使用新颖抗PD-1序列的双特异性和单特异性抗体

摘要

本发明涉及双特异性异二聚体检查点抗体。

说明书

本申请主张2017年11月8日申请的第62/583,438号美国专利申请、2017 年12月14日申请的第62/598,938号美国专利申请和2018年4月16日申请的 第62/658,227号美国专利申请的优先权，其全部明确地以全文引用的方式并入 本文中，特定参考其中的图、图例和权利要求书。

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且特此 以全文引用的方式并入。创建于2018年4月16日的所述ASCII副本命名为 “067461_5215-PR_SL.txt”，并且大小为33,716,782千字节。

背景技术

检查点受体，如CTLA-4、PD-1(程序性细胞死亡1)、TIM-3(T细胞免 疫球蛋白和黏蛋白结构域3)、LAG-3(淋巴细胞活化基因3)、TIGIT(具有Ig 和ITIM结构域的T细胞免疫受体)等抑制了T细胞和其它细胞类型的活化、 增殖和/或效应活性。在检查点受体抑制针对肿瘤细胞的内源性T细胞反应的 假设指导下，抗-CTLA4和抗PD1抗体(包括纳武单抗(nivolumab)、派姆单 抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)) 的临床前和临床研究确实证实了检查点阻断导致令人印象深刻的抗肿瘤反应， 刺激内源性T细胞攻击肿瘤细胞，使得小部分患有各种恶性肿瘤的患者长期癌 症缓解。不幸的是，只有一部分患者对这些疗法有反应，取决于适应症和其它 因素，每种单一疗法的反应率一般在10％至30％之间，有时甚至更高。这些 药物(例如伊匹单抗加纳武单抗)的治疗组合产生甚至更高的反应率，在某些 情况下接近60％。临床前研究表明，抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体之间的 额外协同作用阻断了最近鉴别的检查点受体，包括LAG-3、TIM-3、BTLA和TIGIT。虽然多个检查点阻断的潜力非常有希望，但预计与这些药物的组合治疗会带来很高的经济负担。此外，与单一疗法相比，组合疗法(例如纳武单抗 加伊匹单抗)的自身免疫毒性显著升高，导致许多患者停止治疗。

大量研究(Ahmadzadeh等人,《血液(Blood)》114:1537(2009),Matsuzaki 等人,PNAS 107(17):7875-7880(2010),Fourcade等人,《癌症研究(Cancer Res.)》72(4):887-896(2012)和Gros等人,《临床研究杂志(J.Clinical Invest.)》 124(5):2246(2014))审查了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，表明TIL通常表达多个 检查点受体。此外，表达多个检查点的TIL可能实际上是最具肿瘤反应性的。 相反，外周的非肿瘤反应性T细胞更可能表达单个检查点。具有单特异性全长 抗体的检查点阻断对于肿瘤反应性TIL的去抑制与假设导致自身免疫毒性的 自身抗原反应性单表达T细胞相比可能并无区别。

因此，本发明涉及结合到人类PD-1和第二不同检查点抑制剂蛋白质的双 特异性抗体。还提供结合到人类PD-1的单特异性单克隆抗体。

发明内容

本发明涉及新颖抗PD-1抗原结合结构域(ABD)和其在产生抗PD-1单 价单克隆抗体和异二聚体双特异性抗体中的用途，所述双特异性抗体结合到 PD-1和选自由以下组成的群组的第二目标抗原：CTLA-4、LAG-3、TIM-3、 TIGIT、BTLA和ICOS，和制备和使用所述抗体的方法。

因此，在一些方面，本发明提供抗PD-1单价单克隆抗体。在这个方面， 抗PD-1单克隆抗体包含：a)重链，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链 -CH2-CH3；和b)轻链，其由N端到C端包含VL-CL；其中VHCDR1、VHCDR2、 VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3选自由以下组成的群组：来自图 24中的XENP26940的CDR和来自图40中的XNE28652的CDR。

在另一方面，抗体具有来自图24中所描绘的XENP26940的VH和VL。

在其他方面，抗体具有来自图40中所描绘的XENP28652的VH和VL。

在任一方面，铰链-CH2-CH3可以是选自由以下组成的群组的Fc结构域： 来自人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。当来自IgG1时，Fc结构 域可以是变异体人类IgG1结构域，例如包括氨基酸取代427L/434S。另外， 变异体IgG1 Fc结构域可以包含选自图5中所描绘的那些消融变异体，并且确 切地说，E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。当Fc结构域为变异体人 类IgG4结构域时，其可以包含S228P氨基酸取代。

在其他方面，本发明提供包含编码重链的第一核酸和编码轻链的第二核酸 的核酸组合物。还包括包含第一表达载体和第二表达载体的表达载体组合物， 所述第一表达载体包含第一核酸，所述第二表达载体包含所述第二核酸，或包 含所述第一核酸和第二核酸的单一表达载体。进一步包括的是包含表达载体组 合物或表达载体的宿主细胞。还包括制备抗PD-1抗体的方法，其包含在表达 所述抗体的条件下培养宿主细胞，且回收所述抗体。此外，本发明提供治疗有 需要的患者的癌症的方法，其包含向所述患者给予所述抗体。

在其他方面，本发明提供异二聚体双特异性抗体。这些抗体包含：a)第 一单体，其包含：i)结合人类PD-1的单链Fv结构域(scFv)，其中所述scFv 结构域包含：1)第一可变重链结构域(VH1)；2)scFv连接子；和3)第一 可变轻链结构域(VL1)；和ii)第一变异体Fc结构域；b)第二单体，其包 含：i)重链，其包含第二可变重链结构域(VH2)-CH1-铰链-CH2-CH3；和c) 轻链，其包含第二可变轻链结构域(VL2)和轻链恒定结构域(CL)；其中所 述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域形成第一抗原结合结构域 (ABD1)：且其中所述第二可变重链结构域和所述第二可变轻链结构域形成结 合到选自以下的抗原的第二ABD(ABD2)：人类CTLA-4、人类LAG-3、人 类TIM-3、人类TIGIT、人类BTLA和人类ICOS。ABD1可以是图13、15、 16、18、20、21、24、33和40中所概述的1C11VH和VL结构域中的任一种。

在特定方面，ABD1具有选自由以下组成的对的序列：来自图15中的 XENP25806的1C11[PD-1]_H3.234_L3.144、来自图15中的XENP25812的 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148、来自图15中的XENP25813的1C11[PD-1]_H3.241_L3.148和来自图15中的XENP25819的 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92。

在这些方面，第一单体由N端到C端可以包含VH1-scFv连接子-VL1-铰 链-变异体Fc结构域。

在其他方面，第一单体由N端到C端可以包含VL1-scFv连接子-VH1-铰 链-变异体Fc结构域。

在特定方面，ABD1具有选自由以下组成的对的序列：来自图15中的 XENP25806的1C11[PD-1]_H3.234_L3.144、来自图15中的XENP25812的 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148、来自图15中的XENP25813的 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148和来自图15中的XENP25819的 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92，且ABD2结合到选自以下的抗原：人类CTLA-4、 人类LAG-3、人类TIM-3、人类TIGIT、人类BTLA和人类ICOS。

在另一方面，抗CTLA-4 ABD2具有选自序列表的SEQ ID NO:38134和 38138、36739和36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、 36771和36775、36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和 36807和36811和36815的对的序列。

在另一方面，抗LAG-3 ABD2具有选自以下的对的序列：SEQ ID NO: 32755和32760、36819和36823、36827和36831、36835和36839、36843和 36847、36851和36855、36859和36863、36867和36871、36875和36879、 36883和36887、36891和36895、36899和36903、36907和36911、36915和 36919、36923和36927、36931和36935、36939和36943、36947和36951和 36955和36959。

在另一方面，抗TIM-3 ABD2具有选自以下的对的序列：SEQ ID NO:36508 和36513、35757和37591、37959和37599、37603和37607、37611和37615、 37619和37623、37627和37631、37635和37639、37643和37647、37651和 37655、37659和37663、37667和37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695。

在另一方面，抗TIGIT ABD2具有选自以下的对的序列：SEQ ID NO:37435 和37439、37443和37447、37451和37455、37459和37463、37467和37471、 37475和37479、37483和37487、37491和37495、37499和37503、37507和 37511、37515和37519、37523和37527、37531和37535、37539和37543、 37547和37551、37555和37559、37563和37567、37571和37575和37579 和37583。

在另一方面，抗ICOS ABD2具有选自由以下组成的群组的序列：a)来自 US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和 26353和26358的对；b)图49中的XENCS500的VH和VL序列；和c)图 49中的XENCS501的VH和VL序列。

在另一方面，抗BTLA ABD2具有选自以下的对的序列：SEQ ID NO:20936 和20941、36707和36711、36715和36719、36723和36727和36761和36735。

在许多方面，本发明的异二聚体抗体具有第二变异体IgG1 Fc结构域，其 包含氨基酸取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述第一变异体 IgG1 Fc结构域和第二变异体IgG1 Fc结构域各自包含氨基酸取代 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；且其中所述第一变异体IgG1 Fc结构域 包含氨基酸取代S364K/E357Q，且第二变异体IgG1 Fc结构域包含氨基酸取代 L368D/K370S，其中编号根据如Kabat中的EU索引。

在其他方面，本发明提供核酸组合物，其包含：a)编码所述第一单体的 第一核酸；b)编码所述第二单体的第二核酸；和c)编码根据权利要求15到 30中任一项所述的轻链的第三核酸。

在另一方面，本发明提供表达载体组合物，其包含：a)包含所述第一核 酸的第一表达载体；b)包含所述第二核酸的第二表达载体；和c)包含所述 第三核酸的第三表达载体。还提供包含表达载体组合物的宿主细胞，和通过在 表达所述抗体的条件下培养所述宿主细胞来制备所述抗体的方法，且回收所述 抗体。进一步提供治疗有需要的患者的癌症的方法，其包含向患者给予本发明 的异二聚体双特异性抗体。

附图说明

图1A到1O描绘了本发明的几种形式。第一个是“开瓶器(bottle opener)” 形式，具有第一和第二抗抗原结合结构域。另外，mAb-Fv、mAb-scFv、中心 scFv、中心Fv、单臂中心scFv、单scFv-mAb、scFv-mAb、双scFv形式、DVD-Ig、 三叉型(Trident)和mAb-(scFv2)均已展示。对于所描绘的所有scFv结构域， 其可以是由N端到C端，重链可变-(任选的连接子)-轻链可变，或相反。此外， 对于单臂scFv-mAb，scFv可以连接到重链单体的N端或轻链的N端。

图2A到2D描绘了本发明中使用的多种抗原的抗原序列(包括在许多情 况下人类和食蟹猴)，以辅助开发易于临床开发的结合到两者的抗原结合结构 域。除非另外说明，否则所有提及这些抗原都是针对人类抗原。人类ICOS的 序列(sp|Q9Y6W8)展示于WO/2018/045110的SEQ ID NO:26246中。人类 ICOS，胞外结构域(sp|Q9Y6W8|21-140)的序列为WO/2018/045110的SEQ ID NO:26247。

图3A到3F描绘了异二聚化变异体组中的适用对(包括歪斜变异体和pI 变异体)。在图3E上，无对应的“单体2”变异体的变异体；这些是pI变异 体，其可以单独用在任一单体上，或包括在开瓶器的Fab侧上，例如且适当带 电scFv连接子可以用在利用scFv作为第二抗原结合结构域的第二单体上。适 合的带电连接子展示于图7中。

图4描绘了等排变异体抗体恒定区和其相应取代的清单。pI_(-)表示较低 pI变异体，而pI_(+)表示较高pI变异体。这些变异体可以任选地且独立地与 本发明的其它异二聚化变异体(以及其它变异体类型，如本文所概述)组合。

图5描绘了消融了FcγR结合的适用消融变异体(有时称为“基因剔除” 或“KO”变异体)。通常，在两种单体上都发现了消融变异体，尽管在一些情 况下其可能仅在一种单体上。

图6A和6B展示了本发明的两个特别有用的实施例。

图7A和7B描绘了多种带电scFv连接子，其可以用于增加或降低利用一 种或多种scFv作为组分的异二聚体抗体的pI。本文中特别适用的(+H)正性 连接子，尤其与本文所示的抗CD3vl和vh序列一起使用。根据Whitlow等人， 《蛋白质工程(Protein Engineering)》6(8):989-995(1993)，具有单一电荷的单 一在先技术scFv连接子称为“Whitlow”。应注意，这种连接子用于减少scFv 的聚集和增强scFv的蛋白水解稳定性。

图8描绘了工程化异二聚体-歪斜Fc变异体的清单以及异二聚体产率(通 过HPLC-CIEX确定)和热稳定性(通过DSC确定)。未确定的热稳定性用“n.d.” 表示。

图9描绘了XENP21575的序列，基于融合瘤克隆1C11和在重链中具有 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的人类IgG1的可变区的嵌合抗PD-1 抗体。CDR用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对 含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)， CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR 且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。另外，每个 CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在序列 表中具有其自身的SEQ ID NO:。

图10描绘了通过抗PD-1克隆1C11阻断经PD-1转染的HEK293T细胞上 的PD-1/PD-L1相互作用。

图11描绘了抗PD-1克隆1C11与经SEB刺激T细胞的结合。

图12A和12B描绘了在SEB刺激人类PBMC和用抗PD-1克隆1C11处 理之后的细胞激素释放分析(A：IL-2；B：IFNγ)。

图13A到13C描绘了在重链中具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 取代的以人类IgG1形式的抗PD-1克隆1C11的说明性Fab人源化变异体的序 列。CDR用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含 有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)， CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR 且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。如所属领域 的技术人员将了解，VH和VL结构域可以格式化为Fab或scFv。另外，每个 CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在序列 表中具有其自身的SEQ ID NO:。

图14描绘了通过Octet所确定的XENP22553对PD-1的亲和力(以及相 关传感器图)。

图15A到15T描绘了抗PD-1克隆1C11的说明性scFv变异体的序列。 CDR是带下划线的，scFv连接子是带双下划线的(在序列中，scFv连接子是 带正电scFv(GKPGS)4连接子，尽管如将为所属领域的技术人员所了解，此连 接子可以替换为其它连接子，包括不带电或带负电连接子)，且斜杠表示可变 结构域的边界。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于 所使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VH和VL 结构域内所包括的CDR。此外，命名规则说明scFv由N端到C端的方向；此 图中的一些序列定向为VH-scFv连接子-VL(由N端到C端)，虽然一些被定 向为VL-scFv连接子-VH(由N端到C端)，但如所属领域的技术人员将了解， 这些序列也可以从本文中的描述按相反方向使用。此外，如所属领域的技术人 员将了解，VH和VL结构域可以格式化为Fab或scFv。另外，每个CDR在 序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在序列表中具 有其自身的SEQ ID NO:。

图16A和16H描绘了说明性变异体抗PD-1 mAb的序列，其具有来自如 实例XD中所述的所选scFv的VH和VL结构域。CDR用粗体显示，且斜杠 表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此， 取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不 同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VH 和VL结构域内所包括的CDR。如所属领域的技术人员将了解，VH和VL结 构域可以格式化为Fab或scFv。另外，每个CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:。

图17A到17Q描绘了通过DSF所确定的变异体抗PD-1 scFv的稳定性和 通过Octet所确定的基于来自变异体scFv的VH/VL的抗PD-1 mAb的平衡解 离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。scFv的XENP用粗体表示， 全长mAb的XENP用括号括起来。

图18A到18G描绘了基于克隆1C11的说明性变异体抗PD-1 mAb的序列。 CDR用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含有CDR 每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位 置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包 括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。如所属领域的技术 人员将了解，VH和VL结构域可以格式化为Fab或scFv。另外，每个CDR 在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在序列表中 具有其自身的SEQID NO:。

图19描绘了通过Octet所确定的变异体抗PD-1 mAb的平衡解离常数 (KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图20A到20L描绘了基于XENP22553的重链的变异体重链的序列。CDR 用粗体显示。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所 使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因 此本文不仅包括带下划线的CDR还包括VH结构域内所包括的CDR。如所属 领域的技术人员将了解，VH和VL结构域可以用于Fab或scFv中。另外，每 个CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH结构域在序列表中 具有其自身的SEQ ID NO:。

图21A到21G描绘了基于XENP22553的轻链的变异体轻链的序列。CDR 用粗体显示。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所 使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因 此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VL结构域 内所包括的CDR。如所属领域的技术人员将了解，VL结构域可以用于Fab或 scFv中。另外，每个CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VL 结构域在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:。

图22A至22E描绘了通过Octet所确定的变异体抗PD-1 mAb的平衡解离 常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。变异体由如图20和图21所 描绘之重链和轻链XenD所定义。

图23描绘了通过Octet所确定的变异体抗PD-1 mAb的平衡解离常数 (KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。变异体由图20和图21中所描绘的 重链和轻链XenD所定义。

图24A到24J描绘了基于克隆1C11的额外说明性变异体抗PD-1 mAb的 序列。CDR是带下划线的，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且 对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所 示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的 CDR且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。如所 属领域的技术人员将了解，VH和VL结构域可以格式化为Fab或scFv。另外，每个CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO:，且每个VH和VL结构域在 序列表中具有其自身的SEQ ID NO:。

图25描绘了通过Octet所确定的变异体抗PD-1 mAb的平衡解离常数 (KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图26描绘了通过Biacore所确定的抗PD-1 1C11变异体的亲和力(KD)。

图27描绘了亲和力优化的抗PD-1 1C11变异体与经SEB刺激T细胞的结 合。

图28描绘了通过抗PD-1 1C11变异体阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结 合，如通过使用Octet在串联表位框并分析(tandem epitope binning assay)中 标准化BLI反应所确定。

图29描绘了在用所指示测试物培育之后经SEB刺激PBMC分析中的IFNγ 分泌。

图30描绘了在用所指示测试物培育之后经SEB刺激PBMC分析中的IFNγ 分泌。

图31描绘了在用20μg/mL所指示测试物培育之后MLR分析中的IFNγ 分泌。

图32描绘了在用所指示浓度的所指示测试物培育之后MLR分析中的 IFNγ分泌。

图33描绘了XENP26842的序列，具有消融变异体 (E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，“IgG1_PVA_/S267k”)和Xtend变异体 (M428L/N434S)的二价抗PD-1 mAb。CDR是带下划线的。如本文所提及且 对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所 示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的 CDR且还包括使用其它编号系统的V

图34描绘了在第0天移植有人类PBMC和在第1天和第8天给药所指示 测试物之后第14天的NSG小鼠全血的CD45

图35描绘了在第0天移植有人类PBMC和在第1天给药所指示测试物之 后第7天的NSG小鼠血清的IFNγ浓度。

图36A和36B描绘了在移植有pp65反应性huPBMC和用所指示测试物 处理之后移植有表达pp65的MCF-7细胞的NSG小鼠的A)平均肿瘤体积和 B)肿瘤体积变化。

图37A至37D描绘了在移植有pp65反应性huPBMC和用所指示测试物 处理之后移植有表达pp65的MCF-7细胞的NSG小鼠全血的A)CD45

图38描绘了移植有huPBMC的NSG小鼠(给药有所指示测试物)的重 量随时间的变化(占初始体重的百分比)。

图39A到39C描绘了在给药所指示测试物之后移植有huPBMC的NSG 小鼠的A)人类CD45

图40A到40BB描绘了基于克隆1C11的额外说明性变异体抗PD-1 mAb 的序列。CDR是带下划线的，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及 且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中 所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线 的CDR且还包括使用其它编号系统的V

图41描绘了通过Octet所确定的人类PD-1的抗PD-1 1C11变异体的亲和 /解离常数(K

图42描绘了通过Octet所确定的人类PD-1的抗PD-1 1C11变异体的亲和 /解离常数(K

图43描绘了通过Octet所确定的人类PD-1的抗PD-1 1C11变异体的亲和 /解离常数(K

图44描绘了通过Octet所确定的人类PD-1的抗PD-1 1C11变异体的亲和 /解离常数(K

图45描绘了通过Octet所确定的人类PD-1和食蟹猴PD-1的抗PD-1 1C11 变异体的亲和/解离常数(K

图46描绘了在经SEB刺激PBMC分析中通过所指示1C11变异体(以及 基于作为对照的纳武单抗的PBS和抗PD-1XENP16432)诱导IFNγ。P值来自 配对t测试，其比较了来自同一供体的PBMC的IFNγ分泌。

图47描绘了在经SEB刺激PBMC分析中通过所指示1C11变异体(以及 基于作为对照的纳武单抗的PBS和抗PD-1XENP16432)诱导IL-2。P值来自 配对t测试，其比较了来自同一供体的PBMC的IL-2分泌。

图48描绘了在经SEB刺激PBMC分析中通过所指示抗PD-1mAb XENP16432(基于纳武单抗的PBS和XENP28652)诱导IFNγ。P值来自配对 t测试，比较同一供体的PBMC的IFNγ分泌。

图49A到49KK展示了以“开瓶器”形式的本发明的多种异二聚体抗体 的序列，其使用“XENCS”编号命名。每个表示三个多肽链(“Fab链、scFv 链和轻链”)，CDR带有下划线，连接子带有双下划线，且结构域之间的连接 点以“/”表示。这些中的每一者具有其自身的序列且因此识别符。

图50A到50E展示了几种有用的“开瓶器”形式“骨架”的序列，其中 scFv侧的Fv指向几种特定抗PD-1 ABD，但不指向“Fab”侧的Fv序列。如 所属领域的技术人员将了解且下文所概述，这些“骨架”序列可以与本文所概 述并且含于序列表内的任何Fab序列一起使用(例如，连接到“Fab侧重链” 或“Fab单体”的VH和连接到恒定轻链的VL)。还应注意，这些开瓶器骨架 序列可以用于图1F的中心scFv形式(有时也被称作“2+1”形式)，添加有本 文所述的第二VH和CH1结构域。每个Fab链起始于“/”(描绘CH1结构域 的起点)，使得本文所述的来自ABD的VH结构域在N端融合形成全长重链， 来自ABD的对应VL结构域在N端融合到“/”(描绘轻链中CL结构域的起 点)，使得Fab链和轻链形成Fab。概述了特定抗PD-1 ABD的scFv链，CDR 带有下划线，scFv连接子带有双下划线，且结构域之间的连接点以“/”表示。 BO骨架1到4(XENCS556到559)与BO骨架5到8(XENCS560到563) 相同，不同之处在于后者包括428L/434S

图51展示了个体双特异性抗体XmAb20717(抗CTLA-4×抗PD-1)选择 性地靶向共表达PD1和CTLA4的293T细胞。

图52展示了XmAB20717的结合亲合力有助于T细胞活化。确切地说， 展示了在第0天将人类PBMC移植到NSG小鼠中接着在第1天给药所指示测 试物之后第14天的IFNγ水平。

图53展示了与抗PD1二价抗体相比，XmAB20717促进优良的T细胞活 化。确切地说，展示了在第0天将人类PBMC移植到NSG小鼠接着在第1天 给药所指示测试物之后在第14天的CD45+细胞计数和IFNγ水平。

图54为展示XmAb20717增强小鼠的同种异体抗肿瘤反应的图。NSG小 鼠移植有KG1a-luc，接着移植有huPBMC。所呈现的肿瘤负荷由通过KG1a-luc 的IVIS成像得到的几何平均通量得出。

图55为展示PD1×CTLA4双特异性抗体在用于检查点阻断的小鼠模型中 具有高度活性的图，如在CD45+细胞计数中所测量。

图56为展示CTLA4×LAG3双特异性为活性的且与用于三重阻断的抗 PD-1组合用于检查点阻断的小鼠模型的图。

图57A和57B描绘了所指示测试物的检查点受体占用率，如通过表达 CTLA-4和LAG-3两者的HEK293T细胞群体的百分比所指示，未占用CTLA-4 和/或PD-1受体通过染色显示。

图58展示了描绘了在用所指示测试物处理之后(Q1)CTLA-4-PD-1+、 (Q2)CTLA-4+PD-1+、(Q3)CTLA-4-PD-1+和(Q4)CTLA-4-PD-1-细胞的群 体的FACS散布图。

图59A和59B描绘了在用XmAb20717处理后移植有KG1a-luc接着移植 有huPBMC的NSG小鼠的肿瘤负荷(由通过KG1a-luc的IVIS成像所获得的 几何平均通量得出)。

图60描绘了XmAb22841与表达CTLA-4和LAG-3的HEK293T细胞的 结合。

图61A到61D描绘了所指示测试物的检查点受体占用率，如通过表达CTLA-4和LAG-3两者的HEK293T细胞群体的百分比所指示，未占用CTLA-4 和/或LAG-3受体通过染色显示。

图62A和62B展示了在用所指示测试物处理之后表达CTLA-4和LAG-3 两者的HEK293T细胞上未占用A)LAG-3和B)CTLA-4受体的量。

图63A到63F描绘了所指示测试物与来自6个不同PBMC供体(A-F) 的经SEB刺激T细胞的结合。

图64描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用XENP16432、 XmAb20717、XmAb22841和XmAb22841与XENP16432组合处理后经SEB 刺激T细胞的IL-2释放的增加倍数。

图65描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用XENP16432、 XmAb20717、XmAb22841和XmAb22841与XENP16432组合处理后经SEB 刺激T细胞的IFNγ释放的增加倍数。

图66描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用抗PD-1 mAb (XENP16432)处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基因的表达的变化倍数(x 轴)。y轴描绘显著性。

图67描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用XmAb20717 处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基因的表达的变化倍数(x轴)。

图68描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用XmAb22841 处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基因的表达的变化倍数(x轴)。

图69描绘了与用抗PD-1 mAb(XENP16432)处理相比，在用XmAb20717 处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基因的表达的变化倍数(x轴)。

图70描绘了与用抗PD-1 mAb(XENP16432)处理相比，在用XmAb22841 处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基因的表达的变化倍数(x轴)。

图71描绘了与用抗RSV mAb(XENP15074)处理相比，在用XmAb22841 与抗PD-1 mAb(XENP16432)组合处理后经SEB刺激T细胞的免疫相关基 因的表达的变化倍数(x轴)。

图72描绘了与用抗PD-1 mAb(XENP16432)单独处理相比，在用 XmAb22841与抗PD-1 mAb(XENP16432)组合处理后经SEB刺激T细胞的 免疫相关基因的表达的变化倍数(x轴)。

图73描绘了抗RSV抗体的序列。值得注意的是，这些序列是基于具有消 融变异体的人类IgG1产生(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K， “IgG1_PVA_/S267k”)。CDR是带下划线的。如本文所提及且对含有CDR每 一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置 的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包括 使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。

图74描绘了具有来自纳武单抗的可变区的抗PD-1抗体的序列。值得注意 的是，这些序列是基于具有消融变异体的人类IgG1产生 (E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，“IgG1_PVA_/S267k”)。CDR是带下划 线的。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的 编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文 中不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域 内所包括的CDR。

图75描绘了具有来自派姆单抗的可变区的抗PD-1抗体的序列。值得注意 的是，这些序列是基于具有S228P变异体的人类IgG4产生。CDR是带下划线 的。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编 号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中 不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内 所包括的CDR。

图76A和图76B描绘了在hFcRn(Tg276)小鼠中单次静脉内给予2mg/kg 之后，个别小鼠的A)XENP20053和B)XmAb20717的药物动力学概况。

图77描绘了在hFcRn(Tg276)小鼠中静脉内给予2mg/kg单次剂量之后 XENP20053和XmAb20717(个别动物)的半衰期。

图78描绘了在hFcRn(Tg276)小鼠中静脉内给予2mg/kg单次剂量之后 XENP20053和XmAb20717(个别动物)的C

图79描绘了在hFcRn(Tg276)小鼠中静脉内给予2mg/kg单次剂量之后 XmAb20717和XENP20053的所选PK参数的平均值。

图80A到80J描绘了用PBS、板结合的XmAb20717、可溶性XmAb20717 和板结合的抗CD3抗体(OKT3)处理的人类PBMC的A)IFNγ、B)IL-1β、 C)IL-2、D)IL-4、E)IL-8、F)IL-6、G)IL-10、H)IL-12p70、I)IL-13 和J)TNFα的释放。

图81A和81B描绘了展示XmAb20717与A)人类CTLA-4和B)食蟹猴 CTLA-4结合的传感器图。

图82A和图82B描绘了展示XmAb20717与A)人类PD-1和B)食蟹猴 PD-1结合的传感器图。

图83描绘了XmAb20717与人类和食蟹猴CTLA-4和PD-1结合的平衡解 离常数(K

图84描绘了用和不用XmAb20717预培育的情况下，CTLA-4与配体CD80 和CD86的竞争结合实验的传感器图。

图85描绘了用和不用XmAb20717预培育的情况下，PD-1和配体PD-L1 和PD-L2的竞争结合实验的传感器图。

图86描绘了展示XmAb20717(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)人类FcγRI、B)人类FcγRIIb、C)人 类FcγRIIA(131H)、D)人类FcγRIIA(131R)、E)人类FcγRIIIA(158V) 和F)人类FcγRIIIA(158F)结合的传感器图。

图87描绘了展示XmAb20717(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)食蟹猴FcγRI、B)食蟹猴FcγRIIA、C) 食蟹猴FcγRIIb和D)食蟹猴RcγRIIIA结合的传感器图。

图88描绘了展示XmAb20717(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)鼠类FcγRI、B)鼠类FcγRIIb、C)鼠 类FcγRIII和D)鼠类FcγRIV结合的传感器图。

图89描绘了在pH 6.0下XmAb20717和XENP20053与人类、食蟹猴和小 鼠FcRn结合的平衡解离常数(K

图90描绘了展示在pH 6.0下XmAb20717和XENP20053与人、食蟹猴和 小鼠FcRn(1000、500、250和125nM)结合的传感器图。

图91描绘了串联BLI实验，其展示了负载有PD-1且浸渍到XmAb20717 或缓冲液中，接着最终浸渍到CTLA-4抗原中的生物传感器。

图92描绘了在用抗RSV mAb XENP15074、抗PD-1 mAb XENP16432和 XmAb20717处理之后经SEB刺激人类PBMC的IL-2分泌。各点表示独特的 人类供体。

图93描绘了在用抗RSV mAb XENP15074、抗PD-1 mAb XENP16432和 XmAb20717处理之后未经刺激人类PBMC的IL-2分泌。各点表示独特的人类 供体。

图94描绘了在用抗RSV mAb XENP15074、XENP20111与XENP20059 组合(基于XmAb20717的抗PD-1和抗CTLA-4结合结构域的单价mAb)和 XmAb20717处理之后未经刺激人类PBMC的IL-2分泌。各点表示独特的人类 供体。

图95描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的体重随时间的变化(占初始体重 的百分比)。OSP具有人类PBMC，且给药有所指示测试物。将死亡小鼠设定 为初始体重的70％。*表示p<0.05，未配对斯图登氏t测试，每组与huPBMC 相比。三角指示给药日。

图96描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的存活。OSP具有人类PBMC，且 给药有所指示测试物。

图97描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的血清IFNγ浓度随时间推移。OSP 具有人类PBMC，且给药有所指示测试物。

图98A到98C描绘了经静脉内移植的NSG小鼠血液的A)人类CD45

图99描绘了XENP16434的序列，基于具有消融变异体 (E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，“IgG1_PVA_/S267k”)的阿特朱单抗的 二价抗PD-L1 mAb。

图100描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的体重随时间的变化(占初始体 重的百分比)。OSP具有人类PBMC，且给药有所指示测试物。将死亡小鼠设 定为初始体重的70％。

图101描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的存活。OSP具有人类PBMC， 且给药有所指示测试物。

图102A到102C描绘了在第14天经静脉内移植的NSG小鼠血液的A) 人类CD45

图103描绘了XmAb20717与用所指示浓度的所指示测试物预处理的 PD-1

图104描绘了XmAb20717与用所指示浓度的所指示测试物预处理的 PD-1

图105描绘了用于阻断XmAb20717结合到PD-1

图106A到106J描绘了用PBS、板结合的XmAb22841、可溶性XmAb22841 和板结合的抗CD3抗体(OKT3)处理的人类PBMC的A)IFNγ、B)IL-1β、 C)IL-2、D)IL-4、E)IL-8、F)IL-6、G)IL-10、H)IL-12p70、I)IL-13 和J)TNFα的释放。

图107描绘了XENP29154的序列，其为内部产生的TGN1412。

图108A到108J描绘了用风干XmAb22841、风干XENP15074(同型对照) 和风干XENP29154(阳性对照)处理的人类PBMC的A)IFNγ、B)IL-1β、 C)IL-2、D)IL-4、E)IL-8、F)IL-6、G)IL-10、H)IL-12p70、I)IL-13 和J)TNFα的释放。

图109A和109B描绘了展示XmAb22841与A)人类CTLA-4和B)食蟹 猴CTLA-4结合的传感器图。

图110A和110B描绘了展示XmAb22841与A)人类LAG-3和B)食蟹 猴LAG-3结合的传感器图。

图111描绘了XmAb22841与人类和食蟹猴CTLA-4和LAG-3结合的平衡 解离常数(K

图112描绘了在用和不用XmAb22841预培育的情况下，CTLA-4和配体 CD80和CD86的竞争结合实验的传感器图。

图113描绘了XmAb22841阻断了Ramos细胞上可溶性LAG-3-Fc与细胞 表面MHC II类的结合。

图114描绘了展示XmAb22841(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)人类FcγRI、B)人类FcγRIIb、C)人 类FcγRIIA(131H)、D)人类FcγRIIA(131R)、E)人类FcγRIIIA(158V) 和F)人类FcγRIIIA(158F)的结合。

图115描绘了展示XmAb22841(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)食蟹猴FcγRI、B)食蟹猴FcγRIIA、C) 食蟹猴FcγRIIb和D)食蟹猴RcγRIIIA结合的传感器图。

图116描绘了展示XmAb22841(实线)和人类IgG比较者(具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体；虚线)与A)鼠类FcγRI、B)鼠类FcγRIIb、C)鼠 类FcγRIII和D)鼠类FcγRIV结合的传感器图。

图117描绘了在pH 6.0下XmAb22841和XENP22602与人类、食蟹猴和 小鼠FcRn结合的平衡解离常数(K

图118描绘了展示在pH 6.0下XmAb22841和XENP22602与人、食蟹猴 和小鼠FcRn(1000、500、250和125nM)结合的传感器图。

图119描绘了串联BLI实验，其展示了负载有LAG-3且浸渍到XmAb22841 或缓冲液中，接着最终浸渍到CTLA-4抗原中的生物传感器。

图120描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的体重随时间的变化(占初始体 重的百分比)。OSP具有人类PBMC，且给药有所指示测试物。将死亡小鼠设 定为初始体重的70％。

图121描绘了经静脉内移植的NSG小鼠的存活。OSP具有人类PBMC， 且给药有所指示测试物。

图122A和122B描绘了经静脉内移植的NSG小鼠血清在第7天和第14 天时血清A)IFNγ浓度和B)的IL-10浓度。OSP具有人类PBMC，且给药有 所指示测试物。

具体实施方式

A.材料的并入

1.图和图例

以下的所有图、伴随的图例和序列(其识别符和/或描述)：2017年11月 8日申请的美国专利申请第62/583,438号；2017年12月14日申请的美国专利 申请第62/598,938号；2018年4月16日申请的美国专利申请第62/658,227号； 2016年11月10日申请的美国专利申请第62/420,500号；2016年6月22日申 请的美国专利申请第62/353,511号；2016年6月14日申请的美国专利申请第 62/350,145号；2017年6月14日申请的美国专利申请第15/623,314号和2017 年6月14日申请的PCT/US17/37555，其全部明确地并且独立地以全文引用的 方式并入本文中，尤其对于其中所描绘的氨基酸序列。

2.序列

参考如下随附序列表：适用作ABD的抗PD-1序列包括SEQ ID NO: 6209-11464(PD-1 scFv序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为Fab)、SEQ ID NO:11465-17134(PD-1 Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv),SEQ ID NO:33003-33072(额外PD-1 Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为 scFv)、SEQ ID NO:33073-35394(额外PD-1 scFv序列，尽管其中的Fv序列 可以格式化为Fab)和SEQ ID NO:36127-36146(PD-1二价构筑体，其可以格 式化为scFv或Fab的任一者)。适用作ABD的抗CTLA-4序列包括SEQ ID NO: 21-2918(CTLA-4scFv序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为Fab)、SEQ ID NO:2919-6208(CTLA-4Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)、 SEQ ID NO:36739-36818(额外CTLA-4Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格 式化为scFv)和SEQ ID NO:35395-35416(CTLA-4单臂构筑体，其可以格式 化为Fab或scFv的任一者)。适用作ABD的抗LAG-3序列包括SEQ ID NO:17135-20764(LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO: 36819-36962(额外LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO:35417-35606(额外LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为 scFv)、SEQ ID NO:25194-32793(额外LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以 格式化为scFv)和SEQ ID NO:32794-33002(单臂LAG-3构筑体，其可以格 式化为Fab或scFv的任一者)。适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884(TIM-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO: 37587-37698(额外TIM-3 Fab，其中的Fv序列可以格式化为scFv)和SEQ ID NO:36347-36706(二价TIM-3构筑体，其可以格式化为Fab或scFv的任一者)。 适用作ABD的抗BTLA序列包括SEQ IDNO:20885-21503(BTLA Fab，尽管 其中的Fv序列可以格式化为scFv)和SEQ ID NO:36707-36738(额外BTLA Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)。适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523(TIGIT Fab，尽管其中的Fv序列可以格式化为 scFv)和SEQID NO:37435-37586(尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)。 如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重 链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

本发明的双特异性抗体包括SEQ ID NO:35607-35866和SEQ ID NO: 21524-22620的LAG3×CTLA4构筑体。PD-1×CTLA4构筑体包括SEQ ID NO: 36167-36346和SEQ ID NO:23316-23735所列举的那些构筑体。PD-1×TIM3 构筑体包括SEQ ID NO:25174-25193所列举的那些构筑体。PD-1×LAG3构筑 体包括SEQ ID NO:35867-36126和SEQ ID NO:23736-25133所列举的那些构 筑体。PD-1×TIGIT构筑体包括SEQ ID NO:25134-25173所列举的那些构筑体。 PD-1×BTLA构筑体包括SEQ ID NO:22724-23315和SEQ ID NO:36147-36166 所列举的那些构筑体。CTLA4X BTLA构筑体包括SEQ ID NO:22624-22723 所列举的那些构筑体。最后，XENP23552、XENP22841、XENP22842、 XENP22843、XENP22844、XENP22845、XENP22846、XENP22847、 XENP22848、XENP22849、XENP22850、XENP22851、XENP22852、XENP22858、XENP22854、XENP22855的名称都应在标题中包含 “M428L/N434S”符号，这些无意中被遗漏了。

B.命名法

本发明的双特异性抗体以几种不同形式列出。各多肽被给予唯一的 “XENP”编号(或在一些情况下，“XENCS”编号)，但是将在所属领域中了 解，较长序列可能含有较短编号。举例来说，对于给定序列，开瓶器形式的 scFv侧单体的重链将具有第一XENP编号，而scFv结构域将具有不同的XENP 编号。一些分子具有三个多肽，因此使用XENP编号与组分作为名称。因此， 以开瓶器形式的分子XENP20717包含三个序列，通常被称作“XENP20717 HC-Fab”、XENP20717HC-scFv”和“XENP20717LC”或等效物，但所属领 域的技术人员将能够通过序列比对容易地识别这些序列。这些XENP编号出现 在序列表以及标识符中，并且用于图中。另外，一个包含三种组分的分子产生 多个序列标识符。举例来说，Fab单体的清单具有全长序列、可变重链序列以 及可变重链序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻链序列以及可变轻 链序列的三个CDR；并且scFv-Fc结构域具有全长序列、scFv序列、可变轻 链序列、3个轻链CDR、scFv连接子、可变重链序列以及3个重链CDR；应 注意具有scFv结构域的本文所有分子使用单个带电scFv连接子(+H)，尽管 可以使用其它者。另外，特定可变结构域的术语命名使用“Hx.xx_Ly.yy”类 格式，其中编号作为特定可变链序列的唯一标识符。因此，XENP22841的Fab 侧的可变结构域为“7G8_H3.30_L1.34”，其指示可变重链结构域H3.30与轻链 结构域L1.34组合。在这些序列按scFv形式使用的情况下，名称 “7G8_H3.30_L1.34”表示可变重链结构域H3.30与轻链结构域L1.34组合，且 由N端至C端呈vh-连接子-vl定向。具有与重链和轻链可变结构域一致但呈 相反顺序的序列的这种分子将命名为“7G8_L1.34_H3.30”。类似地，不同构 筑体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和图中将显而易见的。

C.定义

为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这类定义意味着涵盖语 法等效物。

本文的“消融”意味着活性的降低或去除。因此举例而言，“消融FcγR 结合”意指与不含特定变异体的Fc区相比，Fc区氨基酸变异体具有小于50％ 起始结合，较佳具有大于70-80-90-95-98％活性损失，且一般而言，活性低于 Biacore、SPR或BLI分析中的可侦测结合的水平。FcγR结合的消融的特定用 途是图5中所示的那些，其通常被添加到两个单体中。

如本文所用，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞 介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上的结合 的抗体且随后引起目标细胞裂解。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa 结合增加引起ADCC活性增加。

如本文所用，“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”意指如下 的细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别目标细胞上的结 合的抗体且随后引起目标细胞的吞噬。

本文的“抗原结合结构域”或“ABD”意味着六个互补决定区 (ComplementaryDetermining Region，CDR)的组，当作为多肽序列的一部分 存在时，特异性结合如本文所讨论的目标抗原。因此，“检查点抗原结合结构 域”结合如本文所概述的目标检查点抗原。如所属领域中已知，这些CDR通 常以可变重链CDR(vhCDR或VHCDR)的第一组和可变轻链CDR(vlCDR 或VLCDR)的第二组的形式存在，对于重链而言各自包含三个CDR：vhCDR1、 vhCDR2、vhCDR3，且对于轻链而言各自包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。 CDR分别存在于可变重链结构域和可变轻链结构域中，且一起形成Fv区。 (CDR编号方案参见表1和上文相关论述)。因此，在一些情况下，抗原结合 结构域的六个CDR由可变重链结构域和可变轻链结构域提供。在“Fab”形式 下，6个CDR的组由两条不同的多肽序列提供，可变重链结构域(vh或VH； 含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻链结构域(vl或VL；含有vlCDR1、 vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C端连接到重链CH1结构域的N端， vl结构域的C端连接到轻链恒定结构域的N端(且因此形成轻链)。在scFv 形式下，vh和vl结构域共价连接(通常通过使用如本文所概述的连接子)到 单个多肽序列中，其可以是(由N端开始)vh-连接子-vl或vl-连接子-vh，通常优选前者(包含位于各侧的任选的结构域连接子，取决于所使用的形式(例 如根据图1)。一般来说，在第二单体中scFv结构域的C端连接到铰链的N端。

本文的“修饰”意味着多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或与蛋 白质化学连接的部分的改变。举例来说，修饰可以是连接到蛋白质的改变的碳 水化合物或PEG结构。本文的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、 插入和/或缺失。出于清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由 DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA中的密码子的20种氨基酸。

本文的“氨基酸取代”或“取代”意谓用不同氨基酸取代在亲体多肽序列 中的特定位置处的氨基酸。特定言之，在一些实施例中，取代为不在特定位置 天然存在的氨基酸，亦即不在有机体内天然存在或不在任何有机体中天然存在 的氨基酸。举例来说，取代E272Y是指变异体多肽，在此情况下是Fc变异体， 其中在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换。为了清楚起见，已经过工程化以改 变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)换成CGA (仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其起始的 特定位置具有相同的氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。

如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意味着在亲本多肽序列的特定位 置添加氨基酸序列。举例来说，-233E或233E表示在位置233之后和位置234 之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置 234之前插入AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中在特定位 置处去除氨基酸序列。例如，E233-或E233#，E233()或E233del表示在位置 233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的 序列GluAspAla的缺失。

如本文所用，“变异体蛋白质”或“蛋白质变异体”或“变异体”意指通 过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。相比于亲本蛋白质，蛋 白质变异体具有至少一个氨基酸修饰，但又不过多，否则使得变异体蛋白质无 法使用如下文所述的比对程序与亲本蛋白质比对。一般而言，使用下文所述的 比对程序，如BLAST，变异体蛋白质(如本文所概述的变异体Fc结构域等， 通常与亲本蛋白质至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％一致，。

如下文所述，在一些实施例中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人类野 生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定结构域或Fc区， 尽管具有变异体的人类序列也可以充当“亲本多肽”，例如可以包括美国公开 案第2006/0134105号的IgG1/2杂合物。本文的蛋白质变异体序列将优选与亲 本蛋白质序列具有至少约80％的一致性，并且最优选至少约90％的一致性， 更优选至少约95-98-99％的一致性。因此，如本文所用，“抗体变异体”或“变 异体抗体”意味着通过至少一个氨基酸修饰与亲本抗体不同的抗体，如本文所用的“IgG变异体”或“变异体IgG”意味着通过至少一个氨基酸修饰与亲本 IgG(同样，在许多情况下，来自人类IgG序列)不同的抗体，并且如本文所 用的“免疫球蛋白变异体”或“变异体免疫球蛋白”意味着通过至少一个氨基 酸修饰与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用，“Fc变异 体”或“Fc变异体”意指与人类IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比在Fc 结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。

本发明的Fc变异体是根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说， N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有丝氨酸取代的Fc变异 体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多 肽具有取代M428L和N434S的Fc变异体。WT氨基酸的身份标识可以是非特 定的，在此情况下前述变异体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任 意的，也就是说，例如N434S/M428L与M428L/N434S是相同的Fc变异体， 以此类推。关于本发明中所讨论的与抗体有关的所有位置，除非另外指出，否 则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的 EU索引是指EU抗体的编号。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的许多一级 序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其 列表(参见《免疫学相关序列(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICALINTEREST)》,第5版,NIH公开第91-3242号,E.A.Kabat等人，其以引用的 方式整体并入本文中)。还参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊 (Proc Natl Acad Sci USA)》63:78-85，其以引用的方式整体并入本文中。修饰 可以是添加、缺失或取代。

本文的“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包含蛋白质、多肽、 寡肽和肽。此外，构成本发明的抗体的多肽可以包括一个或多个侧链或末端的 合成衍生作用、糖基化、PEG化、环形排列、环化、与其它分子的连接子、 蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。

如本文所用，“残基”意味着蛋白质中的位置和其相关的氨基酸身份标识。 举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中位置 297处的残基。

如本文所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL以及CL免疫 球蛋白结构域的多肽，所述结构域通常位于两条不同的多肽链上(例如 VH-CH1位于一个链上而VL-CL位于另一个链上)。Fab可以指隔离情况下的 这种区或在本发明的双特异性抗体的情形下的这种区。在Fab的情形下，Fab 除CH1结构域和CL结构域以外还包含Fv区。

如本文所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含ABD的VL结构 域和VH结构域的多肽。Fv区可被设计成Fab和scFv形式(如上文所论述， 通常是还包含如上文所概述的恒定区的两条不同的多肽)，其中vl结构域和vh 结构域组合(通常使用如本文所论述的连接子)以形成scFv。

本文的“单链Fv”或“scFv”意味着通常使用如本文所讨论的scFv连接 子将可变重链结构域共价连接到可变轻链结构域，以形成scFv或scFv结构域。 scFv结构域由N端至C端可呈任一定向(vh-连接子-vl或vl-连接子-vh)。在 序列表和图中所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序在名称中指示，例如， H.X_L.Y意指N端到C端是vh-连接子-vl，并且L.Y_H.X是vl-连接子-vh。

如本文所用，“IgG子类修饰”或“同型修饰”意指将IgG同型的一个氨 基酸转化成不同比对的IgG同型中的对应的氨基酸的氨基酸修饰。举例来说， 因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中 的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。

如本文所用，“非天然存在的修饰”意指非同型的氨基酸修饰。举例来说， 因为人类IgG的无一者在位置434处包括丝氨酸，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 (或其杂合体)中的取代434S被视为非天然存在的修饰。

如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份标识”意指由DNA和RNA编码 的20种天然存在的氨基酸之一。

如本文所用，“效应功能”意味着由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用 产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文所用，“IgG Fc配体”意味着与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc 配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、 FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄 球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)， 其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,《免疫评论(Immunological Reviews)》190:123-136，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc配体可以包括 结合Fc的未发现分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所用， “Fc配体”意指与抗体Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子， 优选多肽。

如本文所用，“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”意指结合IgG 抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族 包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII (CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括 FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa (包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和 FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,《免疫学快报(ImmunolLett)》82:57-65， 其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人类FcγR或FcγR同种 型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、 兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII (CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型 或同种异型。

如本文所用，“FcRn”或“新生Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区且至少 部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包含但不限于 人类、小鼠、大鼠、兔以及猴。如所属领域中已知，功能性FcRn蛋白质包括 两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白且重链由FcRn基因编 码。除非另外说明，否则本文中FcRn或FcRn蛋白质是指FcRn重链与β-2微 球蛋白的复合物。多种FcRn变异体用于增强与FcRn受体的结合，且在一些 情况下，增加血清半衰期。“FcRn变异体”增强与FcRn受体的结合，且适合 的FcRn变异体在下文中展示。

如本文所用，“亲本多肽”意指随后经过修饰来产生变异体的起始多肽。 亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变异体或工程化版本。 因此，如本文所用，“亲本免疫球蛋白”意指未修饰的免疫球蛋白多肽，其被 修饰以产生变异体，并且本文所用的“亲本抗体”意指未修饰的抗体，其被修 饰以产生变异体抗体。应注意“亲本抗体”包含如下文概述的已知的市售、以 重组方式产生的抗体。在此情形下，“亲本Fc结构域”将相对于所列举的变异 体而言；因此，“变异体人类IgG1 Fc结构域”是相比于人类IgG1的亲本Fc 结构域，“变异体人类IgG4 Fc结构域”是相比于人类IgG4亲本Fc结构域等。

如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含IgG分子的CH2-CH3 结构域，并且在一些情况下包括铰链的多肽。在人类IgG1的EU编号中， CH2-CH3结构域包含氨基酸231到447，且铰链为216到230。因此“Fc结构 域”的定义包含氨基酸231-447(CH2-CH3)或216-447(铰链-CH2-CH3)或 其片段。在此情形下，“Fc片段”可能含有较少来自N端和C端中任一个或 两个的氨基酸但仍保留与另一Fc结构域或Fc片段形成二聚体的能力，如可以 使用通常基于尺寸的标准方法(例如，非变性色谱、尺寸排阻色谱等)检测。 人类IgG Fc结构域是特别用于本发明的，且其可以是来自人类IgG1、IgG2或 IgG4的Fc结构域。

与亲本Fc结构域相比，“变异体Fc结构域”含有氨基酸修饰。因此，与 人类IgG1 Fc结构域相比，“变异体人类IgG1 Fc结构域”是含有氨基酸修饰(一 般是氨基酸取代，但在消融变异体的情况下包括氨基酸缺失)的结构域。一般 来说，变异体Fc结构域与对应的亲本人类IgG Fc结构域具有至少约80、85、 90、95、97、98或99％的一致性(使用下文论述的一致性算法，其中一个实 施例利用如所属领域中已知的BLAST算法，使用默认参数)。或者，与亲本 Fc结构域相比，变异体Fc结构域可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。另外，如本文所 论述，本文的变异体Fc结构域仍保留与另一Fc结构域形成二聚体的能力，如 使用如本文所述的已知技术(如非变性凝胶电泳)所测量。

本文的“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部 分，不包括可变重链结构域；在人类IgG1的EU编号中，这是氨基酸118-447。 本文的“重链恒定区片段”意指含有较少来自N端和C端中任一个或两个的 氨基酸但仍保留与另一重链恒定区形成二聚体的能力的重链恒定区。

如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序编号，或 根据确定的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。

如本文所用，“目标抗原”意指通过包括给定抗体的可变区的抗原结合结 构域而特异性结合的分子。如下文所论述，在本发明的情况下目标抗原是检查 点蛋白质。

在本发明的异二聚体抗体的单体的情形下，本文的“链型”意指类似于 DNA中的“匹配”的两股，将异二聚化变异体并入各单体中以便保持“匹配” 以形成异二聚体的能力。举例来说，如果将一些pI变异体工程化到单体A(例 如使得pI更高)中，那么同样可以使用的作为“电荷对”的空间变异体不会 干扰pI变异体，例如将使得pI更高的电荷变异体放在相同“链”或“单体” 上以保留两种功能。类似地，对于如下文更全面概述的组中成对出现的“歪斜” 变异体来说，所属领域的技术人员在决定所述一组对将进入哪个链或单体时考 虑pI，以使得使用歪斜变异体的pI也使pI分离最大化。

如本文所用，“目标细胞”意指表达目标抗原的细胞。

在产生根据本发明的双特异性抗体的情形下，本文的“宿主细胞”意指含 有编码双特异性抗体的组分的外源核酸并且能够在适合的条件下表达双特异 性抗体的细胞。适合的宿主细胞在下文中论述。

如本文所用，“可变区”或“可变结构域”意指免疫球蛋白的区，其包括 基本上由分别构成κ、λ以及重链免疫球蛋白基因基因座的Vκ、Vλ和/或VH 基因中的任一种编码的一个或多个Ig结构域，且含有赋予抗原特异性的CDR。 因此，“可变重链结构域”与“可变轻链结构域”配对以形成抗原结合结构域 (“ABD”)。此外，各可变结构域包含三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)(对 于可变重链结构域而言vhCDR1、vhCDR2以及vhCDR3，且对于可变轻链结构域而言vlCDR1、vlCDR2以及vlCDR3)和四个框架(FR)区，其按照以下 顺序由氨基端至羧基端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本文的“野生型或WT”意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列， 包括等位基因变异。WT蛋白质具有未经过有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序 列。

本发明提供多种具有与人类抗体结构域的序列一致性的抗体结构域。两个 类似序列(例如抗体可变结构域)之间的序列一致性可通过以下文献中的算法 测量：Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“生物序列对比(Comparison Of Biosequences)”，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482[局部同源算法]； Needleman,S.B.和Wunsch,CD.(1970)“适用于在两个蛋白质的氨基酸序列中 搜索类似性的通用方法(A General MethodApplicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of TwoProteins)”，《分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.)》48:443[同源比对算法]；Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988)“生 物序列比较的改良工具(Improved Tools For BiologicalSequence Comparison)” 《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))》85:2444[类似性搜索 方法]；或Altschul,S.F.等人，(1990)“基础局部比对搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)”，《分子生物学杂志》215:403-10，即“BLAST”算法， 参见

本发明的抗体通常是分离的或重组的。“分离”当用于描述本文中公开的 各种多肽时，意指一种多肽，其已经被鉴别且从表达其的细胞或细胞培养物中 分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备经分离的多肽。“经分离的 抗体”是指基本上与具有不同抗原特异性的其它抗体脱离的抗体。“重组”意 指在外源宿主细胞中使用重组核酸技术产生抗体，且所述抗体也可被分离。

“特异性结合”或“特异性结合到”特定抗原或表位，或“对”特定抗原 或表位“有特异性”意指结合可测量地不同于非特异性相互作用。特异性结合 可以如下测量：例如相比于对照分子的结合来确定一种分子的结合，所述对照 分子通常是不具有结合活性的类似结构分子。举例而言，特异性结合可藉由与 类似于目标的对照分子竞争来确定。

特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体来展现，所述抗体针对抗 原或表位的KD为至少约10

而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过具有KA或Ka为以下 的抗原或表位的抗体来展现：相对于对照物，比表位大至少20倍、50倍、100 倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定 的抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI 分析测量。

D.抗体

本发明涉及结合如本文所论述的两种不同检查点抗原的双特异性检查点 抗体的产生。如下所述，通常使用术语“抗体”。可以用于本发明的抗体可以 采用如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体 衍生物、片段和模拟物。

传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每种四聚体典型地由相同的两对多 肽链组成，每对具有一条“轻链”(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重 链”(典型地具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被分类为κ和λ轻链。本 发明涉及通常基于IgG类的双特异性抗体，其具有几种子类，包括但不限于 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使 用。应注意IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多型性的不同 同种异型。本文所描绘的序列使用356E/358M同种异型，然而在本文中包括 另一同种异型。也就是说，本文所包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可能 具有356D/358L，替换356E/358M同种异型。

此外，本文的多种抗体具有至少一个位置220处的半胱氨酸替换为丝氨 酸；通常对本文所描绘的大多数序列而言，这是在“scFv单体”侧，尽管其 也可以在“Fab单体”侧，或两者，以减少二硫化物形成。特别包含在本文的 序列内的是半胱氨酸替换的(C220S)序列中的一个或两个。

因此，如本文所用，“同型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的 免疫球蛋白的任一子类。应了解治疗抗体还可以包含同型和/或子类的杂合体。 举例来说，如US公开案2009/0163699中所示，其以引用的方式并入，本发明 包含使用人类IgG1/G2杂合体。

高变区通常包含来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表 示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B (HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸 残基；Kabat等人,《免疫学相关蛋白质的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》,第5版.马里兰州贝塞斯达美国国家 卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth, Bethesda,Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的 26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987) 《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。

如所属领域的技术人员将了解，CDR的精确编号和布置在不同系统中可 以不同。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包含相关(固有) CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、 vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR (例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下， 参见Lafranc等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1):55-77(2003)：

表1

在通篇本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区 中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统且 Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。

重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。本文的“铰链”或“铰链区” 或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒 定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域结束于EU位置 215处，且IgG CH2结构域开始于残基EU位置231处。因此本文中对于IgG 而言定义抗体铰链包含位置216(在IgG1中为E216)至230(在IgG1中为 p230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链 片段”，其在铰链结构域的N端和C端中任一个或两个处含有较少氨基酸。如 本文所提及，pI变异体还可在铰链区中制成。

轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并与可变 重链结构域一起形成Fv区)和轻链恒定区(通常称为CL或Cκ)。

所关注的用于另外取代的另一区是Fc区，如本文所概述。

本发明提供了大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含 三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、 vhCDR2和vhCDR3。这些可以相应地是较大可变轻链结构域或可变重链结构 域的一部分。另外，如本文中更全面地概述，当使用重链和轻链时(例如当使 用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以位于单独的多肽链上，或 在scFv序列的情况下位于单个多肽链上。

CDR有助于抗体的抗原结合位点，或更具体地说，表位结合位点的形成。 “表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作 用的决定子。表位是如氨基酸或糖侧链的分子的聚组，且通常具有特定的结构 特征以及特定的电荷特征。单个抗原可以具有超过一个表位。

表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分) 和未直接涉及结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基 酸残基；换而言之，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区范围内。

表位可以是构形的也可以是线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同 区段的氨基酸空间并置而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生 的表位。构形和非构形表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后 者的结合丧失。

表位典型地包括呈独特空间构象的至少3个且更通常至少5个或8-10个 氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻 断另一种抗体与目标抗原结合的能力，例如“框并”。如下文所概述，本发明 不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结 合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

因此，本发明提供不同的抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知， 本发明的异二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以是重叠的。 这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、 铰链结构域、重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、 可变重链结构域、可变轻链结构域、轻链恒定结构域、FAb结构域和scFv结 构域。

因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域，和任选地铰链结构域 (-H-CH2-CH3)。对于IgG来说，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3 (Cγ2和Cγ3)以及位于CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的较低铰链区。虽然 Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链Fc区通常被界定成包括残基C226 或P230到其羧基末端，其中编号是根据如Kabat中的EU索引进行。因此，IgG 情形下的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU索引是指位置 118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”根 据如Kabat中的EU索引是指位置231-340，“CH3”根据如Kabat中的EU索 引是指位置341-447。因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域，和任选地铰 链结构域(铰链-CH2-CH3)。在本文的实施例中，当scFv连接到Fc结构域时， scFv构筑体的C端连接到Fc结构域的全部或部分铰链；例如其通常连接到作 为铰链起点的序列EPKS。在一些实施例中，如下文更充分描述，对Fc区进 行氨基酸修饰，例如改变与一个或多个FcγR受体或与FcRn受体的结合，并 且实现如本文所概述的异二聚体形成和纯化。

重链包括可变重链结构域和恒定结构域，其包含CH1-任选的铰链-包括 CH2-CH3的Fc结构域。轻链包括可变轻链结构域和轻链恒定结构域。scFv 包括可变重链、scFv连接子以及可变轻链结构域。在本文所概述的大多数构 筑体和序列中，可变重链的C端连接到scFv连接子的N端，scFv连接子的C 端连接到可变轻链的N端(N-vh-连接子-vl-C)，尽管此顺序可以调换(N-vl- 连接子-vh-C)。

本发明的一些实施例包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的， 但是通常包括由scFv连接子连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构 域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常由N端至C端定向为vh-scFv连接 子-vl，但是针对任一个scFv结构域(或使用Fab的vh和vl序列构筑的那些) 这种定向可以逆向，成为vl-scFv连接子-vh，其中取决于形式(大体参见图1) 任选的连接子位于一个末端或两个末端。

如本文所示，存在多种可以用于共价连接所列举的结构域的适合的连接子 (用作结构域连接子或scFv连接子)，包括传统肽键，其通过重组技术来生成。 在一些实施例中，连接子肽可能主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或 Thr。连接子肽应该具有足以连接两个分子的长度，以便其相对于彼此呈现正 确的构象，从而使其保留所期望的活性。在一个实施例中，连接子具有约1 到50个氨基酸的长度，优选约1到30个氨基酸的长度。在一个实施例中，可 以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施例中使用约5个到约10个氨基酸。适用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、 (GSGGS)n(SEQ IDNO:37756)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:37757)和(GGGS)n (SEQ ID NO:37758)(其中n是至少一(并且通常是3到4)的整数)、甘氨酸 -丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。或者，多种非蛋白 质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇 和聚丙二醇的共聚物可以用作连接子。

其它连接子序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包 括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。 连接子可以来源于免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。连接子可以来源于任何同 型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε 和Cμ。连接子序列还可以来源于其它蛋白质，如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、 KIR)、铰链区源序列，和来自其它蛋白质的其它天然序列。

在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文所概述的 任何两个域连接在一起。举例来说，在图中1F，可能存在将Fab的CH1结构 域的C端连接到scFv的N端的结构域连接子，并且另一任选的结构域连接子 将scFv的C端连接到CH2结构域(尽管在许多实施例中，使用铰链作为这个 结构域连接子)。尽管可以使用任何适合的连接子，但许多实施例利用甘氨酸 丝氨酸聚合物作为结构域连接子，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ IDNO: 37756)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:37757)和(GGGS)n(SEQ ID NO:37758)， 其中n为至少一(并且通常3到4到5)的整数以及允许具有足够长度和柔性 的两个结构域的重组连接以允许每个结构域保持其生物功能的任何肽序列。在 一些情况下，且在关注如下文概述的“链型”的情况下，可以使用如在scFv 连接子的一些实施例中所使用的带电结构域连接子。

在一些实施例中，连接子是scFv连接子，用于共价连接如本文所论述的 vh结构域和vl结构域。在许多情况下，scFv连接子是带电scFv连接子，多种 所述带电scFv连接子展示于图7中。相应地，本发明进一步提供带电scFv连 接子，以辅助第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正 或负(或两者，在不同单体上使用scFv的骨架的情况下)电的scFv连接子， 由此允许包含带电连接子的单体改变pI而不会在Fc结构域中产生进一步的变 化。这些带电连接子可以被取代到含有标准连接子的任何scFv中。此外，如 所属领域的技术人员将了解，根据所期望的pI变化，在适当的“链”或单体 上使用带电scFv连接子。举例来说，如本文所论述，为了产生三重F形式异 二聚体抗体，计算每个所期望抗原结合结构域的Fv区的初始pI，且选择其一 来产生scFv，且依据pI选择正性或负性连接子。

带电结构域连接子还可以用于同样增强本发明单体的pI分离，且因此图

7中所包括的连接子可以用于本文中利用连接子的任何实施例中。

特定来说，图1中所描绘的形式是抗体，通常称为“异二聚体抗体”，意 指蛋白质具有至少两种自组装到异二聚体Fc结构域中的相关Fc序列和至少两 个Fv区，无论作为Fab或作为scFv。

E.嵌合和人源化抗体

在某些实施例中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的 重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此 类抗体可以包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系 序列“的产物”或“来源于”特定种系序列的重链或轻链可变区。作为人类生 殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”其的人类抗体可以通过将人类抗 体的氨基酸序列与人类生殖系免疫球蛋白的氨基酸序列比较且选择与人类抗 体的序列在序列方面最接近(也就是说，最大一致性％)的人类生殖系免疫球 蛋白序列(使用本文所概述的方法)来鉴别出来。由于例如天然存在的体细胞 突变或有意引入定点突变，作为特定人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或 “来源于”特定人类生殖系免疫球蛋白序列的人类抗体与生殖系序列相比可含 有氨基酸差异。然而，人源化抗体典型地在氨基酸序列方面与由人类生殖系免 疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％一致，且当相比于其它物种(例如鼠 类生殖系序列)的生殖系免疫球蛋白氨基酸序列时，含有将所述抗体标识为来 源于人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列与生殖 系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％或甚至 至少96％、97％、98％或99％一致。典型地，来源于特定人类生殖系序列的人源化抗体相比于由人类生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列将显示不超 过10-20个氨基酸差异(在引入本文的任何歪斜、pI和消融变异体之前；也就 是说，在引入本发明的变异体之前，变异体数目通常较低)。在某些情况下， 相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示不超过 5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何歪斜、 pI和消融变异体之前；也就是说，在引入本发明的变异体之前，变异体数目通 常较低)。

在一个实施例中，亲本抗体已经发生亲和成熟，如所属领域中已知。可以 利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所 述。基于选择的方法可以用于人类化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限 于以下文献中所述的方法：Wu等人,1999,《分子生物学杂志》294:151-162；Baca等人,1997,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272(16):10678-10684；Rosok 等人,1996,《生物化学杂志》271(37):22611-22618；Rader等人,1998，《美国 国家科学院院刊》95:8910-8915；Krauss等人,2003,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》16(10):753-759，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。 其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方 法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,《免疫学杂志》169:1119-1125；De Pascalis 等人,2002,《免疫学杂志》169:3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整 体并入本文中。

VII.异二聚体抗体

相应地，在一些实施例中，本发明提供异二聚体检查点抗体，其依赖于使 用两种不同的将自组装而形成异二聚体Fc域和异二聚体抗体的重链变异体Fc 结构域。

本发明涉及新颖构筑体，其提供的异二聚体抗体允许结合到超过一种检查 点抗原或配体，例如允许双特异性结合。异二聚体抗体构筑体是基于抗体重链 中的两个Fc结构域的自组装性质，例如两种“单体”组装成“二聚体”。异二 聚体抗体是通过改变每种单体的氨基酸序列来产生，如下文更充分地论述。因 此，本发明大体上涉及产生能够以数种方式与抗原共接合的异二聚体检查点抗 体，依赖于在每个链上不同的恒定区中的氨基酸变异体以促进异二聚体形成和 /或允许在同二聚体上容易地纯化异二聚体。

因此，本发明提供双特异性抗体。抗体技术中正存在的一个问题是期望“双 特异性”抗体同时结合到两种不同抗原，通常由此允许不同抗原接近且从而产 生新功能和新疗法。一般来说，这些抗体是通过将每条重链和轻链的基因纳入 宿主细胞中来产生。这通常引起所期望的异二聚体(A-B)以及两种同二聚体 (A-A和B-B(不包含轻链异二聚体问题))的形成。然而，形成双特异性抗体 的主要障碍是难以从同二聚体抗体中纯化异二聚体抗体和/或难以偏向于形成 异二聚体(相对于形成同二聚体)。

存在多种机制可以用于产生本发明的异二聚体。此外，如所属领域的技术 人员将了解，这些机制可以组合以确保高度异二聚化。因此，引起异二聚体产 生的氨基酸变异体称为“异二聚化变异体”。如下文所论述，异二聚化变异体 可以包括空间变异体(例如下文所述的“杵和臼”或“歪斜”变异体以及下文 所述的“电荷对”变异体)以及“pI变异体”，其允许从异二聚体中纯化同二 聚体。正如WO2014/145806(全文特此并入本文供参考)中大体所述，且如 下文关于“异二聚化变异体”的论述具体所述，适用的异二聚化机制包括“杵 和臼”(“KIH”；本文中有时称为“歪斜”变异体)(参见WO2014/145806中 的论述)、如WO2014/145806中所述的“静电转向”或“电荷对”、如 WO2014/145806中所述的pI变异体，以及如WO2014/145806和下文中所概述 的一般额外Fc变异体。

在本发明中，存在可以容易纯化异二聚体抗体的几种机制；一种依赖于 pI变异体的使用，以便每种单体具有不同pI，从而允许对A-A、A-B和B-B 二聚体蛋白质进行等电纯化。或者，一些骨架形式(如“三重F”形式)也允 许根据尺寸实现分离。如下文进一步概述，还可以“偏斜”形成异二聚体(相 对于同二聚体)。因此，空间异二聚化变异体与pI或电荷对变异体的组合特别 适用于本发明中。

一般而言，特别用于本发明的实施例依赖于如下的变异体的组：其包括有 助于异二聚化形成(相较于同二聚化形成)的歪斜变异体，其与pI变异体偶 合，其增加两个单体之间的pI差异，以辅助从同二聚体纯化异二聚体。

另外，如下文更全面地概述，取决于异二聚体抗体的形式，pI变异体可以 含在单体的恒定结构域和/或Fc结构域内，或可以使用带电连接子(结构域连 接子或scFv连接子)。也就是说，利用scFv的骨架(如三重F形式)可以包 括带电scFv连接子(带正电或负电)，从而进一步增强pI用于纯化目的。如 所属领域的技术人员将了解，一些三重F形式联合仅带电scFv连接子使用且 不进行额外的pI调节，但是本发明提供的pI变异体位于一种或两种单体上； 和/或也联合带电结构域连接子使用。另外，额外氨基酸的工程化(用于替代 功能)也可以赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变异体。

在利用pI作为分离机制以允许对异二聚体蛋白质纯化的本发明中，可以 将氨基酸变异体引入一个或两个单体多肽中；也就是说，一个单体(为了简单 起见，本文中称为“单体A”)的pI可以加以工程化以与单体B分离，或单体 A和B变化均可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如所 论述，任一种或两种单体的pI变化可以如下进行：除去或添加带电残基(例 如用带正或负电的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如甘氨酸置换成谷氨酸)、 将带电残基从正或负电荷变为相反电荷(天冬氨酸变为赖氨酸)或将带电残基 变为中性残基(例如电荷损失；赖氨酸变为丝氨酸)。多种这些变异体展示于 图中。

相应地，本发明的这个实施例使得至少一个单体的pI产生了足够的变化， 从而可以将异二聚体与同二聚体分离。如所属领域的技术人员将了解，且如下 文进一步所论述，这可通过使用“野生型”重链恒定区和已经工程化成以增加 或降低其pI的变异体区进行(wt A-+B或wt A--B)，或通过增加一个区并减少 另一区进行(A+-B-或A-B+)。

因此，一般来说，本发明的一些实施例的组分是抗体恒定区中的氨基酸变 异体，其涉及形成“pI抗体”的二聚体蛋白质中至少一种(若非两种)单体的 等电点(pI)的改变，这是通过将氨基酸取代(“pI变异体”或“pI取代”)并 入一种或两种单体中来实现。如本文所示，如果两个单体的pI相差小到0.1 个pH单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么 可以实现异二聚体与两种同二聚体的分离。

如所属领域的技术人员将了解，为了得到良好分离，在每个或两个单体上 包含的pI变异体的数目将部分地取决于组分的起始pI，例如在三重F形式下， 取决于所关注的scFv和Fab的起始pI。也就是说，为了确定对哪种单体进行 工程化或以哪个“方向”(例如更正或更负)，计算两种目标抗原的Fv序列并 且据此作出决定。如所属领域中已知，不同的Fv将具有用于本发明中的不同 起始pI。一般来说，如本文所概述，pI经工程化而使得每种单体的总pI差异 达到至少约0.1log，如本文所概述优选0.2到0.5。

此外，如所属领域的技术人员将了解且如本文所概述，在一些实施例中， 可以根据尺寸将异二聚体与同二聚体分离。举例来说，如图1所示，几种形式 允许根据尺寸来分离异二聚体和同二聚体。

A.异二聚化变异体

本发明提供异二聚体蛋白质，包含多种形式的异二聚体抗体，其利用异二 聚体变异体来实现异二聚体形成和/或由同二聚体纯化。

异二聚化歪斜变异体中存在多个适合对的组。这些变异体以成“对”“组” 方式出现。也就是说，将一组对并入第一单体中且将另一组对并入第二单体中。 应注意，这些组不一定表现为“臼包杵”型变异体，其中一个单体上的残基与 另一个单体上的残基之间存在一对一对应；也就是说，组中的这些对形成了两 个单体之间的界面，促进了异二聚体形成且阻碍了同型二聚体形成，从而使在 生物学条件下自发形成异二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同 型二聚体A/A:50％异二聚体A/B:25％同型二聚体B/B)。

B.空间变异体

在一些实施例中，通过添加空间变异体可以辅助异二聚体的形成。也就是 说，通过改变每个重链中的氨基酸，不同重链缔合形成异二聚体结构的可能性 大于与相同Fc氨基酸序列形成同二聚体的可能性。适合的空间变异体包括于 图中。

一种机制在所属领域中通常称为“杵和臼”，还可以任选地使用所谓的氨 基酸工程来产生空间影响以有利于形成异二聚体而不利于形成同二聚体；这有 时称为“杵和臼”，如以下文献中所述：USSN 61/596,846；Ridgway等人，《蛋 白质工程》9(7):617(1996)；Atwell等人，《分子生物学杂志》1997 270:26； 美国专利第8,216,805号，所有这些文献全部并入本文供参考。图标出了依赖 于“杵和臼”的“单体A-单体B”对的数目。另外，如Merchant等人，《自然·生 物技术》16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以歪斜 形成异二聚化。

一种用于产生异二聚体抗体的另一种机制有时称为“静电转向”，如 Gunasekaran等人,《生物化学杂志》285(25):19637(2010)中所述，所述文献以 全文引用的方式并入本文中。这在本文中有时被称作“电荷对”。在这个实施 例中，静电用于歪斜形成异二聚化。如所属领域的技术人员将了解，这些还可 以影响pI且从而影响纯化，且因此在一些情况下还可以被视为pI变异体。然 而，由于这些是为了强制发生异二聚化而产生且不是作为纯化工具使用，因此 其被分类为“空间变异体”。这些包含但不限于，与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与 C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。

额外单体A和单体B变异体可以任选地且独立地以任何量与其它变异体 (如本文所概述的pI变异体或US 2012/0149876的图37中所示的其它空间变 异体，其中的图和图例和SEQ ID NO特此并入本文中供参考)组合。

在一些实施例中，本文所概述的空间变异体可以任选地且独立地与任何 pI变异体(或其它变异体，如Fc变异体、FcRn变异体等)一起并入一个或两 个单体中，且可以独立地且任选地包含于本发明的蛋白质中或从本发明的蛋白 质中排除。

一系列适合的歪斜变异体见于图3中，且图8展示了多个实施例中的一些 对特定效用。在多个实施例中，特别适用的组中的对，其包含(但不限于) S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括二硫桥键， T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)。就命名法而言，对 “S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体中的一者具有双变异体组S364K/E357Q并且另一者具有双变异体组L368D/K370S；如上文所提及，这 些对的“链型”取决于起始pI。

C.用于异二聚体的pI(等电点)变异体

一般来说，如所属领域的技术人员将了解，pI变异体存在两种通用类别： 提高蛋白质pI(碱性变化)的变异体和降低蛋白质pI(酸性变化)的变异体。 如本文所述，可以实现这些变异体的所有组合：一个单体可以是野生型，或 pI与野生型无显著差异的变异体；且另一个单体可以更具碱性或更具酸性。或 者，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。

pI变异体的优选组合示于图4中。如本文所概述且如图中所示，这些变化 是相对于IgG1展示，而且所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在 重链恒定结构域是来自IgG2-4的情况下，还可以使用R133E和R133Q。

在一个实施例中，例如在图1A、E、F、G、H和I形式下，pI变异体的 优选组合具有一个单体(负Fab侧)，其包含208D/295E/384D/418E/421D变异 体(当相对于人类IgG1时，N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)，和第二单 体(正scFv侧)，其包含带正电scFv连接子，包括(GKPGS)

因此，在一些实施例中，一个单体具有来自图4的一组取代且另一单体 具有带电连接子(以带电scFv连接子形式，因为所述单体包含scFv，或以带 电结构域连接子形式，如所述形式所表明，其可选自图7中所描绘的那些)。

1.同型变异体

另外，本发明的许多实施例依赖于将来自一种IgG同型的特定位置的pI 氨基酸“引进”另一种IgG同型中，从而减少或排除变异体中引入非所需免疫 原性的可能性。多种这些变异体展示于美国公开2014/0370013的图21中，此 文献特此并入本文供参考。也就是说，IgG1因多种原因所致(包括高效应功 能)是治疗抗体的共同同型。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2的重链恒 定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1骨 架中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。 举例来说，IgG1具有在位置137的甘氨酸(pI 5.97)，且IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；引进谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所述，为了显著影响变异 体抗体的pI，通常需要多个氨基酸取代。然而，应注意，如下文所论述，IgG2 分子中的均一变化使得血清半衰期延长。

在其它实施例中，产生非同型氨基酸变化，以降低所得蛋白质的总体电荷 状态(例如通过将较高pI氨基酸变为较低pI氨基酸)，或允许结构适应稳定 性等，如下文更进一步描述。

另外，通过对重链和轻链恒定结构域进行pI工程化，可以发现异二聚体 中的各个单体发生显著变化。如本文所论述，使两种单体的pI相差至少0.5 可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现 分离。

D.计算pI

每种单体的pI可以依赖于变异体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，包 括变异体重链恒定结构域和融合搭配物。因此，在一些实施例中，使用以下美 国公开中的图19的图表，基于变异体重链恒定结构域计算pI变化： 2014/0370013。如本文所论述，对哪种单体进行工程化通常根据Fv和骨架区 的固有pI来决定。或者，可以对每种单体的pI进行比较。

E.还赋予更好的FcRn体内结合的pI变异体

在pI变异体降低单体pI的情况下，其可以具有改善体内血清滞留时间的 额外好处。

虽然仍处于审查，但是相信Fc区使体内半衰期延长，原因是在核内体中 在pH 6结合到FcRn隔绝了Fc(Ghetie和Ward，1997《今日免疫学(Immunol Today)》18(12):592-598，此文献完全并入本文供参考)。随后内体隔室使Fc 再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间敞开，则较高pH(约7.4)诱导Fc 释放回到血液中。Dall'Acqua等人表明，在小鼠中，在pH6和pH 7.4的FcRn 结合增强的Fc突变异体实际上具有减小的血清浓度以及与野生型Fc相同的半 衰期(Dall'Acqua等人，2002，《免疫学杂志》169:5171-5180，此文献完全并 入本文供参考)。Fc对FcRn的亲和力在pH 7.4增强被认为是禁止了Fc释放 回到血液中。因此，延长Fc体内半衰期的Fc突变理想地增强了较低pH下的 FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0到7.4的pH范围内，氨 基酸组胺酸的电荷状态发生变化。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置找到 His残基并不出乎意料。

最近，已经提出具有等电点较低的可变区的抗体也可以具有较长血清半衰 期(Igawa等人，2010PEDS.23(5):385-392，其以引用的方式整体并入本文中)。 然而，对这种抗体的机制的了解尚浅。此外，不同抗体，可变区情况不同。pI 降低且半衰期延长的恒定区变异体为改善抗体的药物动力学特性提供了更加 模块化的方法，如本文所述。

F.用于额外功能的额外Fc变异体

除pI氨基酸变异体之外，可以出于多种原因(包括但不限于改变与一种 或多种FcγR受体的结合、改变与FcRn受体的结合等)而产生多个适用的Fc 氨基酸修饰。

相应地，本发明的蛋白质可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异二聚 化变异体，包括pI变异体和空间变异体。每组变异体可以独立地且任选地包 括于任何特定异二聚体蛋白质中或从任何特定异二聚体蛋白质中排除。

G.FcγR变异体

相应地，可以产生多个适用的Fc取代来改变与一种或多种FcγR受体的结 合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知与 FcγRIIIa的结合增加引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞 介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上的所结 合抗体且随后促使目标细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb的结 合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括 USSN 11/124,620(尤其是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出 的氨基酸取代，所有这些文献全文以及尤其是针对其中所揭露的变异体所述内 容特此并入本文中供参考。可以使用的特定变异体包括但不限于236A、239D、 239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、 239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。

另外，存在可以用于增强与FcRn受体的结合以及延长血清半衰期的额外 Fc取代，如USSN 12/341,769中具体所揭露(全文并入本文供参考)，包括但 不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、 436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。

H.消融变异体

类似地，另一类功能变异体是“FcγR消融变异体”或“Fc基因剔除(FcKO 或KO)”变异体。在这些实施例中，在一些治疗应用中，期望减少或除去Fc 结构域与一种或多种或全部Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa 等)的正常结合以避免额外作用机制。也就是说，例如，在许多实施例中，确 切地说，在使用双特异性检查点抗体的情况下，需要消融FcγRIIIA结合以消 除或显著降低ADCC活性，使得Fc结构域中的一者包含一个或多个Fcγ受体 消融变异体。这些消融变异体描绘于图5中，且各自可以独立地且任选地包括 在内或排除，利用消融变异体的优选方面选自由以下组成的群组： G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。 应注意本文中提及的消融变异体消融FcγR结合，但是通常不消融FcRn结合。

如本领域中已知，人类IgG1的Fc结构域与Fcγ受体的结合最高，且因此 当异二聚体抗体的骨架中的恒定结构域(或Fc结构域)是IgG1时，可以使用 消融变体。或者，或在IgG1背景下除消融变异体以外，例如，糖基化位置297 处的突变(通常成A或S)也能够显著消融与FcγRIIIa的结合。人类IgG2和 IgG4与Fcγ受体的结合天然地降低，且因此可以在具有或不具有消融变异体 的情况下使用那些骨架。

I.异二聚体变异体与Fc变异体的组合

如所属领域的技术人员将了解，所述异二聚化变异体(包括歪斜和/或pI 变异体)全部可以任选地且独立地按任何方式组合，只要其保持其“链型”或 “单体分区”。另外，所有这些变异体可以按任一种异二聚化形式组合。

在pI变异体的情况下，虽然图中展示了可以特别使用的实施例，但是可 以根据改变两种单体之间的pI差异以辅助纯化的基本规则来产生其它组合。

另外，异二聚化变异体中的任一种(歪斜变异体和pI变异体)也独立地 且任选地与Fc消融变异体、Fc变异体、FcRn变异体组合，大体如本文所概 述。优选组合展示于图6中。

目标抗原的抗原结合结构域

本发明的双特异性抗体具有以二价、双特异性形式或三价双特异性形式结 合到两个不同的目标抗原(“目标对”)的两个不同的抗原结合结构域(ABD)， 大体如图1中所示。在本发明中，双特异性异二聚体抗体靶向一侧上的人类 PD-1和另一侧上的第二抗原，所述第二抗原选自CTLA-4、TIM-3、LAG-3、 TIGIT、ICOS和BTLA，其序列展示于图2中。因此，适合的双特异性抗体结 合PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1 和BTLA和PD-1和ICOS。应注意，对于各对，通常这些双特异性抗体命名 为“抗PD-1×抗CTLA-4”或通常简化或简便(且因此互换地)为“PD-1×CTLA-4” 等。应注意，除非本文中特别规定，否则名称中抗原列表的顺序不赋予结构； 亦即PD-1×CTLA-4开瓶器抗体可以具有结合PD-1或CTLA-4的scFv，尽管 在一些情况下，顺序规定所指示的结构。

如本文更全面地概述，这些ABD组合能够以各种形式，如下文所概述， 通常为其中一个ABD以Fab形式且另一个以scFv形式的组合。如本文所论述 且在图1中展示，一些形式使用单一Fab和单一scFv(图1A、C和D)，且一 些形式使用两个Fab和单一scFv(图1E、F、G、H和I)。

VIII.抗原结合结构域

如本文所论述，本发明的双特异性异二聚体抗体包括两个抗原结合结构域(ABD)，其中的每一者结合到不同目标蛋白质。如本文所概述，这些异二聚体 抗体可以是双特异性且二价的(例如以图1A中所描绘的形式，每个抗原结合 到单个ABD)或双特异性且三价(例如图1F中所描绘，一个抗原结合到单个 ABD且另一个抗原结合到两个)。

此外，一般来说，其中一个ABD包括如本文所概述的scFv，所述scFv 由N端至C端呈vh-scFv连接子-vl或vl-scFv连接子-vh的定向。其它ABD 中的一个或两个，根据所述形式，通常是Fab，其包括一个蛋白质链上的vh 结构域(通常作为重链的组分)和另一个蛋白质链上的vl(通常作为轻链的组 分)。

本发明提供多种结合多种不同目标蛋白质的ABD，如下文所概述。如所 属领域的技术人员将了解，6个CDR的任何组或vh结构域和vl结构域可以呈 scFv形式或Fab形式，其随后添加到重链恒定结构域和轻链恒定结构域，其 中重链恒定结构域包含变异体(包括在CH1结构域以及Fc结构域内)。含于 序列表中的scFv序列利用特定带电连接子，但如本文所概述，可以使用不带 电连接子或其它带电连接子，包括图7中所描绘的那些。

此外，如上文所论述，序列表中所使用用于鉴别CDR的编号是Kabat， 然而，可以使用不同编号，其将改变如表1中所示的CDR的氨基酸序列。

对于本文所列出的所有可变重链结构域和可变轻链结构域，可以制得其它 变异体。如本文所概述，在一些实施例中，6个CDR的组可以具有0、1、2、 3、4或5个氨基酸修饰(特别适用的是氨基酸取代)，以及可变重链结构域和 可变轻链结构域的框架区中的变化，只要框架(不包含CDR)保留与选自美 国专利第7,657,380号(其图和图例以全文引用的方式并入本文中)的图1中 所列出的序列的人类生殖系序列的至少约80、85或90％一致性。因此，例如， 本文所述的相同CDR可以与来自人类生殖系序列的不同框架序列组合，只要 框架区保留与选自美国专利第7,657,380号的图1中所列出的序列的人类生殖 系序列的至少约80、85或90％一致性。或者，CDR可以具有氨基酸修饰(例 如来自所述组CDR中的1、2、3、4或5氨基酸修饰(也就是说，CDR可以 是经修饰的，只要6个CDR的组中的变化的总数小于6个氨基酸修饰，其中 改变CDR的任何组合；例如，vlCDR1中可能存在一个变化，vhCDR2中可能存在两个变化，vhCDR3中可能不存在变化等))，以及具有框架区变化，只要 框架区保留与选自美国专利第7,657,380号的图1中所列出的序列的人类生殖 系序列的至少80、85或90％一致性。

A.PD-1抗原结合结构域

在本发明的实施例中，ABD中的一者结合人类PD-1。WO 2017/218707 特此以全文引用的方式明确地并入，且确切地说对于描绘抗PD-1序列的图、 图例和SEQ识别符概述了大量抗PD-1 ABD，其可以与ABD组合用于其它检 查点抑制剂。然而，本发明涉及基于1C11克隆的额外抗PD-1 ABD，如图13、 15、16、18、20、21、24、33和40中所示。

如所属领域中已知，可变结构域的稳定性可基于形式而改变。也就是说， 识别和/或适用于Fab形式的VH和VL结构域可能不如scFv形式稳定，并且 因此有时进行额外工程以增加稳定性(例如Tm)。

在有用的实施例中，本发明提供包含以下的抗PD-1 ABD：VHCDR1，其 包含氨基酸序列HYG(M/I)N；VHCDR2，其包含氨基酸序列WINT(Y/H)TGEP(T/Y)YA(D/P)GF(T/Q)(G/E)；VHCDR3，其包含氨基酸序列 DY(F/Y)GSSPY；a VLCDR1，其包含氨基酸序列VLCDR1 R(S/A)SQSIV(F/H)SNGNTYLE；VLCDR2，其包含氨基酸序列KVSNRF(S/T) 和VHCDR3，其包含氨基酸序列FQGSHVPN。众所周知，描绘为“(S/T)”的 氨基酸意指任一氨基酸都可以在此位置处。另外，包括**GG

在适用的实施例中，本发明的双特异性抗体包括ABD到人类PD-1。在这 些实施例中，使结合到PD-1的六个CDR选自图13、15、16、18、20、21、 24、33和40中的任一者中所描绘的那些CDR。或者，在这些实施例中，使结 合到PD-1的VH和VL结构域选自图13、15、16、18、20、21、24、33和 40中描绘的那些结构域。

在一些实施例中，本发明的双特异性抗体包括以Fab形式的ABD到PD-1。 在一些实施例中，ABD到PD-1含有图13、16、18、20、21、24、33和40的 任何ABD的6个CDR，或图13、16、18、20、21、24、33和40的任何ABD 的VH和VL结构域。

在具有Fab ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图24的 XENP26940 1C11[PD-1]_H3.303_L3.152的ABD。因此，来自XENP026940的 六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

在具有Fab ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图40的 XENP28652 1C11[PD-1]_H3.328_L3.153的ABD。因此，来自XENP28652的 六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

在一些实施例中，本发明的双特异性抗体包括以ScFv形式的ABD到 PD-1。在一些实施例中，ABD到PD-1含有图15的任何ABD的6个CDR或 图15的任何ABD的VH和VL结构域。

在具有scFv ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图15中所描绘 的XENP025806 1C11[PD-1]_H3.234_L3.144的ABD。因此，来自XENP025806 的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

在具有scFv ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图15中所描绘 的XENP025812 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148的ABD。因此，来自XENP025812 的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

在具有scFv ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图15中所描绘 的XENP025813 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148的ABD。因此，来自XENP025813 的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

在具有scFv ABD到PD-1的许多实施例中，特别适用的是图15中所描绘 的XENP025819 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92的ABD。因此，来自XENP025819 的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于本发明的构筑体中。

B.CTLA-4抗原结合结构域

如所属领域的技术人员将了解，任何数目的抗CTLA-4 ABD序列可以与 本发明的scFv抗PD-1序列组合用于产生双特异性抗体。适用作ABD的抗 CTLA-4序列包括SEQ ID NO:21-2918(CTLA-4scFv序列，尽管其中的Fv 序列可以格式化为Fab)、SEQ ID NO:2919-6208(CTLA-4 Fab序列，尽管其 中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO:36739-36818(额外CTLA-4 Fab 序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)和SEQ ID NO:35395-35416(CTLA-4单臂构筑体，其可以格式化为Fab或scFv的任一者)。如所属领域的 技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中， 如将从序列识别符显而易见。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。

本发明中备受关注的是CTLA-4H3_L0.22的Fab CTLA-4 ABD的序列， 包括VH(SEQID NO:38134，具有VHCDR(SEQ ID NO:38135、38136和38137) 和VL(SEQ ID NO:38138，具有VLCDR(SEQ ID NO:38139、38140和38141)。

C.LAG-3抗原结合结构域

如所属领域的技术人员将了解，任何数目的抗LAG-3 ABD序列可以与本 发明的scFv抗PD-1序列组合用于产生双特异性抗体。适用作ABD的抗LAG-3 序列包括SEQ ID NO:17135-20764(LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格 式化为scFv)、SEQ ID NO:36819-36962(额外LAG-3 Fab，尽管其中的Fv序 列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO:35417-35606(额外LAG-3 Fab，尽管其 中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO:25194-32793(额外LAG-3 Fab， 尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)和SEQ ID NO:32794-33002(单臂 LAG-3构筑体，其可以格式化为Fab或scFv的任一者)。如所属领域的技术人 员将理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从 序列识别符显而易见。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959。

本发明中备受关注的是XENP22594的LAG-3 Fab ABD的序列，包括VH (SEQ ID NO:32755，具有VHCDR(SEQ ID NO:32756、32757和32758)和 VL(SEQ ID NO:32760，具有VLCDR(SEQ ID NO:32761、32762和32763)。

本发明中备受关注的是XENP22656的LAG-3 Fab ABD的序列，包括VH (SEQ ID NO:28815，具有VHCDR(SEQ ID NO:28816、28817和28118)和 VL(SEQ ID NO:28820，具有VLCDR(SEQ ID NO:28821、28822和28823)。

D.TIM-3抗原结合结构域

如所属领域的技术人员将了解，任何数目的抗TIM-3 ABD序列可以与本 发明的scFv抗PD-1序列组合用于产生双特异性抗体。适用作ABD的抗TIM-3 序列包括SEQ ID NO:20765-20884(TIM-3 Fab，尽管其中的Fv序列可以格式 化为scFv)、SEQ ID NO:37587-37698(额外TIM-3 Fab，其中的Fv序列可以 格式化为scFv)和SEQ ID NO:36347-36706(二价TIM-3构筑体，其可以格 式化为Fab或scFv的任一者)。如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别 符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

在一些实施例中，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和 37591、37959和37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、 37627和37631、37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和 37663、37667和37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695。

本发明中备受关注的是XENP21189的TIM-3 ABD的Fab序列，包括VH (SEQ ID NO:36508，具有VHCDR(SEQ ID NO:36509、36510和36511)和 VL(SEQ ID NO:36513，具有VLCDR(SEQ ID NO:36514、36515和36516)。

E.BTLA抗原结合结构域

如所属领域的技术人员将了解，任何数目的抗BTLA ABD序列可以与本 发明的scFv抗PD-1序列组合用于产生双特异性抗体。适用作ABD的抗BTLA 序列包括SEQ ID NO:20885-21503(BTLA Fab，尽管其中的Fv序列可以格式 化为scFv)和SEQ ID NO:36707-36738(额外BTLA Fab，尽管其中的Fv序 列可以格式化为scFv)。如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成 对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

在一些实施例中，本发明中使用的抗BTLA ABD选自SEQ ID NO:36707 和36711、36715和36719、36723和36727和36761和36735的对。

本发明中备受关注的是XENP20269的抗BTLA ABD的Fab序列，包括 VH(SEQ ID NO:20936，具有VHCDR(SEQ ID NO:20937、20938和20939) 和VL(SEQ ID NO:20941，具有VLCDR(SEQ ID NO:20942、20943和20944)。

F.ICOS抗原结合结构域

如所属领域的技术人员将了解，任何数目的抗ICOS ABD序列可以与本发 明的scFv抗PD-1序列组合用于产生双特异性抗体。适用作ABD的抗ICOS 序列包括如US2018/0127501中所公开的许多，其以全文引用的方式明确并入 且确切地说用于图例和图19、20和24中所描绘的序列，以及来自 US2018/0127501的SEQ ID NO:27869-28086，其含有多种ICOS Fab序列(重 链VH1-CH1和轻链VL1-CL)，如命名法中所指示。如所属领域的技术人员将 理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列 识别符显而易见。

在一些实施例中，本发明中使用的抗ICOS ABD选自来自US2018/0127501 的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的 对。

在本发明中备受关注的是来自图49的XENCS500的抗ICOS ABD的Fab 序列，其具有VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0。

在本发明中备受关注的是来自图49的XENCS501的抗ICOS ABD的Fab 序列，其具有VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0。

G.TIGIT抗原结合结构域

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。

IX.单价抗PD-1抗体

此外，如所属领域的技术人员将了解，本文所概述的新颖Fv序列也可以 用于单特异性抗体(例如“传统单克隆抗体”)或非异二聚体双特异性形式。

因此，本发明提供单克隆(单特异性)抗体，其包括图中的6个CDR和/ 或vh和vl序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，在一些实施例 中，IgG1、IgG2以及IgG4(包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区)特 别适用。也就是说，本文中具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人类IgG1 抗体的恒定区。

A.抗PD-1单克隆抗体

如所属领域的技术人员将了解，本文所概述的新颖Fv序列也可以用于单 特异性抗体(例如“传统单克隆抗体”)或非异二聚体双特异性形式。因此， 本发明提供单克隆(单特异性)抗体，其包括图中的6个CDR和/或vh和vl 序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，在一些实施例中，IgG1、 IgG2以及IgG4(包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区)特别适用。也 就是说，本文中具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人类IgG1抗体的恒 定区。

在一些实施例中，单克隆抗体选自图13、16、18、20、21、24、33和40 中所描绘的那些。

在一些实施例中，包含来自图24的XENP26940 1C11[PD-1]_H3.303_L3.152的VH和VL结构域的抗体。因此，来自 XENP026940的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于产生单克隆抗体。 在一些实施例中，来自XENP026940的VH和VL可以与IgG1恒定结构域一 起使用。在一些实施例中，来自XENP026940的VH和VL可以与IgG1恒定 结构域一起使用，其可能含有额外Fc变异体，确切地说428L/434S FcRn变异 体。在一些实施例中，来自XENP026940的VH和VL可以与IgG4恒定结构 域一起使用，尤其具有S228P氨基酸取代。在一些实施例中，抗体为XENP26940。

在一些实施例中，包含来自图40的XENP28652 1C11[PD-1]_H3.328_L3.153的VH和VL结构域的抗体。因此，来自XENP28652 的六个CDR和/或VH和VL结构域可以用于产生单克隆抗体。在一些实施例 中，来自XENP28652的VH和VL可以与IgG1恒定结构域一起使用。在一些 实施例中，来自XENP28652的VH和VL可以与IgG1恒定结构域一起使用， 所述恒定结构域可能含有额外Fc变异体，确切地说428L/434S FcRn变异体。 在一些实施例中，来自XENP28652的VH和VL可以与IgG4恒定结构域一起 使用，尤其具有S228P氨基酸取代。在一些实施例中，抗体为XENP28652。

X.本发明的适用形式

如所属领域的技术人员将了解且下文更充分地论述，本发明的双特异性异 二聚体抗体可以采用广泛多种构形，如一般在图1中所描绘。一些图描绘了“单 端”构形，其中分子的一个“臂”上存在一种类型的特异性并且另一个“臂” 存在不同特异性。其它图描绘了“双端”构形，其中分子的“顶部”存在至少 一种类型的特异性且分子的“底部”存在一种或多种不同特异性。因此，本发 明涉及与不同的第一抗原和第二抗原共接合的新颖免疫球蛋白组合物。

如所属领域的技术人员将了解，本发明的异二聚体形式可以具有不同的价 数且具有双特异性。也就是说，本发明的异二聚体抗体可以是二价和双特异性 的，其中一个检查点目标通过一个ABD结合且另一个检查点目标通过另一个 ABD结合。异二聚体抗体也可以是三价且双特异性的，其中第一抗原通过两 个ABD结合且第二抗原通过第二ABD结合。

A.开瓶器形式

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的“三重F”或“开瓶 器”骨架形式。在此实施例中，抗体的一个重链含有单链Fv(“scFv”，如本 文所定义)且另一个重链为“常规”Fab格式，其包含可变重链和轻链。这种 结构在本文中有时被称作“三重F”形式(scFv-Fab-Fc)或“开瓶器”形式(由 于与开瓶器具有大致可见的相似性)(参见图1A)。通过在恒定区(例如Fc 结构域、CH1结构域和/或铰链区)中使用促进异二聚体抗体形成的氨基酸变 异体来使两条链合在一起，如下文更充分地描述。

本发明“三重F”形式存在几个显著优点。如所属领域中已知，依赖于两 种scFv构筑体的抗体类似物通常具有稳定性和聚集问题，这些问题在本发明 中可以通过添加“规则”的重链与轻链对来缓解。另外，与依赖于两条重链和 两条轻链的形式相反，不存在重链和轻链配对不当(例如重链1与轻链2配对 等)的问题。

本文所概述的许多实施例一般依赖于包含第一单体的开瓶器形式，所述第 一单体包含scFv(本文中有时称为“scFv单体”或“scFv链”)，所述scFv包 含使用scFv连接子(在许多但非所有情况下带电)共价连接的可变重链和可 变轻链结构域，其中scFv通常通过结构域连接子共价连接到第一Fc结构域的 N端(其如本文所概述可以是未带电或带电的并且可以是外源性或内源性的 (例如，原生铰链结构域的全部或部分)。因此，scFv单体可以具有由N端到 C端选自以下的结构：VH1-scFv连接子-VL1-任选的连接子-CH2-CH3、 VL1-scFv连接子-VH1-任选的连接子-CH2-CH3、VH1-scFv连接子-VL1-铰链 -CH2-CH3和VL1-scFv连接子-VH1-铰链-CH2-CH3。开瓶器形式下的第二单 体是重链(VH2-CH1-铰链-CH2-CH3)，且组合物另外包括轻链(VL2-CL)。

此外，开瓶器形式的Fc结构域通常包含歪斜变异体(例如，图3和图8 中所示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群组： S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包括pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，开瓶器形式包括歪斜变异体、pI变异体和消融变异体。 因此，一些实施例包括开瓶器形式，其包含：a)包含带电scFv连接子(其中 图7的+H序列在一些实施例中是优选的)的第一单体(“ScFv单体”)、歪斜 变异体S364K/E357Q、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和结 合到本文所概述的PD-1的Fv；b)包含歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的第二单体(“Fab单体”)，且可变重链 结构域与可变轻链结构域结合到如本文所概述的第二抗原的Fv；和c)轻链。

WO2017/218707中概述了此形式的若干适合的组合。一般来说，本发明 涉及基于新识别的克隆1C11的新抗PD-1 ABD的使用。在此情况下，异二聚 体抗体结合到PD-1和第二目标抗原，所述第二目标抗原选自由以下组成的群 组：CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、TIGI(其全部分类为检查点受体)和 ICOS(其为活化剂)。

在一些实施例中，抗PD-1 ABD为开瓶器形式的scFv侧。因此，适合的 ABD对包括(scFv第一，Fab第二)、PD-1×CTLA-4、PD-1×LAG-3、PD-1×TIM-3、 PD-1×BTLA、PD-1×TIGIT和PD-1×ICOS。适合的CDR组以及ABD描述于 下文中，其中特别有用的组合类似地描述于下文中。

在一些实施例中，开瓶器形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异体和 FcRn变异体。因此，一些实施例包含开瓶器形式，其包括：a)第一单体(“scFv 单体”)，其包括带电scFv连接子(在一些实施例中，优选图7的+H序列)、 歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 FcRn变异体M428L/N434S以及结合到如本文所概述的PD-1的Fv；b)第二 单体(“Fab单体”，其包括歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的抗原的Fv)；以 及c)轻链。

具体来说，图50展示了一些开瓶库“构架”序列，其具有PD-1 scFv单 体但缺少可在另一侧使用的Fab序列。也就是说，如本文所论述，CTLA-4、 TIM-3、LAG-3、BTLA-、TIGIT和ICOS的任何ABD的Fab部分的Fv序列。

下文概述特定开瓶器实施例。

B.mAb-Fv

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的mAb-Fv骨架形式。 在此实施例中，所述形式依赖于使用“额外”可变重链结构域与一个单体的C 端连接，以及“额外”可变轻链结构域与另一单体的C端连接，因此形成第 三抗原结合结构域，其中所述两种单体的Fab部分结合到如本文所概述的目标 抗原且“额外”scFv结构域结合PD-1。

在这个实施例中，第一单体包含第一重链，其包含第一可变重链结构域和 包括第一Fc结构域的第一重链恒定结构域，其中第一可变轻链结构域使用结 构域连接子共价附接到第一Fc结构域的C端(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选 的连接子]-vl2)。第二单体包含第二可变重链结构域，其属于包括第二Fc结构 域的第二重链恒定结构域，和第三可变重链结构域，其使用结构域连接子共价 连接到第二Fc结构域的C端(vj1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的连接子]-vh2)。 两个C末端连接可变结构域构成结合PD-1的Fv。这个实施例进一步利用包含 可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合目标抗原的两个相同Fab。就本文的许多实施例来说，这些构筑体包括所期望且 如本文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额外的Fc变异体等。

此外，mAb-Fv形式的Fc结构域包含歪斜变异体(例如，图3和8中所 示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群组： S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电 scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，mAb-Fv形式包括歪斜变异体、pI变异体和消融变异体。 因此，一些实施例包括mAb-Fv形式，其包含：a)第一单体，其包含歪斜变 异体S364K/E357Q、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第 一可变重链结构域(其与轻链的第一可变轻链结构域一起构成Fv)和第二可 变重链结构域；b)第二单体，其包含歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及第一可变重链结构域(其与第一可变 轻链结构域一起构成如本文所概述的Fv)和第二可变轻链(其与第二可变重 链结构域一起形成结合到PD-1的Fv(ABD)；和c)轻链，其包含第一可变 轻链结构域和轻链恒定结构域。

在一些实施例中，mAb-Fv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异体 和FcRn变异体。因此，一些实施例包括mAb-Fv形式，其包括：a)第一单体， 其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S以及第一可 变重链结构域(其与轻链的第一可变轻链结构域一起构成结合到抗原的Fv) 和第二可变重链结构域；b)第二单体，其包括歪斜变异体L368D/K370S、pI 变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S以及第一可 变重链结构域(其与第一可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的抗原 的Fv)，以及第二可变轻链，其与第一单体的第二可变重链结构域一起形成结 合PD-1的Fv(ABD)；和c)轻链，其包含第一可变轻链结构域和轻链恒定 结构域。

C.mAb-scFv

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的mAb-scFv形式。在 此实施例中，所述形式依赖于使用ScFv与单体中的一者的C端连接，因此形 成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合本文所概述的抗原中的 一者，并且“额外”scFv结构域结合PD-1。因此，第一单体包含第一重链(包 含可变重链结构域和恒定结构域)，且C端共价连接scFv，其包括scFv可变 轻链结构域、scFv连接子以及scFv可变重链结构域，呈定向(vh1-CH1-铰链 -CH2-CH3-[任选的连接子]-vh2-scFv连接子-vl2或vh1-CH1-铰链 -CH2-CH3-[任选的连接子]-vl2-scFv连接子-vh2)。这个实施例进一步利用包含 可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合抗 原的两个相同Fab。就本文的许多实施例来说，这些构筑体包括所期望且如本 文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额外的Fc变异体等。

此外，mAb-scFv形式的Fc结构域包含歪斜变异体(例如，图3和8中所 示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群组： S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电 scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，mAb-scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体和消融变异 体。因此，一些实施例包括mAb-scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含 歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 和可变重链结构域(其与共同轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所 概述的目标抗原的Fv和结合到PD-1的scFv结构域)；b)第二单体，其包含 歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消 融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与共同 轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原的Fv)；和c) 共同轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

在一些实施例中，mAb-scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异 体和FcRn变异体。因此，一些实施例包括mAb-scFv形式，其包含：a)第一 单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与共同轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的抗原 的Fv和结合到PD-1的ScFv结构域)；b)第二单体，其包含歪斜变异体 L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与共同轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的抗原 的Fv)；和c)共同轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

D.中心scFv

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的中心scFv形式(有 时也被称作“2+1”形式)。在此实施例中，所述形式依赖于使用插入的scFv 结构域，因此形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合目标抗 原并且“额外”scFv结构域结合PD-1。将scFv结构域插入一种单体的Fc结 构域与CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域。这实际上可以被认为 是开瓶器形式的补充，其中在scFv的N端添加了额外VH-CH1结构域，所述 域利用了共同轻链。

在这个实施例中，一个单体包含第一重链，其包含第一可变重链结构域、 CH1结构域(和任选的铰链)以及Fc结构域的，且scFv包括scFv可变轻链 结构域、scFv连接子以及scFv可变重链结构域。scFv使用任选的结构域连接 子共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端 之间(vh1-CH1-[任选的连接子]-vh2-scFv连接子-vl2-[包括铰链的任选的连接 子]-CH2-CH3，或scFv的相反定向vh1-CH1-[任选的连接子]-vl2-scFv连接子 -vh2-[包括铰链的任选的连接子]-CH2-CH3)。另一单体是标准Fab侧。这个实施例进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重 链缔合而形成结合目标抗原的两个相同Fab。就本文的许多实施例来说，这些 构筑体包括所期望且如本文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额外 的Fc变异体等。

此外，中心scFv形式的Fc结构域包含歪斜变异体(例如，图3和8中所 示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群组： S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电 scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，中心scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体和消融变异 体。因此，一些实施例包括中心scFv形式，其包含：a)第一单体，其包含歪 斜变异体S364K/E357Q、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和 可变重链结构域(其与轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的 目标抗原的Fv)和结合到PD-1的ScFv结构域；b)第二单体，其包含歪斜变 异体L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异 体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与轻链的可变 轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原的Fv)；和c)轻链，其 包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

在一些实施例中，中心scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异 体和FcRn变异体。因此，一些实施例包括中心scFv形式，其包含：a)第一 单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原 的Fv和结合到PD-1的ScFv结构域)；b)第二单体，其包含歪斜变异体 L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的SSTR2 的Fv)；和c)轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

E.中心Fv

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1G中所示的中心Fv形式。在 此实施例中，所述形式依赖于使用插入的Fv域(也就是说，中心Fv域)，从 而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合目标抗原且“中心 Fv”结构域结合PD-1。将scFv结构域插在单体的Fc结构域与CH1-Fv区之间， 从而提供第三抗原结合结构域，其中每种单体含有scFv组分(例如一种单体 包含可变重链结构域且另一种单体包含可变轻链结构域)。

在这个实施例中，一个单体包含第一重链，其包含第一可变重链结构域、 CH1结构域和Fc结构域和额外的可变轻链结构域。所述轻链域使用结构域连 接子共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N 端之间(vh1-CH1-[任选的连接子]-vl2-铰链-CH2-CH3)。另一个单体包含第一 重链，其包含第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域和额外的可变重 链结构域(vh1-CH1-[任选的连接子]-vh2-铰链-CH2-CH3)。所述轻链域使用结 构域连接子共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域 的N端之间。

这个实施例进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所 述轻链与重链缔合而形成结合目标抗原的两个相同Fab。就本文的许多实施例 来说，这些构筑体包括所期望且如本文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变 异体、额外的Fc变异体等。

F.单臂中心scFv

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的单臂中心scFv形式。 在这个实施例中，一种单体仅包含Fc结构域，而另一种单体使用所插入的scFv 结构域，从而形成第二抗原结合结构域。在这种形式下，Fab部分结合目标抗 原且scFv结合PD-1反之亦然。将scFv结构域插在一种单体的Fc结构域与CH1-Fv区之间。

在这个实施例中，一种单体包含第一重链，所述第一重链包含第一可变重 链结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包含scFv可变轻链结构域、 scFv连接子和scFv可变重链结构域。scFv使用结构域连接子共价连接在重链 恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间。第二单体包 含Fc结构域。这个实施例进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域 的轻链，所述轻链与重链缔合而形成Fab。就本文的许多实施例来说，这些构 筑体包括所期望且如本文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额外的 Fc变异体等。

此外，单臂中心scFv形式的Fc结构域通常包括歪斜变异体(例如，图3 和8中所示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群 组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S: S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电 scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，单臂中心scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融 变异体和消融变异体。因此，单臂中心scFv形式的一些实施例包含：a)第一 单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与轻链的可变轻链 结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原的Fv和结合到PD-1的scFv结构域)；b)第二单体，其包括Fc结构域，所述Fc结构域具有歪斜变异体 L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和c)轻链，其包含可变轻链结构域和 轻链恒定结构域。

在一些实施例中，单臂中心scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融 变异体和FcRn变异体。因此，单臂中心scFv形式的一些实施例包含：a)第 一单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原 的Fv和结合到PD-1的ScFv结构域)；b)第二单体，其包括Fc结构域，所 述Fc结构域具有歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S；和c)轻链， 其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

G.单臂scFv-mAb

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1中所示的单臂scFv-mAb形 式。在这个实施例中，一个单体仅包含Fc结构域，而另一个单体使用连接到 重链的N端的scFv结构域，通常通过使用连接子：vh-scFv连接子-vl-[任选的 结构域连接子]-CH1-铰链-CH2-CH3或(呈相反定向)vl-scFv连接子-vh-[任选 的结构域连接子]-CH1-铰链-CH2-CH3。以此形式，Fab部分各自结合目标抗原 且scFv结合PD-1。这个实施例进一步利用包含可变轻链结构域和轻链恒定结 构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成Fab。就本文的许多实施例来说，这些构筑体包括所期望且如本文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额 外的Fc变异体等。

此外，单臂scFv-mAb形式的Fc结构域通常包括歪斜变异体(例如，图3 和8中所示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群 组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S: S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，单臂scFv-mAb形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融 变异体和消融变异体。因此，单臂scFv-mAb形式的一些实施例包含：a)第 一单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与轻链的可变轻链 结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原的Fv和结合到PD-1的scFv结构域)；b)第二单体，其包括Fc结构域，所述Fc结构域具有歪斜变异体 L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和c)轻链，其包含可变轻链结构域和 轻链恒定结构域。

在一些实施例中，单臂scFv-mAb形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融 变异体和FcRn变异体。因此，单臂scFv-mAb形式的一些实施例包含：a)第 一单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原 的Fv和结合到PD-1的ScFv结构域)；b)第二单体，其包括Fc结构域，所 述Fc结构域具有歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S；和c)轻链， 其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

H.scFv-mAb

特别用于本发明的一种异二聚体骨架是图1E中所示的mAb-scFv形式。 在此实施例中，所述形式依赖于使用ScFv与单体中的一者的N端连接，因此 形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合目标抗原，并且“额 外”scFv结构域结合PD-1。

在这个实施例中，第一单体包含第一重链(包括可变重链结构域和恒定结 构域)，且N端共价连接scFv，其包括scFv可变轻链结构域、scFv连接子以 及scFv可变重链结构域，呈定向((vh1-scFv连接子-vl1-[任选的结构域连接 子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3)或(scFv呈相反定向)((vl1-scFv连接子-vh1-[任 选的结构域连接子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3))。这个实施例进一步利用包含 可变轻链结构域和轻链恒定结构域的轻链，所述轻链与重链缔合而形成结合目 标的两个相同Fab。就本文的许多实施例来说，这些构筑体包括所期望且如本 文所述的歪斜变异体、pI变异体、消融变异体、额外的Fc变异体等。

此外，scFv-mAb形式的Fc结构域通常包括歪斜变异体(例如，图3和8 中所示的一组氨基酸取代，且特别适用的歪斜变异体选自由以下组成的群组： S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S: S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C)；任选地消融变异体(包括图5中所示的那些)；任选地带电scFv连接子(包括图7中所示的那些)；以及包含pI变异体的重链(包括图4 中所示的那些)。

在一些实施例中，scFv-mAb形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异 体和消融变异体。因此，一些实施例包括scFv-mAb形式，其包含：a)第一 单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与共同轻链的可变 轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标的Fv和结合到PD-1的scFv结构域)；b)第二单体，其包含歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重链结构域(其与共同轻链的可变 轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标抗原的Fv)；和c)共同轻链， 其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

在一些实施例中，scFv-mAb形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异 体和FcRn变异体。因此，一些实施例包括scFv-mAb形式，其包含：a)第一 单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与共同轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标 抗原的Fv和结合到PD-1的ScFv结构域)；b)第二单体，其包含歪斜变异体 L368D/K370S、pI变异体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S和可变重链 结构域(其与共同轻链的可变轻链结构域一起构成结合到如本文所概述的目标 的Fv)；和c)共同轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域。

I.双scFv形式

本发明还提供如所属领域中已知且如图1B中所示的双scFv形式。在这个 实施例中，SSTR2×CD3异二聚体双特异性抗体由两个scFv-Fc单体构成(两 个单体皆呈(vh-scFv连接子-vl-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3)形式或 (vl-scFv连接子-vh-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3)形式，或一个单体一种 定向且另一个单体另一种定向)。

在一些实施例中，双scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异体 和消融变异体。因此，一些实施例包括双scFv形式，其包含：a)第一单体， 其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和结合PD-1或目标抗原的第一scFv；和 b)第二单体，其包括歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和结合PD-1或另一目标抗原的第二 scFv。

在一些实施例中，双scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、消融变异体 和FcRn变异体。在一些实施例中，双scFv形式包括歪斜变异体、pI变异体、 消融变异体和消融变异体。因此，一些实施例包括双scFv形式，其包含：a) 第一单体，其包含歪斜变异体S364K/E357Q、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S以及第一 scFv；和b)第二单体，其包括歪斜变异体L368D/K370S、pI变异体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融变异体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变异体M428L/N434S以及第二 scFv。

XI.本发明的特定实施例

如所属领域的技术人员将了解，本发明提供本发明的不同形式的抗PD-1 scFv序列与不同目标抗原的ABD的大量可能组合。

在一些实施例中，图13、15、16、18、20、21、24、33和40的任何PD-1 ABD可以与图1的任何形式的任何抗TIM-3 ABD、任何抗CTLA-4ABD、任 何抗ICOS ABD、任何抗TIM-3 ABD、任何抗LAG-3 ABD或任何抗BTLA ABD 组合。特别适用的是图15的抗PD-1ScFv序列与此等ABD的序列表的Fab ABD组合。在一些实施例中，这些组合使用如美国公开案第2016/0355608号(其还可以用于中心scFv形式)的图162中所描绘的开瓶器形式的“骨架”序 列或使用如美国公开案第2016/0355608号的图163中所描绘的“mAb-scFv” 形式的“骨架”序列来进行，其两个图(和随附的图例)明确地以引用的方式 并入本文中。

A.PD-1×CTLA-4开瓶器实施例

在一些实施例中，本发明提供结合到人类PD-1和人类CTLA-4两者的双 特异性异二聚体抗体。如所属领域的技术人员将了解，存在大量可能的抗PD-1 scFv序列与CTLA-4的ABD的组合。

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且CTLA-4 ABD为Fab构筑体。在 这些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗CTLA-4 ABD序列 组合。适用于本发明的抗CTLA-4ABD序列包括SEQ ID NO:21-2918(CTLA-4 scFv序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为Fab)、SEQ ID NO:2919-6208 (CTLA-4 Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)、SEQ ID NO: 36739-36818(额外CTLA-4 Fab序列，尽管其中的Fv序列可以格式化为scFv)和SEQ ID NO:35395-35416(CTLA-4单臂构筑体，其可以格式化为Fab或scFv 的任一者)。如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形式 出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

在一些实施例中，当CTLA-4 ABD选自本序列表的SEQ ID NO:2919-6208 和SEQ IDNO:35395-35416的对时，使用来自图15的PD-1 ABD作为scFv并 且CTLA-4 ABD作为Fab Fv，以开瓶器形式制备本发明的异二聚体抗体。在 一些实施例中，将CTLA-4 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:471，将CTLA-4 Fab的VL添加到SEQ ID NO:473且将PD-1scFv添加到 SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将CTLA-4 Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将CTLA-4 Fab的VL添加到SEQ ID NO:476且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将CTLA-4 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQID NO:477，将CTLA-4 Fab 的VL添加到SEQ ID NO:479且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一些 实施例中，将CTLA-4 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将CTLA-4 Fab的VL添加到SEQ ID NO:482且将PD-1 scFv添加到 SEQ ID NO:481。

在一些实施例中，CTLA-4 Fab包含SEQ ID NO:38134的可变重链结构域 和SEQ IDNO:38138的可变轻链结构域。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS556；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS556的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS556的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS557；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS557的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS557的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS558；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS558的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS558的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS559；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS559的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS559的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS560；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS560的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS560的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS561；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS561的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS561的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS562；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS562的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS562的轻链。

在一些实施例中，本中的抗CTLA-4 Fab选自SEQ ID NO:2919-6208和 SEQ ID NO:36739-36818中的任一者，特别适用的是包含SEQ ID NO:38134 的可变重链结构域和SEQID NO:38138的可变轻链结构域的CTLA-4 Fab。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS563；也就是 说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS563的Fab链，且将来自 CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS563的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS556；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS556的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS556的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS557；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS557的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS557的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS558；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS558的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS558的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS559；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS559的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS559的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS560；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS560的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS560的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS561；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS561的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS561的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS562；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS562的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS562的轻链。

在一些实施例中，抗CTLA-4 Fab选自序列表的SEQ ID NO:36739和 36743、36747和36751、36755和36759、36763和36767、36771和36775、 36779和36783、36787和36791、36795和36799、36803和36807和36811 和36815的对。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS563；也就是说，将来自CTLA-4 Fab的VH N端添加到XENCS563的Fab链，且将来自CTLA-4 Fab的VL N端添加到XENCS563的轻链。

在一些实施例中，本发明的PD-1×CTLA-4异二聚体抗体选自由以下组成 的群组：XENCS502、XENCS509、XENCS516、XENCS523、XENCS530、 XENCS537、XENCS544以及XENCS551。

B.PD-1×ICOS开瓶器实施例

在一些实施例中，本发明提供结合到人类PD-1和人类ICOS两者的双特 异性异二聚体抗体。如所属领域的技术人员将了解，存在大量可能的抗PD-1 scFv序列与ICOS的ABD的组合。

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且ICOS ABD为Fab构筑体。在这 些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗ICOS ABD序列组合。 适用作ABD的抗ICOS序列包括如US2018/0127501中所公开的许多，其以全 文引用的方式明确并入且确切地说用于图例和图19、20和24中所描绘的序列， 以及来自US2018/0127501的SEQ ID NO:27869-28086，其含有多种ICOS Fab 序列(重链VH1-CH1和轻链VL1-CL)，如命名法中所指示。另外包括来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和 26353和26358的VH/VL对的抗ICOS ABD。如所属领域的技术人员将理解， 这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符 显而易见。

在本发明中备受关注的是来自图49的XENCS500的抗ICOS ABD的Fab 序列，具有VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0。在本发明中备受关注的是 来自图49的XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列，其具有 VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0。

在一些实施例中，将ICOS Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的 SEQ ID NO:471，将ICOS Fab的VL添加到SEQ ID NO:473且将PD-1 scFv添 加到SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将ICOS Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将ICOS Fab的VL添加到SEQ ID NO:476 且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将ICOS Fab的VH 结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:477，将ICOS Fab的VL添加到SEQ ID NO:479且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一些实施例中，将 ICOS Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将ICOS Fab 的VL添加到SEQ ID NO:482且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:481。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS556；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS556的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS556 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS557；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS557的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS557 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS558；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS558的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS558 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS559；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS559的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS559 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS560；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS560的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS560 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS561；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS561的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS561 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS562；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS562的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS562 的轻链。

在一些实施例中，抗ICOS Fab选自来自US2018/0127501的序列表的SEQ ID NO:26323和26328、27477和27452和26353和26358的对，特别适用的 是来自图49(VH_ICOS_H0_L0和VL_ICOS_H0_L0)中的XENCS500的抗 ICOS ABD和来自图49(VH_ICOS_H0.66_L0和VL_ICOS_H0.66_L0)中的 XENCS501的抗ICOS ABD的Fab序列。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS563；也就是说，将来自ICOS Fab的VH N端添 加到XENCS563的Fab链，且将来自ICOS Fab的VL N端添加到XENCS563 的轻链。

在一些实施例中，本发明的PD-1×ICOS异二聚体抗体选自由以下组成的 群组：XENCS500、XENCS501、XENCS507、XENCS508、XENCS514、 XENCS515、XENCS521、XENCS522、XENCS528、XENCS529、XENCS535、 XENCS526、XENCS542、XENCS543、XENCS549和XENCS550。

C.PD-1×LAG-3开瓶器实施例

在一些实施例中，本发明提供结合到人类PD-1和人类LAG-3两者的双特 异性异二聚体抗体。如所属领域的技术人员将了解，存在大量可能的抗PD-1 scFv序列与LAG-3的ABD的组合。

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且LAG-3 ABD为Fab构筑体。在这 些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗LAG-3 ABD序列组合。 适用作ABD的抗LAG-3序列包括SEQ ID NO:17135-20764；SEQ ID NO: 36819-36962；SEQ ID NO:35417-35606；SEQ IDNO:25194-32793；SEQ ID NO: 32794-33002(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和36823、36827和36831、36835和36839、 36843和36847、36851和36855、36859和36863、36867和36871、36875和 36879、36883和36887、36891和36895、36899和36903、36907和36911、 36915和36919、36923和36927、36931和36935、36939和36943、36947和 36951和36955和36959；以及XENP22594的LAG-3 Fab ABD的序列，包括VH(SEQ ID NO:32755，其具有VHCDR(SEQ ID NO:32756、32757和32758) 和VL(SEQ ID NO:32760，其具有VLCDR(SEQ ID NO:32761、32762和32763) 和XENP22656的LAG-3 Fab ABD的序列，包括VH(SEQ ID NO:28815，其 具有VHCDR(SEQ ID NO:28816、28817和28118)和VL(SEQ ID NO:28820， 其具有VLCDR(SEQ ID NO:28821、28822和28823)。

在一些实施例中，将LAG-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的 SEQ ID NO:471，将LAG-3 Fab的VL添加到SEQ ID NO:473，且将PD-1 scFv 添加到SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将LAG-3 Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将LAG-3Fab的VL添加到SEQ ID NO:476，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将LAG-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:477，将LAG-3 Fab 的VL添加到SEQ ID NO:479，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一 些实施例中，将LAG-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将LAG-3 Fab的VL添加到SEQ ID NO:482，且将PD-1 scFv添加到 SEQ ID NO:481。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS556；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS556的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS556的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS557；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS557的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS557的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS558；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS558的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS558的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS559；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS559的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS559的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS560；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS560的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS560的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS561；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS561的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS561的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS562；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS562的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS562的轻链。

在一些实施例中，抗LAG-3 Fab选自以下的对：SEQ ID NO:36819和 36823、36827和36831、36835和36839、36843和36847、36851和36855、 36859和36863、36867和36871、36875和36879、36883和36887、36891和 36895、36899和36903、36907和36911、36915和36919、36923和36927、 36931和36935、36939和36943、36947和36951和36955和36959；特别适 用的是XENP22594的VH/VL(VH SEQ ID NO:32755和VL SEQ ID NO:32760) 和XENP22656的VH/VL(VH SEQ ID NO:28815VL SEQ ID NO:28820)。在 这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的XENCS563；也就是 说，将来自LAG-3 Fab的VH N端添加到XENCS563的Fab链，且将来自LAG-3 Fab的VL N端添加到XENCS563的轻链。

在一些实施例中，本发明的PD-1×LAG-3异二聚体抗体选自由以下组成的 群组：XENCS503、XENCS504、XENCS510、XENCS511、XENCS517、 XENCS518、XENCS521、XENCS524、XENCS525、XENCS531、XENCS532、 XENCS538、XENCS539、XENCS545、XENCS546、XENCS552和XENCS553。

D.PD-1×TIM-3开瓶器实施例

在一些实施例中，本发明提供结合到人类PD-1和人类TIM-3两者的双特 异性异二聚体抗体。如所属领域的技术人员将了解，存在大量可能的抗PD-1 scFv序列与TIM-3的ABD的组合。

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且TIM-3 ABD为Fab构筑体。在这 些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗TIM-3 ABD序列组合。 适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。

在一些实施例中，将TIM-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的 SEQ ID NO:471，将TIM-3 Fab的VL添加到SEQ ID NO:473，且将PD-1 scFv 添加到SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将TIM-3 Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将TIM-3Fab的VL添加到SEQ ID NO:476，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将TIM-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:477，将TIM-3 Fab 的VL添加到SEQ ID NO:479，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一 些实施例中，将TIM-3 Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将TIM-3 Fab的VL添加到SEQ ID NO:482，且将PD-1 scFv添加到 SEQ ID NO:481。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS556；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS556的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS556的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS557；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS557的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS557的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS558；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS558的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS558的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS559；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS559的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS559的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS560；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS560的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS560的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS561；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS561的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS561的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和 37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS562；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS562的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS562的轻链。

适用作ABD的抗TIM-3序列包括SEQ ID NO:20765-20884；SEQ ID NO: 37587-37698；SEQ ID NO:36347-36706(如所属领域的技术人员将理解，这些 序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而 易见)，抗TIM-3 ABD选自以下的对：SEQ ID NO:35757和37591、37959和37599、37603和37607、37611和37615、37619和37623、37627和37631、 37635和37639、37643和37647、37651和37655、37659和37663、37667和 37671、37675和37679、37683和37687和37691和37695；以及特别适用的 是XENP21189的抗TIM-3 ABD的Fab序列(VH SEQ ID NO:36508和VL SEQ ID NO:36513)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其余部分为来自图50的 XENCS563；也就是说，将来自TIM-3 Fab的VH N端添加到XENCS563的 Fab链，且将来自TIM-3 Fab的VL N端添加到XENCS563的轻链。

在一些实施例中，本发明的PD-1×TIM-3异二聚体抗体选自由以下组成的 群组：XENCS505、XENCS512、XENCS519、XENCS526、XENCS533、 XENCS540、XENCS547和XENCS554。

E.PD-1×TIGIT开瓶器实施例

在一些实施例中，本发明提供结合到人类PD-1和人类TIGIT两者的双特 异性异二聚体抗体。如所属领域的技术人员将了解，存在大量可能的抗PD-1 scFv序列与TIGIT的ABD的组合。

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且TIGIT ABD是Fab构筑体。在这 些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗TIGIT ABD序列组合。 适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。

在一些实施例中，将TIGIT Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的 SEQ ID NO:471，将TIGIT Fab的VL添加到SEQ ID NO:473，且将PD-1 scFv 添加到SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将TIGIT Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将TIGITFab的VL添加到SEQ ID NO:476，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将TIGIT Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:477，将TIGIT Fab 的VL添加到SEQ ID NO:479，且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一 些实施例中，将TIGIT Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将TIGIT Fab的VL添加到SEQ ID NO:482，且将PD-1 scFv添加到 SEQ ID NO:481。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS556；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS556的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS556的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS557；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS557的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS557的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS558；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS558的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS558的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS559；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS559的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS559的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS560；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS560的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS560的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS561；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS561的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS561的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS562；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS562的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS562的轻链。

适用作ABD的抗TIGIT序列包括SEQ ID NO:21504-21523和SEQ ID NO: 37435-37586(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)，以及选自以下的 对的TIGIT ABD：SEQ ID NO:37435和37439、37443和37447、37451和37455、 37459和37463、37467和37471、37475和37479、37483和37487、37491和 37495、37499和37503、37507和37511、37515和37519、37523和37527、 37531和37535、37539和37543、37547和37551、37555和37559、37563和 37567、37571和37575和37579和37583。在这些实施例中，异二聚体抗体的 其余部分为来自图50的XENCS563；也就是说，将来自TIGIT Fab的VH N 端添加到XENCS563的Fab链，且将来自TIGITFab的VL N端添加到 XENCS563的轻链。

F.PD-1×BTLA开瓶器实施例

在一些实施例中，PD-1 ABD为scFv且BTLA ABD为Fab构筑体。在这 些实施例中，来自图15的任何scFv ABD可以与任何抗BTLA ABD序列组合。 适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO: 36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形 式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD选 自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQID NO:20941)。

在一些实施例中，将BTLA Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的 SEQ ID NO:471，将BTLA Fab的VL添加到SEQ ID NO:473且将PD-1 scFv 添加到SEQ ID NO:472。在一些实施例中，将BTLA Fab的VH结构域添加到 US2016/0355608的SEQ ID NO:474，将BTLA Fab的VL添加到SEQ ID NO:476 且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:475。在一些实施例中，将BTLA Fab的VH 结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:477，将BTLA Fab的VL添加到SEQ ID NO:479且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:478。在一些实施例中，将 BTLA Fab的VH结构域添加到US2016/0355608的SEQ ID NO:480，将BTLA Fab的VL添加到SEQ ID NO:482且将PD-1 scFv添加到SEQ ID NO:481。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS556；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS556的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS556 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS557；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS557的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS557 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS558；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS558的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS558 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS559；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS559的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS559 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS560；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS560的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS560 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS561；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS561的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS561 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS562；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS562的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS562 的轻链。

适用作ABD的任何抗BTLA序列包括SEQ ID NO:20885-21503和SEQ ID NO:36707-36738(如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对” 形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见)；抗BTLA ABD 选自以下的对：SEQ ID NO:36707和36711、36715和36719、36723和36727 和36761和36735；特别适用的是XENP20269的Fab抗BTLA ABD(VH SEQ ID NO:20936和VL SEQ ID NO:20941)。在这些实施例中，异二聚体抗体的其 余部分为来自图50的XENCS563；也就是说，将来自BTLA Fab的VH N端 添加到XENCS563的Fab链，且将来自BTLA Fab的VL N端添加到XENCS563 的轻链。

XII.本发明的核酸

本发明进一步提供编码本发明的异二聚体双特异性抗体以及本文所概述 的单特异性抗体的核酸组合物。

如所属领域的技术人员将了解，核酸组合物将取决于异二聚体蛋白质的形 式和骨架。因此，举例来说，当所述形式需要三种氨基酸序列(如三重F形式 (例如第一氨基酸单体包含Fc结构域和scFv，第二氨基酸单体包含重链和轻 链))时，可以将三种核酸序列并入一种或多种表达载体中供表达。类似地， 一些形式(例如，图1中所公开的双scFv形式)仅需要两种核酸；同样，其 可以放入一个或两个表达载体中。

如所属领域中所知，取决于用于产生本发明的异二聚体抗体的宿主细胞， 可以将编码本发明组分的核酸并入如所属领域中已知的表达载体中。一般来 说，核酸可操作地连接到任何数目的调节元件(启动子、复制起点、可选标记、 核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外或整合载体。

随后使本发明的核酸和/或表达载体在任何数目的不同类型的如所属领域 中熟知的宿主细胞(包含哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞)中转 化，在许多实施例中，适用哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。

在一些实施例中，根据所述形式，编码每种单体的核酸和编码轻链的任选 核酸在适当时各自包含在单一表达载体内(通常在不同或相同启动子控制下)。 在特别用于本发明的实施例中，不同表达载体上均含有这两种或三种核酸中的 每一种。如本文和62/025,931(特此并入本文供参考)所示，可以利用不同的 载体比率驱使异二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，虽然蛋白质包含1:1:2 比率的第一单体:第二单体:轻链(本文的许多实施例具有构成异二聚体抗体的 三种多肽的情况下)，但是这些并非得到最佳结果的比率。

本发明的异二聚体抗体是通过培养包括如所属领域中熟知的表达载体的 宿主细胞来产生。一经产生，则进行传统的抗体纯化步骤，包括离子交换色谱 步骤。如本文所论述，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色 谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现分离。也就是说，将改变每 种单体的等电点(pI)的pI取代纳入，使得每种单体具有不同pI且异二聚体 也具有不同pI，从而促进“三重F”异二聚体的等电纯化(例如阴离子交换柱、 阳离子交换柱)。这些取代还有助于确定和监测纯化(例如IEF凝胶、cIEF和 分析型IEX柱)后受到污染的任何双scFv-Fc和mAb同二聚体。

XIII.异二聚体检查点抗体的生物和生物化学功能

总体而言，向癌症患者给予本发明的双特异性抗体，以本文所述的多种方 式评估功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤尺寸、 转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状况评估来评定免疫肿瘤学 治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以与“旧 式(old fashioned)”测量一起评估免疫状态变化(例如，在ipi处理后ICOS+ CD4+T细胞的存在)，“旧式”测量如肿瘤负荷、大小、浸润性、LN参与、 转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：检查点对CD4+T细胞活化 或增殖、CD8+T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒性活性 和/或CTL介导的细胞消除、NK细胞活性以及NK介导的细胞消除的抑制性 作用。

在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67胞 内染色以及3H-胸苷掺入法评估免疫细胞增殖来评定处理。

在一些实施例中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含 量的增加来评定处理，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、 CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞 脱粒。

一般来说，如本领域中已知地进行基因表达分析。

一般来说，还如所属领域中已知地，类似地进行蛋白质表达测量。

在一些实施例中，通过评估众多细胞参数来评定通过目标细胞活力检测测 量的细胞毒性活性，从而评定处理，所述细胞参数，如酶活性(包含蛋白酶活 性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。 这些分析的特定实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、

在一些实施例中，通过评定由细胞激素产生测量的T细胞活性，使用细胞 激素，使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定处理，所述细胞 激素包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13。

**调配物等。

**EE

**TT

XIV.实例

A.实例1：研究XmAb22841的体外结合

1.1A：XmAb20717同时占用了在细胞表面上表达的PD-1和CTLA-4。

将稳定表达CTLA-4的HEK293T细胞(加利福尼亚州圣克拉拉美国冠科 生物技术公司(Crown Bioscience,Santa Clara,Calif.))用编码PD-1的 pCMV6-AC-GFP载体(马里兰州罗克维尔市傲锐基因(OriGene,Rockville, Md.)转染。转染后3天，用经所指示测试物在4℃下处理细胞30分钟。在培 育之后，洗涤细胞两次且用结合太平洋蓝的XENP20111(基于来自XmAb20717 的抗PD-1臂的单臂scFv-Fc)和结合APC的XENP20059(基于来自XmAb20717的抗CTLA-4臂的单臂Fab-Fc)在4℃下染色30分钟，且通过流式细胞术分 析。图57和图58展示了用各种测试物处理后的受体占用率，如通过GFP+ (CTLA-4+PD-1+)HEK293T细胞的各种群体的百分比所描绘，未占用CTLA-4 和/或PD-1受体通过染色指示。举例来说，CTLA-4受体的占用降低了 PD-1

B.实例2：XmAb20717增强小鼠的同种异体抗肿瘤反应

NOD SCIDγ(NSG)小鼠在第0天移植有KG1A-luc癌细胞。在第21天， 将人类PBMC腹膜内移植到小鼠中。在移植PBMC之后，所指示测试物通过 腹膜内注射(用PBS给药对照小鼠)每周给药，持续4周(或总共4次给药)。 通过使用体内成像系统(

C.实例3：研究XmAb22841的体外结合

1.XmAb22841结合到表达CTLA-4和LAG-3的HEK293T

将稳定表达CTLA-4的HEK293T细胞(加利福尼亚州圣克拉拉美国冠科 生物技术公司)用编码LAG-3的pCMV6-AC-GFP载体(马里兰州罗克维尔市 傲锐基因)转染。转染后3天，将细胞与所指示浓度的以下测试物在4℃下培 育30分钟：XmAb22841；XENP16433，基于来源于XmAb22841的抗CTLA-4 臂的亲本克隆的二价mAb；XENP16436，基于来源于XmAb22841的抗LAG-3 臂的亲本克隆的二价mAb；XENP24893，基于来自XmAb22841的抗CTLA-4 臂的单臂scFv-Fc；XENP24895，基于来自XmAb22841的抗LAG-3臂的单臂 Fab-Fc；以及XENP15074，作为对照的二价抗RSV mAb。在培育之后，洗涤 细胞两次且用结合抗人类Fc-A647的二级抗体检测结合(宾夕法尼亚西格罗夫 杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch,West Grove,Pa.))。指示测试物与 GFP+细胞(即CTLA-4+LAG-3+)结合的MFI描绘于图60中。

2.XmAb22841在表达CTLA-4和LAG-3的HEK293T上的CTLA-4和LAG-3的占用

将稳定表达CTLA-4的HEK293T细胞(加利福尼亚州圣克拉拉美国冠科 生物技术公司)用编码LAG-3的pCMV6-AC-GFP载体(马里兰州罗克维尔市 傲锐基因)转染。转染后3天，用以下测试物在4℃下处理细胞30分钟： XmAb22841、XENP16433、XENP16436、XENP24893、XENP24895和 XENP15074。在培育之后，洗涤细胞两次且用结合太平洋蓝的XENP24895和 结合A647的XENP23552染色。图61A-D展示了用各种测试物处理后的受体 占用率，如通过GFP+(CTLA-4+LAG-3+)HEK293T细胞的各种群体的百分比 所描绘，未占用CTLA-4和/或LAG-3受体通过染色指示。举例来说，CTLA-4 受体的占用降低了LAG-3

3.结合到经SEB刺激T细胞的XmAb22841

在经SEB刺激PBMC分析中测量XmAb22841与T细胞的结合。葡萄球 菌肠毒素B(SEB)为以类似于经由T细胞受体(TCR)通过活化实现的方式 引起T细胞活化和增殖的超抗原，包括例如表达LAG-3和CTLA-4的检查点 受体。因此，用500ng/mL SEB刺激来自6名供体的人类PBMC持续3天。 随后用所指示浓度的所指示测试物处理细胞30分钟。在培育之后，用抗人类Fc-A647抗体洗涤细胞并且染色(杰克逊免疫研究)。对于每个供体，指示所 指示测试物与CD3

数据表明，在每个供体的PBMC中，相比于单特异性对照，XmAb22841 与CD3

D.实例4：研究在用双特异性检查点抗体处理之后细胞激素释放和免疫 相关基因表达概况

用100ng/mL SEB刺激人类PBMC持续2天。在刺激之后，随后用100 ng/mL SEB和20μg/mL所指示测试物再刺激细胞两次。在处理后24小时收集 细胞上清液，并且在MULTI-SPOT384孔盘(马里兰州罗克维尔市麦索斯盖尔 发现(Meso Scale Discovery,Rockville,Md.))上通过多重分析对IL-2和IFNγ 进行分析。从细胞提取RNA且通过

图64和图65分别描绘了在通过抗PD-1 mAb(XENP16432)、XmAb20717 和XmAb22841以及XmAb22841与抗PD-1 mAb组合(与抗RSV mAb (XENP15074)相比)处理之后的IL-2和IFNγ的倍数增加。值得注意的是， XmAb22841与抗PD-1 mAb的组合比单独一者产生显著更多的细胞激素释放， 证实了三重免疫检查点阻断的优势。图66到图72展示了双特异性检查点抗体、 抗PD-1 mAb和抗RSV mAb之间的各种基因(如通过

E.实例5：抗PD-1克隆1C11的产生

1.抗PD-1融合瘤的产生和筛选

为了开发额外的PD-1靶向臂，首先通过融合瘤技术(通过ImmunoPrecise、 其标准方法和快速初免方法)产生单克隆抗体。对于标准方法，将抗原注射到 3种BALB/c小鼠中。在处死杂交瘤产生之前7到10天，经免疫小鼠接受抗 原增强。在抗原上通过ELISA评估抗体效价且选择最佳反应小鼠进行融合。 在融合前4天给出最终抗原增强。合并来自小鼠的淋巴细胞，随后与Sp2/0骨 髓瘤细胞融合。使细胞在HAT选择性单步克隆培养基上生长10到12天，此 时准备好融合瘤进行筛选。对于快速初免方法，将抗原注射到3种BALB/c小 鼠中。在19天之后，合并来自所有小鼠的淋巴细胞，随后与Sp2/0骨髓瘤细 胞融合。使细胞在HAT选择性单步克隆培养基上生长10到12天，此时准备 好融合瘤进行筛选。所使用的抗原是人类PD-1(huPD-1-mFc)的小鼠Fc融合 体、食蟹猴PD-1(cynoPD-1-mFc)的小鼠Fc融合体、His标记的人类PD-1 (huPD-1-His)、His标记的食蟹猴PD-1(食蟹猴PD-1-His)或其混合物。

使如上文所述产生的抗PD-1融合瘤克隆使用Octet，基于生物膜干涉法 (BLI)的方法经历两轮筛选。Octet的实验步骤通常包括以下各者：固定(将 配体或测试物捕获到生物传感器上)；缔合(将涂覆有配体或测试物的生物传 感器浸渍到含有对应测试物或配体的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传 感器返回到含有缓冲液的孔中)以便确定测试物的亲和力。含有单独缓冲液的 参考孔还包括于数据处理期间的背景校正的方法

对于第一轮，使用抗小鼠Fc(AMC)生物传感器捕获浸渍到500nM二 价人类和食蟹猴PD-1-Fc-His中的克隆。对于第二轮，将在第一轮中对于人类 和食蟹猴PD-1两者鉴别为阳性的克隆捕获到AMC生物传感器上且浸渍到500 nM单价人类和食蟹猴PD-1-His中。

2.克隆1C11的表征

实例1中所鉴别的一个融合瘤克隆为克隆1C11。通过基因合成产生编码 融合瘤克隆1C11的V

3.用克隆1C11阻断PD-L1

T细胞活化需要阻断检查点受体/配体相互作用。在细胞结合分析中研究XENP21575的阻断能力，XENP16432(抗PD-1 mAb，其具有纳武单抗的可变 区)、XENP21461(抗PD-1 mAb，其具有派姆单抗的可变区)和XENP15074 (抗RSV Mab，其具有莫维珠单抗的可变区)作为对照。将经转染以表达PD-1 的HEK293T细胞用XENP21575以及对照抗体培育。在培育之后，添加PD-L1 的鼠类Fc融合体并且使其培育。用抗鼠类IgG二级抗体检测PD-L1-mFc与 HEK293T细胞的结合，其数据描绘于图10中。数据表明，XENP21575的PD-L1 阻断类似于XENP16432和XENP21461的阻断。

4.克隆1C11的T细胞表面结合

在经SEB刺激PBMC分析中测量抗PD-1克隆1C11与T细胞的结合。葡 萄球菌肠毒素B(SEB)为以类似于经由T细胞受体(TCR)活化所实现的方 式引起T细胞活化和增殖的超抗原，包括例如PD-1的检查点受体的表达。用 100ng/mL刺激人类PBMC持续3天。在刺激之后，将PBMC用所指示浓度 的所指示测试物在4℃下培育30分钟。将PBMC用抗CD3-FITC(UCHT1)和人类免疫球蛋白κ轻链的APC标记的抗体染色。如APC MFI指示在FITC+ 细胞上测试物与T细胞的结合描绘于图11中。

5.通过克隆1C11的T细胞活化

如通过细胞激素分泌所指示，在经SEB刺激PBMC分析中研究通过克隆 1C11的T细胞活化。用500ng/mL SEB刺激人类PBMC持续2天。随后在培 养基中洗涤细胞两次且用500ng/mL SEB与所指示量的所指示测试物组合刺 激24小时。随后通过细胞分析上清液的IL-2和IFN，其数据描绘于图图12 中。

6.克隆1C11的人源化

使用字符串内容优化人源化克隆1C11(参见例如2010年2月2日颁布的 美国专利第7,657,380号)。通过基因合成产生编码重链和轻链的DNA并且使 用标准分子生物学技术亚克隆到表达载体pTT5中。在图13中描绘了二价抗 体形式的克隆1C11的说明性人源化变异体的序列。

使用大体如实例中所述的Octet确定XENP22553的亲和力。确切地说， 使用抗人类Fc(AHC)生物传感器捕获具有浸渍到多浓度组胺酸标记的PD-1 中的测试物。亲和力结果和对应的传感器图描绘于图14中。

7.稳定性优化以scFv形式的克隆1C11的人源化变异体

抗PD-1克隆1C11人源化变异体H3L3的可变区(如在XENP22553中) 经工程化以用于在scFv的情形下(例如双特异性抗体中)改善稳定性(同时 维持亲和力)。通过基因合成产生编码具有XENP22553的可变重链和可变轻链 区的scFv的DNA且使用标准分子生物学技术亚克隆到表达载体pTT5中。scFv 的C端包括用于纯化的聚组氨酸标签。随后通过标准突变诱发构建scFv变异 体的库，其说明性序列描绘于图15中(尽管已除去聚组氨酸标签)。

使用差示扫描荧光确定(DSF)评估ScFv-His的稳定性。使用Bio-Rad CFX 连接实时PCR检测系统进行DSF实验。将蛋白质与SYPRO橙色荧光染料混 合且在PBS中稀释到0.2mg/mL。SYPRO橙色的最终浓度为10×。在25℃的 初始10分钟培育时段之后，使用1℃/min的加热速率将蛋白质从25℃加热到 95℃。每30秒进行荧光测量。使用仪器软件计算熔融温度(T

为了确定变异体的亲和力，来自scFv的可变区被格式化为具有 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的二价IgG1形式的Fab。说明性序 列描绘于图16中。通过基因合成产生编码重链和轻链的DNA且使用标准分 子生物学技术将其克隆到含有IgG1恒定区的pTT5表达载体中，且瞬时转染 到HEK293E细胞中。使用Octet进行上清液的亲和力筛选。抗人类Fc(AHC) 生物传感器用于捕获每个上清液的1:2稀释液到2.0nm的密度，并且浸渍到PD-1-His中用于K

8.亲和力优化以scFv形式的克隆1C11的人源化变异体

抗PD-1克隆1C11人源化变异体H3L3的可变区(如在XENP22553中) 以Fab形式产生且经工程化以优化亲和力，例如用作二价单特异性抗体或用于 双特异性抗体。

在第一库中，发现来自实施例4D中产生的scFv的可变重链和轻链区的亲 和力增加，将所述可变重链与轻链区组合在一起产生具有 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代的二价IgG1形式，其说明性序列描 绘于图20中。通过基因合成产生编码重链和轻链的DNA且使用标准分子生 物学技术将其克隆到含有IgG1恒定区的pTT5表达载体中，且瞬时转染到HEK293E细胞中。通过蛋白质A层析来纯化抗体，且使用Octet进行亲和力 筛选。AHC生物传感器用于捕获抗体，并且浸渍到多浓度PD-1-His中用于 K

在第二库中，通过对编码XENP22553的重链或轻链的表达载体的标准突 变诱发来构建额外变异体。用于额外重链和轻链变异体的说明性序列描绘于图 20和图21中。将含有编码额外重链变异体的DNA和编码XENP22553的轻链 的DNA或编码XENP22553的重链的DNA和编码额外轻链变异体的DNA的 表达载体瞬时转染到HEK293E细胞中。使用Octet进行上清液的亲和力筛选。 抗人类Fc(AHC)生物传感器用于捕获每个上清液的1:2稀释液到2.0nm的密度，并且浸渍到PD-1-His中用于K

大体如上文所述，产生了另一库。所得抗体的说明性序列描绘于图24中。 将编码所选择抗体的DNA转染到HEK293E细胞中，且通过蛋白质A层析来 纯化抗体，并且使用Octet筛选亲和力。抗人类Fc(AHC)生物传感器用于捕 获抗体，并且浸渍到多浓度PD-1-His中用于K

9.如通过Biacore所确定，亲和力优化的1C11变异体的亲和性筛选

使用基于表面等离子共振(SPR)的技术确定如上文所述产生的1C11变 异体和基于纳武单抗(XENP16432)和派姆单抗(XENP21461)的对照mAb 的亲和力。Biacore的实验步骤通常包括以下各者：固定(将配体捕获到传感 器芯片上)；缔合(使各种浓度的分析物在传感器芯片上流动)；和解离(使缓 冲液在传感器芯片上流动)以便确定测试物的亲和力。具有单独缓冲液的参考 流还包括于数据处理期间的背景校正的方法中。使用1:1结合模型通过分析经 处理数据，得到结合亲和力和动力学速率常数。确切地说，将抗PD-1 mAb捕 获到蛋白质A传感器芯片上，且随后使多浓度经组氨酸标记的人类PD-1或经 组氨酸标记的食蟹猴PD-1在传感器芯片上流动。所得解离常数(K

10.亲和力优化的1C11变异体的T细胞表面结合

在经SEB刺激PBMC分析中测量亲和力优化的1C11变异体与T细胞的 结合。用500ng/mL SEB刺激人类PBMC持续3天。在刺激之后，将PBMC 用所指示浓度的所指示测试物培育30分钟。将PBMC用抗CD3-FITC(UCHT1) 和A647标记的抗体染色。如A647MFI所指示，在FITC+细胞上测试物与T 细胞的结合描绘于图27中。

11.通过亲和力优化的1C11变异体阻断PD-L1和PD-L2结合到PD-1

使用Octet HTX仪器在串联表位框并分析中研究亲和力优化的1C11变异 体阻断PD-L1和PD-L2与PD-1结合的能力。Octet的实验步骤大体如实例所 述。确切地说，在浸渍到100nM第一测试物(如在图28中所描绘的表的左 侧所指示)且随后浸渍到100nM第二测试物(如在图28中所描绘的表的顶 部所指示)之前，将人类PD-1的鼠类Fc融合体负载到AMC(抗小鼠Fc捕 获)生物传感器上。测试物包括人源化克隆1C11和PD-L1和PD-L2的Fc融 合体的亲和力优化的变异体(RnD系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)。使每 一测试物对的BLI反应相对于使生物传感器浸渍到HBS-EP缓冲液中且随后浸 渍到测试物中的反应进行标准化。描绘了每对测试物的标准化BLI反应。如果 第二测试物提供低于0.4的标准化BLI反应，那么将第二测试物与PD-1的结 合视为被第一测试物阻断。如果第二测试物提供0.4与0.6之间的标准化BLI 反应，那么将阻断视为临界。如果第二测试物提供低于0.6的标准化BLI反应， 那么将第二测试物与PD-1的结合视为被第一测试物阻断。数据表明，抗PD-1 1C11变异体中的每一者阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结合。

F.实例6：进一步工程化亲和力优化的1C11变异体

我们进一步工程化1C11变异体，以使用前述方法以及通过混合和匹配似 乎最能调节亲和力的取代来调节PD-1亲和力。另外，我们使变异体1C11可 变重链与变异体1C11可变轻链组合，此证实了有利的亲和性调节。所得抗体 的说明性序列描绘于图40中。

1.额外亲和力工程化的1C11变异体的亲和性筛选

大体如上文所述，使用Octet确定额外工程化1C11变异体的亲和力。确 切地说，AHC生物传感器用于捕获1C11变异体并且浸渍到多浓度His标记的 人类PD-1中(以及His标记的食蟹猴PD-1，其数据描绘于图41中)。所得解 离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)描绘于图41到图45中，其 中各图描绘不同实验组。

2.在经SEB刺激PBMC分析中通过1C11变异体诱导细胞激素分泌

虽然实验之间以及从Octet或Biacore得到的数据之间存在技术可变性， 但1C11_H3L3的亲和力(通过Octet所确定)一般在15nM到19nM的范围 内(来自4/6实验)。从各轮工程化中，我们得到了具有更紧密亲和力的1C11 变异体(例如，具有0.51到0.74nM范围内的亲和力的XENP26940；以及具 有0.77nM的亲和力的XENP28652，如通过Octet所确定)以及对人类PD-1 具有更弱的亲和力的变异体(例如，具有333nM的亲和力的XENP26928，如 通过Octet所确定)。因此，我们在经SEB刺激PBMC分析中研究通过细胞激 素分泌所指示的具有不同亲和力的变异体的T细胞活化。用100ng/mL SEB 刺激来自18种独特供体的PBMC持续2天。随后用SEB和20μg/mL测试物 洗涤和再刺激细胞。描绘IFNγ和IL-2分泌的数据分别描绘于图46和图47中。 数据表明1C11变异体的活性与其亲和力之间的相关性，如通过XENP26928 的较弱结合亲和力和对应的细胞激素分泌的较弱诱导所指示。

综上所述，我们鉴别了新颖抗PD-1 mAb 1C11，其在人源化成1C11_H3L3(XENP22533)时具有类似于基于纳武单抗的抗PD-1 mAb XENP16432的亲和 力(分别为通过Biacore所确定的8.6nM和4.5nM；分别为通过Octet所确定 的约18nM和10nM)。尽管具有类似亲和力，但XENP22533比XENP16432 更紧密地结合T细胞，如图11中所描绘。我们对XENP22533进行工程化， 以产生具有如通过Octet所测量的对PD-1具有超过两个数量级的经调节亲和 力的变异体。此“亲和力梯”应证实适用于鉴别对PD-1的最优亲和力，其可 以最佳地导航PD-1受体再循环、抗体:抗原复合物寿命和抗体血清半衰期的复 杂生理行为。未来将在体内小鼠肿瘤模型中探索这些因素。

G.实例7：具有XmAb22841和αPD-1的三重检查点阻断增强了经SEB 刺激细胞的细胞激素分泌

用100ng/mL SEB刺激人类PBMC持续2天。洗涤细胞两次且用100ng/mL SEB和20μg/mL所指示测试物再刺激24小时。收集细胞上清液并且分析IFNγ 和IL-2分泌，如图29和图30中所描绘。数据表明，通过XmAb22841与 XENP16432组合实现的三重检查点阻断(基于纳武单抗具有消融效应功能的 二价αPD-1 mAb)增强了超出单独XENP16432或XmAb22841的细胞激素分 泌。值得注意的是，XmAb22841与XENP16432的组合使细胞激素分泌增强到 与通过XENP16432、XENP16433(二价αCTLA-4mAb，其具有基于伊匹单 抗的消融效应功能)与XENP16436(二价αLAG-3mAb，具有基于25F7的消 融效应功能)的组合三重检查点阻断类似的水平。

H.实例8：XmAb22841的亲合力影响来自MLR的细胞激素释放

使来自2种独特供体的PBMC混合(400,000个细胞/供体)且用20μg/mL 所指示测试物培育5天。培育之后，分析细胞的IFNγ，如图31中所描绘。在 类似实验中，将混合PBMC用各种浓度的所指示测试物培育5天，且在图32 中描绘了IFNγ相对于PBS的诱导倍数。数据表明，XmAb22841增强IFNγ分 泌超出XENP24895(基于XmAb22841的抗LAG-3臂的单臂单价mAb)与 XENP24893(基于XmAb22841的抗CTLA-4臂的单臂单价mAb)的组合，证 实了通过二价结合实现的亲合力对于增强细胞激素释放是必需的。

I.实例9：具有XmAb22841和αPD-1的三重检查点阻断增强NSG小 鼠的GVHD

使NOD SCIDγ(NSG)小鼠(每组10只)在第0天通过IV-OSP移植10×106 人类PBMC。在第1天，用XENP26842(二价αPD-1 mAb，基于具有消融效 应功能的纳武单抗和M428L/N434S Xtend突变；在图33中所描绘的序列)、 XmAb22841、XmAb22841与XENP16432或PBS的组合给药小鼠，持续4周 (总共4次给药)。在第7天、第14天和第21天抽取血液以对各种淋巴细胞群 体进行计数(如图34中所描绘(第14天))和IFNγ的血清浓度如(图35中 所描绘(第7天))。

J.实例10：具有XmAb22841和αPD-1的三重检查点阻断增强小鼠的 抗肿瘤反应

使NOD SCIDγ(NSG)小鼠(每组10只)在第14天后侧皮内移植3×106 表达pp65的MCF-7细胞。在第0天，使小鼠腹膜内移植来自HLA匹配型CMV+ 供体的5×10

K.实例11：抗PD-1 mAb 1C11增强移植有PBMC的NSG小鼠的GVHD

在GVHD研究中，我们研究了人缘化抗PD-1 mAb 1C11_H3L3 (XENP22553)的作用。在第0天，使NSG小鼠静脉内移植10×106人类PBMC， 接着用以下测试物在第1天、第8天、第15天和第21天处理：PBS对照、XENP16432(基于具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变异体的纳 武单抗的抗PD-1抗体)和XENP22553。图38描绘了小鼠的体重随时间的变 化(占初始体重的百分比)，且图39描绘了小鼠血液的人类CD45+细胞、CD4+T 细胞和CD8+T细胞计数随时间推移。

L.实例12：Xtend Fc结构域延长了hFcRn转基因小鼠的抗PD-1×抗 CTLA-4双特异性抗体的半衰期

在第0天用2mg/kg XmAb20717或XENP20053(XmAb20717的非Xtend 类似物)处理Tg276转基因hFcRn小鼠(hFcRn的半合；n＝5)。在处理后1 小时且在第2天、第5天、第8天、第12天、第15天、第19天、第22天、 第16天、第29天、第33天和第35天收集全血样品。使用人类PD-1和人类 CTLA-4抗原检测测试物浓度。使用具有PK参数的Phoenix WinNonlin软件(6.4.0.768版)进行PK解释分析，用于游离药物血清浓度相对于时间的非隔 室分析。XmAb20717和XENP20053的药物动力学概况描绘于图76中；半衰 期描绘于图77中；且C

M.实例13：XmAb20717不诱导未经处理的T细胞P的细胞激素释放

将BMC解冻隔夜，且用20μg/mL所指示可溶或与板结合的测试物处理 24小时。抗CD3抗体为克隆OKT3。随后收集细胞上清液且用V-PLEX促炎 屏面1人类试剂盒(马里兰州罗克维尔市麦索斯盖尔)分析。各点表示在技术 单重态中测试的独特人类供体。配对t测试用于确定统计学显著性(n.s.表示p 值>0.05)。图80中所描绘的数据显示，XmAb20717不诱导未经处理的T细胞 的细胞激素释放(A：IFNγ；B：IL-1β；C：IL-2；D：IL-4；E：IL-8；F：IL-6；G：IL-10；H：IL-12p70；I：IL-13；J：TNFα)。

N.实例14：XmAb20717的结合的进一步表征

1.A：XmAb20717结合人类和食蟹猴CTLA-4和PD-1

XmAb20717与人类和食蟹猴CTLA-4和PD-1的结合使用Octet，基于生 物膜干涉法(BLI)的方法表征。通过使用1:1结合模型全局分析经处理数据， 得到结合亲和力。Octet传感器图展示于图81和图82中。所得平衡解离常数 (K

2.B：XmAb20717与CTLA-4和PD-1的配体竞争结合

在用和不用XmAb20717的情况下，CD80和CD86与CTLA-4的结合以 及在用和不用XmAb20717的情况下，PD-L1和PD-L2与PD-1的结合使用 Octet，基于生物膜干涉法(BLI)的方法表征。Octet传感器图展示于图84和 图85中。在所有情况下，100nM CTLA-4和100nMPD-1展现出与其配体(分 别为CD80/CD86和PDL1/PDL2)的结合信号。在过量XmAb20717的存在下， 在实验之前在室温下用CTLA-4或PD-1预培育1小时，由于XmAb20717与 CTLA-4和PD-1分别竞争其配体CD80/CD86和PD-L1/PD-L2，未观察到任何 配体的结合信号。

3.C：XmAb20717未结合FcγR

XmAb20717与人类、食蟹猴和小鼠FcγR的结合使用Octet，基于生物膜 干涉法(BLI)的方法表征。还使用类似方法测试比较者抗体：具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体。Octet传感器图展示于图图86到图88中。尽管观察 到对于比较者抗体的原生人类IgG1抗体的预期结合图案，但对于XmAb20717 未检测到任何FcγR的结合。

4.D：XmAb20717在pH 6.0下结合人、食蟹猴和小鼠FcRn

XmAb20717与人类、食蟹猴和小鼠FcRn在pH 6.0下的结合使用Octet， 基于生物膜干涉法(BLI)的方法表征。还使用类似方法测试比较者抗体： XENP20053，抗PD1×抗CTLA4双特异性抗体，其含有与XmAb20717相同的 可变区和工程化恒定区但缺乏包含用于增强FcRn结合的氨基酸取代 XmAb20717。通过使用1:1朗缪尔模型(Langmuir model)全局分析经处理数 据，得到结合亲和力。Octet传感器图展示为图90。所得平衡解离常数(K

5.E：XmAb20717同时结合PD-1和CTLA-4

使用串联浸渍法在Octet HTX仪器上使用BLI技术测试XmAb20717与 PD1和CTLA4抗原两者的结合。首先，使生物传感器负载PD-1，随后浸渍到 XmAb20717或缓冲液中作为对照，且最后浸渍到CTLA-4中。图91展示了表 示XmAb20717可以同时结合到两种抗原的结合传感器图。在最终CTLA4抗 原浸渍期间，XmAb20717传感器图的信号继续增大，而未负载XmAb20717 的对照传感器图则持平。

O.实例15：XmAb20717的进一步体外表征

1.A：与抗PD-1抗体相比，XmAb20717促进经SEB刺激PBMC的更 多IL-2分泌。

用500ng/mL SEB刺激来自22种独特供体的PBMC持续48小时。随后 将细胞在培养基中洗涤两次且用500ng/mL SEB加20μg/mL所指示测试物再 刺激18小时。收集培养物上清液且通过ELISA分析IL-2浓度，其数据描绘于 图92中。

2.B：与抗PD-1抗体相比，XmAb20717抑制未经刺激人类PBMC的 IL-2分泌

用20μg/mL所指示测试物处理22种独特供体的未经刺激PBMC持续72 小时。收集培养物上清液且通过ELISA分析IL-2浓度，其数据描绘于图93 中。

3.C：与包含XmAb20717的组分臂的混合物相比，XmAb20717促进人 类淋巴细胞的更多IL-2分泌

用500ng/mL SEB刺激来自22种独特供体的PBMC持续48小时(来自 XENP15074和XENP20717的数据从图92复制而来)。随后将细胞在培养基中 洗涤两次且用500ng/mL SEB和20μg/mL所指示测试物再刺激18小时。收集 培养物上清液且通过ELISA分析IL-2丰度，其数据描绘于图94中。

P.实例16：鼠类模型的体内研究的进一步分析

我们进一步分析较早实例中所述的GVHD研究的数据。图95描绘了小鼠 的体重随时间的平均变化(占初始体重的百分比)。图96描绘了小鼠的存活随 时间推移。图97描绘了小鼠的平均IFNγ水平随时间推移。图98描绘了小鼠 血液的人类CD45

Q.实例17：GVHD模型中XmAb20717与PD-L1阻断的组合

在另一GVHD研究中，我们研究了XmAb20717与PD-L1阻断(抗PD-L1 mAb)的组合。在第0天，用10×10

R.实例18：XmAb20717与比较者抗PD-1抗体的相互作用

为了确定派姆单抗或纳武单抗是否可能干扰XmAb20717的结合活性，用 纳武单抗或派姆单抗(16点2倍连续稀释液，开始于100μg/mL)在4℃下处 理稳定地表达PD-1-GFP和CTLA-4的293T细胞30分钟。用200μL冰冷FACS 缓冲液(3％FBS/PBS)洗涤细胞两次，且在冰上用结合到Alexa647(16点3 倍连续稀释液，开始于200μg/mL)的XmAb20717染色30分钟。随后通过 FACS分析细胞与XmAb20717的结合，其数据描绘于图103和图104中。图 103中所描绘的数据表示纳武单抗未显著干扰XmAb20717与PD-1

S.实例19：XmAb22841不诱导未经处理的T细胞的细胞激素释放且并 非超激动的

将PBMC解冻过夜，且用20μg/mL所指示可溶或与板结合的测试物处理 24小时。抗CD3抗体为克隆OKT3。随后收集细胞上清液且用V-PLEX促炎 屏面1人类试剂盒(马里兰州罗克维尔市麦索斯盖尔)分析。各点表示在技术 单重态中测试的独特人类供体。配对t测试用于确定统计学显著性(n.s.表示p 值>0.05)。图106中所描绘的数据显示，XmAb22841不诱导未经处理的T细 胞的细胞激素释放(A：IFNγ；B：IL-1β；C：IL-2；D：IL-4；E：IL-8；F： IL-6；G：IL-10；H：IL-12p70；I：IL-13；J：TNFα)。

还通过斯特宾协议(Stebbings protocol)的风干法评估XmAb22841的超 激动特性(斯特宾(Stebbings)R.等人，2007)。通过在室温下在SpeedVac

T.实例20：XmAb22841的结合的进一步表征

1.A：XmAb22841结合人类和食蟹猴CTLA-4和LAG-3

XmAb22841与人类和食蟹猴CTLA-4和LAG-3的结合使用Octet，基于 生物膜干涉法(BLI)的方法表征。通过使用1:1结合模型全局分析经处理数 据，得到结合亲和力。Octet传感器图展示于图109和图110中。所得平衡解 离常数(K

2.B：XmAb22841与CTLA-4和LAG-3的配体竞争结合

在用和不用XmAb22841的情况下，CD80和CD86与CTLA-4的结合使 用Octet，基于生物膜干涉法(BLI)的方法表征。Octet传感器图展示于图112。 在两种情况下，100nM CTLA-4展示出与其配体(CD80/CD86)的结合信号。 在过量XmAb22841的存在下，在实验之前在室温下用CTLA-4预培育1小时， 由于XmAb22841与CTLA-4对其配体CD80/CD86竞争，未观察到任何配体 的结合信号。

可溶性LAG-3结合到在癌症细胞系表面上表达的MHC II类。因此，我们 确定XmAb22841在与XmAb22841复合时可能阻断可溶性LAG-3与 MHCII

3.C：XmAb22841未结合FcγR

XmAb22841与人类、食蟹猴和小鼠FcγR的结合使用Octet，基于生物膜 干涉法(BLI)的方法表征。还使用类似方法测试比较者抗体：具有原生IgG1 恒定区的抗CD19抗体。Octet传感器图展示于图114到图116中。尽管观察 到对于比较者抗体的原生人类IgG1抗体的预期结合图案，但XmAb22841未 检测到任何FcγR的结合。

4.D：XmAb22841在pH 6.0下结合人、食蟹猴和小鼠FcRn

XmAb22841与人类、食蟹猴和小鼠FcRn在pH 6.0下的结合使用Octet， 基于生物膜干涉法(BLI)的方法表征。还使用类似方法测试比较者抗体： XENP22602，抗CTLA-4×抗LAG-3双特异性抗体，其含有与XmAb22841相 同的可变区和工程化恒定区但缺乏包含用于增强FcRn结合的氨基酸取代 XmAb22841。通过使用1:1朗缪尔模型全局分析经处理数据，得到结合亲和 力。Octet传感器图展示为图118。呈现所得平衡解离常数(K

5.E：XmAb22841同时结合CTLA-4和LAG-3

在Octet HTX仪器上使用BLI技术的方法。首先，使生物传感器负载 LAG3，随后浸渍到XmAb22841或缓冲液中作为对照，且最后浸渍到CTLA4 中。图119展示了表示XmAb22841可以同时结合到两个抗原的结合传感器图。 在最终CTLA4抗原浸渍期间，XmAb22841传感器图的信号继续增大，而未负 载XmAb22841的对照传感器图则持平。

U.实例21：通过XmAb22841和PD-1阻断的GVHD的进一步分析

我们进一步分析来自较早实例中所述的研究通过XmAb22841和PD-1阻 断的三重检查点阻断的GVHD研究的数据。图120描绘了小鼠的体重随时间 的平均变化(占初始体重的百分比)。图121描绘了小鼠的存活随时间推移。 图122描绘了在第7天和第14天的IFNγ和IL-10浓度。