含NAD和NMDA受体拮抗剂的药物组合物及其用途

摘要

本发明属于药物组合物领域，具体涉及含NAD的药物组合物及其用途。本发明提供了一种含NAD的药物组合物，所述药物组合物包含NAD和NMDA受体拮抗剂，所述NMDA受体拮抗剂选自美金刚。所述药物组合物增强了NAD对阿尔兹海默症的效果，扩大了NAD的治疗范围。

说明书

技术领域

本发明属于药物组合物领域，具体涉及含NAD的药物组合物及其用途。

背景技术

阿尔茨海默症是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。80岁的老人有20％的几率患有阿尔兹海默症。

目前常见的阿尔茨海默病药物有两类。其中一类称为N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，包括美金刚，研究表明美金刚对中、重度患者的整体专归有明显作用。

关于阿尔茨海默症新的治疗药物和方法是科研工作者不断的追求，现如今的研究发现，增加核NAD

可见，关于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对阿尔兹海默症的治疗并不明确，制约了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在临床中的应用。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明提供了一种含NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NMDA受体拮抗剂的药物组合物，增强了NAD对阿尔兹海默症的效果，扩大了NAD的治疗范围。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明在一个实施例中提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含NAD和NMDA受体拮抗剂。

优选地，所述NMDA受体拮抗剂选自美金刚。

优选地，所述组合物中NAD与美金刚的摩尔比为1:10至10:1；优选地，所述组合物中NAD与美金刚的摩尔比为1:5至5:1；优选地，所述组合物中NAD与美金刚的摩尔比为1:3至3:1；优选地，所述组合物中NAD与美金刚的摩尔比为1:1。

在一个实施例中，本发明提供一种药物制剂，所述制剂包含所述药物组合物。

优选地，所述制剂选自液体剂型、固体剂型、半固体剂型或气体剂型。

所述液体剂型包括溶液剂、注射剂、输液剂、口服液等；固体剂型包括片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等；半固体剂型包括软膏剂、凝胶剂等；气体剂型包括气雾剂、喷雾剂等。

在另一个实施例中，本发明提供了一种所述药物组合物或所述药物制剂在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

(三)有益效果

本发明提供了一种含NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的药物组合物，增强了NAD对阿尔兹海默症的效果，扩大了NAD的治疗范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为NAD及美金刚单独给药对HT-22神经元细胞活力的影响；

图2为L-谷氨酸(L-glu)诱导下NAD及美金刚细胞活力检测；

图3为NAD与美金刚联合用药细胞活力检测；

图4为NAD与美金刚联合用药ROS水平检测；

图5为NAD与美金刚联合用药ROS显微荧光成像；

图6为NAD与美金刚联合用药qRT-PCR实验。

注：图中“*”表示某实验组与对照组(Control组)比较的显著性；“#”表示某实验组与诱导组(L-glu组)比较的显著性。对比对象不同故符号不同。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面通过具体的实施例进行详细的说明。

实施例1：NAD及AD阳性药美金刚单独给药对HT-22神经元细胞的影响

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以10000个细胞/孔将细胞分至96孔板中，每孔100μL DMEM完全培养基。

2、加药处理。待96孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，每孔100μL更换为DMEM-SF无血清培养基，各药物按照如下浓度进行加药处理：

美金刚：0，0.1，0.5，1，10，50，100μM

NAD：0，0.05，0.1，1，10，100，500，1000μM

3、细胞活力检测。

①配置MTT溶液。加药处理18h后，按照3mg/mL称取所需量的MTT粉末溶于新鲜的DMEM-SF培养基中，将溶解好MTT的培养基按照20μL/孔加入到96孔板中，此时每孔总体积为120μL，即MTT终浓度为0.5mg/mL。

②检测。MTT加入原96孔板反应4h后从培养箱取出，用1×PBS缓冲液清洗3次后，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床震荡15min，结束后用酶标仪在550nm处检测吸光度。

如图1所示，从以上实验结果来看：美金刚对神经元活性的影响呈现出依浓度梯度上升的趋势，其低浓度也并不会降低细胞活性；NAD对神经元活性的提高主要体现在中至高浓度(10，100，500，1000μM)，并且在中高浓度范围内基本上呈浓度依赖趋势，浓度进一步升高则细胞活性增加不明显。

实施例2：L-谷氨酸(L-glu)诱导实验

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以10000个细胞/孔将细胞分至96孔板中，每孔100μL DMEM完全培养基。

2、加药处理。待96孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，加药处理：

①L-Glu配制(现配现用)。称取所需量的L-Glu溶解于新鲜的DMEM-SF(100μL/孔)无血清培养基中使其浓度为20mM待用；

②将各药物按照如下浓度分别溶解于①中配制好的溶液中：

美金刚：0.0.5，1，10，50，100μM

NAD：0，0.05，0.1，1，10，100，500，1000μM

3、细胞活力检测。

①配置MTT溶液。加药处理18h后，按照3mg/mL培养基称取所需量的MTT粉末溶于新鲜的DMEM-SF培养基中，将溶解好MTT的培养基按照20μL/孔加入到96孔板中，此时每孔总体积为120μL，即MTT终浓度为0.5mg/mL。

②检测。MTT加入原96孔板反应4h后从培养箱取出，用1×PBS缓冲液清洗3次后，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床震荡15min，结束后用酶标仪在550nm处检测吸光度。

以前期各阳性药物及NAD分别单独给药的实验结果为基础，进行了L-谷氨酸(L-glu)诱导实验。通过对实验数据的分析，如图2所示，我们可以得知L-glu的诱导有效降低了细胞活力。NAD很好的提高了神经元细胞活力，与实施例1对细胞活性影响的趋势相近，但美金刚并未能挽救L-glu损害的神经元活力。

实施例3：联合用药检测细胞活力实验

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以10000个细胞/孔将细胞分至96孔板中，每孔100μL DMEM完全培养基。

2、加药处理。待96孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，加药处理：

①L-Glu配制(现配现用)。称取所需量的L-Glu溶解于新鲜的DMEM-SF(100μL/孔)无血清培养基中使其浓度为20mM待用；

②将各药物按照如下浓度分别溶解于①中配制好的溶液中：

美金刚(Mem100)：100μM

NAD(N100)：100μM

美金刚+NAD(MN50):各50μM

3、细胞活力检测。

①配置MTT溶液。加药处理18h后，按照3mg/mL培养基称取所需量的MTT粉末溶于新鲜的DMEM-SF培养基中，将溶解好MTT的培养基按照20μL/孔加入到96孔板中，此时每孔总体积为120μL，即MTT终浓度为0.5mg/mL。

②检测。MTT加入原96孔板反应4h后从培养箱取出，用1×PBS缓冲液清洗3次后，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床震荡15min，结束后用酶标仪在550nm处检测吸光度。

如图3所示，在谷氨酸的诱导下，100μM的美金刚和100μM的NAD能够提高L-glu损害的神经元活力，但二者联用的效果则均显著高于其各自单独在同等剂量下单独处理，这提示NAD和美金刚可以协同作用挽救神经元活力。

实施例4：联合用药ROS水平检测实验

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以10000个细胞/孔将细胞分至黑色避光96孔板。每孔100μLDMEM完全培养基。

2、加药处理。待96孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，加药处理：

①L-Glu配制(现配现用)。称取所需量的L-Glu溶解于新鲜的DMEM-SF(100μL/孔)无血清培养基中使其浓度为20mM待用；

②将各药物按照如下浓度分别溶解于①中配制好的溶液中：

美金刚(Mem100)：100μM

NAD(N100)：100μM

美金刚+NAD(MN50):各50μM

3、细胞ROS水平检测。

①配置DCFH-DA溶液。加药处理18h后，按照10mM浓度将DCFH-DA活性氧探针溶于新鲜的DMEM-SF培养基中，将孔板中原培养基抽走，后将溶解好DCFH-DA的培养基按照35μL/孔加入到96孔板中，在培养箱中孵育25min。

②检测。反应结束后将孔板取出，用1×PBS缓冲液清洗2次后，最后一次在每孔中加入100μL 1×PBS，用酶标仪分别在488nm激发光和525nm发射光的条件下检测荧光强度。

从图4中可以看出，100μM的NAD和美金刚均可以显著降低L-glu诱导的ROS产生，而其二者联用对ROS产生的作用效果相对于同等剂量的二者分别单独处理均具有显著性降低。

实施例5：联合用药ROS显微荧光成像实验

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以5×10

2、加药处理。待孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，加药处理：

①L-Glu配制(现配现用)。称取所需量的L-Glu溶解于新鲜的DMEM-SF(100μL/孔)无血清培养基中使其浓度为20mM待用；

②将各药物按照如下浓度分别溶解于①中配制好的溶液中：

美金刚(Mem100)：100μM

NAD(N100)：100μM

美金刚+NAD(MN50):各50μM

3、ROS荧光成像

①配置DCFH-DA溶液。加药处理18h后，按照10mM浓度将DCFH-DA活性氧探针溶于新鲜的DMEM-SF培养基中，将孔板中原培养基抽走，后将溶解好DCFH-DA的培养基按照500μL/孔加入到12孔板中，在培养箱中孵育25min。

②检测。反应结束后将孔板取出，用1×PBS缓冲液清洗2次后，最后一次在每孔中加入500μL 1×PBS，在荧光显微镜下观察并拍摄荧光显微图像。

如图5所示，不做处理的Control组细胞具有微弱的ROS，而L-glu处理的神经元出现了强烈的ROS绿色荧光。100μM的NAD和美金刚均在一定程度上降低了ROS的强度，且二者联用明显得到更好的改善，与实例4所得结果一致。

实施例6：联合用药qRT-PCR实验

1、细胞铺板。HT-22细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以5×10

2、加药处理。待孔板中细胞过夜贴壁，在显微镜下观察确认细胞状态良好后，加药处理：

①L-Glu配制(现配现用)。称取所需量的L-Glu溶解于新鲜的DMEM-SF(100μL/孔)无血清培养基中使其浓度为20mM待用；

②将各药物按照如下浓度分别溶解于①中配制好的溶液中：

美金刚(Mem100)：100μM

NAD(N100)：100μM

美金刚+NAD(MN50):各50μM

3、总RNA提取及反转录

每孔各加入200μL Trizol RNA提取剂，轻轻吹打至体系呈均一、透明的溶液状，并移至1.5mL离心管中，每管加入40μL三氯甲烷后震荡并4℃离心10min，取上清液80μL并加入等量异丙醇至-20℃进行过夜层析。层析后的样品经过75％和100％乙醇洗涤后用超纯水进行溶解。检测RNA样品浓度后将等量(1μg)RNA样品通过qPCR反转录为cDNA作为后续qRT-PCR的模板。

4、qRT-PCR检测目的基因mRNA水平

将所得cDNA作为模板进行qRT-PCR实验，使用实时荧光定量PCR仪检测抗氧化因子SOD2和GSH的mRNA表达，所用引物如下：

mGSH-f：5’-CAATGTAAAATTGGGCTCGAA-3’；

mGSH-r:5’-GTTTCCCGTGCAATCAGTTC-3’；

mSOD2-f:5’-AGACACGGCTGTCAGCTTCT-3’；

mSOD2-r:5’-CTGGACAAACCTGAGCCCTA-3’.

结果如图6所示，L-glu显著降低了抗氧化因子SOD2和GSH的转录，100μM的NAD则将这二者的转录重新提高，而100μM的美金刚单独处理轻微上调GSH的mRNA水平，但无显著性；在加入50μM NAD共同处理后，发现SOD2和GSH二者的水平明显上调，且强于100μM NAD和美金刚分别单独处理，两组相比具有很强的显著性。

以上实验结果证明，NAD能够与NMDA受体拮抗剂类AD阳性药美金刚协同作用，通过减轻氧化应激水平提高神经元活力，显示出良好的协同抗AD潜力。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。