一种食品中无机砷含量的测试方法

摘要

本发明涉及一种食品中无机砷含量的测试方法，包括以下步骤：(1)样品前处理：将样品用氧化性的酸溶液处理，用热浸提法提取，离心取上层清液定容后上机测试；(2)色谱柱分离：以阴离子交换色谱柱为分析柱，流动相为磷酸盐，采用梯度洗脱对提取液进行分离；(3)用ICP‑MS对样品中各形态砷进行检测分析。本发明采用硝酸‑双氧水的提取体系，优选了硝酸和双氧水的浓度，即充分提取了样品中各类的砷形态，完成了对As(III)向As(V)的转化，并且不会将有机砷进行氧化，避免了样品测定时有机砷对无机砷的干扰，特别是高浓度的砷甜菜碱对无机砷的干扰，是对目前已有的食品中无机砷检测的有益补充。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种无机砷含量的测试方法，更具体涉及一种动物性海产品中无机砷含量的测试方法。

背景技术

砷是一种常见的有毒元素，但其毒性主要取决于其化学形态。砷的无机形态是高度致癌的，最近的流行病学研究发现无机砷暴露与心脏病和糖尿病有关。砷化合物的半致死剂量依次为：亚砷酸盐(As

海产品是营养素的重要来源，是健康均衡饮食的重要组成部分。全球超过10亿人以海产品为主要动物蛋白质来源。虽然海产品对人体营养有一些好处，但它可以在组织中积累大量潜在的有毒元素(如砷)，可能对人类健康构成风险。从水产品、蔬菜、海藻和大米中摄入的砷约占砷总摄入量的96％。

鱼类海产品中砷形态主要为砷甜菜碱(AsB)，贝类海产品中砷形态主要为砷甜菜碱和砷糖，被认为是无毒的，其在海产品中的出现对人体健康几乎没有危害；我国GB2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定水产动物及其制品(鱼类及其制品除外)、鱼类及其制品、婴幼儿罐装辅助食品(以水产及动物肝脏为原料的产品)中无机砷限量分别为0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg。通常以阴离子交换色谱柱作为分析柱时，由于海产品中高浓度的砷甜菜碱相对于低浓度的亚砷酸盐(As3+)在色谱柱中往往产生拖尾，会影响低含量亚砷酸盐(As

现有技术针对砷的不同形态的测试发展已经比较成熟，包括高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)，原子荧光光谱法(AFS)，原子吸收光谱法(AAS)，高效液相色谱与氢化物发生-原子吸收联用技术(HPLC-HG-ASS)，毛细管电泳与电感耦合等离子质谱联用技术(CE-ICP-MS)等技术，其中高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法具有灵敏度高，检出限低，线性范围宽等优点，广泛应用于食品和环境的形态学研究。但是对于水产品，或者罐装辅助食品等样品中不同形态砷测量的一直难以克服的一个问题是有机砷对无机砷的干扰，以及测试过程中有机砷向无机砷的转化，导致测量不够准确。因此亟需开发一种能避免有机砷干扰，针对食品中无机砷的准确，快速的测试和评估方法，对食品安全，健康饮食提供技术支撑。

发明内容

为克服现有技术中对食品，特别是动物性水产品或婴幼儿罐装辅助食品中无机砷含量测试不准确的缺陷，本发明方法能够保证样品前处理过程中防止有机砷形态向无机砷形态转化，同时色谱分离能够使无机砷和有机砷充分分离，避免有机砷的干扰。检测快速准确，是一种有望上升为国家标准方法的食品样品中无机砷的检测方法。本发明方法采用氧化热浸提法对样品中无机砷进行提取，将亚砷酸盐全部氧化为砷酸盐的同时保持有机砷形态不发生变化。解决了高含量砷甜菜碱及砷糖干扰亚砷酸盐测定的难题，能够完成食品中，特别是动物性海产品及其婴幼儿罐装辅助食品中无机砷的准确测定。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种食品中无机砷含量的测试方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：将样品用氧化性的酸溶液处理，用热浸提法提取，离心取上层清液定容后上机测试；

(2)色谱柱分离：以阴离子交换色谱柱为分析柱，流动相为磷酸盐，对样品提取液进行梯度洗脱；

(3)用ICP-MS对样品中各形态砷进行检测分析。

进一步地，步骤(1)中所述氧化性的酸溶液为HNO

目前，对砷形态分析中，主要的前处理方法是水，水-乙酸，硝酸-水，甲醇-水，磷酸-水，乙腈-水，乙酸-水，盐酸-水等体系对样品进行提取。本发明采用HNO

更进一步地，步骤(1)中所述氧化性的酸溶液中还含有0.01-0.02mol/L的甲磺酸。加入一定量甲磺酸，在对As(III)氧化为As(V)的过程中，能够抑制有机砷的氧化和化学反应，能更大程度避免有机砷对无机砷的干扰，进一步提高检测无机砷的准确性。

进一步地，步骤(2)中流动相A相和B相为8-25mmol/L的(NH

在本发明一个具体实施方式中，A相(NH

进一步地，在流动相A相和B相含有1-5％的甲醇，优选含有1-2％的甲醇。

发明人发现在HPLC-ICP-MS技术中，甲醇用于增强砷形态的信号强度。但甲醇的浓度不易过高，一方面继续增加甲醇浓度，信号强度进入平台期，提升并不明显；另一方面，进入ICP的甲醇可能会转化为碳元素，在采样锥和截取锥上沉积富集从而影响测定结果。

在本发明一个优选实施方式中，B相中还含有1-2mmol/L的焦磷酸钠。发明人预料不到地发现，在B相中加入少量的焦磷酸钠，可以加强As(V)和有机砷的分离效果，As(V)出峰时间缩短，峰型变窄，灵敏度提高。

在本发明的另一个优选实施方式中，对流动相的A相和B相pH值为7-9，优选为7.2-8，最优选为7.5-7.6。

在本发明的另一个优选实施方式中，流动相的流速为1-1.5mL/min，优选为1-1.2mL/min。

优选地，在步骤(2)中，所述梯度洗脱是指在0-5min内，A相为80％-100％，B相为0-20％；在5-11min，A相为0％-20％，B相为80-100％；在11min后，A相为80％-100％，B相为0-20％；优选地，在0-5min内，A相为90％-100％，B相为0-10％；在5-11min，A相为0％-10％，B相为90-100％；在11min后，A相为90％-100％，B相为0-10％。

进一步地，步骤(2)中所述阴离子交换色谱柱包括但不限于Dionex IonPac AS7、Dionex IonPac AS14、Dionex IonPac AS19和Hamilton PRP-X100等。优选为HamiltonPRP-X100，该色谱柱在较宽的pH值范围内相对稳定，普适性强，色谱柱与磷酸盐流动相结合分析砷形态较为成功。

通过上述优化的色谱柱条件，本发明可以再很短时间内(15min)完成对样品中不同形态砷的分离，在各类有机砷含量较高的水产品中，As(V)和多种有机砷分离效果好，不会产生干扰。

本发明的食品样品没有特别的限定，比如肉蛋类，饮品，保健品，药材，乳品等。但本发明方法由于充分排除了有机砷的干扰，特别适用于有机砷(特别是砷糖，砷甜菜碱)含量较高的食品，比如动物性水产品，或者以动物肝、脏为原材料的一些食品，比如婴幼儿辅食等目前国家食品安全标准“食品污染物限量”(GB2762-2017)中要求测定无机砷的样品的检测。

相对于现有技术，本发明取得了以下有益效果：

一、本发明采用硝酸-双氧水的提取体系，优选了硝酸和双氧水的浓度，即充分提取了样品中各类的砷，完成了对AS(III)向AS(V)的转化，并且不会将有机砷进行氧化，避免了样品中有机砷对无机砷的干扰。

二、本发明在色谱柱中，优选了合适的流动相条件和梯度洗脱的条件，能够快速使样品中各形态砷发生有效分离，避免了有机砷，特别是高浓度的砷甜菜碱对无机砷的干扰。

三、本发明对食品中，特别是富含有机砷的动物性水产品及其婴幼儿罐装辅助食品，进行各种砷形态含量的检测，特别是对无机砷的检测，能有效避免有机砷在测试过程中对无机砷的干扰，准确判断样品中无机砷的含量，不会出现有机砷造成的假阳性的情况。是对目前已有的食品中砷检测的有益补充。

附图说明

图1为流动相中甲醇浓度对5种砷形态化合物信号强度的影响。

图2为5种砷形态混合标准溶液色谱图(10μg/L)。

图3为青柳蛤本底和加标对比色谱图。

图4为鳕鱼本底和加标对比色谱图。

图5为过氧化氢加入量对无机砷加标回收的影响(5μg/L加标)。

图6为过氧化氢加入量对无机砷加标回收的影响(100μg/L加标)。

具体实施方式

以下以具体实施例的形式对本发明检测水产品等食品中的无机砷做进一步的解释说明，但应该理解的是，实施例的内容是为了更加清楚理解本发明，而不是对本发明保护范围的限制。

1260型高效液相色谱仪及7700x型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)；Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250mm×4.1mm，10μm)及其保护柱(美国哈密尔顿公司)；Milliplus2150超纯水处理系统(美国密理博公司)；干燥箱(德国MMM集团产品)；高速离心机(美国Beckman公司)。

超纯水：电阻率18.2MΩ·cm；氨水(NH

1.砷形态标准储备液(10.0mg/L，以As计)：分别准确吸取一定量的亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱溶液标准物质，用适量水稀释成10.0mg/L的单标准储备液。4℃保存，保存期6个月。

2.砷形态混合标准中间液(1.00mg/L，按As计)：准确吸取亚砷酸根标准储备液、砷酸根标准储备液、一甲基砷标准储备液、二甲基砷标准储备液、砷甜菜碱标准储备液各1.0mL于10mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度。现用现配。

3.砷形态混合标准系列溶液：分别准确吸取砷形态混合标准中间液(1.00mg/L)0.00mL、0.01mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL于10mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度。此标准系列溶液中各砷形态的浓度分别为0.0μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L。现用现配。

注：根据实际样品中各砷形态的浓度适当调整标准系列溶液中各砷形态的质量浓度，若样品中砷形态浓度超过标准曲线上限应稀释后重新测定。

实施例1

配制溶液：

1.硝酸-过氧化氢提取液(0.15mol/L硝酸+0.45％双氧水)：量取10mL硝酸和15mL过氧化氢(30％)加水稀释至1000mL。

2.流动相A(10mmol/L磷酸氢二铵+2％甲醇，pH＝7.5)：准确称取1.320g磷酸氢二铵，置于1000mL容量瓶中，用水溶解，加入20mL甲醇，用水稀释定容至刻度，氨水调节pH至8.0，混匀。经0.45μm水系滤膜过滤后，于超声水浴中超声脱气30min，备用。

3.流动相B(20mmol/L磷酸氢二铵+2％甲醇，pH＝7.6)：准确称取2.640g磷酸氢二铵，置于1000mL容量瓶中，用水溶解，加入20mL甲醇，用水稀释定容至刻度，混匀。经0.45μm水系滤膜过滤后，于超声水浴中超声脱气30min，备用。

首先考察了流动相中不同浓度甲醇的增敏效果，分别配制含0％、1％、2％、3％、4％和5％甲醇的流动相，考察甲醇浓度对5种砷形态化合物的信号强度(用积分面积表示)的影响，结果见图1。结果表明，加入1％甲醇后，五种砷形态的信号强度均比无甲醇的信号强度增加1倍，甲醇加入量在2％-5％之间时，进入平台期，增敏效果不明显。引入ICP的甲醇会转化为碳元素，在采样锥和截取锥上沉积富集从而影响测定结果，因此不能选择较高浓度的甲醇作为增敏剂。本实施例选择2％的甲醇作为增敏剂加入到流动相中。在优化的条件下，5种砷形态混合标准溶液(10μg/L)的色谱图如图2所示，AsB、As(III)、DMA、MMA和As(V)在15min内实现基线分离。

接着考察流动相，配制10mmol/L(NH

10mmol/L(NH

实施例2

青柳蛤中主要的砷形态为AsB，含有少量的未知砷化物1(U1)、DMA、未知砷化物2(U2)和As(V)。向青柳蛤中加入20μg/L 5种砷砷形态混合标准溶液，AsB、As(III)、DMA、MMA和As(V)的加标回收率分别为94.2％、105.2％、101.0％、99.8％和103.6％。AsB回收率相对As(III)较低，同时由加标前后对比色谱图可知高浓度的AsB拖尾导致与As(III)产生少量的重叠(图3)，从而在定量上造成偏差；若样品中含有少量As(III)，高浓度的AsB拖尾也会干扰其准确测定，造成假阴性的出现。同样的，贝类样品中也存在砷糖，砷糖的存在也会干扰As(III)的测定，导致假阳性的出现。鳕鱼中主要的的砷形态为AsB，含有少量的DMA。与青柳蛤结果相似，高浓度的AsB拖尾影响As(III)的准确测定(图4)。

可见，在动物性水产品中，高浓度的AsB拖尾会极大影响无机砷的检测，造成假阴性的检测结果，因此为了解决高浓度AsB拖尾及砷糖对As(III)的干扰，本发明采用过氧化氢将As(III)氧化成As(V)，测定样品中As(V)含量即可代表无机砷的含量。向样品中分别加入5μg/L和100μg/L的5种砷形态混标溶液，探讨过氧化氢加入量对低和高浓度As(III)氧化效果的影响，以As(V)的测定值与As(III)和As(V)加标量之和的比值作为考量标准。分别配制含有0.4％～2％的过氧化氢(30％)的0.15mol/L硝酸溶液，将提取液加入到加标的样品中，采用90℃热浸提3h的方法进行提取。结果表明，当提取液中过氧化氢的量为0.45％时，无机砷的回收率最高(90％以上)，同时色谱图显示As(III)全部转化为As(V)。

为了保证提取过程中只氧化As(III)，用0.15mol/L硝酸-0.45％过氧化氢提取液分别配制10μg/L和100μg/L的AsB、DMA和MMA单标准溶液，采用相同的提取温度和时间进行处理，考察提取过程中对有机砷形态的影响，结果见表1。结果表明，低和高浓度的AsB、DMA、MMA的加标回收率范围分别为99.8％～102.3％和97.6％～101.2％；同时未检出As(III)，有很少量的As(V)，说明前处理过程中有机砷形态稳定存在。但在高浓度AsB、DMA和MMA下加标回收率仍略显不足。

表1 AsB、DMA和MMA单标准溶液加标氧化试验(％)

为进一步抑制在氧化过程中有机砷向无机砷的转化，发明人预料不到地发现在提取液中还加入少量甲磺酸，具体是0.15mol/L硝酸+0.45％过氧化氢+0.01mol/L甲磺酸，按照上述同样的方法，考察对有机砷形态的影响，结果见表2。结果表明，低和高浓度的AsB、DMA、MMA的加标回收率范围分别为100.2％～102.6％和100.1％～104.0％；同时未检出As(III)和As(V)，说明前处理过程中有机砷形态稳定存在，未出现无机砷。在高浓度AsB、DMA和MMA下加标回收率令人满意。

表2 AsB、DMA和MMA单标准溶液加标氧化试验(％)

综上，采用0.15mol/L硝酸+0.45％过氧化氢+0.01mol/L甲磺酸的混合酸液，90℃热浸提3h的方法做进一步的试验。

实施例3

准确称取1g左右(精确至0.001g)鳕鱼样品于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL 1％硝酸+0.45％过氧化氢+0.01mol/L甲磺酸混合溶液，90℃热浸提3h，每隔30min振摇一次。提取完毕后，取出冷却至室温，8000r/min离心10min，取上层清液，过0.22μm水系滤膜，同时做空白实验。

RF入射功率：1550W，载气：高纯氩气，载气流速：0.65L/min，补偿气流速：0.45L/min，碰撞气流速(He)：4.5mL/min，射频电压：1.70V，采样深度：8.0mm，蠕动泵转速：0.3r/s。

色谱柱：Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250mm×4.1mm，10μm)；流动相：A相为10mmol/L(NH

表3 梯度洗脱程序

分别配制0.5、1.0、5.0、10、20、50、100μg/L的5种砷形态混合标准溶液，在优化好的实验条件下，考察线性范围和检出限，结果见表4。在0.5μg/L～100μg/L浓度范围内，相关系数r均大于0.999，说明5种砷形态均满足线性要求。

采用逐级稀释法，分别测定不同浓度下5种砷形态的信噪比(S/N)，S/N＝3时的溶液浓度为检出限，AsB、As(III)、DMA、MMA和As(V)的检出限分别为0.05、0.05、0.05、0.1和0.1μg/L。

表4 方法线性范围和检出限

选取含有高浓度AsB的鳕鱼样品，采用优化好的分离测试方法和样品前处理方法进行精密度和加标回收试验，加入三个浓度水平的5种砷形态混合标准溶液，平行制备6个样品测定砷形态含量，计算精密度和加标回收率。结果见表5，对DMA，MMA以及无机砷的检测，回收率和RSD都在令人满意的程度。

表5 鳕鱼样品精密度和加标回收试验结果

实施例4

其他条件和操作和实施例3一致，区别在于

表6 鳕鱼样品精密度和加标回收试验结果

通过实施例3和实施例4的比较，可以看出，在流动相的B相中加入少量的Na

实施例5

其他条件和操作和实施例3一致，区别在于

表7 鳕鱼样品精密度和加标回收试验结果

实施例6

其他条件和操作和实施例3一致，区别在于

表8 鳕鱼样品精密度和加标回收试验结果

本发明通过优化样品前处理条件、液相色谱条件、电感耦合等离子体质谱条件，建立了测定动物性海产品及其婴幼儿罐装辅助食品中无机砷的HPLC-ICP-MS方法。本方法前处理简单，具有线性范围宽，检出限低，灵敏度高，结果准确可靠等优点。