一种扶正化瘀制剂中柚皮素HPLC含量测定方法

摘要

本发明涉及一种扶正化瘀制剂中柚皮素HPLC含量测定方法，建立了扶正化瘀制剂中柚皮素成分的含量测定方法，并对多批次扶正化瘀制剂中柚皮素进行了含量测定，所测得的色谱峰的分离度、峰纯度均较佳，且在较大浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，该方法操作简便、快速、专属性强，具有优异的稳定性、精密度、重现性和准确度等特点，有利于扶正化瘀制剂的质量控制和表征。

说明书

技术领域

本发明属于扶正化瘀制剂质量控制领域，特别涉及一种扶正化瘀制剂中柚皮素HPLC含量测定方法。

背景技术

扶正化瘀制剂中处方中包括松花粉、发酵虫草菌粉、桃仁、丹参、绞股蓝和五味子六味药材。扶正化瘀胶囊(片)主要用于乙型肝炎肝纤维化属瘀血阻络，肝肾不足证者，症见胁下痞块，胁肋疼痛，面色晦暗，或见赤缕红斑，腰膝酸软，疲倦乏力，头晕目涩，舌质暗红或有瘀斑，苔薄或微黄，脉弦细。

扶正化瘀胶囊(片)在我国已使用多年，其组分复杂。扶正化瘀胶囊质量标准为国家药品标准：WS3-459(Z-79)-2005Z，扶正化瘀片的质量标准为国家药品标准：YBZ19332995-2009Z。标准中对丹参和发酵虫草菌粉进行了指标性成分含量测定，未对松花粉中的特异性化学成分含量控制和表征。经过LC-MS对松花粉和扶正化瘀制剂中成分研究后发现，柚皮素是松花粉的主要及特异性成分之一，在扶正化瘀制剂种均可被检测到。柚皮素(C

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀制剂中柚皮素HPLC含量测定方法，该方法具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点。

本发明提供了一种扶正化瘀制剂中柚皮素HPLC含量测定方法，包括：

(1)取供试品加入乙醇溶液溶解，超声提取或加热回流提取，过滤，取滤液得到供试品溶液；

(2)取柚皮素对照品加入甲醇溶解，制得对照品溶液；

(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC测定；其中，色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇-0.05％磷酸溶液；柱温为20-40℃；检测波长为285-303nm；流速为0.5-2.0ml/min；进样量为1-20μl；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3000。

所述步骤(1)中的乙醇浓度为60-80％。

所述步骤(1)中的超声提取或加热回流时间为0.5-1h。

所述步骤(1)中过滤，按常规条件选择微孔滤膜的孔径。一般为0.22μm-0.8μm，优选0.45μm。或者离心6000r/min-12000r/min，5-15min。

所述步骤(2)中的甲醇浓度为80-100％。

所述步骤(3)中的C18色谱柱径长规格为4.6mm×150mm或4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。

所述步骤(3)中的甲醇与0.05％磷酸溶液的体积比为42:58，流动相甲醇可在其相对值±30％的范围内进行调整，0.05％磷酸溶液随之进行调整。

所述步骤(3)中的检测波长为288nm±3nm。

所述步骤(3)中流速较佳的为0.8-1.2ml/min，最佳的为1.0ml/min。

所述步骤(3)中的进样量最佳10μl。

将柚皮素对照品逐级稀释成2.84、4.74、7.90、13.17、21.95、36.59、60.98μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素的质量浓度为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。

本发明具有操作简便、快速、专属性强、重复性好等特点；柚皮素在扶正化瘀制剂中含量稳定，故可作为扶正化瘀制剂质量控制的指标成分，对扶正化瘀制剂的研究具有重要意义，有助于扶正化瘀制剂后续质量控制研究。

附图说明

图1为扶正化瘀胶囊中柚皮素HPLC色谱图；其中，A为溶剂空白；B为阴性对照；C为柚皮素对照品；D为扶正化瘀胶囊供试品。

图2为扶正化瘀片中柚皮素HPLC色谱图；其中，A为溶剂空白；B为阴性对照；C为柚皮素对照品；D为扶正化瘀片供试品。

图3为柚皮素溶液最大吸收波长。

图4为松花粉中柚皮素的LC-MS正负离子提取碎片峰。

图5为扶正化瘀胶囊中柚皮素的LC-MS正负离子提取碎片峰。

图6为扶正化瘀片中柚皮素的LC-MS正负离子提取碎片峰。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.材料和方法

1.1实验材料

扶正化瘀制剂样品由上海黄海制药有限责任公司提供(扶正化瘀胶囊批号：190701；扶正化瘀片批号：S190701)。柚皮素对照品，批号：3597，纯度：98％，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；HPLC级甲醇和96％磷酸，均购自上海安谱科技股份有限公司。

1.2实验仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；XP-105电子天平(梅特勒-托利多)；Diamonsil C

1.3柚皮素含量测定方法

1.3.1色谱条件

流动相：甲醇-0.05％磷酸溶液(42:58)；柱温：30℃；检测波长为288nm；流速1.0ml/min；进样量10μl；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3000。

1.3.2溶液制备

1)对照品溶液的制备

取柚皮素对照品适量，精密称取，置容量瓶中，加入90％甲醇制成每1ml含有20μg柚皮素对照品的溶液。

2)供试品溶液的制备

取扶正化瘀胶囊10粒(取扶正化瘀片10片，研细)，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声30min或回流30min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)空白溶液制备

按2)的处理方法，使用去除松花粉样品的扶正化瘀提取粉添加辅料后压片即得片剂或制成胶囊作为供试品，用70％乙醇溶液制备阴性。

1.4系统适用性考察

1.4.1专属性

测定阴性样品，结果应对照柚皮素与阴性样品相同保留时间处无对应的色谱峰出现。

1.4.2线性关系

将柚皮素对照品逐级稀释成2.84、4.74、7.90、13.17、21.95、36.59、60.98μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素的质量浓度为(X)横坐标，柚皮素峰面积为(Y)纵坐标，进行线性回归。

1.4.3精密度试验

精密吸取柚皮素对照品10μl，连续进样5针，计算柚皮素峰面积RSD应≤2％，考察仪器精密度。

1.4.4稳定性试验

取同一供试品溶液(扶正化瘀胶囊批号：190701；扶正化瘀片批号：S190701)，在室温放置0、2、4、8、12、24、48h时取样测定，计算柚皮素含量，扶正化瘀干膏粉RSD≤6％；扶正化瘀片RSD≤6％。

1.4.5重复性试验

取同一批号供试品溶液(扶正化瘀胶囊批号：190701；扶正化瘀片批号：S190701；)6份，计算柚皮素含量，扶正化瘀胶囊RSD≤6％；扶正化瘀片RSD≤6％。

1.4.6准确度试验

精密取同一批样品(扶正化瘀胶囊批号：190701；扶正化瘀片批号：S190701)9份，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的对照品溶液，测定原液与加标供试液，计算回收率和RSD值。扶正化瘀胶囊回收率应在80-115％，RSD≤6％；扶正化瘀片回收率应在80-115％，RSD≤6％。

1.5提取与分析方法研究

1.5.1采用Agilent1260II液相色谱仪DAD检测器进行全波长扫描，确定柚皮素最大波长范围。

1.5.2不同提取方法

取扶正化瘀胶囊10粒(取扶正化瘀片10片，研细)，取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择超声或回流30min，测定含量。

1.5.3不同提取时间

取扶正化瘀胶囊粉末(取扶正化瘀片10片，研细，)取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择不同时间点回流，测定含量。

1.5.4选择不同批次的扶正化瘀制剂进行柚皮素的含量测定。

2.结果

2.1专属性

供试品和柚皮素对照品的HPLC保留时间相同，柚皮素与其他成分的色谱峰分离度良好，对照柚皮素与阴性样品相同保留时间处无对应的色谱峰出现(图1)。

2.2精密度试验

柚皮素对照品溶液峰面积分别为：11.60、11.58、11.62、11.67、11.41，平均峰面积为：311.58，RSD为0.9％(≤2％)，说明仪器精密度良好。

2.3线性关系的考察

计算得回归方程为Y＝0.632 1X+0.171 5，相关系数r＝1.000 0，结果表明柚皮素在3.0～61.0μg/ml范围内有较好的线性关系。

2.4重复性试验

重复性试验的结果表明，该方法重复性良好，RSD为0.5％(≤6％)(表1、2)。

表1扶正化瘀胶囊中柚皮素重复性试验结果

表2扶正化瘀片中柚皮素重复性试验结果

2.5稳定性试验

扶正化瘀胶囊：在室温放置不同时间时测定的柚皮素含量分别为：0.057mg/g、0.056mg/g、0.055mg/g、0.056mg/g、0.056mg/g、0.057mg/g、0.055mg/g，RSD为1.5％(≤6％)。表明供试品溶液在48h内稳定。

扶正化瘀片：在室温放置不同时间时测定的柚皮素含量分别为：0.092mg/g、0.089mg/g、0.090mg/g、0.090mg/g、0.091mg/g、0.089mg/g、0.088mg/g，RSD为1.5％(≤6％)。表明供试品溶液在48h内稳定。

2.6准确度试验

扶正化瘀胶囊中柚皮素回收率在95％～101％范围内，平均回收率95％，RSD为2.5％；扶正化瘀片中柚皮素回收率在97％～101％范围内，平均回收率99％，RSD为1.3％。符合《中国药典》2015年版四部指导原则<9101>的要求(表3、4)。

表3扶正化瘀胶囊中柚皮素加标回收试验

表4扶正化瘀片中柚皮素加标回收试验

2.7采用Agilent1260II液相色谱仪DAD检测器全波长扫描，柚皮素最大波长在289.8nm左右。因此在289±3nm的波长进行检测可获得较好的准确性。

2.8不同提取方法比较

取扶正化瘀胶囊10粒，取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择超声和回流30min，测定柚皮素含量，结果显示，超声和回流的柚皮素含量差别不大(表5)。

表5扶正化瘀胶囊不同提取方法柚皮素含量

扶正化瘀片10片，研细，取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择超声和回流30min，测定柚皮素含量，结果显示，超声和回流的柚皮素含量差别不大(表6)。

表6扶正化瘀片不同提取方法柚皮素含量

2.10不同提取时间比较

取扶正化瘀胶囊10粒，取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择不同时间点超声，测定柚皮素含量，结果显示30min内可以将柚皮素含量提取完全。

表7扶正化瘀胶囊不同提取时间柚皮素含量

取扶正化瘀片10片，研细，取约1.2g，加入70％乙醇25ml，选择不同时间超声测定柚皮素含量，结果显示30min内可以将柚皮素含量提取完全。

表8扶正化瘀片不同提取时间柚皮素含量

2.12扶正化瘀制剂中柚皮素的含量测定

分别取不同批次的扶正化瘀胶囊和扶正化瘀片各10批次进行含量测定，其平均含量在0.04-0.09mg/g和0.06-0.25mg/g之间。柚皮素色谱峰的峰形对称、分离效果良好。