一种葛花解酲方含药血清在癌细胞中的应用

摘要

本发明通过制备葛花解酲方含药血清，观察不同浓度的含药血清对HepG2肝癌细胞侵袭、转移及上皮间质转化的影响以及观察不同浓度的含药血清对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响，证实了葛花解酲方含药血清能够抑制HepG2肝癌细胞的增殖并促进其凋亡等作用，为该方的临床抗肝癌转移应用提供理论和数据支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种葛花解酲方含药血清在癌细胞中的应用。

背景技术

原发性肝癌是我国发病率较高的恶性肿瘤，据报道，我国每年新发患者占全球总数患者的一半左右，且呈逐年上升趋势

因此抑制肝癌细胞的EMT过程在肝癌的预防与治疗中尤其重要。葛花解酲方由葛花、豆蔻、砂仁等药物组成，具有分消酒湿、理气健脾的功用，在散渗结合、消补兼施的法则下治疗酒积伤脾证。通过课题的前期研究发现，该方具有减轻肝脏损害、减少肝细胞破坏、阻止肝细胞的脂肪变性、促进肝内脂质代谢、抑制瘤组织的生长等重要作用

鉴于此，本发明通过制备葛花解酲方含药血清，观察不同浓度的含药血清对HepG2肝癌细胞侵袭、转移及上皮间质转化的影响以及观察不同浓度的含药血清对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响，为该方的临床抗肝癌转移应用提供理论和数据支撑。

发明内容

本发明的目的是一种葛花解酲方含药血清在制备治疗癌细胞尤其是制备治疗HepG2肝癌细胞药物或制剂中的应用。

本发明所述的一种葛花解酲方含药血清在制备治疗癌细胞药物中的应用；

优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗肝癌细胞药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗HepG2肝癌细胞药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗HepG2肝癌细胞迁移药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方在制备治疗含药血清在HepG2肝癌细胞侵袭药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗HepG2肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表达药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗抑制HepG2肝癌细胞增殖能力药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗促进HepG2肝癌细胞凋亡药物中的应用。

进一步优选的，本发明所述葛花解酲方含药血清在制备治疗肝癌细胞制剂中的应用。

本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂。

本发明所述制剂为胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、片剂、注射制剂、冻干粉针剂。

本发明所述的药学上可接受的辅料没有限定，可以是填充剂、崩解剂、粘合剂、抗氧化剂、润滑剂、表面活性剂或矫味剂等本领域常用辅料中的一种或几种。

有益效果：

本发明通过研究证实，具有以下有益效果：

1、本发明通过Western Blot检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响证实，葛花解酲方含药血清可通过增强E-cadherin的蛋白表达和下调N-cadherin的表达来抑制上皮间质转换过程，从而抑制肿瘤侵袭转移，发挥抗肿瘤的作用，为葛花解酲方的临床应用提供了有力的实验数据和支撑。

2、本发明通过Transwell检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞的迁移侵袭能力证实，葛花解酲方高、中、低剂量组含药血清均可有效抑制HepG2细胞的迁移能力。与空白对照组比较，各给药组中细胞迁移率明显减少(P＜0.05)，且呈浓度依赖性。

3、本发明通过CCK8法检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞的增殖影响证实，葛花解酲方各浓度含药血清在干预24h后，5％、10％浓度组对细胞增殖的影响不大，与对照组相比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。在各给药组干预48h和72h后，10％、20％浓度组的增殖率分别为72.08％、69.80％和68.04％、62.91％，与对照组相比较，对细胞的增殖率影响具有统计学意义(P＜0.05)。

4、通过流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞凋亡的影响证实，葛花解酲方各浓度含药血清均能一定程度上促进HepG2细胞发生凋亡，与空白对照组比较，各给药组明显促进细胞发生凋亡(P＜0.01)，且呈浓度依赖性。

附图说明

图1葛花解酲方含药血清对HepG2细胞迁移的影响(0.1％结晶紫×200，A.空白对照组；B.低剂量血清组；C.中剂量血清组；D.高剂量血清组)。

图2葛花解酲方含药血清对HepG2细胞侵袭的影响(0.1％结晶紫×100，A.空白对照组；B.低剂量血清组；C.中剂量血清组；D.高剂量血清组)。

图3 Western Blot法检测葛花解酲方对肝癌细胞株中E-cad、N-cad的影响。

图4葛花解酲方含药血清对HepG2细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

实施例1

葛花解酲方含药血清在HepG2肝癌细胞迁移、侵袭中的应用以及E-cadherin、N-cadherin蛋白表达中的应用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物和细胞

SD大鼠，雌雄各半，SPF级，体重180-200g，40只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2014-0011。人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库，编号SCSP-510，严格按照说明书常规培养、传代、冻存，待处于对数生长期时进行实验。

1.1.2实验药物

葛花解酲方由莲花青皮0.9克、木香1.5克、橘皮4.5克、人参4.5克、猪苓4.5克、白茯苓4.5克、神曲6克、泽泻6克、干生姜6克、白术6克、白豆蔻仁15克、葛花15克、砂仁15克等药物组成，购自贵阳同仁堂，由贵州中医药大学第一附属医院药剂科按原方比例制备成水煎液(生药浓度分别为1g/ml、2g/ml、4g/ml)备用。

1.1.3主要试剂与仪器

胎牛血清(美国Gibco公司，批号：2036224C)；E-cadherin、N-cadherin(Abcam公司，编号分别为：ab40772、ab18203)；基底胶(美国BD Biosciences公司，型号：9119018)；Transwell小室(美国Corning公司，批号：08619005)；流式细胞仪(美国BD公司，型号：BDFACS Canto)；免疫蛋白印迹检测分析系统(美国Bio-Rad公司，型号：BIO-RAD ChemidocTouch)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司，型号：Olympus IX71)。

1.2实验方法

1.2.1实验分组

以HepG2肝癌细胞株为研究对象，将SD大鼠适应性喂养两天后，随机分为对照组、葛花解酲方低剂量组、葛花解酲方中剂量组和葛花解酲方高剂量组。

1.2.2葛花解酲方含药血清制备

对照组给予生理盐水灌胃，实验组给予不同浓度的葛花解酲方水煎液灌胃(生药浓度分别为1g/ml、2g/ml、4g/ml)，剂量均为1ml/100g，每天2次，连续灌胃5天，末次给药2h后用1％的戊巴比妥钠麻醉大鼠，采用股动脉取血法取血，离心后取上清液置于56度水浴锅中灭活30分钟，过滤除菌，超净台分装，-80冰箱保存备用。

1.2.3 Transwell检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞的迁移侵袭能力

将所有培养试剂和Transwell chamber放于37度温育，待细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数调整细胞浓度为2×10

细胞迁移抑制率＝(对照组迁移细胞数-实验组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数

Matrige基底胶4度过夜溶解，用预冷的无血清培养基稀释Matrige至终浓度为1mg/ml，在chamber上室底部中央垂直加入100ul稀释后的Matrige，37度孵育1h使其干成胶状。小室中加入200ul各组细胞悬液，下室加入800ul含20％血清的培养基。培养24h后，用PBS清洗2遍，甲醇固定15min，染色后用无菌棉签擦去小室中的细胞，用镊子取下上室底部膜晾干后转移至载玻片上中性树胶封片，镜下观察。随机选取5个视野观察并进行拍摄、记数。

细胞侵袭抑制率＝(处理组细胞数/空白对照组细胞数)×100％。

1.2.4 Western Blot检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响

将处于对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液，计数，种于培养瓶，待细胞贴壁后，加入不同浓度的葛花解酲方含药血清，继续放入培养箱中培养24h；弃去培养基，用预冷的pbs洗涤，加入含PMSF的细胞裂解液0.6ml，于冰上裂解10min，用1ml移液枪反复吹吸后转移到ep管中，4度，12000r/min，离心15min，吸取上清得到细胞总蛋白，用BCA定量试剂盒定量后进行SDS-PAGE电泳，转膜，用专用封闭液封闭PVDF膜，一抗孵育，洗涤膜，二抗孵育，洗涤膜，最后ECL显影，于化学发光成像分析仪中曝光；采用Image图像分析软件进行结果分析，测得条带的灰度值，计算各组的目的条带和内参的比值，比较各组间差异。

1.3统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差

2实验结果

2.1葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞迁移的影响

通过镜下观察，葛花解酲方高、中、低剂量组含药血清均可有效抑制HepG2细胞的迁移能力。与空白对照组比较，各给药组中细胞迁移率明显减少(P＜0.05)，且呈浓度依赖性。结果见图1。

2.2葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞侵袭的影响

通过镜下观察，葛花解酲方高、中、低剂量组含药血清均可有效抑制HepG2细胞的侵袭能力。与空白对照组比较，各给药组中细胞侵袭率明显减少(P＜0.05)，且呈浓度依赖性。结果见图2。

2.3葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

葛花解酲方高、中、低剂量组含药血清均可有效上调HepG2细胞中E-cadherin的表达水平，有效下调细胞中N-cadherin的表达水平，与空白对照组比较差异明显(P＜0.05)。结果见表1、图3。

表1葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

注：与对照组比较，**P＜0.01；与10％含药血清组比较，#P＜0.05

3、总结

肝癌作为最常见和预后极差的恶性肿瘤，其治疗方法的选择和肿瘤的分化程度、肿瘤的大小以及是否存在血管侵犯等因素密切相关，对于大多数早中期患者，肝脏移植和手术治疗是目前临床上公认的相对有效的治疗手段，即使能够对患者进行根治性切除，但肝癌的临床转移率非常高，加之术后发生侵袭转移是导致患者预后差及最终死亡的最主要原因，因此找出肝癌细胞侵袭转移的调控和分子机制用于指导临床具有重要的科学意义。目前，随着传统中医药的不断发展和广泛应用，越来越多的肝癌患者选择中医药从多个层次、多个环节、多个靶点来进行治疗，且中医药讲究整体，在抑制肿瘤细胞增殖、调节机体免疫功能、改善患者的临床症状及减低放化疗对机体的损伤等多方面具有重要作用。

葛花解酲方在《脾胃论》中主治“饮酒过度导致脾胃功能低下，同时伴呕吐欲吐”，该方作为散渗结合、消补兼施的经典方剂，在前期研究中发现该方不仅可减轻肝脏损害、保护肝功能

近年来研究发现，在肝癌

在本次实验中，Transwell和基底胶实验结果显示，与对照组比较，葛花解酲方各含药血清组肝癌细胞的侵袭转移作用均减弱，差异具有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)，提示该方可抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力。Western Blot结果显示，葛花解酲方各含药血清组可上调细胞中E-cadherin的表达，下调N-cadherin的表达。上述实验结果表明，葛花解酲方含药血清可通过增强E-cadherin的蛋白表达和下调N-cadherin的表达来抑制上皮间质转换过程，从而抑制肿瘤侵袭转移，发挥抗肿瘤的作用，为葛花解酲方的临床应用提供了有力的实验数据和支撑。

实施例2

葛花解酲方含药血清在HepG2肝癌细胞增殖能力、HepG2肝癌细胞凋亡中的应用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物和细胞

SD大鼠，雌雄各半，SPF级，体重180-200g，20只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2014-0011。人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库，编号SCSP-510，严格按照细胞说明书常规培养、传代、冻存。

1.1.2实验药物

葛花解酲方由莲花青皮0.9克、木香1.5克、橘皮4.5克、人参4.5克、猪苓4.5克、白茯苓4.5克、神曲6克、泽泻6克、干生姜6克、白术6克、白豆蔻仁15克、葛花15克、砂仁15克等药物组成，购自同仁堂，由贵州中医药大学第一附属医院按原方比例制备水煎液(生药浓度为4g/ml)备用。

1.1.3主要试剂与仪器

胎牛血清(美国Gibco公司，批号：2036224C)；细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK8(日本东仁化学科技公司，批号：NN710)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司，批号：KGA108)；流式细胞仪(美国BD公司，型号：BD FACS Canto)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司，型号：Olympus IX71)。

1.2实验方法

1.2.1葛花解酲方含药血清制备

20只SD大鼠适应性喂养两天后，随机分为空白组与葛花解酲方组，每组10只，分别给予生理盐水和葛花解酲方水煎液灌胃，剂量均为1ml/100g，每天2次，连续灌胃5天，末次给药2h后用1％的戊巴比妥钠麻醉大鼠，采用股动脉取血法取血，离心后取上清液置于56度水浴锅灭活30分钟，过滤除菌，超净台分装，-80冰箱保存备用。

1.2.2细胞分组

空白组，5％含药血清组，10％含药血清组和20％含药血清组。

1.2.3 CCK8法检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞的增殖影响

取对数生长期的HepG2肝癌细胞制成单细胞悬液并计数，细胞数约为1x10

细胞增殖率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％

1.2.4流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞凋亡的影响

取对数生长期的肝癌细胞制成单细胞悬液并计数，按每孔2×10

1.3统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差(

2实验结果

2.1葛花解酲方含药血清对HepG2细胞增殖能力的影响

葛花解酲方各浓度含药血清在干预24h后，5％、10％浓度组对细胞增殖的影响不大，与对照组相比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。在各给药组干预48h和72h后，10％、20％浓度组的增殖率分别为72.08％、69.80％和68.04％、62.91％，与对照组相比较，对细胞的增殖率影响具有统计学意义(P＜0.05)。结果见表2。

表2葛花解酲方含药血清对HepG2细胞增殖能力的影响

注：与正常细胞组比较：*P＜0.05、**P＜0.01；

2.2葛花解酲方含药血清对HepG2细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果显示，葛花解酲方各浓度含药血清均能一定程度上促进HepG2细胞发生凋亡，与空白对照组比较，各给药组明显促进细胞发生凋亡(P＜0.01)，且呈浓度依赖性。结果见表3、图4。

表3葛花解酲方含药血清对HepG2细胞凋亡的影响

注：与正常细胞组比较：**P＜0.01

3、总结

肝癌作为最常见和预后极差的恶性肿瘤，大多数早中期患者仍以手术为主要治疗手段，但术后发生侵袭转移是导致患者死亡的最主要原因。目前，随着传统中医药的不断发展和广泛应用，越来越多的肝癌患者选择中医药从多个层次、多个环节、多个靶点来进行治疗，且中医药讲究整体，在抑制肿瘤细胞增殖、调节机体免疫功能、改善患者的临床症状及减低放化疗对机体的损伤等多方面具有重要作用。葛花解酲方作为散渗结合、消补兼施的经典方剂，方中葛花独入阳明，解酒醒脾；猪苓、茯苓、泽泻淡渗利湿，使酒湿之邪从小便而出；砂仁、白蔻仁、青皮、橘皮、木香、干生姜温中健脾，行气和胃；人参、白术补气健脾；神曲解酒化食。诸药同用，共奏分消酒湿，温中健脾之功。课题组在前期研究中发现该方不仅可减轻肝脏损害、保护肝功能

同时亦可抑制瘤块生长、改善免疫功能等作用，但其对肝癌细胞迁移侵袭的影响及可能的作用机制尚未阐明。

本研究初步探讨了葛花解酲方含药血清对于高转移肝癌细胞HepG2的增殖和凋亡的影响。研究结果显示，细胞培养24h后，5％、10％浓度组对细胞增殖的影响不大，与对照组相比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。在各给药组干预48h和72h后，10％、20％浓度组的增殖率分别为72.08％、69.80％和68.04％、62.91％，与对照组相比较，对细胞的增殖率影响具有统计学意义(P＜0.05)。在凋亡实验研究中，各给药组在干预24h后，葛花解酲方各浓度含药血清均能一定程度上促进HepG2肝癌细胞发生凋亡，与空白对照组比较，各给药组明显促进细胞发生凋亡(P＜0.01)，且呈浓度依赖性。综上所述，本研究发现不同浓度的葛花解酲方含药血清对HepG2肝癌细胞具有明显的抑制增殖并促进其凋亡的作用，且作用效应呈现剂量依赖性，然而该方含药血清是通过何种途径实现上述作用的机制有待进一步研究。

实施例3

取葛花解酲方含药血清为原料药，加入1/30的淀粉，制粒，得颗粒剂。

实施例4

取葛花解酲方含药血清为原料药，加入1/30的淀粉，混匀，制粉，装入胶囊，得胶囊剂。

实施例5

取葛花解酲方含药血清作为原料药，加入及1/20的糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。

实施例6

取葛花解酲方含药血清作为原料药，加入1/15的淀粉，制粒，压片，制成片剂。

实施例7

取葛花解酲方含药血清作为原料药，加入8倍量的注射用水，灭菌，得注射剂。

实施例8

取葛花解酲方含药血清作为原料药，冻干，得冻干粉剂。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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