个实例中，所述受试者是手术患者。在一个实例中，所述受试者是烧伤患者。在一个实例中，所述受试者具有感染的伤口(例如，细菌感染的伤口)。在一个实例中，所述患者患有AIDS或被HIV感染。在一个实例中，所述受试者患有癌症，诸如血液癌症，例如白血病，例如AML或CML或CLL或淋巴瘤。在一个实例中，所述受试者是组织或器官移植患者，例如造血干细胞移植或骨髓移植患者。在一个实例中，所述受试者具有尿路或静脉内导管。在一个实例中，所述受试者处于机械通气。在一个实例中，所述受试者已经在接受免疫抑制剂。在一个实例中，所述受试者患有肺炎。在一个实例中，所述受试者是重症监护室(ICU)患者。在一个实例中，所述受试者是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者。在一个实例中，所述受试者正患有脑膜炎、妊娠期的感染、胆囊破裂(胆囊破裂是其中胆囊渗漏或破裂的医学病况。破裂通常由胆囊的炎症引起)、伴有败血性休克的流产(伴有败血性休克的流产可能是一种急性的危及生命的疾病)、子宫内膜炎(子宫内膜炎是子宫的内衬的炎性病况，通常是由于感染引起)、急性呼吸窘迫综合征(急性呼吸窘迫综合征是一种肺部病况；其当液体充满肺部中的气囊时发生)或蜂窝组织炎。

使用免疫抑制药物的群体(更多人具有慢性疾病)的平均年龄的增加以及所进行的侵入性手术的数量的增加，已经导致败血症的发生率增加。任选地，所述受试者已经经历手术，使用免疫抑制剂药物治疗和/或患有慢性疾病。

任选地，所述受试者是超过60、65、70、75或80岁的人或者是儿科患者。在一个替代方案中，所述受试者是儿科患者(例如，人类婴儿或儿童)或青少年。在一个实例中，所述方法治疗或预防受试者中的新生儿败血症。在一个实例中，所述受试者是免疫受损的人或动物，例如患有急性病毒感染，诸如HIV感染；或所述受试者患有癌症，例如血液癌，诸如白血病；或者所述患者是移植患者，例如已经接受器官、组织或骨髓移植的患者。在一个实例中，所述受试者是革兰氏阴性细菌脂多糖或脂质A阳性的人或动物。在一个实例中，所述受试者是革兰氏阳性细菌细胞壁脂磷壁酸阳性的人或动物。

任选地，所述方法治疗或预防受试者中的败血病和/或败血症(例如败血性休克)。

SIRS(系统性炎性应答综合征)标准已经被用于定义败血症。

SIRS是以下中的两种或更多种的存在：异常的体温、心率、呼吸频率或血液气体以及白血细胞计数。败血症是例如响应于感染过程的SIRS。严重的败血症是例如具有败血症诱导的器官功能障碍或组织灌注不足(表现为低血压、乳酸升高或尿输出减少)的败血症。尽管施用静脉内流体，但败血性休克是例如严重的败血症加上持续性低血压。

在一个实施方案中，所述方法预防或延迟受试者中的终末器官功能障碍的进展(当所述受试者是人或动物时)。

终末器官功能障碍的实例包括以下：

• 肺：急性呼吸窘迫综合征(ARDS) (PaO

• 脑：脑病症状，包括烦乱、混乱、昏迷；原因可以包括局部缺血、出血、小血管中的血块形成、微脓肿、多灶性坏死性脑白质病

• 肝脏：由于不能合成凝血因子，蛋白合成功能的破坏急性地表现为血液凝结的进行性破坏，并且代谢功能的破坏导致胆红素代谢受损，导致未缀合的血清胆红素水平升高

• 肾脏：低尿输出或无尿输出，电解质异常或体积超负荷

• 心脏：收缩和舒张性心力衰竭，可能是由于抑制肌细胞功能的化学信号、细胞损伤导致，表现为肌钙蛋白渗漏(尽管本质上不一定是缺血性的)

在儿科中对于SIRS存在终末器官功能障碍的更具体定义

• 心血管功能障碍(在流体复苏后，具有至少40 ml/kg的类晶体)

• 低血压，其中血压为年龄的<第5百分位数或收缩血压为低于年龄正常值的<2个标准偏差，或

• 需要血管加压剂，或

• 以下标准中的两个：

• 原因不明的代谢性酸中毒，其中碱缺失> 5 mEq/l

• 乳酸性酸中毒：血清乳酸是正常上限的2倍

• 少尿(尿输出<0.5 ml/kg/h)

• 毛细血管再充盈延长> 5秒

• 核心与外周温差> 3℃

• 呼吸功能障碍(不存在紫绀性心脏病或已知的慢性肺病)

• 氧气的动脉分压与吸入的气体中的氧气分数的比率(PaO

• 二氧化碳的动脉分压(PaCO

• 需要大于FiO

• 神经功能障碍

• 格拉斯哥昏迷评分(GCS)≤11，或

• 具有发育迟缓/智力残疾的人中的精神状态发生改变，其中GCS下降3点或更多点

• 血液功能障碍

• 慢性血小板减少症患者中的血小板计数< 80,000/mm

• 国际归一化比率(INR)> 2

• 弥散性血管内凝血

• 肾功能障碍

• 具有慢性肾病的患者中的血清肌酐≥年龄正常值上限的2倍或基线肌酐增加2倍

• 肝功能障碍(仅适用于> 1个月的婴儿)

• 总血清胆红素≥4 mg/dl，或

• 丙氨酸氨基转移酶(ALT)≥正常上限的2倍

表2记载败血症的阳性诊断的标准。

任选地，所述方法减少患者中的选自以下的一种或多种症状：发热，体温低，呼吸急促，心律升高，混乱，混乱，代谢性酸中毒，呼吸性碱中毒，血压低，凝血功能障碍(诸如一个或多个器官中的血液凝结，或瘀伤)和挫伤。任选地，所述方法减少败血性休克。任选地，所述败血症是严重的败血症。

任选地，在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有＜36℃或＞38℃的温度；>90/min的心率，>20次呼吸/min的呼吸速率或PaCO

任选地，在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有以下中的两种或更多种的存在：体温异常、心率异常、呼吸速率异常、血液气体异常和白血细胞计数异常。

任选地，所述受试者是植物。在一个实例中，所述受试者是原生生物，例如变形虫。任选地，在该实例中，所述微生物是病毒(例如，大型或巨型病毒，例如，拟菌病毒)。所述核酸酶例如是Cas，并且可使用感染病毒微生物的病毒噬菌体递送的指导RNA进行编程。

在一个实例中，所述微生物是酵母，例如假丝酵母。

优选地，所述微生物是细菌。任选地，所述细菌是革兰氏阳性细菌。任选地，所述细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、军团菌、嗜血杆菌、

任选地，所述第一物种选自表1中的物种。

任选地，所述第一物种是肠出血性大肠杆菌(EHEC)、大肠杆菌血清型O157：H7或产生志贺毒素的大肠杆菌(STEC)。在一个实例中，所述细菌选自

● 产生志贺毒素的大肠杆菌(STEC)(STEC也可称为产生vero细胞毒素的大肠杆菌(VTEC)；

● 肠出血性大肠杆菌(EHEC) (这种致病型是新闻中最经常听到的与食物传播的暴发相关的致病型)；

● 产肠毒素大肠杆菌(ETEC)；

● 肠致病性大肠杆菌(EPEC)；

● 肠聚集性大肠杆菌(EAEC)；

● 肠侵入性大肠杆菌(EIEC)；和

● 弥散性附着的大肠杆菌(DAEC)。

肠出血性大肠杆菌(EHEC)血清型O157:H7是人病原体，其引起全世界的血性腹泻和溶血性尿毒综合征(HUS)的爆发。常规抗微生物剂触发EHEC中的SOS应答，其促进有效的志贺毒素的释放，所述志贺毒素造成与EHEC感染相关的大部分发病率和死亡率。牛是EHEC的天然储库，并且近似75%的EHEC爆发与食用受污染的牛来源的产品有关。EHEC在人中引起疾病，但在成年反刍动物中无症状。大肠杆菌血清型O157:H7 (EHEC)感染的特征包括腹部绞痛和血性腹泻，以及危及生命的并发症溶血性尿毒综合征(HUS)。目前，需要EHEC感染的治疗法(Goldwater和Bettelheim, 2012)。常规抗生素的使用加剧志贺毒素介导的细胞毒性。在由疾病控制与预防中心进行的一项流行病学研究中，针对EHEC肠炎用抗生素治疗的患者具有发展HUS的更高风险(Slutsker等人, 1998)。额外研究支持在EHEC感染中禁忌使用抗生素；针对与EHEC相关的出血性结肠炎接受抗生素疗法的儿童具有增加的发展HUS的机会(Wong等人, 2000; Zimmerhackl, 2000; Safdar等人, 2002; Tarr等人, 2005)。常规抗生素通过增强

在一个实例中，所述受试者(例如，人)正患有溶血性尿毒综合征(HUS)或处于溶血性尿毒综合征(HUS)的风险中，例如，所述受试者正患有大肠杆菌感染，诸如EHEC大肠杆菌感染。

本发明的一个方面提供了：用于在所述治疗方法中与本发明的核酸酶一起使用的多种病毒(例如，噬菌体或用于产生噬菌体的噬菌粒)，其中每种病毒包含本文所述的核酸的拷贝，其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

本发明的一个方面提供了：用于在治疗受试者的微生物感染的方法中与可编程核酸酶一起使用的多种病毒(例如，噬菌体或用于产生噬菌体的噬菌粒)，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；

其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；

其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

任选地，所述方法用于持久治疗，例如，如本文所述；和/或任选地，所述感染是急性感染。

任选地，所述方法用于快速治疗，例如，如本文所述；和/或任选地，所述感染是急性感染。

任选地，所述核酸酶根据本文本发明的任何核酸酶。任选地，所述核酸根据本文本发明的任何核酸。

任选地，所述核酸酶根据本文本发明的任何核酸酶。任选地，所述核酸根据本文本发明的任何核酸。

在一个替代方案中，当所述微生物是病毒时，所述多种病毒是能够感染携带微生物的宿主细胞的噬菌体，其中将所述核酸引入宿主细胞中用于在其中表达RNA。所述RNA与宿主细胞中的核酸酶复合，以指导所述核酸酶以切割所述微生物的靶标位点(即，切割病毒RNA或DNA)，由此使病毒微生物失活。例如，所述微生物是病毒(例如在变形虫中；或在人、动物或植物细胞中)，且所述多种病毒的病毒能够靶向所述微生物，由此所述核酸酶被编程以切割所述微生物(例如，在变形虫中或在所述细胞中)。

本发明的一个方面提供了：组合物，其包含用于在所述治疗方法中对本发明的核酸酶进行编程的多种核酸，其中每种核酸是如本文定义的核酸。

本发明的一个方面提供了：包含用于在治疗受试者的微生物感染的方法中对可编程核酸酶进行编程的多种核酸的组合物，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和所述核酸，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的微生物感染；其中每种核酸编码RNA用于在受试者中表达RNA，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

任选地，所述方法用于持久治疗，例如，如本文所述；和/或任选地，所述感染是急性感染。

任选地，所述方法用于快速治疗，例如，如本文所述；和/或任选地，所述感染是急性感染。

任选地，所述核酸酶根据本文本发明的任何核酸酶。任选地，每种核酸根据本文本发明的任何核酸。

任选地，所述组合物是包含所述核酸和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。任选地，所述组合物用于口服、静脉内、肺、直肠、局部、颊、眼、鼻内或皮下施用于人或动物受试者。任选地，所述组合物是除草剂或杀虫剂或杀昆虫剂或杀线虫剂或杀螨剂。任选地，所述组合物对酵母有毒。任选地，所述组合物对巨型病毒有毒。

本发明的一个方面提供了：包含用于治疗方法中的根据本发明的核酸酶的CRISPR/Cas系统，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9或本文提及的任何其他Cas)，且所述系统包含一个或多个指导RNA或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述微生物的基因组包含的靶标位点。

在一个实例中，本文提及的每个指导RNA是单一指导RNA(即，嵌合指导RNA)。在另一个实例中，每个指导RNA包含与tracrRNA杂交的crRNA。

在一个实例中，本文提及的靶标位点由所述细菌的必需基因、毒力基因或抗生素抗性基因包含。在一个实例中，本文提及的靶标位点由多拷贝序列(即，每个细菌基因组中以多于一个(例如，2、3、4、5、6、7、8或9或更多个)拷贝存在的序列)包含。例如，所述靶标位点由核糖体RNA基因包含。在一个实例中，本文提及的靶标位点由核糖体RNA基因(例如，23S核糖体RNA基因)、

任选地，本文的每个指导RNA能够与包含所述靶标位点的原间隔区序列杂交，其中所述原间隔区序列长度为15-45个核苷酸，例如长度为15-25；18-21；20；或约20个核苷酸。任选地，本文的每个指导RNA包含长度为15-45个核苷酸、例如长度为15-25；18-21；20；或约20个核苷酸的间隔区序列。

任选地，本文的每个指导RNA与5′-NGG原间隔区相邻基序(PAM)同源，例如，其中所述细菌是大肠杆菌。任选地，本文的每个指导RNA与5′-CCA或5′-CCT原间隔区相邻基序(PAM)同源，例如，其中所述细菌是艰难梭菌。

本发明的一个方面提供了：用于本发明的系统中的指导RNA或编码指导RNA的DNA，所述系统用于治疗受试者中的急性微生物感染、例如败血病或败血症的方法中。

本发明的一个方面提供了：包含指导RNA或DNA的核酸载体。

任选地，所述载体是噬菌体、噬菌粒、病毒噬菌体、病毒、质粒(例如，接合质粒)或转座子。以下实例显示使用接合质粒作为载体可以实现几乎完全的杀死。因此，在一个实施方案中，每种载体是从载体细菌、例如益生菌载体细菌递送用于施用于人或动物受试者的接合质粒。在一个实例中，所述载体细菌是乳杆菌(例如罗伊氏乳杆菌)或大肠杆菌。这在下面例举，并且实现完全(100%)杀死。

本发明的一个方面提供了：用于施用于人或动物以用于治疗败血症或败血病的抗败血症或抗败血病组合物，所述组合物包含多种载体，其中每种载体是本发明的载体。

本发明的一个方面提供了：治疗(例如，快速和/或持久地治疗)受试者的急性微生物感染的方法，其中所述方法如本文所定义。

本发明的一个方面提供了：治疗(例如，快速和/或持久地治疗)受试者的急性微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗(例如，快速和/或持久地治疗)所述受试者的急性微生物感染。

本发明的一个方面提供了：治疗(例如，快速和/或持久地治疗)受试者的急性微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和多种病毒，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗(例如，快速和/或持久地治疗)所述受试者的急性微生物感染；其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

任选地，所述核酸酶根据本文本发明的任何核酸酶。任选地，所述核酸根据本文本发明的任何核酸。

本发明的一个方面提供了：治疗(例如，快速和/或持久地治疗)受试者的急性微生物感染的方法，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶和多种核酸，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗(例如，快速和/或持久地治疗)所述受试者的急性微生物感染；其中每种病毒包含编码RNA用于在受试者中表达RNA的核酸的拷贝，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点；其中每种核酸编码RNA用于在受试者中表达RNA，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

任选地，所述核酸酶根据本文本发明的任何核酸酶。任选地，每种核酸根据本文本发明的任何核酸。

在一个实例中，所述方法用于医学或牙科和眼科用途(例如，用于在生物体中治疗或预防感染或在生物体中限制感染的传播)。

在一个实例中，所述方法用于美容用途(例如，用于美容产品，例如化妆品)或者用于卫生用途(例如用于卫生用品，例如肥皂)。

在一个实例中，所述载体和/或核酸酶在施用于所述受试者之前由组合物包含，所述组合物为以下中的任何一种(此处的宿主是指第一物种或菌株的微生物)：在一个实例中，所述组合物为医学、眼科、牙科或药物组合物(例如由抗宿主疫苗包含)。在一个实例中，所述组合物为抗微生物组合物，例如抗生素或抗病毒组合物，例如药物、消毒剂或漱口水。在一个实例中，所述组合物为美容组合物(例如面部或身体化妆组合物)。在一个实例中，所述组合物为除草剂。在一个实例中，所述组合物为杀虫剂(例如当宿主为芽孢杆菌属(例如苏云金芽孢杆菌)宿主时)。在一个实例中，所述组合物为饮料(例如啤酒、葡萄酒或酒精饮料)添加剂。在一个实例中，所述组合物为食品添加剂(例如其中宿主为大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属或梭菌属(例如肉毒梭菌)宿主)。在一个实例中，所述组合物为水添加剂。在一个实例中，所述组合物为用于水生动物环境(例如鱼缸中)的添加剂。在一个实例中，所述组合物为石油或石化工业组合物或者包含在这种组合物中(例如当宿主为硫酸盐还原细菌，例如脱硫弧菌属宿主时)。在一个实例中，所述组合物为石油或石油化工添加剂。在一个实例中，所述组合物为化学添加剂。在一个实例中，所述组合物为消毒剂(例如供人类或动物使用的消毒设备，例如用于手术或医疗用途，或者用于婴儿喂养)。在一个实例中，所述组合物为用于人类或动物使用的个人卫生组合物。在一个实例中，所述组合物为用于环境用途，例如用于土壤处理或环境净化(例如自污水，或自石油、石化产品或化学品，例如当宿主为硫酸盐还原细菌，例如脱硫弧菌属宿主时)的组合物。在一个实例中，所述组合物为植物生长刺激剂。在一个实例中，所述组合物为用于石油、石化产品、金属或矿物提取中的组合物。在一个实例中，所述组合物为织物处理或添加剂。在一个实例中，所述组合物为兽皮、皮革或仿麂皮处理或添加剂。在一个实例中，所述组合物为染料添加剂。在一个实例中，所述组合物为饮料(例如啤酒或葡萄酒)酿造或发酵添加剂(例如当宿主为乳酸杆菌属宿主时)。在一个实例中，所述组合物为纸张添加剂。在一个实例中，所述组合物为油墨添加剂。在一个实例中，所述组合物为胶添加剂。在一个实例中，所述组合物为抗人类、动物或植物寄生虫的组合物。在一个实例中，所述组合物为空气添加剂(例如用于空气调节设备中的空气或由空气调节设备产生的空气，例如其中宿主为军团菌属宿主)。在一个实例中，所述组合物为防冻添加剂(例如其中宿主为军团菌属宿主)。在一个实例中，所述组合物为洗眼液或眼科组合物(例如隐形眼镜液)。在一个实例中，组合物由乳制品包含(例如组合物在或为牛奶或奶制品；例如其中宿主为乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属或李斯特氏菌属宿主)。在一个实例中，所述组合物为或由家用或工业清洁产品包含(例如其中宿主为大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属或梭菌属(例如肉毒梭菌)宿主)。在一个实例中，所述组合物由燃料包含。在一个实例中，所述组合物由溶剂(例如水除外)包含。在一个实例中，所述组合物为烘焙添加剂(例如食品烘焙添加剂)。在一个实例中，所述组合物为实验室试剂(例如用于生物技术或者重组DNA或RNA技术)。在一个实例中，组合物由纤维沤麻剂包含。在一个实例中，组合物用于维生素合成工艺。在一个实例中，所述组合物为抗作物或植物的破坏成分(例如当宿主为腐生菌)。在一个实例中，所述组合物为防腐化合物，例如用于防止或减少金属腐蚀(例如当宿主为硫酸盐还原细菌，例如脱硫弧菌属宿主，例如用于减少或防止石油提取、处理或保存设备；金属提取、处理或保存设备；或者矿物提取、处理或保存设备的腐蚀时)。在一个实例中，所述组合物为农业或耕作组合物或者包含在这种组合物中。在一个实例中，所述组合物为青贮饲料添加剂。本发明提供了本文描述用于在该段落中描述的任何一种组合物中，或者用于在该段落中描述的任何一项用途中的CRISPR阵列、编码gRNA的核苷酸序列、一种或多种载体，例如其中宿主细胞为微生物细胞、细菌或古细菌细胞。本发明提供了用于在该段落中描述的任何一项应用的方法，其中所述方法包括组合本发明的CRISPR阵列、编码gRNA的核苷酸序列、一种或多种载体与宿主细胞(例如细菌或古细菌细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞不存在于人类(或人类胚胎)或动物体内或上。

本发明的任一方面例如用于工业或家庭用途，或者用于这样用途的方法中。例如，其用于农业、石油或石化工业、食品或饮料行业、服装行业、包装行业、电子行业、计算机行业、环境行业、化学工业、航空航天工业、汽车行业、生物技术行业、医疗行业、健康行业、牙科产业、能源产业、消费品产业、医药工业、采矿业、清洗业、林业、渔业、休闲业、回收业、化妆品业、塑胶工业、纸浆或造纸工业、纺织业、服装行业、皮革或仿麂皮或兽皮行业、烟草行业或钢铁行业，或用在其中。

本文的宿主细胞是指第一物种或菌株的微生物。任选地，本文的任何宿主细胞是细菌或古细菌细胞。在一个实例中，所述细胞处于固定相。在一个实例中，所述细胞处于指数相。在一个实例中，所述细胞处于延滞相。在一个实例中，所述细胞是野生型细胞或天然存在的细胞，例如，由天然存在的微生物组包含，例如，人、动物、植物、土壤、水、海洋、水路或环境的。在一个实例中，所述细胞是人工遗传修饰的。

在一个实例中，将本发明的多种载体引入多种所述宿主细胞中，其中所述宿主细胞由细菌群体包含，例如离体、体内或体外。在一个实例中，所述宿主细胞由微生物群群体包含，所述微生物群群体由生物体或环境(例如，水路微生物群、水微生物群、人或动物肠道微生物群、人或动物口腔微生物群、人或动物阴道微生物群、人或动物皮肤或毛发微生物群或人或动物腋窝微生物群)包含，所述群体包含与所述生物体或环境共栖或共生的第一细菌和包含所述宿主细胞的第二细菌，其中所述宿主细胞对所述生物体或环境有害(例如，致病)。在一个实施方案中，所述群体是离体的。在一个实例中，第一细菌亚群对第二细菌亚群的比率增加。在一个实例中，所述第一细菌是拟杆菌属(例如，脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌)细菌。任选地，拟杆菌属包含一种、两种、三种或更多种选自以下的拟杆菌物种：粪便拟杆菌、多毛拟杆菌、解纤维素拟杆菌、coprocola、嗜粪拟杆菌、coprosuis、狄氏拟杆菌、多雷拟杆菌、埃氏拟杆菌、faecis、finegoldii、fluxus、脆弱拟杆菌、肠道拟杆菌、产黑素拟杆菌、nordii、oleiciplenus、口腔拟杆菌、卵形拟杆菌、嗜果胶拟杆菌、蓝斑拟杆菌、粪便拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌和木糖降解拟杆菌。例如，所述拟杆菌属是多形拟杆菌或包含多形拟杆菌。例如，所述拟杆菌属是脆弱拟杆菌或包含脆弱拟杆菌。

在一个实例中，所述宿主、第一或第二细胞是在US20160333348、GB1609811.3、PCT/EP2017/063593和所有美国等同申请中公开的任何细菌物种。这些物种的公开内容(具体地包括PCT/EP2017/063593的表1)以其整体并入本文，并且用于可能在本文的一项或多项权利要求中包括其中的一种或多种公开内容。

在一个实例中，所述宿主细胞或细菌群体被用于人食用的饮料或水(例如，水路或饮用水)携带。在一个实例中，所述宿主细胞或所述群体由组合物(例如，药物(例如，细菌肠道移植物)、饮料、漱口水或食品)包含，所述组合物用于施用于人或非人动物以用于使肠道或其口腔微生物群形成群体和重新平衡(例如，其中所述药物的用途是治疗或预防人或动物中的疾病或病况)。在一个实例中，所述宿主细胞或所述群体在固体表面上或由生物膜(例如，肠道生物膜或工业设备上的生物膜)包含。在用于体外处理工业或医用流体、固体表面、装置或容器(例如用于食品、消费品、化妆品、个人健康护理产品、石油或石油生产)；或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品的本发明的一个实例中，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在其上。

在一个实例中，本发明提供了用于医学或营养用途的容器，其中所述容器包含用于所述方法中的载体。例如，所述容器为灭菌容器，例如，吸入器或连接至注射器或IV针头。

在一个实例中，所述载体或组合物通过粘膜、肠道、口腔、鼻内、直肠内、阴道内、眼或颊施用来用于施用(或施用)于人或非人动物受试者。

任选地，每种宿主细胞是人微生物群中发现的菌株或物种的，任选地其中所述宿主细胞与不同菌株或物种的细胞混合，其中不同细胞是肠杆菌科或人(例如，在人肠道中)益生菌的、共栖的或共生的细菌。在一个实例中，所述宿主细胞是大肠杆菌或沙门氏菌细胞。

本发明任选地用于改变细菌的混合群体中第一和第二细菌的亚群的相对比率，例如用于改变人或动物微生物组，诸如用于改变人的微生物群中的拟杆菌门(例如拟杆菌属，例如脆弱拟杆菌和/或多形拟杆菌)、厚壁菌门和/或革兰氏阳性或阴性细菌的比率。

在一个实例中，本发明的载体或组合物包含用于在宿主细胞中表达用于宿主细胞裂解的细胞内溶素的核苷酸序列，任选地其中细胞内溶素为噬菌体phi11、噬菌体Twort、噬菌体P68、噬菌体phiWMY或噬菌体K细胞内溶素(例如MV-L细胞内溶素或P-27/HP细胞内溶素)。

在一个实例中，所述靶标位点由每种微生物宿主细胞的染色体包含，例如，其中所述序列由宿主细胞的抗生素抗性基因、毒力基因或必需基因包含。一个实例提供了与抗生素药剂(例如，β-内酰胺抗生素)组合的本发明的载体，例如，其中所述载体靶向由抗生素抗性基因包含的原间隔区序列，所述抗生素抗性基因由宿主细胞基因组或附加体(例如，由宿主细胞包含的质粒)包含。在一个实例中，所述附加体是质粒、转座子、移动遗传元件或病毒序列(例如，噬菌体或原噬菌体序列)。

在一个实例中，靶标是染色体序列、内源性宿主细胞序列、野生型宿主细胞序列、非病毒性染色体宿主细胞序列、非内源性序列和/或非噬菌体序列(即这些中的一种多种或全部)，例如序列是野生型宿主染色体细胞序列，诸如作为由宿主细胞染色体包含的抗生素抗性基因或必需基因序列。在一个实例中，所述序列是宿主细胞质粒序列，例如抗生素抗性基因序列。

任选地，所述核酸酶是Cas，且所述靶标位点由原间隔区序列包含，其邻近NGG、NAG、NGA、NGC、NGGNG、NNGRRT或NNAGAAW原间隔区序列相邻基序(PAM)，例如，AAAGAAA或TAAGAAA PAM (这些序列被写成5'-3')。在一个实施方案中，PAM紧邻原间隔区序列的3'末端。在一个实例中，所述Cas是金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌或化脓性链球菌Cas。在一个实例中，所述Cas是Cpf1和/或所述PAM是TTN或CTA。任选地，所述Cas是I型(例如，I-A、I-B、I-C、I-D、I-E或I-F型) CRISPR系统Cas。任选地，所述Cas是II型CRISPR系统Cas。任选地，所述Cas是IIII型CRISPR系统Cas。任选地，所述Cas是IV型CRISPR系统Cas。任选地，所述Cas是V型CRISPR系统Cas。任选地，所述Cas是VI型CRISPR系统Cas。

任选地，所述核酸酶是Cas，且每种载体包含同源CRISPR阵列，所述同源CRISPR阵列包含多个拷贝的相同间隔区，用于靶向靶标位点。任选地，提供了本发明的一种或多种载体，其中所述载体包含所述gRNA编码序列的多个CRISPR阵列，用于宿主细胞原间隔区序列靶向，其中所述原间隔区包含靶标位点。任选地，所述或每种载体包含两个、三个或更多个拷贝的编码crRNA(例如，gRNA)的核酸序列，其中所述拷贝包含用于靶向宿主细胞靶标位点(例如，由毒力、抗性或必需基因序列包含的位点)的相同间隔区序列。

在一个实例中，至少两个靶标序列被Cas修饰，例如抗生素抗性基因和必需基因。以多重方式的多重靶向可用于减少逃逸突变宿主细胞的进化。

在一个实例中，Cas为野生型内源性宿主细胞Cas核酸酶。在一个实例中，通过dsDNA Cas核酸酶(例如，Cas9，例如，spCas9或saCas9)来实施靶标位点切割，由此通过非同源末端连接(NHEJ)来修复切割；或者，所述Cas是外切核酸酶或Cas3。

在一个实例中，所述阵列、gRNA编码序列或载体不与在细胞中与所述阵列或gRNA编码序列的重复序列一起天然发现的编码Cas内切核酸酶的序列组合。

可以从本发明的阵列或载体省略tracrRNA序列，例如对于不使用tracrRNA的类型的Cas系统，或者可以将内源tracrRNA与由载体编码的cRNA一起使用。

在一个实例中，宿主靶标位点由至少5、6、7、8、9、10、20、30或40个连续核苷酸包含。

在一个实例中，所述或每种载体包含对于微生物内crRNA或gRNA的转录为功能性的外源性启动子。

任选地，每种载体是质粒、粘粒、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或原噬菌体。例如，本发明提供了包含本发明的多种载体的多种噬菌体，例如，其中所述载体是相同的。在一个实例中，载体为病毒载体。病毒载体对外源性DNA插入具有特别有限的容量，因此需要考虑病毒包装容量。需要为编码重要病毒功能，诸如用于表达外壳蛋白和聚合酶的序列留出空间。在一个实例中，载体为噬菌体载体或AAV或慢病毒载体。在宿主为细菌细胞的情况下，噬菌体载体是有用的。在一个实例中，所述载体是能够感染古细菌宿主细胞的病毒。

任选地，载体组分由能够转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移的转座子包含。所述转座子可以是如US20160333348、GB1609811.3和所有美国等同申请中所述的转座子；这些的公开内容，包括这些特定的转座子公开内容，以其整体并入本文，并且用于可能在本文的一项或多项权利要求中包括其中的一种或多种公开内容。

在一个实例中，所述或每种载体由纳米颗粒提供或在脂质体中提供。

在一个实例中，所述或每种宿主细胞(或第一和/或第二细菌)是革兰氏阳性细胞。在一个实例中，所述或每种宿主细胞是肠杆菌科，例如沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、克雷伯氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、肠杆菌、沙雷氏菌或柠檬酸杆菌细胞。任选地，所述或每种细胞是大肠杆菌(例如，大肠杆菌K12)或沙门氏菌(例如，肠道沙门氏菌鼠伤寒血型变型)细胞。任选地，所述或每种宿主细胞(或第一和/或第二细菌)是革兰氏阴性细胞。

任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为支原体属、衣原体属、螺旋体属或结核分枝杆菌属。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为链球菌属(例如化脓性链球菌或嗜热链球菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为链球菌属(例如金黄色葡萄球菌，例如MRSA)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为大肠杆菌(例如O157: H7)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弧菌属(例如霍乱弧菌(例如O139)或创伤弧菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为奈瑟氏菌属(例如淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为博德特氏菌属(例如百日咳博德特氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为志贺氏菌属(例如痢疾杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为布鲁氏菌属(例如流产布鲁氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弗朗西斯氏菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为黄单孢菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为农杆菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为欧文氏菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为军团菌属(例如嗜肺军团菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为李斯特氏菌属(例如单核细胞增生李斯特氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弯曲菌属(例如空肠弯曲杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为耶尔森氏菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为疏螺旋体属(例如博氏疏螺旋体)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为螺杆菌属(例如幽门螺杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为梭菌属(例如艰难梭菌或肉毒梭菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为埃立克体属(例如查菲埃立克体)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌或肠道沙门氏菌，例如血清型鼠伤寒沙门氏菌，例如DT 104)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为衣原体属(例如衣原体肺炎)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为副衣原体属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为棒状杆菌属(例如无枝菌酸棒杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为肠球菌属(例如粪肠球菌或屎肠球菌，例如利奈唑胺耐药的)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为不动杆菌属(例如鲍曼不动杆菌，例如多重耐药的)宿主。

任选地，本发明用于减少环境(例如土壤，包含所述宿主细胞和酵母细胞的组合物)、人、动物或植物微生物组中的宿主细胞的生长或增殖。例如，当微生物组天然存在时，这是有用的。

任选地，所述核酸酶是Cas，且所述靶标由包含在宿主细胞的基因组中紧接同源PAM的3'的至少5、6、7、8、9或10个连续核苷酸的原间隔区序列包含，其中所述PAM选自AWG、AAG、AGG、GAG和ATG。

在某些配置中，本发明的使用核酸酶切割的快速和持久的微生物杀死以及生长或增殖抑制的观察可应用于除了人和动物以外的受试者中(例如，以治疗植物或酵母培养物)，或用于基底、诸如工业表面、流体和设备的离体或体外处理。因此，本发明进一步提供以下概念。本文上文和其他地方的本发明的本文中的任何其他特征、其配置、方面、实施方案、选项和实例加上必要变更可与这些概念组合(包括在本文的权利要求中提供特征的组合)。

一个概念提供了：本发明的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施如本文所定义的治疗方法的组合物中的用途，其中所述受试者是除了人或动物以外的生物体。

一个概念提供了：本发明的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施基底的微生物感染的离体或体外处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

在本文中，基底感染的处理可以意指对基底表面上和/或并入基底材料中的细菌群体(例如，一个或多个菌落)的处理。例如，该处理可以是杀死工业设备或装备(例如，医疗装备，诸如解剖刀或医疗装置或管道)表面上的细菌的处理。在另一个实例中，所述基底是流体(例如，液体或气体)，诸如流体形式的医用流体或石油产品(例如，油或烃流体或液体)。

一个概念提供了：可编程核酸酶在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

任选地，在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者或基底施用核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或对核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，其中T2是T1之后至少1小时。T1和T2可以如本文所定义。

任选地，到所述处理的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍。任选地，在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120分钟)。

任选地，在所述处理的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。

任选地，所述方法包括向所述受试者或基底施用RNA或编码RNA用于在所述受试者或基底中或上表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者或基底包含的微生物中的靶标位点。

任选地，将所述核酸酶与所述RNA或核酸同时或依次施用于所述受试者或基底。

任选地，在施用所述RNA或核酸之前，所述受试者或基底包含核酸酶。

任选地，将多种病毒(例如，噬菌体)施用于所述受试者或基底，其中每种病毒包含所述核酸的拷贝，其中所述病毒感染由所述受试者或基底包含的微生物以向其递送所述核酸。

任选地，施用的病毒：微生物的比率为10至150。

任选地，任选地到所述处理的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间。

任选地，到所述处理的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者或基底暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

任选地，所述受试者是植物；或其中所述基底是金属、塑料、混凝土、石材、木材、玻璃或陶瓷基底。任选地，受试者是流体(例如，液体或气体)。

任选地，所述微生物是细菌或古细菌。任选地，所述细菌是革兰氏阳性细菌。任选地，所述细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、军团菌、嗜血杆菌、

任选地，所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

参考WO2016177682，其讨论基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方面，并公开用于控制基底的MIC或生物污损的方法。该文件中公开的方法、核酸酶、阵列、RNA、载体和病毒可用于本发明中，例如用于实施本发明的方法或用途，并且WO2016177682中公开的这些部分以及基底和细菌的公开内容通过引用并入本文，用于潜在地提供可能用于本文的一项或多项权利要求中的特征的公开内容。

任选地，本发明的用途是用于控制工业或家用系统(例如，WO2016177682中公开的系统，其公开内容通过引用并入本文)中的基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损。在一个实例中，所述系统包含设备(例如用于工业过程)且表面为所述设备的表面。在一个实例中，生物污损包括微生物生物膜和/或污泥的形成、增殖或维持。在一个实例中，微生物为固着的。在一个实例中，“控制”包括防止、减少或消除所述MIC或生物污损，或者减少所述MIC或生物污损在系统中的扩散。细胞生长或增殖或维持为例如细胞活力的特征。因此，在一个实例中，所述方法减少微生物增殖和/或维持。

任选地，所述微生物被与所述基底接触的微生物生物膜包含。任选地，所述表面和宿主细胞与流体诸如水性液体(例如海水、淡水、储存水或饮用水)接触。

淡水为地球表面在冰原、冰盖、冰川、冰山、沼泽、池塘、湖泊、河流和溪流中以及地下作为含水层和伏流中的地下水天然存在的水。淡水通常特征为具有低浓度的溶解盐和其他完全溶解的固体。该术语具体地不包括海水和苦咸水，尽管其确实包括富含矿物质的水诸如铁质泉。在一个实例中，所述淡水为这些淡水类型中的任一种。饮用水为用于人或动物(例如牲畜)食用的水。在一个实例中，流体选自工业冷却水(其中系统为冷却系统)、污水(其中系统为污水处理或储存系统)、饮用水(其中系统为饮用水处理、储存、运输或输送系统)、造纸水(其中系统为纸张制造或加工系统)、游泳池水(其中系统为泳池或泳池水处理或储存系统)、灭火器用水(其中系统为灭火系统)、或者任何管道、槽、坑、池或通道中的工业过程用水。

任选地，所述用途用于控制储库或容器中流体的细菌恶化变质)，其中所述流体包含介导所述生物污损的第一微生物物种的第一宿主细胞群体，所述方法包括

(i) 使所述群体与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每种载体包含CRISPR阵列，由此CRISPR阵列被引入宿主细胞中，其中

(a) 每种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞内序列转录的启动子；和

(b) 每种crRNA能够与宿主细胞的靶标序列杂交，以指导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)以修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；所述靶标序列为介导宿主细胞活力的基因序列；且

其中所述方法包括允许所述cRNA在宿主细胞中在Cas存在的情况下进行表达，由此修饰宿主细胞内的靶标序列，导致宿主细胞活力减小并控制所述生物污损。

在一个实例中，流体为液体。在一个实例中，流体为气态流体。

实例系统选自：

石化产品回收、加工、储存或运输系统；烃类回收、加工、储存或运输系统；原油回收、加工、储存或运输系统；天然气回收、加工、储存或运输系统(例如油井、石油钻井平台、石油钻探设备、油品泵送系统、石油管道、天然气钻井平台、天然气开采设备、天然气泵送设备、天然气管道、油轮、气槽船、储油装备或储气装备)；水处理或储存设备、蓄水池(例如饮用水蓄水池)；空气或水调节(例如冷却或加热)设备，例如冷却液管、冷凝器或热交换器；医疗或手术设备、环境(例如土壤、水道或空气)处理设备、纸张制造或回收设备、发电厂例如火力或核能发电厂、燃料(例如烃类燃料，例如石油、柴油或LPG)储存设备；采矿或冶金、矿物或燃料回收系统例如矿山或采矿设备；工程系统、船舶设备、货物或货物储存设备(例如货物集装箱)；食品或饮料制造、加工或包装设备；清洗设备(例如洗衣设备，例如洗衣机或洗碗机)、餐饮(例如家庭或商业餐饮)设备、耕作设备、建筑(例如建筑、公用事业基础设施或道路施工)设备、航空设备、航空航天设备、运输设备(例如机动车辆(例如汽车、卡车或货车))、轨道车、航空器(例如飞机)或者海洋或水路交通车辆(例如船只或船舶，潜艇或气垫船))、包装设备例如消费品包装设备、或者食品或饮料包装设备、电子产品(例如计算机或移动电话或其电子元件)、或者电子产品制造或包装设备、牙科设备、工业或家用管道(例如海底管道)或储存容器(例如水槽或燃料箱(例如油箱，例如车辆油箱))、地下设备、建筑物(例如住宅或办公室或商业楼宇或工厂或发电站)、道路、桥梁、农业设备、工厂系统、原油或天然气勘探设备、办公室系统和家居系统。

在一个实例中，所述系统用于选自以下的工业或商业中：农业、石油或石化工业、食品或饮料行业、服装行业、包装行业、电子行业、计算机行业、环境行业、化学工业、航空航天工业、汽车行业、生物技术行业、医疗行业、健康行业、牙科产业、能源产业、消费品产业、医药工业、采矿业、清洗业、林业、渔业、休闲业、回收业、化妆品业、塑胶工业、纸浆或造纸工业、纺织业、服装行业、皮革或仿麂皮或兽皮行业、烟草行业或钢铁行业。在一个实例中，待处理的表面或流体为用于所述所选择的行业中的设备的表面或流体。在一个实例中，系统用于原油工业中。在一个实例中，系统用于天然气工业中。在一个实例中，系统用于石油工业中。在一个实例中，所述系统为海运集装箱、平台或钻井平台(例如用于海上或海上的石油或天然气平台或钻井平台)、船舶或船只。在一个实施方案中，这样的系统锚定在海上，例如非暂时性锚定在海上，例如已经在海上锚定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个月(例如连续几个月)。在一个实施方案中，这样的系统处于国家或州的水域中，例如非暂时性地在这样水域的海水中，例如已经处于所述国家的水域中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个月(例如连续几个月)。

在一个实例中，待处理的基底表面包括不锈钢、碳钢、铜、镍、黄铜、铝、混凝土、塑料或木材。在一个实例中，基底为金属焊接或连接。在一个实例中，表面为金属(例如钢或铁)或非金属(例如塑料、混凝土、沥青、木材、橡胶或石料)表面。在一个实例中，金属为合金(例如不锈钢、黄铜或者镍、锌、铜、镍或铝合金)。在一个实例中，表面为人造聚合物表面。在一个实例中，表面为基底涂层。在一个实例中，基底与土壤、淡水或海水接触。

在一个实例中，所述流体为饮用水、水道、苦咸水；或者液体燃料例如汽油或柴油(例如用于小汽车或机动车辆)、LPG、煤油、醇(例如乙醇、甲醇或丁醇)、液体氢或液态氨)，在一个实例中，所述燃料为储存的液体燃料。在一个实例中，所述流体为油或非水性流体。在一个实例中，所述流体为由水道或水体例如海水、淡水、饮用水、河流、溪流、池塘、湖泊、蓄水池、储存水(例如储水槽或冷却设备)、地下水、井水、岩层中的水、土壤水或雨水包含的流体。在一个实例中，所述流体为海水。在一个实例中，所述基底与该段落中提及的液体接触。在一个实例中，所述流体或液体选自油、水溶液、水力压裂液、燃料、二氧化碳、天然气、油/水混合物、燃料/水混合物、含盐的水、海洋或海水、苦咸水、淡水来源、湖泊、河流、溪流、沼泽、池塘、沼泽地、来自冰雪融化的径流、泉水、地下水、地下蓄水层、降水、在环境温度下(例如在室温下)为液体并为疏水性的但是可溶于有机溶剂的任何物质、己烷类、苯、甲苯、氯仿、乙醚、植物油类、石化油类、原油、精炼石化产品、挥发性精油、化石燃料、汽油、烃类混合物、喷气式飞机燃料、火箭燃料、生物燃料。在一个实例中，流体为油/水混合物。

如本文所用的术语“微生物影响的腐蚀”或“MIC”，除非另外指明，是指其中系统的任何元件(基底)由于微生物群体例如细菌或古细菌群体中至少一个成员的作用而结构上受到危害的过程。如本文所用的术语“生物污损”，除非另外指明，是指其中微生物(诸如细菌和/或古细菌)在与流体(例如水或水性液体、或烃类、或石油化学品)接触的基底表面上积累的过程。也包括流体(例如水或水性液体、或烃类、或石油化学品)中微生物(诸如细菌和/或古细菌)不期望的积累与增殖，即流体的“恶化变质”。在一个实例中，细菌由船舶或船只压载水包含，并且细菌为环境上不期望的。如本文所用的术语“基底”是指上面可附着细胞并可形成和生长生物膜或者上面可发生生物污损(例如形成粘液或淤泥)的任何类型表面。基底可为“工业”基底诸如石化、燃料、原油或天然气管道系统的设备表面，或者“非工业”(例如家庭，例如家居或办公室)基底诸如厨房台面或淋浴器基底或花园基底。

在一个替代方案中，代替宿主细菌细胞的群体，所述群体为第一物种的古细菌细胞的群体。

任选地，其中所述液体为水性液体(例如海水、淡水、储存水或饮用水)。

在一个替代方案中，相反所述微生物为藻类细胞。

任选地，所述微生物为硫酸盐还原细菌(SRB)细胞(例如脱硫弧菌属或脱硫肠状菌属细胞)。在一个实例中，所述细胞选自致黑脱硫肠状菌、地下脱硫状菌、运动热脱硫杆菌、

任选地，所述表面或流体由原油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备包含。原油为世界上最重要的能源资源之一。其用作许多行业(包括炼油-石化行业)的原材料，其中原油通过各种工艺流程精炼成消费品诸如汽油、油类、石蜡油、润滑剂、沥青、家用燃油、凡士林和聚合物。石油衍生产品也常用于许多其他化学过程。在一个替代方案中，所述流体为所述消费品或者表面与这样的消费品接触。

任选地，所述表面与海水、压裂液或井中液体接触；或者其中所述流体为海水、压裂液或井中液体。

任选地，所述方法的步骤(i)包括提供第二物种的微生物细胞的群体(第二宿主细胞)，第二细胞包含所述载体，其中所述载体能够从第二宿主细胞中转移至第一宿主细胞；并使第二宿主细胞与第一宿主细胞组合，由此将载体引入第一宿主细胞中。在一个实例中，第二细胞在环境(例如在水或土壤环境)中为环境、工业或家庭可接受的，并且第一宿主细胞为环境中不可接受的。

任选地，第一宿主细胞在与所述载体接触之前由微生物细胞的混合物包含(例如由微生物生物膜包含)，其中所述混合物包含所述第二物种的细胞。

任选地，所述第二物种为芽胞杆菌属或硝酸盐还原细菌或硝酸盐还原-硫化物氧化细菌(NRB)的物种。

任选地，NRB选自弯曲杆菌属物种、硝化菌属物种、亚硝化单胞菌属物种、硫微螺菌属物种、硫磺单胞菌属物种、陶厄氏菌属物种、副球菌属物种、假单胞菌属物种、红细菌属物种和脱硫弧菌属物种；或者包含所述物种中的至少两种。

任选地，NRB选自普通消化杆菌、欧洲亚硝化单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌、脱氮副球菌、

任选地，所述方法包括使所述第一物种的宿主细胞同时或依次与生物杀灭剂、同时或依次与所述载体接触。在一个实例中，提供所述载体和生物杀灭剂，其在与宿主细胞接触的组合物中预混合。

任选地，所述生物杀灭剂选自四羟甲基硫酸鏻(THPS)、戊二醛、一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钙、次氯酸钾、次氯酸钠、二溴氰基乙酰胺(DBNPA)、二硫氰基甲烷(MBT)、2-(氰硫基甲基硫代)苯并噻唑(TCMTB)、布罗波尔、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇(BNPD)、三丁基十四烷基氯化鏻(TTPC)、牛磺酰胺及其衍生物、酚类、季铵盐类、含氯物质、喹醛啶盐类、内酯类、有机染料、缩氨基硫脲类、醌类、氨基甲酸酯类、脲、水杨酰胺、对称二苯脲、胍(guanide)、脒类、咪唑啉类、乙酸、苯甲酸、山梨酸、丙酸、硼酸、无水醋酸、亚硫酸、香草酸、对-羟基苯甲酸酯类、异丙醇、丙二醇、苄醇、氯丁醇、苯乙醇、甲醛、碘及其溶液、聚维酮碘、六亚甲基四胺、羟甲基甲硫脲、1- (3-氯烯丙基)-3,5,7-三偶氮(triazo)-1-氮鎓金刚烷氯化物、滔罗定、滔罗胺、N-(5- 硝基-2-呋喃甲叉)-1-氨基-乙内酰脲、5-硝基-2-糠醛缩氨基脲、3,4,4’-三氯二苯脲、3,4’,5-三溴水杨酰苯胺、3-三氟甲基-4,4’-二氯对称二苯脲、8-羟基喹啉、l-环丙基-6-氟-l,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸、1,4-二氢-1-乙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸、过氧化氢、过乙酸、氧氯苯磺酸钠、对氯间二甲苯酚、2,4,4’-三氯-2’-羟基联苯酚、麝香草酚、双氯苯双胍己烷、苯扎氯铵、西吡氯铵、磺胺嘧啶银、硝酸银、溴、臭氧、异噻唑啉酮、聚氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)亚乙基二氯化物、2-(叔丁基氨基)-4-氯-6-乙基氨基-5’-三嗪(特丁津)及其组合。在一个实例中，所述生物杀灭剂为四羟甲基硫酸鏻(THPS)。在一个实例中，所述生物杀灭剂为季铵化合物。

任选地，所述系统用于选自以下的行业操作中：采矿、航运；原油、天然气或石化产品的回收或加工；水力压裂、空气或水加热或冷却；饮用水生产、储存或输送；烃类的运输以及废水处理。

任选地，所述表面为在所述选择的行业中使用的设备表面，或者其中流体为由所述选择的行业中使用的设备包含的流体。

任选地，所述表面为厨房、洗浴或园艺设备的表面，或者其中流体由厨房、洗浴或园艺设备包含。例如，所述设备用于家庭环境。

任选地，流体为容器(例如水槽或瓶)中含有的适于饮用的流体并且表面为与流体接触的容器表面。

任选地，每种载体包含可动遗传元件(MGE)，其中MGE包含转移起点(

任选地，所述第一和另外的宿主细胞由与所述表面接触的流体生物膜包含；或者其中所述细胞由所述流体包含。

任选地，每种MGE为或包含整合性接合元件(ICE)；或者其中每种载体为能够感染所述第一物种的宿主细胞的噬菌体，并且每种MGE为能够在细胞之间进行所述转移的噬菌体核酸。任选地，每种ICE为转座子，例如接合转座子。任选地，每种载体为任选地包含如本文所述的MGE的质粒。任选地，所述序列由第一细胞和/或另外细胞的接合转座子包含。

在一个实例中，所述方法是控制由原油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备(例如原油油轮、石油钻井平台或石油钻探设备)包含的基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法，其中基底的表面与第一宿主细胞的群体接触，其中第一宿主细胞为介导基底的MIC或生物污损的第一物种的硫或硫酸盐还原细菌(SRB)、胞外聚合物产生细菌(EPSB)、产酸细菌(APB)、硫或硫化物氧化细菌(SOB)、铁氧化细菌(IOB)、锰氧化细菌(MOB)、产氨细菌(AmPB)或产乙酸细菌(AcPB)，其中表面和细胞群体与选自海水、淡水、压裂液或井(例如石油或天然气井)中液体的液体接触，所述方法包括

(i) 通过混合液体与多种能够转化或转导第一宿主细胞的载体，使细胞群体与载体接触，每种载体包含CRISPR阵列，由此CRISPR阵列被引入宿主细胞中，其中

(a) 每种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞中序列转录的启动子；

(b) 每种crRNA能够与宿主细胞的靶标序列杂交，以指导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9或Cfp1)以修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；所述靶标序列为用于介导宿主细胞活力的基因序列；

(c) 其中每种(a)的序列包含用于在第一宿主细胞中表达和产生相应crRNA的序列R1-S1-R1’，其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，且R1或R1’为任选的；且S1为第一CRISPR间隔区，其包含与所述第一宿主细胞的靶标序列具有70、75、80、85、90或95%或更多同一性的核苷酸序列或由其组成；和

(ii) 允许所述cRNA在宿主细胞中在Cas存在的情况下进行表达，由此在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞活力减小并控制所述基底的MIC或生物污损。在一个实施方案中，存在R1和R1’两者。

在一个实施方案中，所述方法是控制船舶或船只的压载水的细菌生物污损的方法，其中所述水包含介导所述生物污损的第一微生物物种的第一宿主细胞的群体，所述方法包括

(i) 使所述群体与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每种载体包含CRISPR阵列，由此CRISPR阵列被引入宿主细胞中，其中

(a) 每种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于宿主细胞内序列转录的启动子；和

(b) 每种crRNA能够与宿主细胞的靶标序列杂交，以指导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)以修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；所述靶标序列为用于介导宿主细胞活力的基因序列；和

(ii) 允许所述cRNA在宿主细胞中在Cas存在的情况下进行表达，由此在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞活力减小并控制所述生物污损。

任选地，所述第一宿主细胞为霍乱弧菌、大肠杆菌或肠球菌物种细胞。任选地，步骤(i)包括例如在船舶或船只的船体中混合压载水与载体。任选地，船舶或船只为海上运输工具且水为海水。任选地，不是船舶或船只，压载水由集装箱或海上钻井平台，例如石油平台或石油钻井平台包含。在一个实例中，船舶、船只、集装箱、平台或钻井平台锚定在海上(即暂时不在其位置上)。

在一个实例中，所述方法是从船舶或船只排放压载水的方法，其中排放的压载水包含通过所述方法处理的水。任选地，水被排入水体例如海、海洋或水道(例如河流、运河、湖泊或水库)或者排入集装箱中。

本发明提供以下段落，其由以下实施例支持：-

1. 用于治疗受试者的大肠杆菌或艰难梭菌感染的方法中的可编程Cas (例如，Cas3或Cas9)核酸酶，其中所述Cas核酸酶可用指导RNA 编程，以切割由已经感染所述受试者的大肠杆菌或艰难梭菌细菌的基因组包含的靶标位点，由此杀死大肠杆菌或艰难梭菌细胞，或减少所述细胞的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述Cas核酸酶，其中所述核酸酶用指导RNA编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的大肠杆菌或艰难梭菌细菌的基因组，且到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述受试者的感染减少至少100倍。

2. 用于治疗受试者的大肠杆菌或艰难梭菌感染的方法中的可编程Cas (例如，Cas3或Cas9)核酸酶(任选地根据段落1)，其中所述Cas核酸酶可用指导RNA 编程，以切割由已经感染所述受试者的大肠杆菌或艰难梭菌细菌的基因组包含的靶标位点，由此杀死大肠杆菌或艰难梭菌细胞，或减少所述细胞的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述Cas核酸酶，其中所述核酸酶用指导RNA编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的大肠杆菌或艰难梭菌细菌的基因组，且减少所述受试者的感染，其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

3. 任一前述段落的核酸酶，其中到将所述受试者暴露于所述编程的核酸酶后60分钟，减少至少60%的感染。

4. 任一前述段落的核酸酶，其中在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者施用所述核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或编码所述指导RNA的核酸，其中T2是T1之后至少1小时。

5. 任一前述段落的核酸酶，其中所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。

6. 任一前述段落的核酸酶，其中所述方法包括向所述受试者施用RNA或编码RNA用于在所述受试者中表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

7. 任一前述段落的核酸酶，其中将所述核酸酶与RNA或编码RNA的核酸同时或依次施用于所述受试者。

8. 段落7的核酸酶，其中在向所述受试者施用所述RNA或核酸之前，所述受试者包含核酸酶。

9. 任一前述段落的核酸酶，其中将多种病毒(例如，噬菌体)施用于所述受试者，其中每种病毒包含编码RNA的核酸的拷贝，其中所述病毒感染由所述受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

10. 段落9的核酸酶，其中施用的病毒：由所述受试者包含的微生物的比率为10至150。

11. 根据任一前述段落的核酸酶，其中所述受试者是人或动物，任选地其中所述受试者是超过65岁的人或者是儿科患者。

12. 根据段落11所述的核酸酶，其中所述感染是肺部、腹部或尿路的感染；或其中所述受试者已经经历手术，正进行免疫抑制剂药物治疗和/或正患有慢性疾病。

13. 根据任一前述段落的核酸酶，其中任选地到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间。

14. 根据任一前述段落的核酸酶，其中所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

15. 根据段落11至14中任一项的核酸酶，其中所述方法治疗或预防所述受试者中的败血病和/或败血症(例如，败血性休克)。

16. 段落16的核酸酶，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有＜36℃或＞38℃的温度；>90/min的心率，>20次呼吸/min的呼吸速率或PaCO

17. 段落15或16的核酸酶，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有以下中的两种或更多种的存在：体温异常、心率异常、呼吸速率异常、血液气体异常和白血细胞计数异常。

18. 任一前述段落的核酸酶，其中所述受试者是人或动物，且所述微生物是细菌(例如，大肠杆菌或艰难梭菌)，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述细菌对所述受试者的血液感染减少至少100或1000倍。

19. 段落11至18中任一项的核酸酶，其中在临治疗前，所述受试者的血液被10

20. 根据段落1至10中任一项的核酸酶，其中所述受试者是植物。

21. 根据任一前述段落的核酸酶，其中所述细菌由微生物组包含。

22. 根据段落21的核酸酶，其中所述微生物组包含乳杆菌和/或链球菌细菌。

23. 根据任一前述段落的核酸酶，其中所述大肠杆菌是EHEC大肠杆菌。

24. 根据任一前述段落的核酸酶，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

25. 用于在所述治疗方法中与任一前述段落的核酸酶一起使用的多种病毒(例如，噬菌体或用于产生噬菌体的噬菌粒)，其中每种病毒包含编码RNA的核酸的拷贝，其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

26. 组合物，其包含用于在所述治疗方法中对段落1至24中任一项的核酸酶进行编程的多种核酸，其中每种核酸是如段落6至9中任一项中所定义的核酸。

27. CRISPR/Cas系统，其包含用于治疗方法中的根据任一前述段落的核酸酶，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)，且所述系统包含一个或多个指导RNA或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述微生物的基因组包含的靶标位点。

28. 用于段落27的系统中的指导RNA或编码指导RNA的DNA，其用于治疗所述受试者中的急性微生物感染、例如败血病或败血症的方法中。

29. 包含段落27或28中所述的指导RNA或DNA的核酸载体。

30. 段落29的载体，其中所述载体是噬菌体、噬菌粒、病毒噬菌体、病毒、质粒(例如，接合质粒)或转座子。

31. 用于施用于人或动物以用于治疗败血症或败血病的抗败血症或抗败血病组合物，所述组合物包含多种载体，其中每种载体都根据段落29或30。

32. 治疗受试者的急性微生物感染的方法，其中所述方法如任一前述段落所定义。

33. 段落1至25和27至30中任一项的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施如任一前述段落所定义的治疗方法的组合物中的用途，其中所述受试者是除了人或动物以外的生物体。

34. 段落1至25和27至30中任一项的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

35. 可编程核酸酶在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

36. 段落33、34、35的用途，其中在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者或基底施用核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或对核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，其中T2是T1之后至少1小时。

37. 段落33至36中任一项的用途，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍。

38. 段落33至37中任一项的用途，其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120分钟)。

39. 段落33至38中任一项的用途，其中在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。

40. 段落33至39中任一项的用途，其中所述方法包括向所述受试者或基底施用RNA或编码RNA用于在所述受试者或基底中或上表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者或基底包含的微生物中的靶标位点。

41. 段落40的用途，其中将所述核酸酶与所述RNA或核酸同时或依次施用于所述受试者或基底。

42. 段落40的用途，其中所述受试者或基底在施用所述RNA或核酸之前包含核酸酶。

43. 段落40至42中任一项的用途，其中将多种病毒(例如，噬菌体)施用于所述受试者或基底，其中每种病毒包含所述核酸的拷贝，其中所述病毒感染由所述受试者或基底包含的微生物以向其递送所述核酸。

44. 段落43的用途，其中施用的病毒：微生物的比率为10至150。

45. 段落33至44中任一项的用途，其中任选地到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间。

46. 段落44至45中任一项的用途，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者或基底暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

47. 段落33至46中任一项的用途，其中所述受试者是植物；或其中所述基底是金属、塑料、混凝土、石材、木材、玻璃或陶瓷基底。

48. 段落33至47中任一项的用途，其中所述微生物是细菌。

49. 根据段落48的用途，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。

50. 根据段落48或49的用途，其中所述细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、军团菌、嗜血杆菌、

51. 段落33至50中任一项的用途，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

感染性并发症是癌症患者、尤其是具有潜在血液系统恶性肿瘤(其中尸检研究表明近似60%的死亡是感染相关的)的那些中的发病率和死亡率的严重原因。尽管关于具有实体器官肿瘤的患者中的感染死亡率的数据较少，但据估计，这些患者中的近似50%以感染作为死亡的主要或相关的原因(“Epidemiology of Infections in Cancer Patients”, in“Infectious Complications in Cancer Patients”, Springer InternationalPublishing Switzerland (2014))。细菌感染占主导。这些感染并发症仍然是癌症治疗方式的重大限制。

已经在免疫检查点抑制剂(ICI)治疗的癌症患者中表明用广谱抗生素的经典抗生素治疗的有害作用。Routy等人研究肠道微生物组如何影响针对上皮肿瘤的基于PD-1的免疫疗法的效力(Routy等人Science 2018, 359, 91–97)。在这项工作中，作者还分析在一种或几种先前的疗法后接受针对PD-1/PD-L1相互作用的抗体ICI的具有晚期NSCLC(n =140)、肾细胞癌(n = 67)或尿路上皮癌(n = 42)的患者中的感染/抗生素使用的数据集。在这些患者中，在第一次施用PD-1/PD-L1 mAb之前2个月内或之后1个月内向他们开出广谱抗生素(β-内酰胺+/-抑制剂、氟喹诺酮或大环内酯)的处方。患者通常对于常见指征(牙齿、泌尿和肺部感染)口服抗生素。观察到经典的广谱抗生素治疗经历ICI疗法的癌症患者中的感染的有害作用。参见图8，其显示ICI疗法期间的抗生素治疗具有致命的后果：在抗生素治疗不存在的情况下，中间总体存活期为21.9个月，相比之下，在抗生素治疗的情况下，总体存活期为9.8个月。因此，用经典抗生素治疗的患者中的中值总体存活期为未接受抗生素治疗的患者的中值总体存活期的<50%(或短>12个月)。

Gopalakrishnan等人的工作是另一个近来的实例，其支持“健康”微生物组在免疫-肿瘤疗法结果中的重要性(Gopalakrishnan等人,

几项其他研究为微生物组和免疫-肿瘤学结果之间的关键联系增加了扩展的证据基础：

· “Microbiota: a key orchestrator of cancer therapy”, Nat. Rev. Cancer2017, 17, 271-285

· Matson等人, Science 2018, 359, 104–108

· L. Derosa等人 Annals of Oncology 2018 (epub 30 March 2018)

· M. Vétizou等人 Science. 2015, 350, 1079-84

· Sivan等人 Science 2015, 350, 1084-1089。

另一份报告 - 声称是接受用于癌症疗法的免疫检查点阻断的患者中的感染的第一篇系统综述 – 研究用免疫检查点抑制剂(针对CTLA-4、PD-1和/或PD-L1)治疗的黑色素瘤患者中的严重感染(M. Del Castillo等人 Clin. Infect. Dis. 2016, 63, 1490-1493)。严重感染被定义为需要住院治疗或肠胃外抗微生物剂的感染。在740个患者(898个免疫检查点阻断的疗程)中，在54个患者(7.3%)中发展严重感染。9个患者(17%)被认为死于感染。感染的总数为58，因为一些患者发展>1例感染。大部分感染是细菌来源的(~80%；即，细菌感染：患者的7.3%：5.8%，80%)。肺炎和血流感染是两种占优势的细菌感染类型。

免疫检查点阻断药物与和免疫系统上调相关的免疫相关的不良作用(irAE)相关。用免疫抑制药物、诸如类固醇管控并发症(免疫抑制是随后机会性感染的危险因素)。在740个患者中，46%在治疗过程期间接受类固醇。在接受皮质类固醇或英夫利昔单抗的群组中，严重感染的风险为13.5%(相比之下，总体群体中为7.3%)。

在又另一个报告中，研究接受ICI疗法的肺癌患者中的感染性疾病的新出现担忧。在接受尼沃单抗(PD-1抑制剂)的84个NSCLC患者中，20个患者(23.8%)发展感染性疾病。细菌感染占感染的75%；即18%的患者中存在感染细菌。细菌感染最常见的类型是肺炎。参见K.Fujita等人 Eur. Resp. J. 2017, 50, OA1478。

革兰氏阴性杆菌大肠杆菌是具有癌症的患者中的菌血症的最常见原因之一。该病原体的全因30天死亡率高(~15%) (Y. E. Ha等人 Int. J. Antimicr. Agen. 2013, 42,403– 409)。公开的大肠杆菌菌血症患者(癌症/非癌症)中的30天全因死亡率的估计值从约10%至35%变化(J. K. Abernethy等人 Clin. Microbiol. Infect. 2015, 21, 251.e1–251.e8)，清楚地突出了仅与此病原体相关的高负担。总体而言，菌血症中的病因病原体主要是革兰氏阴性细菌(65%)，其中大肠杆菌(18.3%)、铜绿假单胞菌(18.3%)和肺炎克雷伯氏菌(17.3%)是遇到的最常见的生物体；根据研究癌症患者中的>100例菌血症病例的研究，三种病原体一起占菌血症病例的54%，或革兰氏阴性病例的85% (G. Samonis等人 SupportCare Cancer 2013, 21, 2521–2526)。在这项研究中，入院死亡率为26.2%。可以在其他地方找到相当的数字。例如，具有血流感染的中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的成人癌症患者的研究研究了344个癌症患者中的399例血流感染：最大的病因病原体组是革兰氏阴性杆菌(45%)。在临床分离株中，大肠杆菌(35%)占革兰氏阴性菌内的大多数病例，随后为肺炎克雷伯氏菌(20%)和铜绿假单胞菌(19%)(E. Velasco等人 Eur. J. Clin. Microbiol.Infect. Dis. 2006, 25, 1–7)。三种病原体总共占菌血症病例的33%(或革兰氏阴性病例的74%)。在这项研究中，总体30天死亡率为32%。两份其他报告查看具有实体瘤的患者中的血流感染的病因病原体，并且还发现革兰氏阴性细菌是占优势的病原体类型(在几百个患者中，感染的47-55%)(M. Marín等人 Medicine 2014, 93, 143-149; M. Anatoliotaki等人 Infection 2004, 32, 65-71; 还参见C. Gudiol等人 Virulence 2016, 7, 298-308)。在两项研究中的较大者中(单独的病原体的数目更稳健)，革兰氏阴性组内的三种主要病原体再次为大肠杆菌(55%)、铜绿假单胞菌(18%)和克雷伯氏菌属物种(11%) – 对应于革兰氏阴性病例的92%，或研究的血流感染的528例总病例的51%。

以上关于癌症患者中的特定病因感染病原体的数据概述于下表5中。

因此，关于癌症中的血液感染的可用数据表明，革兰氏阴性病原体参与45-65%的感染病例，其中三种主要病原体 - 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌 – 是绝大多数革兰氏阴性病例中的罪魁祸首(73-92%)。

因此，发明人提出了肿瘤学家的两难困境：

• 癌症疗法的效力降低可能是由于由抗生素疗法导致的微生物组多样性降低

• 至少1/3的使用检查点抑制剂的患者得到严重且威胁生命的感染

• 不治疗这些感染可能导致死于感染(1-2周)

• 用经典抗生素治疗导致4年后无进展存活率从>40%降低至约10%

• 选择是在严重破坏癌症疗法的风险的情况下，处理潜在的致命感染(其必须解决)的立即需求。

因此，发明人意识到，需要可以以使对癌症疗法的损害最小化的不同方式来治疗细菌性致病性感染的方法。发明人意识到，这种需求在其中微生物组组合物可以调节疗法结果的其他治疗环境中、例如在移植环境中也将是有用的。

尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但发明人相信，在一些实施方案中，使用本发明减轻传统抗生素疗法对ICI患者中的总体存活期的有害影响可以转化为总体存活期的多达两倍(或>12个月)。在中值总体存活期方面，获得几个月的治疗效果是该领域中非常显著的成就。实际上，这种数量级的效果大小可与对于ICI试验报告的结果相当(即，其中通常以几个月而不是几年来测量益处)。此外，预计PD-1/PD-L1药物将主导ICI市场。在2023年，预计PD-1/PD-L1占$ 46B USD全球ICI销售额的94%(CTLA-4阻断剂仅占6%)，来源：“Landscape & Forecast: Immune Checkpoint Inhibitors”, Decision Resources,December 2017。因此，对于改进使用PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂的治疗的需求在医学上尤其迫切，并且我们相信本发明在这方面有特别的益处。

在一个实例中，该方法消除施用经典抗生素、诸如广谱抗生素(或本文公开的任何其他抗生素)的需求。在另一个实例中，本发明降低施用于受试者用于治疗感染的经典抗生素、诸如广谱抗生素(或本文公开的任何其他抗生素)的量或给药频率。例如，在使用指导的核酸酶切割且因此治疗在这种环境下的感染的同时，可以向所述受试者施用低剂量的广谱抗生素(例如，常规剂量的50%、40%、30%、20%、10%或更少)。本发明对于使用免疫抑制剂的患者特别有益，例如对于癌症患者、移植患者或患有病毒感染(例如，HIV(人免疫缺陷病毒)、CMV(巨细胞病毒)或RSV(呼吸道合胞病毒)感染)的患者。

术语“广谱抗生素”可以指作用于两种主要细菌组(革兰氏阳性和革兰氏阴性)的抗生素，或针对广泛范围的引起疾病的细菌起作用的任何抗生素。当怀疑细菌感染、但细菌组未知(也称为经验疗法)时或当怀疑被多组细菌感染时，使用这些药物。尽管强大，但广谱抗生素造成特定的风险，尤其是天然、正常细菌的破坏以及抗微生物剂抗性的发展。常用的广谱抗生素的实例是：氨基糖苷(除了链霉素)，氨苄青霉素，阿莫西林，阿莫西林，克拉维酸(奥格门汀)，碳青霉烯(例如亚胺培南)，哌拉西林，他唑巴坦，喹诺酮(例如环丙沙星)，四环素，氯霉素，替卡西林，甲氧苄啶和磺胺甲噁唑(Bactrim)。在兽药中，实例是复合阿莫西林-克拉维酸(co-amoxiclav)(例如，在小动物中)，青霉素，链霉素，氧四环素和增强的磺酰胺。

因此，在一个方面，本发明提供以下条款，其涉及使用编程的核酸酶治疗致病性细菌感染。

1. 用于治疗人或动物受试者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用可编程核酸酶实施，所述可编程核酸酶被编程以切割所述靶标位点，其中所述受试者正患有除了致病性细菌感染以外的另外的疾病或病况，且所述方法包括将疗法施用于所述受试者用于治疗或预防另外的疾病或病况，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述疗法对于治疗或预防所述疾病或病况是有效的。

在一个实例中，条款1提供了：-

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体任选地选自派姆单抗(或KEYTRUDA™)和尼沃单抗(或OPDIVO™)；且

(b) 所述癌症选自转移性黑色素瘤；肾细胞癌；膀胱癌；实体瘤；非小细胞肺癌(NSCLC)；前额和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)；霍奇金氏淋巴瘤；过表达PD-L1且在EGFR或ALK中无突变的癌症；结肠直肠癌和肝细胞癌；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗PD-L1抗体，所述抗PD-1抗体任选地选自atezolimumab (或TECENTRIQ™)、阿维单抗(或BAVENCIO™)和德瓦鲁单抗(或IMFINZI™)；且

(b) 所述癌症选自转移性黑色素瘤；肾细胞癌；实体瘤；非小细胞肺癌(NSCLC)；前额和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)；默克尔细胞癌；霍奇金氏淋巴瘤；过表达PD-L1且在EGFR或ALK中无突变的癌症；结肠直肠癌和肝细胞癌；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗CD52抗体，任选地阿仑单抗(或CAMPATH™)；且

(b) 所述癌症是B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗CD20抗体，任选地奥法木单抗(或ARZERRA™)或利妥昔单抗(或RITUXAN™)；且

(b) 所述癌症是B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(例如难治性CLL)或非霍奇金氏淋巴瘤；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗KIR抗体，任选地利瑞鲁单抗；且

(b) 所述癌症任选地是急性髓性白血病或头颈部的鳞状细胞癌(SCCHN)；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的；

其中

(a) 所述免疫疗法包括向所述患者施用抗CD19 CAR-T，所述抗CD19 CAR-T任选地选自axicabtagene ciloleucel (或YESCARTA™)和tisagenlecleucel(或KYMRIAH™)；且

(b) 所述癌症选自B-细胞淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)；原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤；或高级B-细胞淋巴瘤)；B-细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)；或中枢神经系统淋巴瘤；且

(c) 所述第一细菌选自铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、艰难梭菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)、链球菌(例如，草绿色链球菌或嗜热链球菌)、肺炎球菌和肠球菌细菌。

或者，所述CAR-T是抗CD30、CD38或CD22 CAR-T。在一个实例中，所述癌症是在至少两种其他种类的治疗失败之后的大B-细胞淋巴瘤。在一个实例中，所述癌症是由滤泡性淋巴瘤产生的高级别B-细胞淋巴瘤和DLBCL。在一个实例中，所述癌症是复发/缓解的B细胞急性淋巴细胞白血病。在一个实例中，所述癌症是原发性中枢神经系统淋巴瘤。

在一个实例中，所述核酸酶治疗感染而不引起疗法效力的降低。在一个实施方案中，“不引起疗法效力的降低”意指与通过施用杀死多种不同物种(其中所述多种包括第一物种)的广谱抗生素(或本文公开的抗生素)在患者中引起的降低相比的疗法效力。在一个实施方案中，“不引起疗法效力的降低”意指与在致病性细菌感染的治疗不存在的情况下施用疗法相比(或与在患有所述疾病或病况和针对其接受所述疗法的患者中通常实现的疗法相比)，疗法效力降低不超过70%、80%、90%或95%。这可以例如通过确定所述受试者的无进展存活的持续时间或所述疾病或病况的治疗或所述受试者的总体存活；和/或通过确定所述疾病或病况的一种或多种症状的减少来评价。

在一个实例中，所述感染被完全或实质上完全治疗。在另一个实例中，所述感染被减少(例如，至少80%、90%或95%，如通过感染或其症状的标志物所确定)。标志物可以例如是在已经实施所述方法之后、例如在实施该方法的24小时内、例如在实施该方法之后1-12小时或1-24小时或在施用RNA或编码RNA以在受试者中对核酸酶进行编程的DNA之后1-12小时或1-24小时取自患者的每ml血液样品的第一物种或菌株的细菌的CFU。例如，所述RNA是指导RNA，且所述核酸酶是Cas(例如，Cas3或Cas9)。可以将该减少与临开始该方法之前取自受试者的样品进行比较。或者，所述样品可以是粪便、唾液或尿液样品。

在一个实例中，本发明增加人受试者中的总体存活率(与患有相同癌症且接受相同癌症疗法治疗(例如，施用相同的免疫检查点抑制剂，诸如尼沃单抗、派姆单抗或本文公开的另一种抗体)的人中的中值总体存活率相比)。在一个实例中，本文提供了本发明的任何组合物或其他产品用于这种治疗方法。

在一个实例中，所述方法在人受试者的群体上实施，并且该群体的中值总体存活率是患有相同癌症且接受相同的癌症疗法治疗(例如，施用相同的免疫检查点抑制剂，诸如尼沃单抗、派姆单抗或本文公开的另一种抗体)的人中的中值总体存活率的120-250%(例如，150-200%)。在一个实例中，本文提供了本发明的任何组合物或其他产品用于这种治疗方法。

“致病性细菌感染”是受试者的威胁健康的感染，例如威胁生命的感染。在一个实施方案中，致病性细菌感染是需要住院或肠胃外抗微生物剂的感染。所述感染可以是急性细菌感染，诸如全身感染或局部感染。细菌病原体经常在身体的特定区域中引起感染。其他是泛区域细菌病原体(generalist)。致病性细菌感染与共生细菌、诸如共生肠道细菌的感染形成对比；在这种情况下，所述细菌不引起即时的危害健康或生命的情况。

所述感染(或其症状)可以是以下中的任一种：

• 细菌性阴道病：这由改变阴道微生物群的细菌引起，这由挤出维持健康阴道微生物群体的乳杆菌物种的细菌的过度生长引起。

• 细菌性脑膜炎：这是脑膜(即覆盖脑部和脊髓的保护膜)的细菌性炎症。

• 细菌性肺炎：这是肺部的细菌感染。

• 尿路感染：这主要由细菌引起。症状包括强烈和频繁的排尿感觉或冲动，排尿期间的疼痛以及尿液混浊。主要病原体是大肠杆菌。细菌可以上升到膀胱或肾脏，并引起膀胱炎和肾炎。

• 细菌性肠胃炎：这由肠致病性细菌引起。这些致病性物种通常不同于正常肠道菌群的通常无害的细菌。但是，相同物种的不同菌株可能是致病性的。

• 细菌性皮肤感染：这些包括：

• 脓疱疮，其为通常在儿童中看到的高度感染性的细菌性皮肤感染。其由金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌引起。

• 丹毒，其为更深皮肤层的急性链球菌细菌感染，其经由淋巴系统传播。

• 蜂窝组织炎，其为结缔组织的弥漫性炎症，其具有皮肤的真皮和皮下层的严重炎症。蜂窝组织炎可以由正常的皮肤菌群或由感染性接触引起，并且通常通过皮肤开口、割伤、起水泡、皮肤中的裂痕、昆虫叮咬、动物咬伤、烧伤、手术伤口、静脉内药物注射或静脉内导管插入的部位而发生。在大多数情况下，其为受影响的面部或小腿上的皮肤，尽管可以在其他组织中发生蜂窝组织炎。

在一个实例中，所述第一细菌是链球菌，且所述患者患有胸部感染、蜂窝组织炎或扁桃体炎。在一个实例中，所述第一细菌是肠球菌，且所述患者患有膀胱感染或败血病。在一个实例中，所述第一细菌是铜绿假单胞菌，且所述患者患有腹泻。在一个实例中，所述第一细菌是大肠杆菌，且所述患者患有腹泻。

2. 条款1的方法，其中所述受试者是癌症患者，且所述疗法是癌症疗法。

3. 条款2的方法，其中所述疗法包括施用造血干细胞移植物、化学治疗剂、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂或免疫细胞(例如，T-细胞和/或NK细胞)增强剂；过继性细胞疗法(例如，CAR-T疗法)；放射或手术。

在一个实例中，所述疗法是免疫疗法。合适的免疫疗法的实例是施用过继性细胞疗法(例如，CAR-T疗法)、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂或免疫细胞(例如，T-细胞和/或NK细胞)增强剂。例如，施用抗CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、0X40、CD28、BTLA、CD137、CD27、HVEM、KIR、TIM-3、VISTA、ICOS、GITR、TIGIT或SIRPa抗体，诸如施用选自伊匹木单抗(或YERVOY™)、曲美木单抗、尼沃单抗(或OPDIVO™)、派姆单抗(或KEYTRUDA™)、pidilizumab、BMS-936559、德瓦鲁单抗和阿特朱单抗的抗体，或CAR-T疗法，诸如axicabtagene ciloleucel (Yescarta™)或tisagenlecleucel (Kymriah™)。

在一个实例中，所述免疫增强剂包含白介素2(IL-2)或其片段或缺失突变体。

在一个实例中，所述手术包括除去坏死或癌性组织。

在一个实例中，所述化学疗法包括施用含铂化学疗法药物。在一个实例中，所述化学疗法包括施用吉非替尼。

在一个实例中，所述疗法包括施用环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(CMF)；或阿霉素和环磷酰胺(AC)；多西他赛、阿霉素和环磷酰胺(TAC)；或阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪(ABVD)；或氮芥、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松龙(MOPP)；环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙(CHOP)；博来霉素、依托泊苷和顺铂(BEP)；表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶(ECF)；或表柔比星、顺铂和卡培他滨(ECX)；甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素和顺铂(MVAC)；环磷酰胺、阿霉素和长春新碱(CAV)；或5-氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂(FOLFOX)。

在一个实例中，所述癌症是乳腺癌，且所述疗法包括施用CMF或AC。在一个实例中，所述癌症是霍奇金氏淋巴瘤，且所述疗法包括施用TAC、ABVD或MOPP。在一个实例中，所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤，且所述疗法包括施用CHOP。在一个实例中，所述癌症是生殖细胞癌，且所述疗法包括施用BEP。在一个实例中，所述癌症是胃癌，且所述疗法包括施用ECF或ECX。在一个实例中，所述癌症是膀胱癌，且所述疗法包括施用MVAC。在一个实例中，所述癌症是肺癌，且所述疗法包括施用CAV。在一个实例中，所述癌症是结肠直肠癌，且所述疗法包括施用FOLFOX。

4. 条款3的方法，其中所述疗法是免疫检查点抑制剂抗体。

任选地，所述抗体是抗CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、0X40、CD28、BTLA、CD137、CD27、HVEM、KIR、TIM-3、VISTA、ICOS、GITR、TIGIT或SIRPa抗体。在一个实例中，所述抗体是抗PD-1抗体。在一个实例中，所述抗体是抗PD-L1抗体。在一个实例中，所述抗体是抗CTLA4抗体。

5. 条款3的方法，其中所述疗法是施用选自以下的抗体：伊匹木单抗(或YERVOY™)、曲美木单抗、尼沃单抗(或OPDIVO™)、派姆单抗(或KEYTRUDA™)、pidilizumab、BMS-936559、德瓦鲁单抗和阿特朱单抗。

任选地，所述抗体(例如，抗PD-L1抗体)与抗CTLA4抗体(例如，伊匹木单抗或曲美木单抗)一起施用。

在一个实例中，本文的抗PD-1抗体选自尼沃单抗、派姆单抗、pidillizumab、OPDIVO®、KEYTRUDA®、AMP-514、REGN2810、CT-011、BMS 936559、MPDL3280A和AMP-224。

在一个实例中，本文的抗CTLA4抗体选自曲美木单抗、YERVOY®和伊匹木单抗。

在一个实例中，所述疗法是施用抗KIR抗体，例如lirilumab。

在一个实例中，所述检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG- 3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR或A2aR的抑制剂。在某些方面，所述免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)轴-结合拮抗剂。在一些方面，所述PD-1轴-结合拮抗剂选自PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。在某些方面，所述PD-1轴-结合拮抗剂是PD-1-结合拮抗剂。在一些方面，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1拮抗剂，诸如德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736，阿特朱单抗，也称为MPDL3280A，或阿维单抗，也称为MSB00010118C。在某些方面，所述免疫检查点抑制剂是PD-L2拮抗剂，诸如rHIgM12B7。在一些方面，所述免疫检查点抑制剂是LAG-3拮抗剂，诸如IMP321或BMS-986016。所述免疫检查点抑制剂可以是腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂，诸如PBF-509。

在一些实施方案中，本文所述的抗体(诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)进一步包含人或鼠恒定区。在一个又进一步方面，所述人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。在一个又进一步具体方面，所述人恒定区是IgG1。在一个又进一步方面，所述鼠恒定区选自IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3。在一个又进一步具体方面，所述抗体具有降低或最小的效应子功能。在一个又进一步具体方面，所述最小的效应子功能是由在原核、CHO、Cos或HEK细胞中的产生而导致。在一个又进一步具体方面，所述最小的效应子功能由“效应子更小的Fc突变”或无糖基化导致。

例如，所述疗法包括造血干细胞移植，例如骨髓移植(诸如当所述患者是癌症患者、例如血液癌症或白血病患者时)。

例如，所述疗法包括干细胞移植、皮肤移植或器官移植，例如心脏、肝、肾或肺移植。

6. 条款1或2的方法，其中所述疗法是组织、器官或细胞移植。

7. 任一前述条款的方法，其中所述细菌感染的治疗与向所述受试者施用所述疗法同时实施。

8. 条款1至6中任一项的方法，其中所述细菌感染的治疗在临向所述受试者施用所述疗法之前实施。

在一个实例中，所述细菌感染的治疗在另外的疾病或病况的疗法前不超过7、6、5、4、3、2或1天或24、12、6、5、4、3、2、1或0.5小时实施。在一个实例中，所述细菌感染的治疗在另外的疾病或病况的疗法后不超过7、6、5、4、3、2或1天或24、12、6、5、4、3、2、1或0.5小时实施。

所述感染的治疗和所述疗法的施用可以同时或依次实施。

9. 条款1至6中任一项的方法，其中所述细菌感染的治疗在向所述受试者施用所述疗法之后立即实施。

10. 任一前述条款的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用RNA (例如，gRNA)或编码RNA用于在所述受试者中表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的第一细菌中的靶标位点，由此杀死所述第一细菌。

所述RNA或核酸例如口服、通过IV注射、通过皮下注射或通过吸入施用于所述受试者或患者。

11. 任一前述条款的方法，其包括向所述受试者施用载体(例如，噬菌体或质粒)，其中所述载体编码所述可编程核酸酶。

所述核酸酶例如口服、通过IV注射、通过皮下注射或通过吸入施用于所述受试者或患者。

12. 条款1至10中任一项的方法，其中所述可编程核酸酶是所述第一细胞的内源核酸酶(例如，Cas核酸酶)。

13. 任一前述条款的方法，其中在编程的核酸酶存在的情况下的疗法效力大于在广谱抗生素存在的情况下的疗法效力。

在一个实例中，通过确定所述疾病或病况的无进展存活或治疗的持续时间；和/或通过确定所述疾病或病况的一种或多种症状的减轻，来评价效力更大。例如，将该确定与患有所述疾病或病况以及细菌感染并且正在用所述疗法和抗生素(而不是根据本发明的第一细菌的核酸酶杀死)治疗的患者中的类似确定进行比较。

14. 任一前述条款的方法，其中在编程的核酸酶存在的情况下的疗法效力大于在选自以下的抗生素存在的情况下的疗法效力：甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普丁；替考拉宁；头孢菌素；碳青霉烯；氟喹诺酮；氨基糖苷；粘菌素；红霉素；克林霉素；β-内酰胺；大环内酯；阿莫西林；阿奇霉素；青霉素；头孢曲松；阿奇霉素；环丙沙星；异烟肼(INH)；利福平(RMP)；阿米卡星；卡那霉素；卷曲霉素；甲氧苄啶；呋喃妥因(itrofurantoin)；头孢氨苄；阿莫西林；甲硝哒唑(MTZ)；头孢克肟；四环素；和美罗培南。

15. 任一前述条款的方法，其中所述第一细菌选自：(i)对选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普丁和替考拉宁的抗生素抗性的金黄色葡萄球菌；(ii)对选自头孢菌素、碳青霉烯、氟喹诺酮、氨基糖苷和粘菌素的抗生素抗性的绿脓假单胞菌；(iii)对碳青霉烯抗性的克雷伯氏菌属物种；(iv)对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺、大环内酯、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素抗性的链球菌属物种；(v)对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素抗性的沙门氏菌属物种；(vi)对环丙沙星或阿奇霉素抗性的志贺氏菌属物种；(vii)对选自异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素和阿奇霉素的抗生素抗性的结核分枝杆菌；(viii)对万古霉素抗性的肠球菌属物种；(ix)对选自头孢菌素和碳青霉烯的抗生素抗性的肠杆菌科物种；(x)对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素抗性的大肠杆菌；(xi)对甲硝哒唑(MTZ)、氟喹诺酮或碳青霉烯抗性的梭菌属物种；(xii)对选自头孢克肟、头孢曲松、阿奇霉素和四环素的抗生素抗性的淋病奈瑟氏菌；(xiii)对选自β-内酰胺、美洛培南和碳青霉烯的抗生素抗性的鲍曼不动杆菌；和(xiv)对环丙沙星或阿奇霉素抗性的弯曲杆菌属物种。

16. 任一前述条款的方法，其中所述感染的治疗在受试者中治疗或预防选自以下的病况：阴道病、脑膜炎、肺炎、尿路感染、膀胱炎、肾炎、肠胃炎、皮肤感染、脓疱疮、丹毒、牙科感染和蜂窝组织炎。

17. 任一前述条款的方法，其中所述感染的治疗治疗或预防所述受试者中的败血病或败血症。

在一个实例中，所述感染是血流感染。

18. 任一前述条款的方法，其中所述另外的疾病或病况是癌症；自身免疫性疾病或病况；病毒感染或胃肠道疾病或病况。在一个实例中，所述癌症是转移性的。在一个实例中，所述癌症是黑色素瘤。在一个实例中，所述癌症是具有错配修复缺陷或微卫星不稳定性的实体瘤。在一个实例中，所述癌症是NSCLC。在一个实例中，所述癌症是HNSCC。在一个实例中，所述癌症是霍奇金氏淋巴瘤。在一个实例中，所述癌症是尿路上皮癌。在一个实例中，所述癌症是肺癌。在一个实例中，所述癌症是头颈癌。在一个实例中，所述癌症是头癌。在一个实例中，所述癌症是颈部癌。在一个实例中，所述病毒感染是HIV、CMV或RSV感染。

19. 任一前述条款的方法，其中所述受试者包含与所述第一菌株或物种不同的一种或多种菌株或物种的细菌(第二细菌)，其中所述第二细菌的基因组不包含靶标位点，其中所述第二细菌的基因组在受试者中不被编程的核酸酶切割，由此第二细菌在患者中在编程的核酸酶存在的情况下存活，且其中所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的。

20. 条款19的方法，其中患者(例如，肠道微生物组)中的第二细菌的减少与疗法效力的降低相关。

任选地，所述疗法在受试者的肠道中存在第二细菌的情况下是有效的。

任选地，在临实施所述方法之前，所述第一和/或第二细菌存在于受试者的肠道中。

任选地，在临实施所述方法之前，所述第一和/或第二细菌存在于受试者的血液中。

任选地，在临实施所述方法之前，所述第一细菌存在于受试者的血液中，且所述第二细菌存在于受试者的肠道中。

任选地，在临实施所述方法之前，所述第一细菌存在于受试者的肠道中，且所述第二细菌存在于受试者的血液中。

任选地，杀死受试者的血液中的第一细菌。

任选地，所述细菌是革兰氏阳性细菌。任选地，所述细菌是革兰氏阴性细菌。

任选地，所述第一和第二细菌能够被相同的抗生素杀死。任选地，所述方法不包括向所述受试者施用抗生素。在一个实例中，所述抗生素选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普丁；替考拉宁；头孢菌素；碳青霉烯；氟喹诺酮；氨基糖苷；粘菌素；红霉素；克林霉素；β-内酰胺；大环内酯；阿莫西林；阿奇霉素；青霉素；头孢曲松；阿奇霉素；环丙沙星；异烟肼(INH)；利福平(RMP)；阿米卡星；卡那霉素；卷曲霉素；甲氧苄啶；呋喃妥因(itrofurantoin)；头孢氨苄；阿莫西林；甲硝哒唑(MTZ)；头孢克肟；四环素；和美罗培南。在一个实例中，所述抗生素选自氨基糖苷、氨苄青霉素、阿莫西林、阿莫西林或克拉维酸、碳青霉烯(例如亚胺培南)、哌拉西林或他唑巴坦、喹诺酮(例如环丙沙星)、四环素、氯霉素、替卡西林、甲氧苄啶或磺胺甲噁唑、青霉素、链霉素、氧四环素和增强的磺酰胺。在一个实例中，所述第一细菌对选自以下的抗生素是抗性的：氨基糖苷、氨苄青霉素、阿莫西林、阿莫西林或克拉维酸、碳青霉烯(例如亚胺培南)、哌拉西林或他唑巴坦、喹诺酮(例如环丙沙星)、四环素、氯霉素、替卡西林、甲氧苄啶或磺胺甲噁唑、青霉素、链霉素、氧四环素和增强的磺酰胺。在一个替代方案中，所述抗生素选自β-内酰胺、氟喹诺酮和大环内酯。

任选地，所述第一和第二细菌是相同物种的细菌，但是是该物种的不同菌株。

任选地，所述第一和第二细菌是相同属的细菌，但是是该属的不同物种的细菌。

任选地，所述第一和第二细菌是相同科的细菌，但是是该科的不同属的细菌。

任选地，所述第一和第二细菌是革兰氏阳性细菌。

任选地，所述第一和第二细菌是革兰氏阴性细菌。

任选地，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的。

任选地，患者中的第二细菌的减少与疗法效力的降低相关。任选地，患者中的第二细菌的减少降低疗法的效力。

任选地，患者中的第二细菌的存在与疗法效力的增强相关。任选地，患者中的第二细菌的存在增强疗法的效力。例如，增强的效力是与在第二细菌不存在或存在减少的情况下、诸如在杀死第二细菌的抗生素存在的情况下的疗法相比的效力。

在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中受试者中的疾病或病况(或其症状)减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中受试者中的疾病或病况(或其症状)的进展减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中受试者中的疾病或病况(或其症状)的无疾病进展减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中受试者中的疾病或病况(或其症状)的持续时间减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中受试者中的疾病或病况(或其症状)的严重程度减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中患者中的疾病或病况(或其症状)减少至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或28天或至少1、2、3、4、5、6或12个月。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中患者中的疾病或病况(或其症状)被治疗至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或28天或至少1、2、3、4、5、6或12个月。在一个实例中，所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的，其中患者中的疾病或病况(或其症状)至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%检测不到，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或28天或至少1、2、3、4、5、6或12个月。

21. 条款19或20的方法，其中所述第二细菌选自：

在一个实例中，所述第二细菌是产生短链脂肪酸的细菌(例如，产生丁酸盐的细菌)。在具体方面，所述细菌物种产生丁酸盐。例如，所述第二细菌是梭菌目。所述梭菌目细菌可以实质上是孢子形式的细菌或包括孢子形式的细菌。在具体方面，所述第二细菌是瘤胃球菌科、

在某些实施方案中，所述第一细菌是拟杆菌纲或普雷沃氏菌科，例如，拟杆菌门或拟杆菌属。

在一个实施方案中，所述治疗导致或维持受试者的微生物组(例如，肠道和/或血液微生物组)，这对于免疫检查点抑制剂或其他疗法是有益的。在一个实例中，所述微生物组包含高相对丰度的一种或多种来自以下的细菌物种：厚壁菌门，梭菌纲，梭菌目，瘤胃球菌科，瘤胃球菌属，

例如，与拟杆菌门、拟杆菌目、拟杆菌目或普雷沃氏菌科相比，所述微生物组包含更高相对丰度的厚壁菌门。例如，与拟杆菌门、拟杆菌目、拟杆菌目和普雷沃氏菌科相比，所述微生物组包含更高相对丰度的厚壁菌门。

任选地，所述第二细菌选自

在一个实例中，所述第二细菌是人类中的共生细菌。

在一个实例中，所述第一细菌由以下包含：肠道微生物群、皮肤微生物群、口腔微生物群、咽喉微生物群、毛发微生物群、腋窝微生物群、阴道微生物群、直肠微生物群、肛门微生物群、眼部微生物群、鼻微生物群、舌微生物群、肺微生物群、肝微生物群、肾微生物群、生殖器微生物群、阴茎微生物群、阴囊微生物群、乳腺微生物群、耳微生物群、尿路微生物群、阴唇微生物群、器官微生物群或牙齿微生物群。

在一个实例中，所述第二细菌由以下包含：肠道微生物群、皮肤微生物群、口腔微生物群、咽喉微生物群、毛发微生物群、腋窝微生物群、阴道微生物群、直肠微生物群、肛门微生物群、眼部微生物群、鼻微生物群、舌微生物群、肺微生物群、肝微生物群、肾微生物群、生殖器微生物群、阴茎微生物群、阴囊微生物群、乳腺微生物群、耳微生物群、尿路微生物群、阴唇微生物群、器官微生物群或牙齿微生物群。

在一个实例中，所述第一和/或第二细菌是血液来源的细菌。

22. 任一前述条款的方法，其中所述第一细菌选自葡萄球菌、链球菌、肠球菌、螺杆菌、军团菌、嗜血杆菌、

幽门螺杆菌已经牵涉于胃癌和胃溃疡。因此，在一个实例中，所述第一细菌是幽门螺杆菌，且任选地，所述疾病是癌症，诸如胃癌。在一个实施方案中，所述疗法是化学疗法或用免疫检查点抑制剂(例如，抗体)的疗法。在一个实例中，所述第一细菌是幽门螺杆菌，且所述疾病是胃溃疡。在一个实施方案中，将胃溃疡的三重疗法施用于受试者。

在一个实例中，所述第一细菌是革兰氏阴性细菌，且任选地，所述感染是血液感染。在一个实例中，所述第一细菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌，且任选地，所述感染是血液感染。

23. 条款22的方法，其中所述第一细菌选自大肠杆菌(例如，EHEC大肠杆菌)、艰难梭菌、霍乱弧菌、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌或MRSA)、化脓性链球菌、幽门螺杆菌、鲍曼不动杆菌、军团菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌细菌。

在一个实例中，所述受试者已经施用免疫抑制剂药物，或者处于免疫抑制剂药物、例如类固醇、诸如皮质类固醇的过程中。

24. 用于任一前述条款的方法中的可编程核酸酶。

25. 任一前述条款的方法或核酸酶，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

26. 包含用于条款1至23中任一项的方法中的根据条款24或25的核酸酶的CRISPR/Cas系统，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)，且所述系统包含一个或多个指导RNA (gRNA)或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点。

27. 用于条款26的系统中的指导RNA或编码指导RNA的DNA。

28. 指导RNA或编码指导RNA的DNA，其用于根据条款1至23中任一项的治疗致病性细菌感染的方法中，其中所述指导RNA能够对核酸酶进行编程，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas9、Cas3、Cas13、CasX、CasY或Cpf1核酸酶)。

29. 核酸载体，其包含条款26至28中任一项中所述的指导RNA或DNA。

30. 核酸载体，其编码条款24或25的核酸酶和任选地条款29的指导RNA。

31. 条款29或30的载体，其中所述载体是噬菌体、噬菌粒质粒(例如，接合质粒)或转座子。

所述噬菌体能够感染第一细菌，且所述噬菌粒能够在辅助噬菌体存在的情况下产生这种噬菌体。

32. 药物组合物，其包含编码条款24或25核酸酶的第一核酸载体(或其多个)和编码条款29的指导RNA的第二核酸载体(或其多个)，所述组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

33. 药物组合物，其包含条款26的CRISPR/Cas系统和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

34. 药物组合物，其包含条款31的载体和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

在本文中预防疾病或病况可以例如是降低受试者或患者中的疾病或病况的风险。

在一个替代方案中，所述感染不是由第一细菌、而是由第一古细菌引起，并且在该实施方案中，涉及杀死第一细菌的本发明的方法和其他配置的所有特征反而加上必要变更涉及杀死第一古细菌。

在一个实施方案中，所述方法包括实施如本文所述的治疗急性微生物感染的方法，且因此，如本文所述的该方法的特征可与本发明的治疗致病性细菌感染(即，其中致病细菌感染是第一种方法中的急性微生物感染)的方法组合。在一个实施方案中，所述方法包括实施如本文所述的持久地治疗微生物感染的方法，且因此，如本文所述的该方法的特征可与本发明的治疗致病性细菌感染(即，其中致病细菌感染是第一种方法中的微生物感染)的方法组合。本文第一种方法的任何任选特征都可以加上必要变更适用于本发明的治疗致病性细菌感染的方法。

因此，本发明提供以下方面，其为上述条款的任选特征：-

1. 条款1-23中任一项的方法，其中到实施步骤(b)的前30分钟，所述感染减少至少100倍。任选地，到实施步骤(b)的前30分钟，所述感染减少至少1000倍。任选地，在实施步骤(b)的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。例如，可以通过确定(i)在临开始治疗前取自受试者的样品(例如，血液样品)和(ii)在治疗30分钟时取自受试者的样品(与(i)的样品相同类型的，例如血液样品)中的第一物种或菌株的细菌数目的差异来评价所述减少。例如，可以评价样品的菌落形成单位(CFU)/ml样品的差异，例如，当样品已铺板在各自的petri皿中的琼脂上并在相同条件下孵育时。另一个实例可以使用样品中的细菌的显微镜计数，或技术人员已知的其他常规方法。

2. 条款1-23中任一项的方法，其中到实施步骤(b)的前30分钟，所述第一细菌对所述受试者的血液感染减少至少100或1000倍。

3. 方面2的方法，其中在临治疗前，所述血液被10

4. 条款1-23中任一项或任一前述方面的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用核酸(例如RNA)和核酸酶，其中所述核酸与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的第一细菌中的靶标位点。

5. 方面4的方法，其中将所述核酸酶与所述核酸同时或依次施用于所述受试者。

6. 方面4的方法，其中在向所述受试者施用所述核酸之前，所述受试者包含核酸酶。

7. 方面4至6中任一项的方法，其中将多种噬菌体施用于所述受试者，其中每种噬菌体包含所述核酸的拷贝，其中所述噬菌体感染由所述受试者包含的第一细菌以向其递送所述核酸。

8. 方面7的方法，其中施用的噬菌体：由所述受试者包含的第一细菌的比率为10至150。例如，所述比率为10至100，即感染复数(MOI)为10至100。

可以例如使用在临治疗前来自人或动物受试者的样品(例如，血液或肠道样品)和测定每ml血液或肠道样品的细菌数来确定所述比率。然后可以根据使用样品的测定来算出待施用的噬菌体的量。

9. 条款1-23中任一项或任一前述方面的方法，其中所述感染是肺、脑、皮肤、腹部或尿路的感染。

10. 条款1-23中任一项或任一前述方面的方法，其中所述受试者已经经历手术，进行免疫抑制剂药物治疗，正患有烧伤，正患有糖尿病，正患有癌症或正患有慢性疾病。

11. 条款1-23中任一项或任一前述方面的方法，其中所述受试者是超过65岁的人或者是儿科患者。

12. 条款1-23中任一项或任一前述方面的方法，其中所述方法治疗或预防受试者中的败血症。

13. 条款12的方法，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有＜36℃或＞38℃的温度；>90/min的心率，>20次呼吸/min的呼吸速率或PaCO

14. 条款12或13的方法，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有以下中的两种或更多种的存在：体温异常、心率异常、呼吸速率异常、血液气体异常和白血细胞计数异常。

本发明的免疫检查点或者调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。在本发明中可以通过免疫检查点调节靶向的抑制性免疫检查点分子包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4，也称为CD 152)、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)。具体而言，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

所述免疫检查点抑制剂可以是药物，诸如小分子，配体或受体的重组形式，或抗体，诸如人抗体(例如，WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64,2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白的已知抑制剂或其类似物，特别是可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如技术人员将知道，替代和/或等效名称可以用于本公开中提及的某些抗体。在本发明的上下文中，此类替代和/或等效名称是可互换的。例如，已知lambrolizumab也以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗已知。

考虑可以使用本领域中已知刺激免疫应答的任何免疫检查点抑制剂。这包括直接或间接刺激或增强抗原-特异性T-淋巴细胞的抑制剂。这些免疫检查点抑制剂包括但不限于靶向涉及PD-L2、LAG3、BTLA、B7H4和TIM3的免疫检查点蛋白和途径的药剂。例如，本领域已知的LAG3抑制剂包括可溶性LAG3 (WO2009044273中公开的IMP321或LAG3-Ig)以及阻断人LAG3的小鼠或人源化抗体(例如，WO2008132601中公开的IMP701)，或阻断人LAG3的完全人抗体(诸如在EP 2320940中公开)。另一个实例通过使用针对BTLA的阻断剂提供，所述阻断剂包括但不限于阻断人BTLA与其配体相互作用的抗体(诸如WO2011014438中公开的4C7)。又另一个实例通过使用中和B7H4的药剂提供，所述药剂包括但不限于针对人B7H4的抗体(在WO 2013025779和WO2013067492中公开)或B7H4的可溶性重组形式(诸如在US20120177645中公开)。又另一个实例通过中和B7-H3的药剂提供，所述药剂包括但不限于中和人B7-H3的抗体(例如在US 20120294796中公开为BRCA84D的MGA271和衍生物)。又另一个实例通过靶向TIM3的药剂提供，所述药剂包括但不限于靶向人TIM3的抗体(例如，如WO2013006490 A2中公开或由Jones等人, J Exp Med. 2008; 205(12):2763-79公开的抗人TIM3、阻断抗体F38-2E2)。

T细胞功能障碍或无效能与抑制性受体程序性死亡1多肽(PD-1)的诱导和持续表达同时发生。因此，本文提供了PD-1和通过与PD-1相互作用而信号传导的其他分子(诸如程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2))的治疗性靶向。PD-L1在许多癌症中过表达，并且经常与预后不良相关(Okazaki T等人, Intern. Immun. 2007 19(7):813)。因此，本文提供了通过抑制PD-L1/PD-1相互作用以及调节微生物组来治疗癌症的改进方法。

例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，所述PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，所述PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-L2结合配偶体是PD-1。所述拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449，其全部通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域中已知的，诸如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369，其全部通过引用并入本文。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体{例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体选自尼沃单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是AMP-224。尼沃单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和OPDIVO

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1拮抗剂，诸如德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736，阿特朱单抗，也称为MPDL3280A，或阿维单抗，也称为MSB00010118C。在某些方面，所述免疫检查点抑制剂是PD-L2拮抗剂，诸如rHIgM12B7。在一些方面，所述免疫检查点抑制剂是LAG-3拮抗剂，诸如但不限于IMP321和BMS-986016。所述免疫检查点抑制剂可以是腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂，诸如PBF-509。

在一些实施方案中，本文所述的任何抗体(诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)进一步包含人或鼠恒定区。在一个又进一步方面，所述人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。在一个又进一步具体方面，所述人恒定区是IgG1。在一个又进一步方面，所述鼠恒定区选自IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3。在一个又进一步具体方面，所述抗体具有降低的或最小的效应子功能。在一个又进一步具体方面，最小的效应子功能由在原核细胞中产生而导致。在一个又进一步具体方面，最小的效应子功能由“效应子更低的Fc突变”或无糖基化导致。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中的这些三肽序列中任一者的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列、使得除去上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)，方便地从抗体除去糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基取代为另一个氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守取代)来进行改变。

所述抗体或其抗原结合片段可以使用本领域中已知的方法，例如，通过一定方法来制备，所述方法包括在适合于产生这种抗体或片段的条件下培养含有编码适合于表达的形式的前述抗PD-L1、抗PD-1或抗PD-L2抗体或抗原结合片段中的任一种的核酸的宿主细胞和回收所述抗体或片段。

可以在本文提供的方法中靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4在T细胞的表面上发现，并且当与抗原呈递细胞的表面上的CD80或CD86结合时，充当“关闭开关”。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面上表达并且将抑制信号传递给T细胞。CTLA4与T-细胞共刺激蛋白CD28类似，并且两种分子都结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86，分别称为B7-1和B7-2。CTLA4将抑制信号传递给T细胞，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也在调节性T细胞中发现，并且可能对它们的功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达增加。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

适用于本方法中的抗人CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域中众所周知的方法生成。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，US 8,119, 129, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675,206，也称为曲美木单抗；以前称为ticilimumab)，美国专利号6,207,156；和Hurwitz等人, 1998中公开的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中。前述出版物各自的教导通过引用并入本文。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号US8017114；其全部通过引用并入本文。

示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹木单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和Yervoy®)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO01/14424)。在其他实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体竞争与CTLA-4结合和/或结合CTLA-4上相同的表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体具有至少约90%可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少约90%、95%或99%可变区同一性)。

用于调节CTLA-4的其他分子包括可溶性CTLA-4配体和受体，诸如描述于美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(其全部都通过引用并入本文)，以及免疫粘附素，诸如描述于美国专利号US8329867(其通过引用并入本文)。

用于本发明中的另一种免疫检查点抑制剂是抗KIR抗体。适用于本发明的方法中的抗人-KIR抗体(或衍生自其的VH/VL结构域)可以使用本领域中众所周知的方法生成。

或者，可以使用本领域公认的抗KIR抗体。所述抗KIR抗体可以与多种抑制性KIR受体交叉反应，并且增强携带这些受体中的一种或多种的NK细胞的细胞毒性。例如，所述抗KIR抗体可以结合KIR2D2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一种，并且通过减少、中和和/或逆转由任何或所有这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制来增强NK细胞活性。在一些方面，抗KIR抗体不结合KIR2DS4和/或KIR2DS3。例如，可以使用WO 2006/003179中描述的单克隆抗体1-7F9(也称为IPH2101)、14F1、1-6F1和1-6F5，其教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合KIR的抗体。可以使用的额外本领域公认的抗KIR抗体包括，例如，WO 2005/003168、WO 2005/009465、WO 2006/072625、WO 2006/072626、WO2007/042573、WO 2008/084106、WO 2010/065939、WO 2012/071411和WO 2012/160448中描述的那些。

示例性的抗KIR抗体是lirilumab(也称为BMS-986015或IPH2102)。在其他实施方案中，所述抗KIR抗体包含lirilumab的重链和轻链互补决定区(CDR)或可变区(VR)。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含lirilumab的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域以及lirilumab的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与lirilumab具有至少约90%可变区氨基酸序列同一性。

考虑用于治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、胃肠道癌、淋巴瘤、肺中的肿瘤前病变、结肠癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、默克尔细胞癌、卡波西氏肉瘤、角化棘皮瘤、纺锤细胞瘤、皮脂癌、微囊性附件癌、乳房的佩吉特氏病、非典型性纤维黄瘤、平滑肌肉瘤和血管肉瘤、恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、促结缔组织增生的黑色素瘤和膀胱癌。

在一些实施方案中，所述受试者具有对一种或多种抗癌疗法抗性(已表明是抗性的)的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括癌症或难治性癌症的复发。复发可以指治疗后在原始部位或新部位再次出现癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括在用抗癌疗法治疗期间的癌症进展。在一些实施方案中，所述癌症处于早期或晚期。所述受试者可以具有表达(已经显示例如在诊断测试中表达) PD-L1生物标志物的癌症。在一些实施方案中，所述患者的癌症表达低PD-L1生物标志物。在一些实施方案中，所述患者的癌症表达高PD-L1生物标志物。可以使用选自以下的方法在样品中检测PD-L1生物标志物：FACS、Western印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离振子共振、光谱学、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH及其组合。

在一些实施方案中，所述癌症具有低水平的T细胞浸润。在一些实施方案中，所述癌症没有可检测的T细胞浸润物。在一些实施方案中，所述癌症是非免疫原性癌症(例如，非免疫原性结肠直肠癌和/或卵巢癌)。

例如，向人施用的治疗有效或足够量的免疫检查点抑制剂，诸如抗体，其将在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内，无论是通过一次还是多次施用。在一些实施方案中，例如，使用的抗体是每天施用约0.01至约45 mg/kg、约0.01至约40 mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30 mg/kg、约0.01至约25 mg/kg、约0.01至约20 mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10 mg/kg、约0.01至约5 mg/kg或约0.01至约1 mg/kg。在一些实施方案中，所述抗体以15 mg/kg施用。然而，其他剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体在21天周期的第1天以约100 mg、约200 mg、约300 mg、约400 mg、约500mg、约600 mg、约700 mg、约800 mg、约900 mg、约1000 mg、约1100 mg、约1200 mg、约1300mg或约1400 mg的剂量施用于人。所述剂量可以作为单剂量或作为多剂量(例如，2或3剂)、诸如输注进行施用。该疗法的进展通过常规技术容易地监测。

在一些实施方案中，可以将所述免疫检查点抑制剂与至少一种额外治疗剂组合施用。额外的疗法可以是癌症疗法，诸如放射疗法、手术、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。额外的疗法可以呈辅助或新辅助疗法的形式。

在一个实例中，癌症(无论是否施用免疫检查点抑制剂)或任何其他疾病(例如，病毒感染或自身免疫性疾病)的疗法可以是放射疗法、手术、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法或单克隆抗体疗法。所述疗法可以是前述的组合。可以施用额外的疗法。

在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是施用小分子酶促抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，额外的疗法是施用副作用限制剂(例如，意欲减轻治疗的副作用的发生和/或严重程度的药剂，诸如抗恶心剂等)。

在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是放射疗法。在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是手术。在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是γ辐射。在一些实施方案中，所述疗法(或额外的癌症疗法)是靶向PBK/AKT/mTOR途径的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂。所述疗法(或额外的癌症疗法)可以是本领域中已知的化学治疗剂中的一种或多种。

考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何化合物或疗法施用于患者将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。

所述疗法可以包括向受试者施用以下中的任一种或由其组成：

根据本发明的实施方案，可以使用各种各样的化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过它们在细胞内的活性模式，例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期，进行分类。或者，药剂可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。

化学治疗剂的实例包括烷基化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯并多巴、卡泊酮、美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基氨基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺 (altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀；CC-1065(例如其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1 和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；倍癌霉素(例如合成类似物，KW-2189 和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；原肉质汀(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯膦酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、酚西林、泼尼莫斯汀、曲伐沙星和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(诸如卡奇霉素 (calicheamicin)、特别是卡奇霉素γI1和卡奇霉素ωI1)；达内霉素 (dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、奥曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、染色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(例如吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧阿霉素)、表柔比星、伊索比星、伊达比星、马可霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶呤和三甲氧甲酸；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻虫胺和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、 6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西菌定、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如米托坦和三链烷；叶酸补充剂，诸如克罗来酸；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝拉布昔；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类，诸如美坦生和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝胺醇；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺环；细交链孢菌酮酸；三乙撑亚胺苯醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(例如T-2毒素、疣毒素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫斯汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，诸如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂；甲基苄肼；普卡霉素；吉西他滨；诺维本、法呢基蛋白酪氨酸酶抑制剂、反式铂，和任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常被称为γ-射线、X-射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的直接递送的因素。也考虑其他形式的DNA损伤因子，诸如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV-辐射。所有这些因素最可能影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持的广泛范围的损害。X-射线的剂量范围范围为持续延长时间段(3至4周)的50至200伦琴的每天剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围差异很大，并且取决于同位素的半衰期，发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

技术人员将理解，免疫疗法可以与本文描述的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗(RITUXAN®)是免疫疗法的一个实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞的表面上的标志物特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者其可以募集其他细胞来实际实现细胞杀伤。所述抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且充当靶向剂。或者，所述效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

在一个实例中，所述免疫疗法包括过继性细胞疗法，诸如CAR-T施用，例如，抗CD19或CD20 CAR-T施用。

在一个实例中，所述免疫疗法包括施用IL-2(例如，截短的IL-2或聚乙二醇化的IL-2或Fc-融合的IL-2)或由其组成。

抗体-药物缀合物已经作为开发癌症治疗剂的突破性方法出现。抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞-杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物组合，产生“武装的”MAb，其将有效载荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送还将其在正常组织中的暴露最小化，导致毒性降低和治疗指数改进。FDA批准两种ADC药物，2011年的ADCETRIS® (本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的KADCYLA® (trastuzumab emtansine或T-DM1)验证。目前，在癌症治疗的临床试验的各个阶段中，存在超过30种ADC药物候选物。随着抗体工程改造和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越取决于适合于该方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的生成。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中的表达上调/高水平和稳健的内化。

在免疫疗法的一个方面，所述肿瘤细胞必须携带一些标志物，其易于靶向，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明的实施方案的背景下，任何这些都可能适合于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗体、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和pi 55。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，诸如FLT3配体。

在本发明中，可以通过手术治疗癌症或其他疾病或病况。

近似60%的具有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防，诊断或分期，治愈和姑息手术。治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌性组织被物理除去，切除和/或破坏，并且可以与其他疗法(诸如本发明的实施方案的治疗，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除是指物理除去至少部分肿瘤。除了肿瘤切除以外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制的手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可以在体内形成空腔。可以通过用额外的抗癌疗法输注、直接注射或局部应用区域来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。

在一个实施方案中，所述疗法包括向受试者施用包含限定细菌的细菌移植物，例如粪便微生物移植物。例如，所述移植物是WO2018064165(其公开内容(特别是其中的组合物)通过引用以其整体并入本文用于本发明中的可能应用)中公开的任何组合物。例如，所述移植物是根据任何以下段落(表和序列编号是指WO2018064165中的表和序列，其明确地并入本文以可能用于权利要求中)：-

1. 组合物，其包含至少一种分离的或纯化的细菌群体，所述细菌属于瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一种或多种。

2. 组合物，其包含至少两种分离的或纯化的细菌群体，所述细菌属于瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一种或多种。

3. 段落1或段落2的组合物，其中每种细菌群体以至少10^3 CFU的浓度存在于所述组合物中。

4. 段落1或段落2的组合物，其中所述组合物是活细菌产品或活生物治疗产品。

5. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体作为细菌孢子提供。

6. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一个细菌群体或所述至少两种分离或纯化的细菌群体属于梭菌目XII科和/或梭菌目XIII科。

7. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体属于瘤胃球菌科和/或梭菌科。

8. 段落1或段落2的组合物，其中属于瘤胃球菌科的细菌群体进一步被定义为属于瘤胃球菌属的细菌群体。

9. 段落8的组合物，其中属于瘤胃球菌属的细菌群体进一步被定义为属于物种布氏瘤胃球菌的细菌群体。

10. 段落1或段落2的组合物，其中属于瘤胃球菌科的细菌群体进一步被定义为属于粪杆菌属的细菌群体。

11. 段落10的组合物，其中属于粪杆菌属的细菌群体进一步被定义为属于物种柔嫩粪杆菌的细菌群体。

12. 段落1或段落2的组合物，其中属于微球菌科的细菌群体进一步被定义为属于罗氏菌属的细菌群体。

13. 段落1或段落2的组合物，其中所述组合物进一步包含细菌群体，所述细菌属于物种巴斯德卟啉单胞菌、物种汉氏梭菌、物种

14. 段落1或段落2的组合物，其中所述组合物基本上不含属于拟杆菌目的细菌群体。

15. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体属于选自表1中的物种的物种、亚种或细菌菌株中的一种或多种，其中富集指数(ei)大于0.5。

16. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体选自表1中的物种，其中"ei"等于1。

17. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体包含16S核糖体RNA (rRNA)核苷酸序列，所述16S核糖体RNA(rRNA)核苷酸序列与通过选自以下的NCBI分类ID的NCBI分类ID标识的细菌的16S rRNA核苷酸序列具有至少90%同一性(例如，至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性)：

18. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的细菌群体或所述至少两种分离或纯化的细菌群体是包含与SEQ ID NO:1-876的序列具有至少80%同一性(例如，至少85、90、95或98%同一性)的16S rRNA基因序列的物种、亚种或细菌菌株。

19. 段落1或段落2的组合物，其中所述至少一种分离或纯化的群体细菌或所述至少两种分离或纯化的细菌群体属于选自以下的物种、亚种或细菌菌株：凝固拟杆菌、

在一个实例中，所述移植物包含以下或由以下组成：SER-109或SER-262(且任选地，所述病况是艰难梭菌感染)；VE202或SER-287(且任选地，所述疾病是溃疡性结肠炎)；SER-301(且任选地，所述疾病是IBD)；SER-401(且任选地，所述病况是癌症；例如，其中所述疗法进一步包括施用抗PD-1轴抗体，例如，抗PD-1抗体)；VE800或SER-155(且任选地，所述疗法进一步包括施用移植物，例如，造血干细胞或实体器官移植物)；EDP1066或EDP1815(且任选地，所述疾病是炎性病况，例如结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、皮炎(例如，特应性皮炎)或IBD)；或EDP1503(且所述疾病是癌症，例如，结肠直肠癌、肾细胞癌、黑色素瘤或PD-1复发癌)。在一个实例中，所述疗法包括施用SGM-1019、SG-2-0776或EB8018(且任选地，所述疾病或病况是NASH或IBD或炎性病况，例如，结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、类风湿关节炎(RA)、牛皮癣和皮炎(例如，特应性皮炎)。以“VE”开始的那些由VadantaBiosciences开发，以SER开始的那些由Seres Therapeutics开发，以EDP开始的那些由Evelo Biosciences开发，以SG开始的那些由Second Genome开发，且以EB开始的那些由Enterome开发。

在一个实例中，本文的疾病或病况是炎性病况，例如结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、皮炎(例如，特应性皮炎)或IBD。

6. 其他药剂

考虑到可以将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些额外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂，细胞生长抑制和分化药剂，细胞粘附的抑制剂，增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物剂。通过提高GAP连接数增加细胞间信号传导，将增加对邻近的过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制或分化药剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘附的抑制剂提高本发明实施方案的效力。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑到增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂，诸如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。

任选地，所述疾病或病况选自：

(a) 神经退行性疾病或病况；

(b) 脑部疾病或病况；

(c) CNS疾病或病况；

(d) 记忆丧失或损伤；

(e) 心脏病或心血管疾病或病况，例如心脏病发作、中风或心房纤颤；

(f) 肝脏疾病或病况；

(g) 肾脏疾病或病况，例如慢性肾病(CKD)；

(h) 胰腺疾病或病况；

(i) 肺部疾病或病况，例如囊性纤维化或COPD；

(j) 胃肠疾病或病况；

(k) 喉咙或口腔疾病或病况；

(l) 眼部疾病或病况；

(m) 生殖器疾病或病况，例如阴道、阴唇、阴茎或阴囊疾病或病况；

(n) 性传播性疾病或病况，例如淋病、HIV感染、梅毒或衣原体感染；

(o) 耳部疾病或病况；

(p) 皮肤疾病或病况；

(q) 心脏疾病或病况；

(r) 鼻疾病或病况

(s) 血液疾病或病况，例如贫血，例如慢性疾病或癌症的贫血；

(t) 病毒感染；

(u) 致病性细菌感染；

(v) 癌症；

(w) 自身免疫性疾病或病况，例如，SLE；

(x) 炎性疾病或病况，例如类风湿性关节炎、银屑病、湿疹、哮喘、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩氏病或IBD；

(y) 自闭症；

(z) ADHD;

(aa) 双相障碍；

(bb) ALS [肌萎缩侧索硬化症]；

(cc) 骨关节炎；

(dd) 先天性或发育缺陷或病况；

(ee) 流产；

(ff) 凝血病况；

(gg) 支气管炎；

(hh) 干性或湿性AMD；

(ii) 新生血管形成(例如，肿瘤的或眼睛中的新生血管形成)；

(jj) 普通感冒；

(kk) 癫痫；

(ll) 纤维化，例如肝或肺纤维化；

(mm) 真菌疾病或病况，例如鹅口疮；

(nn) 代谢疾病或病况，例如肥胖、厌食、糖尿病、I型或II型糖尿病。

(oo) 溃疡，例如胃溃疡或皮肤溃疡；

(pp) 皮肤干燥；

(qq) 斯耶格伦氏综合征；

(rr) 细胞因子风暴；

(ss) 耳聋、听力丧失或损伤；

(tt) 代谢缓慢或快速(即，对于受试者的重量、性别和年龄，比平均值更慢或更快)；

(uu) 怀孕病症，例如不育或低生育力；

(vv) 黄疸；

(ww) 皮疹；

(xx) 川崎病；

(yy) 莱姆病；

(zz) 过敏，例如坚果、草、花粉、尘螨、猫或狗皮毛或皮屑过敏；

(aaa) 疟疾、伤寒、肺结核或霍乱；

(bbb) 抑郁症；

(ccc) 精神发育迟滞；

(ddd) 小头畸形；

(eee) 营养不良；

(fff) 结膜炎；

(ggg) 肺炎；

(hhh) 肺栓塞；

(iii) 肺动脉高压；

(jjj) 骨病症；

(kkk) 败血症或败血性休克；

(lll) 鼻炎(Sinusitus)；

(mmm) 压力(例如，职业压力)；

(nnn) 地中海贫血、贫血、血管性血友病或血友病；

(ooo) 带状疱疹或唇疱疹；

(ppp) 月经；

(qqq) 精子计数低。

在一个实例中，神经退行性或CNS疾病或病况选自阿尔茨海默氏病、老年精神病、唐氏综合征、帕金森氏病、Creutzfeldt-jakob疾病、糖尿病性神经病、帕金森综合征、亨廷顿氏病、Machado-Joseph疾病、肌萎缩侧索硬化症、糖尿病神经病变和CreutzfeldtCreutzfeldt- Jakob疾病。例如，所述疾病是阿尔茨海默氏病。例如，所述疾病是帕金森综合征。

在其中本发明的方法在人或动物受试者上实施用于治疗CNS或神经退行性疾病或病况的一个实例中，所述方法引起受试者中Treg细胞的下调，由此促进系统性单核细胞衍生的巨噬细胞和/或Treg细胞穿过脉络丛进入受试者的脑部，由此治疗、预防疾病或病况(例如，阿尔茨海默氏病)或减少其进展。在一个实施方案中，所述方法引起受试者的CNS系统中(例如，脑和/或CSF中) IFN-γ的增加。在一个实例中，所述方法恢复神经纤维和/或减少神经纤维损伤的进展。在一个实例中，所述方法恢复神经髓磷脂和/或减少神经髓磷脂损伤的进展。在一个实例中，本发明的方法治疗或预防WO2015136541中公开的疾病或病况和/或所述方法可以与WO2015136541中公开的任何方法一起使用(该文献的公开内容通过引用以其整体并入本文，例如，用于公开此类方法、疾病、病况和可以施用于受试者以实现CNS和神经退行性疾病和病况的治疗和/或预防的潜在治疗剂，例如，药剂，诸如免疫检查点抑制剂，例如抗PD -1、抗PD-L1、抗TIM3或其中公开的其他抗体)。

可治疗的癌症包括未血管化、或实质上未血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待用本发明治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤、胚细胞瘤和肉瘤；及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤；良性和恶性肿瘤；以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌瘤和黑色素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。

血液癌是血液或骨髓的癌症。血液(或造血)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病及成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(低度恶性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病及脊髓发育不良。

实体肿瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型来命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体肿瘤、诸如肉瘤和癌瘤的实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤、和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合性胶质细胞瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、胚组织瘤、成神经管细胞瘤、许旺氏细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移)。

在一个实例中，所述癌症是血液学癌症。在一个实例中，所述癌症是NSCLC。在一个实例中，所述癌症是肾细胞癌。在一个实例中，所述癌症是尿路上皮癌。在一个实例中，所述癌症是黑色素瘤。

•急性播散性脑脊髓炎(ADEM)

•急性坏死性出血性脑白质炎

•艾迪生氏病

•丙种球蛋白血症

•斑秃

•淀粉样变性

•强直性脊柱炎

•抗GBM/抗TBM肾炎

•抗磷脂综合征(APS)

•自身免疫性血管性水肿

•自身免疫性再生障碍性贫血

•自身免疫性自主神经功能障碍

•自身免疫性肝炎

•自身免疫性高脂血症

•自身免疫性免疫缺陷

•自身免疫性内耳疾病(AIED)

•自身免疫性心肌炎

•自身免疫性卵巢炎

•自身免疫性胰腺炎

•自身免疫性视网膜病变

•自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)

•自身免疫性甲状腺疾病

•自身免疫性荨麻疹

•轴突和神经元神经病变

•Balo病

•白塞氏病

•大疱性类天疱疮

•心肌病

•Castleman疾病

•乳糜泻

•查加斯病

•慢性疲劳综合征

•慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)

•慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)

•Churg-Strauss综合征

•瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮

•克罗恩氏病

•Cogans综合征

•冷凝集素疾病

•先天性心脏阻滞

•柯萨奇心肌炎

•CREST疾病

•必需的混合冷球蛋白血症

•脱髓鞘神经病

•疱疹样皮炎

•皮肌炎

•德维克氏病(视神经脊髓炎)

•盘状狼疮

•Dressler氏综合征

•子宫内膜异位症

•嗜酸性粒细胞性食管炎

•嗜酸性粒细胞性筋膜炎

•结节性红斑

•实验性过敏性脑脊髓炎

•埃文斯综合征

•纤维肌痛

•纤维化肺泡炎

•巨细胞动脉炎(颞动脉炎)

•巨细胞心肌炎

•肾小球肾炎

•Goodpasture氏综合征

•伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)(以前称为韦格纳氏肉芽肿病)

•格雷夫斯氏病

•格林-巴利综合征

•桥本氏脑炎

•桥本氏甲状腺炎

•溶血性贫血

•Henoch-Schonlein紫癜

•妊娠疱疹

•低丙种球蛋白血症

•特发性血小板减少性紫癜(ITP)

•IgA肾病

•IgG4相关的硬化性疾病

•免疫调节的脂蛋白

•包涵体肌炎

•间质性膀胱炎

•幼年型关节炎

•幼年型糖尿病(1型糖尿病)

•幼年型肌炎

•川崎综合征

•兰伯特-伊顿综合征

•白细胞碎裂性血管炎

•扁平苔藓

•硬化性苔藓

•木质样结膜炎

•线性IgA疾病(LAD)

•狼疮(SLE)

•慢性莱姆病

•梅尼埃氏病

•显微镜下多血管炎

•混合性结缔组织病(MCTD)

•Mooren氏溃疡

•Mucha-Habermann病

•多发性硬化症

•重症肌无力

•肌炎

•发作性睡病

•视神经脊髓炎(Devic's)

•中性粒细胞减少

•眼瘢痕性类天疱疮

•视神经炎

•回文性风湿病

•PANDAS(与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神病症)

•副肿瘤性小脑变性

•阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)

•Parry Romberg综合征

•Parsonnage-Turner综合征

•睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)

•天疱疮

•周围神经病变

•周围性脑脊髓炎

•恶性贫血

•POEMS综合征

•结节性多动脉炎

•I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征

•风湿性多肌痛

•多肌炎

•心肌梗塞后综合征

•心包切开术后综合征

•孕酮性皮炎

•原发性胆汁性肝硬化

•原发性硬化性胆管炎

•银屑病

•银屑病关节炎

•特发性肺纤维化

•坏疽性脓皮病

•纯红细胞发育不全

•Raynauds现象

•反应性关节炎

•反射性交感神经营养不良

•Reiter氏综合征

•复发性多软骨炎

•多动腿综合征

•腹膜后纤维化

•风湿热

•类风湿性关节炎

•肉状瘤病

•施密特综合征

•巩膜炎

•硬皮病

•斯耶格伦氏综合征

•精子和睾丸自身免疫

•僵人综合征

•亚急性细菌性心内膜炎(SBE)

•Susac氏综合征

•交感神经性眼炎

•Takayasu氏动脉炎

•颞动脉炎/巨细胞动脉炎

•血小板减少性紫癜(TTP)

•Tolosa-Hunt综合征

•横贯性脊髓炎

•1型糖尿病

•溃疡性结肠炎

•未分化结缔组织病(UCTD)

•葡萄膜炎

•血管炎

•水疱性皮肤病

•白癜风

•韦格纳氏肉芽肿病(现称为肉芽肿病伴多血管炎(GPA))。

• 阿尔兹海默氏病

• 强直性脊柱炎

• 关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎)

• 哮喘

• 动脉粥样硬化

• 克罗恩氏病

• 结肠炎

• 皮炎

• 憩室炎

• 纤维肌痛

• 肝炎

• 肠易激综合征(IBS)

• 系统性红斑狼疮(SLE)

• 肾炎

• 帕金森氏病

• 溃疡性结肠炎。

本发明提供了以下概念。

1. 用于治疗受试者的急性微生物感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且治疗所述受试者的急性微生物感染。

2. 用于持久地治疗受试者的微生物(例如，细菌)感染的方法中的可编程核酸酶，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述受试者的微生物的基因组包含的靶标位点，由此持久地杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述治疗方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且持久地治疗所述受试者的微生物感染。

3. 概念2的核酸酶，其中在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者施用核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或对核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，其中T2是T1之后至少1小时。

4. 任一前述概念的核酸酶，其中所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍。

5. 任一前述概念的核酸酶，其中所述方法包括在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120分钟)。

6. 任一前述概念的核酸酶，其中所述方法包括减少所述感染，使得在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。

7. 任一前述概念的核酸酶，其中所述方法包括向所述受试者施用RNA或编码RNA用于在所述受试者中表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的微生物中的靶标位点。

8. 概念7的核酸酶，其中将所述核酸酶与所述RNA或核酸同时或依次施用于所述受试者。

9. 概念7的核酸酶，其中在向所述受试者施用所述RNA或核酸之前，所述受试者包含核酸酶。

10. 概念7至9中任一项的核酸酶，其中将多种病毒(例如，噬菌体)施用于所述受试者，其中每种病毒包含所述核酸的拷贝，其中所述病毒感染由所述受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

11. 概念10的核酸酶，其中施用的病毒：由所述受试者包含的微生物的比率为10至150。

12. 根据任一前述概念的核酸酶，其中所述受试者是人或动物，任选地其中所述受试者是超过65岁的人或者是儿科患者。

13. 根据概念12的核酸酶，其中所述感染是肺部、腹部或尿路的感染；或其中所述受试者已经经历手术，正进行免疫抑制剂药物治疗和/或正患有慢性疾病。

14. 根据任一前述概念的核酸酶，其中任选地到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间。

15. 根据任一前述概念的核酸酶，其中所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

16. 根据概念12至15中任一项的核酸酶，其中所述方法治疗或预防所述受试者中的败血病和/或败血症(例如，败血性休克)。

17. 概念16的核酸酶，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有＜36℃或＞38℃的温度；>90/min的心率，>20次呼吸/min的呼吸速率或PaCO

18. 概念16或17的核酸酶，其中在开始治疗时，所述受试者(例如，人)具有以下中的两种或更多种的存在：体温异常、心率异常、呼吸速率异常、血液气体异常和白血细胞计数异常。

19. 任一前述概念的核酸酶，其中所述受试者是人或动物，且所述微生物是细菌(例如，大肠杆菌或艰难梭菌)，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述细菌对所述受试者的血液感染减少至少100或1000倍。

20. 概念12至19中任一项的核酸酶，其中在临治疗前，所述受试者的血液被10

21. 根据概念1至11中任一项的核酸酶，其中所述受试者是植物。

22. 根据任一前述概念的核酸酶，其中所述微生物是细菌。

23. 根据概念22的核酸酶，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。

24. 根据概念22或23的核酸酶，其中所述细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、军团菌、嗜血杆菌、

25. 根据任一前述概念的核酸酶，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

26. 用于在所述治疗方法中与任一前述概念的核酸酶一起使用的多种病毒(例如，噬菌体或用于产生噬菌体的噬菌粒)，其中每种病毒包含如概念7至9中任一项中所定义的核酸的拷贝，其中所述病毒能够感染由受试者包含的微生物以向其递送所述核酸。

27. 组合物，其包含用于在所述治疗方法中对概念1至25中任一项的核酸酶进行编程的多种核酸，其中每种核酸是如概念7至9中任一项中所定义的核酸。

28. CRISPR/Cas系统，其包含用于治疗方法中的根据任一前述概念的核酸酶，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)，且所述系统包含一个或多个指导RNA或编码一个或多个指导RNA的DNA，其中每个指导RNA能够对所述Cas核酸酶进行编程以切割由所述微生物的基因组包含的靶标位点。

29. 用于概念28的系统中的指导RNA或编码指导RNA的DNA，其用于治疗受试者中的急性微生物感染、例如败血病或败血症的方法中。

30. 包含概念27或29中所述的指导RNA或DNA的核酸载体。

31. 概念30的载体，其中所述载体是噬菌体、噬菌粒、病毒噬菌体、病毒、质粒(例如，接合质粒)或转座子。

32. 用于施用于人或动物以用于治疗败血症或败血病的抗败血症或抗败血病组合物，所述组合物包含多种载体，其中每种载体都根据概念30或31。

33. 治疗受试者的急性微生物感染的方法，其中所述方法如任一前述概念所定义。

34. 概念1至26和28至30中任一项的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施如任一前述概念所定义的治疗方法的组合物中的用途，其中所述受试者是除了人或动物以外的生物体。

35. 概念1至26和28至30中任一项的核酸酶、多种病毒、系统、指导RNA、DNA或载体在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

36. 可编程核酸酶在制备用于实施基底的微生物感染的离体处理方法的组合物中的用途，其中所述微生物感染由第一物种或菌株的微生物引起，且所述核酸酶可编程以切割由已经感染所述基底的微生物的基因组包含的靶标位点，由此杀死所述第一物种或菌株的微生物，或减少所述微生物的生长或增殖，所述处理方法包括将所述受试者暴露于所述核酸酶，其中所述核酸酶被编程以切割所述靶标位点，由此切割由所述受试者包含的微生物的基因组，且处理所述基底的急性微生物感染。

37. 概念34、35或36的用途，其中在第一时间(T1)和在第二时间(T2)向所述受试者或基底施用核酸酶(例如，编程的核酸酶)和/或对核酸酶进行编程以识别和切割靶标位点的核酸，其中T2是T1之后至少1小时。

38. 概念34至37中任一项的用途，其中到所述处理的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍。

39. 概念34至38中任一项的用途，其中在将所述受试者暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120分钟)。

40. 概念34至39中任一项的用途，其中在所述治疗的前30分钟后，感染的减少立即持续30分钟。

41. 概念34至40中任一项的用途，其中所述方法包括向所述受试者或基底施用RNA或编码RNA用于在所述受试者或基底中或上表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者或基底包含的微生物中的靶标位点。

42. 概念41的用途，其中将所述核酸酶与所述RNA或核酸同时或依次施用于所述受试者或基底。

43. 概念41的用途，其中在施用所述RNA或核酸之前，所述受试者或基底包含核酸酶。

44. 概念41至43中任一项的用途，其中将多种病毒(例如，噬菌体)施用于所述受试者或基底，其中每种病毒包含所述核酸的拷贝，其中所述病毒感染由所述受试者或基底包含的微生物以向其递送所述核酸。

45. 概念44的用途，其中施用的病毒：微生物的比率为10至150。

46. 概念34至45中任一项的用途，其中任选地到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少90%，持续1小时或更长时间。

47. 概念34至46中任一项的用途，其中到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，所述感染减少至少100倍；且其中在将所述受试者或基底暴露于编程的核酸酶后，使所述感染减少至少100倍维持至少60分钟(例如，至少120、145或180分钟)。

48. 概念34至47中任一项的用途，其中所述受试者是植物；或其中所述基底是金属、塑料、混凝土、石材、木材、玻璃或陶瓷基底。

49. 概念34至48中任一项的用途，其中所述微生物是细菌。

50. 根据概念49的用途，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。

51. 根据概念49或50的用途，其中所述细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、军团菌、嗜血杆菌、

52. 概念34至51中任一项的用途，其中所述核酸酶是Cas核酸酶(例如，Cas 3或9)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或锌指核酸酶。

以下以及所有美国对应专利和申请(包括继续申请或分案)的公开内容通过引用并入本文以用于本发明中：US9701964、WO2016177682、US20180140698、WO2017211753、PCT/EP2018/066954、PCT/EP2018/066980、PCT/EP2018/071454、USSN 15/985,658、US20160345578和US20180155729。

本发明提供了以下方面。具体而言，一个方面基于以下令人惊讶的发现：在混合细菌群体中利用内源Cas3能够杀死实质上所有靶向的细菌。这在本文中通过包含与艰难梭菌宿主细胞混合的大肠杆菌的混合细菌群体(例如，可以在人微生物组(例如，肠道微生物组)中发现的组合)来举例说明。此外，当使用内源Cas3时，令人惊讶地看到持久的杀死。发明人相信，迄今本领域中尚未报道在混合细菌群体中的内源Cas3的这种令人惊讶的利用的出版物。为此，提供了以下方面：-

1. 修饰微生物群细菌的混合群体的方法，所述混合群体包含第一和第二细菌亚群，其中所述第一亚群包含第一微生物群物种，且所述第二亚群包含第二微生物群物种的宿主细胞群体，其中所述第二物种是与所述第一微生物群物种不同的物种，且所述第二物种的细菌包含编码功能性内源Cas核酸酶的内源核酸，所述方法包括

(a) 将微生物群细菌的混合群体与编码宿主修饰(HM) crRNA的工程改造的核酸序列的多个拷贝组合，和

(b) 在宿主细胞中表达HM-crRNA，其中每个HM-crRNA由各自的工程改造的核酸序列编码，并且可与所述第二物种的细菌内源且在各自的宿主细胞中表达的功能性表达的内源Cas核酸酶一起操作，所述表达的内源Cas核酸酶在所述各自的宿主细胞中有活性，其中所述各自的工程改造的核酸序列和Cas形成HM-CRISPR/Cas系统，且所述工程改造的核酸序列包含

(i) 包含间隔区和编码所述HM-crRNA的重复序列的核酸序列；

(ii) 编码所述HM-crRNA的序列的核酸序列，其中所述HM-crRNA序列能够与宿主细胞靶标序列杂交以将內源Cas核酸酶引导至宿主细胞中的靶标序列；且其中所述工程改造的核酸序列不编码对于所述第二细菌物种內源的所述Cas核酸酶；由此HM-crRNA指导内源Cas活性以修饰宿主细胞中的宿主靶标序列，由此杀死宿主细胞或减少宿主细胞群体生长，由此减少所述宿主细胞群体的比例和改变混合细菌群体中的所述细菌亚群的相对比例。

任选地，所述HM-系统包含tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列。

2. 方面1的方法，其包括与未接受所述Cas修饰的宿主细胞的对照群体的生长相比，例如，到实施所述方法的前15或30分钟，使宿主细胞群体生长减少至少100倍。

任选地，所述方法包括与未接受所述Cas修饰的宿主细胞的对照群体的生长相比，例如，到实施所述方法的前15或30分钟，使宿主细胞群体生长减少至少3或4个log。

在一个实例中，到所述治疗(即，实施所述方法)的前0.5、1或2小时，实现所述宿主细胞的至少80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%杀死。在一个实例中，到所述治疗的前30分钟，实现所述宿主细胞的至少99%杀死。在一个实例中，到所述治疗的前2小时，实现所述宿主细胞的至少99%杀死。在一个实例中，实现100%杀死。这些在下面例举。在一个实施方案中，杀死少于100%的宿主细胞。

在一个实例中，使所述宿主细胞群体减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%，例如，在治疗的前15分钟内。在一个实例中，使所述宿主细胞群体减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%，例如，在所述治疗的前30分钟内。

任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述宿主细胞群体减少至少100倍。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述宿主细胞群体减少至少1000倍。任选地，所述方法包括到所述治疗的前30分钟(例如，到前15分钟)，使所述宿主细胞群体减少至少10000倍。

3. 任一前述方面的方法，其中所述宿主细胞群体在表面上，由此宿主细胞群体生长在所述表面上被抑制。

4. 任一前述方面的方法，其中所述第一微生物群物种包含与宿主细胞物种的编码16s核糖体RNA的DNA序列具有至少80%同一性的编码16s核糖体RNA的DNA序列，其中所述混合群体中的第一细菌的生长不被所述HM-系统抑制。

5. 任一前述方面的方法，其中所述第一物种是人肠道共生物种和/或人肠道益生菌物种。

6. 任一前述方面的方法，其中所述宿主物种是梭菌物种。

任选地，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞和/或所述第一细胞是革兰氏阳性细菌细胞。

任选地，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞和/或所述第一细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

任选地，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞和/或所述第一细胞是革兰氏阳性细菌细胞。

任选地，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞和/或所述第一细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

任选地，所述宿主细胞包含功能性内源I型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IA型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IB型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IC型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源ID型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IE型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IF型Cas3。任选地，所述宿主细胞包含功能性内源IU型Cas3。

例如，所述宿主细胞物种是梭菌物种(例如，艰难梭菌)，且所述Cas是内源IB型Cas3。例如，所述宿主细胞物种是假单胞菌物种(例如，铜绿假单胞菌)，且所述Cas是内源IE或F型Cas3。例如，所述宿主细胞物种是埃希氏杆菌物种(例如，大肠杆菌)，且所述Cas是内源IE型Cas3(例如，活化或去抑制的Cas3)。例如，所述Cas3与功能性内源宿主细胞Cascade复合体一起使用。在该实例中，没有将Cas3和/或Cascade Cas (或编码Cas3和/或CascadeCas的核苷酸序列)引入宿主细胞。

在一个实例中，所述第一细胞是大肠杆菌。任选地，在混合群体中存在一种、两种、三种或更多种另外物种的细菌。在一个实例中，所述微生物群是人、动物、哺乳动物、啮齿动物、小鼠或昆虫微生物群(例如，肠道或血液微生物群)群体。例如，所述微生物群是哺乳动物肠道微生物群群体。

任选地，所述宿主细胞群体由厚壁菌细胞组成。

任选地，所述修饰是切割宿主染色体靶标序列，其中杀死宿主细胞。因此，所述方法可以是用于杀死宿主细菌细胞(例如由人、哺乳动物、昆虫或动物受试者包含)的方法。

7. 任一前述方面的方法，其中对于每种宿主细胞，所述系统包含根据(i)至(iv)的组分：(i)至少一种编码具有内源Cas核酸酶活性的Cas核酸酶的内源核酸序列，所述内源Cas核酸酶由所述宿主细胞细菌基因组包含的内源核酸序列编码；(ii) 包含间隔区序列和编码HM-crRNA的重复区的工程改造的HM CRISPR阵列，所述HM-crRNA包含与宿主细胞靶标序列杂交以将所述Cas指导至宿主细胞中的靶标以修饰靶标序列的序列；(iii) 任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；(iv) 其中在转化宿主细胞的核酸载体上编码组分(ii)，由此HM-crRNA将内源Cas活性指导至靶标以修饰宿主细胞中的宿主靶标序列；且其中所述靶标序列被内源Cas活性修饰，由此杀死宿主细胞或减少宿主细胞生长；所述方法包括将(iv)的载体引入宿主细胞和在宿主细胞中表达所述HM-crRNA，使HM-cRNA与宿主细胞靶标序列杂交以将内源Cas指导至宿主细胞中的靶标以修饰靶标序列，由此杀死宿主细胞或减少宿主细胞生长，由此改变细菌的混合群体中的所述亚群的相对比例。

8. 任一前述方面的方法，其中每种载体是能够感染宿主细胞的病毒或噬菌体、噬菌粒或非复制性颗粒。

9. 任一前述方面的方法，其中可替代地，HM-crRNA和tracrRNA由单一指导RNA(gRNA)包含，所述方法包括将所述gRNA引入宿主细胞或在宿主细胞中表达gRNA。

10. 任一前述方面的方法，其中所述第一和第二物种各自都是相应的厚壁菌门物种，且所述第一细菌的生长不被HM-系统抑制。

11. 任一前述方面的方法，其中所述第一和第二物种各自都是相应的革兰氏阳性物种，且所述第一细菌的生长不被HM-系统抑制。

12. 任一前述方面的方法，其中所述第一和第二物种各自是相应的革兰氏阴性物种，且所述第一细菌的生长不被HM-系统抑制。

11. 任一前述方面的方法，其中所述第一物种各自是革兰氏阴性物种，所述宿主细胞物种是革兰氏阳性物种，且所述第一细菌的生长不被HM-系统抑制。

如下所例举，发明人令人惊讶地可以将所述载体从革兰氏阴性细胞转移至革兰氏阳性细胞以在本发明的方法中杀死后者。

在一个实例中，所述第一细胞是包含工程改造的核酸的载体细胞。例如，可以通过第一细菌与宿主细胞的接合以及核酸向宿主细胞的接合转移而从载体细菌转移核酸。或者，所述第一细胞可以包含编码病毒、噬菌体或非复制性颗粒的核酸，其中后者在第一细胞中产生，且其后感染混合群体中的宿主细胞，由此将核酸引入宿主细胞中用于根据本发明的方法对其进行修饰。

12. 任一前述方面的方法，其用于治疗人或动物受试者的宿主细胞感染，所述方法包括将所述宿主细胞与所述编码HM-crRNA的工程改造核酸序列同时或依次暴露于第一抗生素，其中靶标序列各自由对所述第一抗生素的抗性的抗生素抗性基因包含，其中在受试者中治疗所述宿主细胞感染。

13. 任一前述方面的方法，其用于治疗或降低人或动物受试者中的疾病或病况的风险，其中所述疾病或病况由所述第二细菌物种介导，其中所述第一细菌物种是人益生菌的、共栖的或共生的，且其中所述第一细菌物种细胞不包含所述靶标序列，其中实施通过所述Cas的靶标序列修饰，且宿主细胞的生长在所述受试者中被抑制，但第一细菌物种细胞的生长不被抑制，其中所述疾病或病况得到治疗或所述受试者中的疾病或病况的风险降低。

因此，所述第一细胞可以是载体细胞，例如大肠杆菌或乳杆菌(例如，罗伊氏乳杆菌)细胞(参见上文对载体细胞的进一步讨论)。

14. 任一前述方面的方法，其用于处理工业或医疗流体、表面、设备或容器；或用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品，其中所述宿主细胞由流体、表面、设备、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在流体、表面、设备、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品上，其中宿主细胞生长被抑制，由此实施所述处理。

15. 任一前述方面的方法，其中每种宿主细胞是葡萄球菌、链球菌、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌)，不动杆菌(例如，鲍曼不动杆菌)，沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)，克雷伯氏菌(例如，肺炎克雷伯氏菌)，螺杆菌(例如，幽门螺杆菌)，李斯特氏菌，大肠杆菌，脱硫弧菌，弧菌(例如，霍乱弧菌)或梭菌(例如，艰难梭菌)细胞。

16. 任一前述方面的方法，其中每个靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因或必需基因包含。

17. 任一前述方面的方法，其中每个靶标序列对于宿主细胞是独特的，例如，在相同物种的细胞中没有发现，但在对于宿主细胞而言是不同的菌株中发现。

18. 任一前述方面的方法，其用于增加混合群体中的拟杆菌的比例，其中实施所述增加。

19. 方面18的方法，其中多形拟杆菌和/或脆弱拟杆菌的比例增加。

20. 方面19或19的方法，其中所述混合群体包含的拟杆菌门相比于厚壁菌门或革兰氏阳性宿主细胞的相对比例增加。

21. 任一前述方面的方法，其用于有利于人或动物中的共栖或共生的拟杆菌。

22. 任一前述方面的方法，其进一步包括在实施所述宿主细胞的修饰后，获得包含改变比率的所述第一和第二细胞的一定量的所述混合群体的细菌，产生包含所述获得的细菌的细菌培养物，和向人或动物施用培养物(任选地与另外的治疗剂一起)，由此治疗或预防人或动物中的疾病或病况。

23. 任一前述方面的方法，其用于在人或动物中产生肠道细菌对潘氏细胞的刺激，其中所述混合群体由所述肠道细菌包含，且其中所述方法包括在所述人或动物中产生包含改变比例的第一和第二细胞的混合群体，或将包含所述改变比例的所述混合群体施用于所述人或动物，由此刺激潘氏细胞。

24. 任一前述方面的方法，其用于在人或动物中产生免疫应答，其中所述肠道细菌由所述混合群体包含，且其中所述方法包括在所述人或动物中产生包含改变比例的第一和第二细胞的混合群体，或将包含所述改变比例的所述混合群体施用于所述人或动物，由此发展所述免疫应答。

25. 任一前述方面的方法，其中步骤(a)的混合群体包含第三细菌物种。

26. 方面25的方法，其中所述第三物种是大肠杆菌。

27. 方面25或26的方法，其中所述第一物种是厚壁菌，且第二物种是厚壁菌，且第三物种是人肠道共生或人肠道益生菌物种。

28. 方面25的方法，其中所述第一物种是革兰氏阳性物种，且第二物种是革兰氏阴性物种，且所述第三物种是人肠道共生或人肠道益生菌物种(例如，革兰氏阴性物种)。

在一个实例中，所述第一细胞是大肠杆菌细胞，且所述宿主细胞选自艰难梭菌、幽门螺杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌或大肠杆菌细胞，且所述Cas是I型Cas3核酸酶，其切割宿主细胞的染色体靶标序列，由此杀死宿主细胞。在一个实例中，所述Cas3是IB型Cas3，例如，其中所述宿主细胞是艰难梭菌细胞。在一个实例中，所述Cas3是IE或F型Cas3，例如，其中所述宿主细胞是铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌细胞。在一个实例中，所述Cas3是IE型Cas3，例如，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实例中，所述Cas3是IE型Cas3，例如，其中所述宿主细胞是沙门氏菌细胞。

本发明还提供了以下概念：-

1. 用于治疗人或动物受试者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用可编程核酸酶实施，所述可编程核酸酶被编程以切割所述靶标位点，其中所述受试者正患有除了致病性细菌感染以外的另外的疾病或病况，且所述方法包括将疗法施用于所述受试者用于治疗或预防另外的疾病或病况，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述疗法对于治疗或预防所述疾病或病况是有效的。

2. 概念1的方法，其中所述受试者是癌症患者，且所述疗法包括施用造血干细胞移植物、化学治疗剂、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激动剂或免疫细胞增强剂；过继性细胞疗法；放射或手术。

3. 概念2的方法，其中所述疗法是免疫检查点抑制剂抗体或选自以下的抗体：伊匹木单抗(或YERVOY®)、曲美木单抗、尼沃单抗(或OPDIVO®)、派姆单抗(或KEYTRUDA®)、pidilizumab、BMS-936559、德瓦鲁单抗(或IMFINZI®)和阿特朱单抗(或TECENTRIQ®)。

4. 概念1的方法，其中所述疗法是组织、器官或细胞移植。

5. 概念1的方法，其中所述细菌感染的治疗与向所述受试者施用所述疗法同时实施。

6. 概念1的方法，其中所述细菌感染的治疗在向所述受试者施用所述疗法之前或之后立即实施。

7. 概念1的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用编码RNA用于在所述受试者中表达所述RNA的核酸，其中所述RNA与核酸酶复合以对所述核酸酶进行编程以切割由所述受试者包含的第一细菌中的靶标位点，由此杀死所述第一细菌。

8. 概念1的方法，其包括向所述受试者施用核酸载体，其中所述载体编码所述可编程核酸酶。

9. 概念1的方法，其中所述可编程核酸酶是所述第一细胞的内源核酸酶。

10. 概念1的方法，其中在编程的核酸酶存在的情况下的疗法效力大于在广谱抗生素存在的情况下的疗法效力。

11. 概念1的方法，其中在编程的核酸酶存在的情况下的疗法效力大于在选自以下的抗生素存在的情况下的疗法效力：甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普丁；替考拉宁；头孢菌素；碳青霉烯；氟喹诺酮；氨基糖苷；粘菌素；红霉素；克林霉素；β-内酰胺；大环内酯；阿莫西林；阿奇霉素；青霉素；头孢曲松；阿奇霉素；环丙沙星；异烟肼(INH)；利福平(RMP)；阿米卡星；卡那霉素；卷曲霉素；甲氧苄啶；呋喃妥因(itrofurantoin)；头孢氨苄；阿莫西林；甲硝哒唑(MTZ)；头孢克肟；四环素；和美罗培南。

12. 概念1的方法，其中所述第一细菌选自：(i)对选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普丁和替考拉宁的抗生素抗性的金黄色葡萄球菌；(ii)对选自头孢菌素、碳青霉烯、氟喹诺酮、氨基糖苷和粘菌素的抗生素抗性的绿脓假单胞菌；(iii)对碳青霉烯抗性的克雷伯氏菌属物种；(iv)对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺、大环内酯、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素抗性的链球菌属物种；(v)对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素抗性的沙门氏菌属物种；(vi)对环丙沙星或阿奇霉素抗性的志贺氏菌属物种；(vii)对选自异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素和阿奇霉素的抗生素抗性的结核分枝杆菌；(viii)对万古霉素抗性的肠球菌属物种；(ix)对选自头孢菌素和碳青霉烯的抗生素抗性的肠杆菌科物种；(x)对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素抗性的大肠杆菌；(xi)对甲硝哒唑(MTZ)、氟喹诺酮或碳青霉烯抗性的梭菌属物种；(xii)对选自头孢克肟、头孢曲松、阿奇霉素和四环素的抗生素抗性的淋病奈瑟氏菌；(xiii)对选自β-内酰胺、美洛培南和碳青霉烯的抗生素抗性的鲍曼不动杆菌；和(xiv)对环丙沙星或阿奇霉素抗性的弯曲杆菌属物种。

13. 概念1的方法，其中所述感染的治疗在所述受试者中治疗或预防选自以下的病况：阴道病、脑膜炎、肺炎、尿路感染、膀胱炎、肾炎、肠胃炎、皮肤感染、脓疱疮、丹毒、蜂窝组织炎、败血病或败血症。

14. 概念1的方法，其中所述另外的疾病或病况是癌症；自身免疫性疾病或病况；或胃肠道疾病或病况。

15. 概念1的方法，其中所述受试者包含与所述第一菌株或物种不同的一种或多种菌株或物种的细菌(第二细菌)，其中所述第二细菌的基因组不包含靶标位点，其中所述第二细菌的基因组在受试者中不被编程的核酸酶切割，由此第二细菌在患者中在编程的核酸酶存在的情况下存活，且其中所述疗法在所述第二细菌存在的情况下是有效的。

16. 概念15的方法，其中患者中的第二细菌的减少与疗法效力的降低相关。

17. 概念15的方法，其中所述第二细菌选自：

18. 概念1的方法，其中所述第一细菌选自大肠杆菌、艰难梭菌、霍乱弧菌、葡萄球菌、化脓性链球菌、鲍曼不动杆菌、军团菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌细菌。

19. 概念1的方法，其中所述核酸酶是Cas核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶。

20. 用于治疗癌症患者中由第一物种或菌株的细菌(第一细菌)引起的致病性细菌感染的方法，所述方法包括通过切割由所述第一细菌的基因组包含的靶标位点来选择性杀死由所述受试者包含的第一细菌，其中所述切割使用Cas核酸酶实施，所述Cas核酸酶被指导RNA编程以切割所述靶标位点，其中所述方法包括将免疫疗法施用于所述受试者用于治疗所述患者中的癌症，其中所述核酸酶治疗所述感染，且在编程的核酸酶存在的情况下，所述免疫疗法对于治疗所述癌症是有效的。

应理解的是，本文描述的具体实施方案以举例说明的方式显示，而不是对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各个实施方案中。本领域技术人员将认识到或仅使用常规研究就能够确定本文描述的具体程序的多个等同方案。此类等同方案被认为在本发明的范围内并被权利要求所涵盖。说明书中提及的所有出版物和专利申请表明本发明所属的领域中的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以及所有美国等同专利申请和专利通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含(comprising)”联合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以指“一个(one)”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中使用术语“或”用来意指“和/或”，除非明确指出其仅指代替代方案，或替代方案是相互排斥的，但本公开支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。贯穿本申请，术语“约”用来表示值包括装置、用于确定该值的方法的误差的固有变异或研究受试者中存在的变异。

如在本说明书和权利要求(多项权利要求)中所用，词语“包含 (comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises))”，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has))”，“包括(including)”(和包括(including) 的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include))”或“含有(containing)”(和含有(containing)的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain))”是包括性或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。

如本文所用的术语“或其组合”或类似术语是指在该术语之前的所列举项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中顺序是重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或条目的重复的组合，诸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解通常在任意组合中的项目或条目的数量没有限制，除非从上下文中显而易见。

本公开的任何部分可以与本公开的任何其他部分组合阅读，除非另外从上下文显而易见。

根据本发明，本文公开和请求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下形成和实施。尽管本发明的组合物和方法在优选的实施方案的方面进行描述，但对本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法和方法的步骤或步骤的顺序施加变化。对本领域技术人员显而易见的所有这样相似的替代和修改被视为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

在以下非限制性实施例中更详细地描述了本发明。

实施例

用可编程核酸酶精确快速杀死细菌

实施例提供了用于快速和精确杀死大肠杆菌和艰难梭菌菌株的方法。作为模型可编程核酸酶系统，我们使用了CRISPR指导的载体(CGV™)系统来特异性靶向肠出血性大肠杆菌(EHEC)和益生菌大肠杆菌Nissle。

实施例1. 精确杀死靶标菌株肠出血性大肠杆菌(EHEC)。

1.1. 设计、构建和递送靶向大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的CRISPR指导的载体(CGV)系统。

本发明提供了一种CGV系统，以特异性靶向肠出血性大肠杆菌(EHEC) ATCC43888(获得自美国典型培养物保藏中心的人粪便分离物)。CGV系统包含两种载体：(a) 含有tracrRNA和来自化脓性链球菌的Cas9蛋白(SpCas)的载体；(b) 含有指导RNA (gRNA)的载体，所述指导RNA (gRNA)包含能够与宿主细胞中的靶标序列杂交以将SpCas9指导至靶标序列的核苷酸序列。为了使得能够特异性杀死大肠杆菌(EHEC) ATCC43888，从该菌株的基因组选择特定序列用于靶向。具体地，该序列含有来自大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的23S核糖体RNA基因的20个核苷酸。另外，5'-NGG原间隔区相邻基序(PAM)与所选靶标序列相邻定位。23S rRNA基因中选定的靶标序列可以在表3中找到。

1.2 靶向大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的CGV系统的表征。

为了建立CGV系统在介导大肠杆菌(EHEC) ATCC43888中的序列特异性杀死中的功能性，将该系统转化至大肠杆菌(EHEC) ATCC43888细胞中。将过夜培养物在新鲜的溶原性培养液(LB)中1:100稀释，并生长至指数中期OD600 ~0.6。通过添加茶碱和阿拉伯糖(2 mM茶碱和1%阿拉伯糖)诱导CRISPR系统，并通过每15分钟将连续稀释液中的培养物铺板1 h来随着时间追踪菌株的存活(图1)。大肠杆菌(EHEC)中的CRISPR诱导令人惊讶地触发细胞的快速杀死，在诱导的30分钟内实现99.98%杀死(图1)。

实施例2. 在大蜡螟幼虫体内感染模型中体内CRISPR杀死靶标菌株肠出血性大肠杆菌(EHEC)。

2.1. CRISPR针对大蜡螟中的大肠杆菌(EHEC) ATCC43888感染的效力

在大蜡螟体内感染模型中测试对靶标菌株大肠杆菌(EHEC) ATCC43888的CRISPR杀死。为了该目的，向大蜡螟幼虫在最后的左腹足后递送细菌10

2.2. 肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染的大蜡螟幼虫的存活曲线。

向大蜡螟幼虫在最后的左腹足后递送细菌(8 × 10

实施例3. 精确杀死靶标菌株益生菌大肠杆菌Nissle 1917

3.1. 设计、构建和递送靶向大肠杆菌Nissle 1917的CRISPR指导的载体(CGV)系统。

本发明提供了特异性靶向大肠杆菌Nissle 1917的CGV系统。CGV系统包含两种载体：(a)含有tracrRNA和来自化脓性链球菌的Cas9(SpCas)的载体；(b) 含有指导RNA(gRNA)的载体，所述指导RNA (gRNA)包含能够与宿主细胞中的靶标序列杂交以将SpCas9指导至靶标序列的核苷酸序列。为了使得能够特异性杀死大肠杆菌Nissle 1917，从该菌株的基因组选择特定序列用于靶向。具体地，该序列含有来自大肠杆菌Nissle 1917的

此外，选择不同的基因组靶标以特异性杀死大肠杆菌Nissle 1917。所述序列含有来自

3.2. 构建和递送靶向大肠杆菌Nissle 1917的CRISPR指导的载体(CGV)。

为了建立CGV在介导大肠杆菌Nissle 1917中的序列特异性杀死中的功能性，将CGV系统转化至大肠杆菌Nissle 191细胞中。将过夜培养物在新鲜的溶原性培养液(LB)中1:100稀释，并生长至指数中期OD600 ~0.6。通过添加茶碱和阿拉伯糖(2 mM茶碱和1%阿拉伯糖)诱导CRISPR系统，并通过每15分钟将连续稀释液中的培养物铺板3 h来随着时间追踪菌株的存活率(图5)。图5和6显示大肠杆菌Nissle 1917中的CRISPR杀死测定，其分别靶向

实施例4.

该实验涉及使用gRNA编码CRISPR阵列精确地杀死艰难梭菌，所述gRNA编码CRISPR阵列通过接合质粒作为载体(我们称为CRISPR指导载体(CGV™))从益生菌载体细菌物种递送。载体细菌(含有CRISPR指导载体(CGV™)的大肠杆菌供体菌株)与艰难梭菌交配，其在递送含有设计阵列的CGV™后被杀死。该CGV™利用艰难梭菌

引言

艰难梭菌(

研究目标

目标1：通过接合递送CGV。

设计并组装CRISPR指导载体(CGV)，其含有特异性靶向并杀死艰难梭菌的阵列。组装缺乏所述阵列的相同CGV以用作结合效率的对照。将两种CGV转化至载体菌株大肠杆菌CA434中，其被用作供体菌株以将质粒接合至我们的目标菌株艰难梭菌

目标2：利用艰难梭菌内源Cas3机制。

在递送的CRISPR阵列在受体靶标菌株艰难梭菌中转录后，指导内源Cas3以切割其自身的DNA；导致细菌死亡。

目标3：艰难梭菌

使用设计的CGV实现对转接合体艰难梭菌细胞的有效杀死。

材料和方法

细菌菌株和生长条件

大肠杆菌菌株CA434获自Chain Biotech。将其在富含营养物的培养基(2xYT)上培养，并在37℃和250rpm下生长过夜。当需要维持CGV时，向培养基中补充12,5μg/mL甲砜霉素。

使艰难梭菌

CGV转移程序

通过电穿孔我们的CGV(对照载体pMTL84151 - FJ797649和CRISPR载体pMTL84151 -cdCRISPR1)的任一种获得大肠杆菌CA434的载体细胞。为了做到这一点，将大肠杆菌CA434的过夜培养物在没有选择的新鲜2x YT培养基中1:100稀释，且生长至OD600 ~0.5。然后，通过标准程序使它们为电感受态(Sharan等人，2009)。用质粒pMTL84151 - FJ797649或pMTL84151 - cdCRISPR1转化电感受态细胞，并在2xYT中在37℃下在摇动(250rpm)下恢复1h。最后，将它们铺板在补充有12.5μg/mL甲砜霉素的LB琼脂上以选择转化体。使转化体在补充有12.5 μg/mL甲砜霉素的液体2xYT中在37℃和250rpm下生长，用于与艰难梭菌交配。将1ml供体细胞以4000xg离心2分钟，除去上清液，并用400μl PBS小心洗涤。在第二离心循环后，将沉淀物转移至厌氧室中，用于与艰难梭菌在BHI非选择性板中交配。遵循修改的方案制备艰难梭菌用于交配(Des Purdy等人, 2002)。艰难梭菌

结果

选择携带对照CGV的艰难梭菌转接合体的BHI+CC+甲砜霉素板的复制物显示一致数量的菌落，每个交配实验导致约~600-750个CFU。对于艰难梭菌与携带具有CRISPR阵列的CGV的大肠杆菌CA434的交配，所述板是空的，未观察到菌落。这转化为接受CRISPR阵列的转接合体艰难梭菌

讨论和结论

该实验的结果显示，我们可以成功地将含有期望的CRISPR阵列的CGV接合至来自大肠杆菌载体细菌的艰难梭菌

参考文献

Purdy D, O'Keeffe TA, Elmore M, Herbert M, McLeod A, Bokori-Brown M,Ostrowski A, Minton NP. (2002) Conjugative transfer of clostridial shuttlevectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumventionof the restriction barrier. Molec. Microbiology 46(2), 439-452

Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., 和Court, D. L. (2009)Recombineering: a homologous recombination-based method of geneticengineering. Nat. Protoc. 4, 206−223。

表1: 实例细菌

任选地，所述细胞选自此表。

3-bp PAM以粗体显示(即，tgg、agg和cgg)。预期的SpCas9-gRNA切割位点由垂直箭头指示(PAM上游3 bp)。