姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍的药物中的用途

摘要

本发明公开了姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍的药物中的用途。实验证明，姜黄素及姜黄素缓释药膜能够可通过上调GAP‑43和MAP‑2的表达来促进神经轴突的生长，通过上调Oct‑6和Krox‑20的表达来促进施万细胞合成分泌髓鞘相关蛋白，促进神经轴突髓鞘的形成。同时，其还能够有效促进大鼠海绵体神经损伤后的修复再生，恢复海绵体神经通路连续性，增加阴茎组织神经末梢nNOS mRNA和蛋白的表达；其还可以进一步改善海绵体神经损伤大鼠的阴茎勃起功能，同时降低阴茎组织纤维化程度，有效促进海绵体神经损伤后的阴茎康复。因此，姜黄素及其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍和修复海绵体神经损伤的药物中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍的药物中的用途。

背景技术

神经性阴茎勃起功能障碍是成年男性阴茎勃起功能障碍(erectiledysfunction,ED)中的一种常见类型，约占全部ED的10％～19％。海绵体神经损伤是导致神经性阴茎勃起功能障碍的根本原因之一，而海绵体神经损伤导致的ED是盆腔及尿道外科手术中常见的并发症，近年来随着医疗技术发展，男性盆腔肿瘤手术、盆腔放疗以及经尿道手术等手术量的增加，海绵体神经损伤的患者也越来越多。目前，海绵体神经损伤后导致的ED临床治疗十分棘手，是泌尿男科领域的研究热点和难点之一，其临床常见治疗手段包括口服5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5，PDE5)抑制剂、阴茎海绵体内血管活性药物注射、使用真空负压吸引设备以及阴茎起勃器植入手术等，但各种治疗方式仍存在各自的缺点，都不能从根本上恢复海绵体神经的连续性，因此寻求海绵体神经损伤后修复再生的方法，谋求重建海绵体神经通路以改善阴茎勃起功能的策略非常有必要。

姜黄素(curcumin，Cur)是从姜科植物姜黄Curcumalonga L.中提取的多酚类物质，具有抗肿瘤、抗突变、抗炎、抗氧化等广泛的药理活性。研究发现，姜黄素作为一种抗肿瘤药物，具有特异杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移、减缓肿瘤内部的血管生成等多靶点作用，能够用来抑制肿瘤的发生，相对于普通化疗药物，姜黄素对人体的不良反应小，因此，姜黄素在制药领域具有良好的前景。

但是，目前还没有将姜黄素用来修复海绵体神经损伤或治疗阴茎勃起功能障碍的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍，特别是治疗海绵体神经损伤导致的神经性阴茎勃起功能障碍的药物中的新用途。

本发明提供了姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍的药物中的用途。

进一步地，所述阴茎勃起功能障碍为神经性阴茎勃起功能障碍。

进一步地，所述神经性阴茎勃起功能障碍为海绵体神经损伤导致的神经性阴茎勃起功能障碍。

本发明还提供了姜黄素或其载药体系在制备修复海绵体神经损伤的药物中的用途。

进一步地，所述药物能够增加海绵体神经损伤后盆神经节处的神经元数量；

和/或，所述药物能够增加神经损伤海绵体神经内的有髓神经纤维数量；

和/或，所述药物能够增加神经损伤海绵体神经末梢nNOS mRNA和nNOS蛋白的表达量。

进一步地，所述药物能够提高神经损伤海绵体内压/平均动脉压的比值；

和/或，所述药物能够降低神经损伤海绵体的阴茎组织纤维化程度；

和/或，所述药物能够提高神经损伤海绵体的阴茎海绵体组织中平滑肌/胶原纤维的比值；

和/或，所述药物能够提高神经损伤海绵体的阴茎海绵体组织中的平滑肌含量；

和/或，所述药物能够提高神经损伤海绵体的阴茎组织中α-SMA蛋白的表达量；

和/或，所述药物能够降低神经损伤海绵体的阴茎组织中Collagen-Ⅰ蛋白的表达量。

进一步地，

所述药物能够提高神经细胞内GAP-43，MAP-2蛋白的表达量；

和/或，所述药物能够促进施万细胞成髓鞘；

和/或，所述药物能够提高施万细胞MBP、MPZ、Oct-6、和Krox-20蛋白的表达量，所述药物能够提高施万细胞MBP、MPZ、Oct-6、和Krox-20mRNA的表达量。

进一步地，所述姜黄素载药体系为姜黄素与可降解聚合物为原料制得的载药体系；优选的，所述可降解聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇；更优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇的分子量为3400～20000。

进一步地，所述姜黄素载药体系的制备方法包括以下步骤：将姜黄素与可降解聚合物加入溶剂中，溶解，然后制备成膜，干燥，该膜即姜黄素载药体系。

进一步地，所述姜黄素载药体系中，姜黄素的质量分数为0.10％～10.00％，优选为0.35％～1.40％；

和/或，所述溶剂为有机溶剂，优选为乙酸乙酯；

和/或，所述成膜的方法为流延法；

和/或，所述膜的厚度为0.1～1.0mm，优选为0.5mm。

PLGA-PEG共聚物具有可降解性、无毒以及良好的生物相容性，可以作为姜黄素的良好载体材料；本发明用PLGA-PEG共聚物包载不同剂量姜黄素后制成了姜黄素药物缓释膜，提高了姜黄素的生物利用度，延长了姜黄素稳定释放时间。

实验证明，姜黄素及姜黄素缓释药膜能够通过上调GAP-43和MAP-2的表达来促进神经轴突的生长，通过上调Oct-6和Krox-20的表达来促进施万细胞合成分泌髓鞘相关蛋白，促进神经轴突髓鞘的形成。同时，姜黄素及姜黄素缓释药膜还能够有效促进大鼠海绵体神经损伤后的修复再生，恢复海绵体神经通路连续性，增加阴茎组织神经末梢nNOS mRNA和蛋白的表达；其还可以进一步改善海绵体神经损伤大鼠的阴茎勃起功能，同时降低阴茎组织纤维化程度，有效促进海绵体神经损伤后的阴茎康复。

所以，姜黄素及其载药体系在制备修复海绵体神经损伤的药物，以及治疗阴茎勃起功能障碍(特别是治疗海绵体神经损伤导致的神经性阴茎勃起功能障碍)的药物中具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1倒置显微镜观察姜黄素对施万细胞成髓鞘的影响结果；A:对照组，B:低浓度姜黄素干预组,C:中浓度姜黄素干预组，D：高浓度姜黄素干预组；各组图片的右上角方框内是局部髓鞘样结构放大图。

图2实施例1、实施例2、实施例3制得的姜黄素缓释药膜和对照例1制得的PLGA-PEG空白膜的扫描电镜结果

图3不同剂量姜黄素缓释药膜的体外姜黄素释放速率；其中，Cur缓释药膜即姜黄素缓释药膜。

图4体外降解实验中各样品在不同时间点的图片；A:高剂量姜黄素缓释药膜，B:中剂量姜黄素缓释药膜，C:低剂量姜黄素缓释药膜，D:PLGA-PEG空白膜。

图5不同剂量姜黄素缓释药膜及PLGA-PEG空白膜的体外降解速率；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。

图6姜黄素缓释膜在不同时间点的体内降解图片

图7荧光金逆行示踪标记的盆神经节阳性神经元的荧光显微镜图片；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组。

图8荧光金逆行示踪标记的盆神经节阳性神经元的数量统计图，柱状图示平均值±标准差，*P<0.05，**P<0.01；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。。

图9透射电镜下各组大鼠海绵体神经纤维的超微结构；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组；图中，MA表示有髓神经纤维，SNC表示施万细胞，→表示脱髓鞘的神经轴突，★表示新生髓鞘。

图10透射电镜下各组大鼠海绵体有髓神经纤维数量统计图，柱状图示平均值±标准差，*P<0.05，**P<0.01；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。

图11实时荧光定量PCR法测得的各组大鼠阴茎组织nNOS mRNA表达水平，柱状图示平均值±标准差，**P<0.01；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。

图12Western blot检测法测得的各组大鼠阴茎组织nNOS蛋白表达水平及统计图，柱状图示平均值±标准差，**P<0.01；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。。

图13大鼠ICP和MAP测定操作。

图14各组大鼠阴茎ICP代表图；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组。

图15各组大鼠阴茎组织HE染色图片；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组。

图16各组大鼠阴茎组织Masson染色图片；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组；蓝染的为胶原纤维，红染的为平滑肌。

图17免疫荧光染色法检测各组大鼠阴茎组织海绵体平滑肌含量结果；A:Sham组，B:高剂量姜黄素缓释药膜组，C:中剂量姜黄素缓释药膜组，D:低剂量姜黄素缓释药膜组，E:PLGA-PEG空白膜组，F:BCNC组；红染的为α-SMA阳性区域。

图18Western blot检测各组大鼠海绵体组织α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平及统计学结果，柱状图示平均值±标准差，**P<0.01；其中，Cur缓释膜即姜黄素缓释药膜。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)为市售产品，分子量为3400～20000，PLGA-PEG中，乳酸、羟基乙酸、乙二醇的摩尔数之比为30:10:11。

实施例1：姜黄素缓释药膜的制备

精密称取3.5mg姜黄素溶于3ml乙酸乙酯中，继续加入996.5mg的PLGA-PEG，室温搅拌30min使其充分溶解。将以上溶液于室温下静置10min后，利用流延法使之在玻璃模槽铺展，室温条件下通风干燥24小时成膜。待溶剂挥发后形成厚度为0.5mm的姜黄素缓释药膜，其中姜黄素的质量分数为0.35％。

实施例2：姜黄素缓释药膜的制备

采用与实施例1相同的方法，区别仅在于控制姜黄素的质量为7.0mg，PLGA-PEG的质量为993.0mg，制得姜黄素的质量分数为0.70％的姜黄素缓释药膜。

实施例3：姜黄素缓释药膜的制备

采用与实施例1相同的方法，区别仅在于控制姜黄素的质量为14.0mg，PLGA-PEG的质量为986.0mg，制得姜黄素的质量分数为1.40％的姜黄素缓释药膜。

对照例1：PLGA-PEG空白膜的制备

精密称取1000.0mg PLGA-PEG溶于3ml乙酸乙酯中，室温搅拌30min使其充分溶解。将以上溶液于室温下静置10min后，利用流延法使之在玻璃模槽铺展，室温条件下通风干燥24小时成膜。待溶剂挥发后形成厚度为0.5mm的PLGA-PEG空白膜。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1：姜黄素促神经生长作用的相关机制研究

1、实验方法(一)姜黄素对PC12细胞轴突生长的影响

(1)MTT比色法检测药物最适浓度：分别用2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L姜黄素干预PC12细胞(购买于武汉普诺赛生命科技有限公司)，筛选姜黄素的最适浓度。

(2)加药诱导实验：分别加入低、中、高三种不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)的姜黄素处理PC12细胞，以未加入姜黄素的细胞组作为阴性对照组，显微镜下每日观察姜黄素处理后的PC12细胞轴突生长情况。并于加药培养72h后拍照，观察PC12细胞形态，测量细胞的轴突生长情况，并制备Western blot的蛋白样本，用于检测PC12细胞轴突生长相关蛋白GAP-43和微管相关蛋白MAP-2的表达情况。

(二)姜黄素对施万细胞成髓鞘的影响

(1)MTT比色法检测药物最适浓度：分别用2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L姜黄素干预施万细胞(购买于武汉普诺赛生命科技有限公司)，筛选姜黄素的最适浓度。

(2)加药诱导实验：取PC12细胞和施万细胞进行共培养，然后分别加入低、中、高三种不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)的姜黄素，以未加入姜黄素的细胞组作为阴性对照组。每2～3天换液1次，直到第7天，用倒置显微镜观察细胞生长情况，加药培养14天后，在透射电镜下观察施万细胞髓鞘生成情况，并制备Western blot和实时荧光定量PCR检测样本，用于检测髓鞘再生相关蛋白MBP、MPZ、Krox-20和Oct-6的蛋白和mRNA表达。

2、实验结果(一)姜黄素对PC12细胞轴突生长的影响

MTT检测结果提示姜黄素浓度为40μmol/L时，表现出明显的细胞毒性，PC12细胞抑制率达40.62％。姜黄素对PC12细胞的抑制率随着药物的浓度降低而逐渐降低。姜黄素浓度为10μmol/L和20μmol/L时，细胞的抑制率为8.36％和17.57％，而姜黄素浓度为2.5μmol/L和5μmol/L时对PC12细胞没有明显的细胞毒性作用。

加药诱导实验结果显示姜黄素能有效促进PC12细胞突起生长，三个浓度的姜黄素干预组中PC12细胞的平均轴突长度均明显大于未加药处理的对照组(P＜0.05)；且随着姜黄素浓度的增加，PC12细胞平均轴突长度也呈逐渐增加的趋势，中高浓度(10μmol/L)姜黄素干预组PC12细胞平均轴突长度显著高于低浓度(2.5μmol/L)姜黄素干预组(P＜0.05)，但中浓度和高浓度姜黄素干预组间PC12细胞平均轴突长度无统计学差异。

此外，与对照组相比，不同浓度姜黄素干预组的GAP-43、MAP-2蛋白的表达量明显增加(P＜0.05)，并且GAP-43，MAP-2蛋白的表达量随着姜黄素浓度增加而增加，呈现剂量依赖性的关系，但不同浓度姜黄素干预组间GAP-43，MAP-2蛋白的表达量无统计学差异。

(二)姜黄素对施万细胞成髓鞘的影响

MTT检测结果提示姜黄素浓度为60μmol/L时，表现出明显的细胞毒性，施万细胞抑制率达42.05％。姜黄素对施万细胞的抑制率随着药物的浓度降低而逐渐降低。姜黄素浓度为10μm/L和20μm/L时，细胞的抑制率为5.91％和12.58％，而姜黄素浓度为2.5μmol/L和5μm/L时对施万细胞细胞没有明显的细胞毒性作用。

显微镜观察结果(图1)显示姜黄素能促进施万细胞成髓鞘，可以看出，对照组施万细胞生成髓鞘样结构极少，而姜黄素干预组施万细胞生成髓鞘样结构随着姜黄素浓度的增加而增多，并可见形态规则的致密板层髓鞘样结构。

实时荧光定量PCR检测结果显示，与对照组相比，低、中、高浓度姜黄素干预组的施万细胞MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20mRNA表达水平均上调(P<0.05)；MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20mRNA表达水平随着姜黄素浓度增加而增加，呈现剂量效应关系，但不同浓度姜黄素干预组间MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20mRNA表达水平无统计学差异(P＞0.05)；

Western blot检测结果显示，与对照组相比，低、中、高浓度姜黄素干预组施万细胞MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20的蛋白表达量明显增加(P<0.05)；MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20蛋白表达量随姜黄素浓度的增加而增加，表现出姜黄素的剂量依赖性，但不同浓度姜黄素干预组间MBP、MPZ、Oct-6和Krox-20蛋白表达量无统计学差异(P＞0.05)。

上述实验结果表明，姜黄素可通过上调GAP-43和MAP-2的表达来促进神经轴突的生长，通过上调Oct-6和Krox-20的表达来促进施万细胞合成分泌髓鞘相关蛋白，促进神经轴突髓鞘的形成。

实验例2：姜黄素缓释药膜的释放性能测定

1、实验方法

实验样品：实施例1、2、3制得的姜黄素质量分数分别为0.35％(低剂量)、0.7％(中剂量)、1.4％(高剂量)的姜黄素缓释药膜，以对照例1制得的PLGA-PEG空白膜为对照。

测试方法：

(1)将各样品裁剪为5×5mm大小，通过扫描电镜观察膜的表观形貌。

(2)通过紫外分光光度计检测姜黄素溶液在480nm处的吸光度(A)，绘制姜黄素浓度(c)-吸光度(A)的标准曲线。计算姜黄素缓释药膜中姜黄素的载药量和包封率。

利用紫外分光光度计测定样品在480nm处的吸光度，代入黄素浓度(c)-吸光度(A)的标准曲线，计算姜黄素的体外累计释放速率。

(3)体外降解：参照国标GB/T16886.13-2001医疗器械生物学评价第13部分内容进行姜黄素缓释药膜的体外降解时间研究。

体内降解：将姜黄素缓释药膜裁剪成长1.0cm×1.0cm长条状，对大鼠进行麻醉后，消毒进盆腔，找到大鼠前列腺和海绵体神经，将姜黄素PLGA-PEG缓释膜放置于海绵体神经旁，并关腹。分别在预先制定好的时间间隔(7、14、28天)处死大鼠，打开盆腔，观察姜黄素缓释药膜的降解情况。

2、实验结果

扫描电镜结果(图2)显示PLGA-PEG空白膜的薄膜表面平滑致密；低剂量姜黄素缓释药膜表面平整且可观察到细小颗粒均匀分散在膜材中；中剂量姜黄素缓释药膜表面略有凸凹并可观察到明显颗粒均匀分散在膜材中；高剂量姜黄素缓释药膜表面明显凸凹并可观察到明显药物颗粒散布于膜材中，断面也能观测到明显药物颗粒。

以姜黄素浓度c为横坐标，吸光度OD值A为纵坐标绘制标准曲线，得到姜黄素药物浓度c与吸光度A的线性关系，具体标准曲线为A＝2.7551c+0.0099，相关系数R2＝0.9966。从表1可知，三种剂量姜黄素缓释药膜中姜黄素的载药量和姜黄素包封率均较高。

表1各姜黄素缓释药膜中药物的载药量与包封率(n＝3)

体外药物释放实验结果如图3所示。可以看出，在第15天时间点，中剂量和高剂量姜黄素缓释药膜的姜黄素释放速率快于低剂量姜黄素缓释药膜；在45天时间内三种剂量姜黄素缓释药膜的姜黄素累计释放量均超过70％，且，在第45天时间点，低、中、高剂量姜黄素缓释药膜中姜黄素累计释放率为分别为：72.5％、79.2％、89.8％。

体外降解实验结果如图4、图5所示。可以看出，在第6周时间点PLGA-PEG空白膜和低剂量姜黄素缓释药膜的降解速率快于中剂量和高剂量姜黄素缓释药膜；10周时三种剂量姜黄素缓释药膜的体外累计降解均超过85％。体内降解实验结果如图6所示。可以看出，姜黄素缓释药膜在体内28天时仅残留小部分膜片，其余大部分已降解完全。

上述实验结果表明，PLGA-PEG共聚物具有可降解性、无毒以及良好的生物相容性；PLGA-PEG共聚物可以作为姜黄素的良好载体材料，包载不同剂量姜黄素后制成姜黄素药物缓释膜，提高姜黄素的生物利用度，延长姜黄素稳定释放时间。

实验例3：姜黄素缓释药膜促大鼠海绵体神经损伤修复的研究

1、实验方法

将36只SD大鼠随机分为以下6组：

A:Sham组(n＝6)：切开腹腔，暴露两侧盆神经节和海绵体神经后，直接关腹并缝合皮肤,关腹并缝合皮肤；

B:高剂量姜黄素缓释药膜组(n＝6):切开腹腔，损伤双侧海绵体神经后,在损伤部位放置高剂量姜黄素缓释药膜(实施例3制得),关腹并缝合皮肤；

C:中剂量姜黄素缓释药膜组(n＝6):切开腹腔，损伤双侧海绵体神经后,在损伤部位放置中剂量姜黄素缓释药膜(实施例2制得),关腹并缝合皮肤；

D:低剂量姜黄素缓释药膜组(n＝6):切开腹腔，损伤双侧海绵体神经后，在损伤部位放置低剂量姜黄素缓释药膜(实施例1制得),关腹并缝合皮肤；

E:PLGA-PEG空白膜组(n＝6):切开腹腔后，损伤双侧海绵体神经后，在损伤部位放置PLGA-PEG空白膜(对照例1制得),关腹并缝合皮肤；

F:BCNC组(n＝6):切开腹腔后，损伤双侧海绵体神经后，关腹并缝合皮肤。

SD大鼠双侧海绵体神经损伤模型的建立：采用10％水合氯醛按0.3ml/100g对大鼠行腹腔麻醉。麻醉生效后，大鼠取仰卧位，固定四肢，常规备皮，碘伏消毒，铺巾。行下腹正中切口，打开腹腔，暴露前列腺，仔细分离后外侧前列腺薄膜，找到盆神经节，于盆神经节下前方找到沿尿道侧面行走的海绵体神经。用同样方法找到右侧海绵体神经；找到双侧海绵体神经及盆神经节后，用血管钳钳夹双侧海绵体神经2min，血管钳闭合至最后一个咬齿，制作双侧海绵体神经损伤动物模型，随后关腹并缝合皮肤。

SD大鼠双侧海绵体神经损伤模型的验证：于模型建立后第1天、14天、28天使用阿朴吗啡(100μg阿朴吗啡粉剂溶解于0.5mg/kg的维生素C和2ml的生理盐水中，按阿朴吗啡100μg/kg的剂量给药)，观察Sham组和BCNC组大鼠的阴茎勃起情况，验证动物模型的可靠性。

术后4周，于各组大鼠阴茎海绵体根部注射荧光金(荧光金粉剂4mg，加入100μL双蒸水配制成4％荧光金溶液，4℃冰箱保存。以10％水合氯醛按0.3ml/100g麻醉大鼠，麻醉满意后，取仰卧位，纵行切开大鼠阴茎皮肤，暴露阴茎海绵体根部，海绵体神经走行区域行多点缓慢、匀速注射，荧光金溶液单次注射量为1μl，随后碘伏消毒缝合伤口)，3天后取材(盆神经节、海绵体神经和阴茎)，用荧光显微镜观察盆神经节处荧光金标记的阳性神经元数目，用透射电镜观察海绵体神经形态结构，用实时荧光定量PCR和Western blot检测阴茎组织神经末梢nNOS mRNA和蛋白表达情况。

2、实验结果

术后4周时，各组大鼠行荧光金注射3天后观察盆神经节处荧光金标记的阳性神经元，结果如图7、图8所示，可以看出三种剂量的姜黄素缓释药膜组大鼠盆神经节处荧光金标记的阳性神经元数量均明显高于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组(P<0.05)，但是低于Sham组(P<0.05)；PLGA-PEG空白膜组和BCNC组之间大鼠盆神经节处荧光金标记的阳性神经元数量无明显统计学差异(P＞0.05)。此外，盆神经节处荧光金标记的阳性神经元数量随姜黄素剂量的增加而增加，中剂量姜黄素缓释药膜组和高剂姜黄素缓释药膜组数量明显高于低剂量姜黄素缓释药膜组，具有统计学差异(P<0.05)，但中剂量姜黄素缓释药膜组和高剂量姜黄素缓释药膜组的数量无统计学差异(P＞0.05)。

用透射电镜观察海绵体神经形态结构发现(图9、图10)，Sham组的海绵体神经内可见大量有髓神经纤维，其髓鞘板层结构规则完整，几乎无变性和崩解；姜黄素缓释药膜组可见大量有髓神经纤维和无髓鞘神经纤维，另外可见直径和厚度均较小的新生髓鞘；PLGA-PEG空白膜组和BCNC组可见大量的无髓鞘神经纤维，部分视野可见神经轴突消失、髓鞘崩解。此外，姜黄素缓释药膜组的有髓神经纤维数量明显高于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组，但少于Sham组(P<0.05)；BCNC组和PLGA-PEG空白膜组有髓神经纤维数量无明显统计学差异(P＞0.05)；不同剂量姜黄素缓释药膜组的有髓神经纤维数量随着姜黄素剂量的增加而增加。中剂量姜黄素缓释药膜和高剂量姜黄素缓释药膜的有髓神经纤维数量明显高于低剂量Cur缓释膜组，具有统计学差异(P<0.05)，但中剂量姜黄素缓释药膜组和高剂量姜黄素缓释药膜组的有髓神经纤维数量无明显统计学差异(P＞0.05)。

实时荧光定量PCR检测结果显示(图11)，BCNC组和PLGA-PEG空白膜组阴茎组织nNOS mRNA可见少量的表达；与BCNC组比较，各剂量的姜黄素缓释药膜组阴茎组织nNOSmRNA表达均明显升高(P＜0.05)；不同剂量姜黄素缓释药膜组阴茎组织nNOS mRNA表达量随着姜黄素剂量的增加而增加，但不同剂量姜黄素缓释药膜组组间nNOS mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)，证明本发明制得的姜黄素缓释药膜可促进海绵体神经末梢nNOS mRNA的表达，并存在一定程度的姜黄素剂量依赖性。

Western blot检测结果显示(图12)，BCNC组和PLGA-PEG空白膜组阴茎组织nNOS蛋白可见少量的表达；与BCNC组比较，姜黄素缓释药膜组阴茎组织nNOS蛋白表达量均明显升高(P＜0.05)；不同剂量姜黄素缓释药膜组阴茎组织nNOS蛋白表达量随着姜黄素剂量的增加而增加，但不同剂量姜黄素缓释药膜组之间nNOS蛋白表达量无统计学差异(P＞0.05)，同样证明本发明制得的姜黄素缓释药膜可促进海绵体神经末梢nNOS蛋白的表达，并存在一定程度的姜黄素浓度依赖性。

上述实验结果表明，本发明提供的姜黄素缓释药膜可有效促进大鼠海绵体神经损伤后的修复再生，恢复海绵体神经通路连续性，增加阴茎组织神经末梢nNOS mRNA和蛋白的表达。

实验例4：姜黄素缓释药膜促海绵体神经损伤大鼠阴茎康复的研究

1、实验方法

将36只SD大鼠随机分为6组(分组方式同实验例3)：Sham组，BCNC组，PLGA-PEG空白膜组，低剂量姜黄素缓释药膜组，中剂量姜黄素缓释药膜组，高剂量姜黄素缓释药膜组。每组6只。

双侧海绵体神经损伤模型的建立和验证：(同实验例2)。

术后4周，于各组大鼠阴茎海绵体根部注射荧光金，3天后取材(阴茎组织)。在取材前采用电刺激海绵体神经，记录海绵体内压(ICP)和平均动脉压(MAP)，评估阴茎勃起功能(如图13所示)。另外取阴茎组织做HE染色和Masson染色观察各组大鼠阴茎海绵体组织形态；采用免疫荧光染色法对各组大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌含量进行检测并比较；采用Western blot技术检测阴茎组织α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)和Collagen-Ⅰ(胶原蛋白Ⅰ型)表达情况。

2、实验结果

各组大鼠在荧光金注射后第3天，采用电刺激海绵体神经行ICP和MAP测定(ICP结果如图14所示)，结果显示Sham组、高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组、低剂量姜黄素缓释药膜组、PLGA-PEG空白膜组和BCNC组大鼠ICP/MAP分别为0.82±0.05、0.68±0.07、0.64±0.07、0.51±0.05、0.34±0.07、0.32±0.06。组间两两比较发现，Sham组、高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂姜黄素缓释药膜组、低剂量姜黄素缓释药膜组ICP/MAP值明显高于PLGA-PEG空白膜组和BCNC组，差异存在统计学意义(P＜0.05)；高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组、低剂量姜黄素缓释药膜组ICP/MAP值均低于Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；不同剂量姜黄素缓释药膜组ICP/MAP值随姜黄素剂量的增加而增大，中剂量和高剂量姜黄素缓释药膜组ICP/MAP值高于低剂量姜黄素缓释药膜组，差异存在统计学意义(P<0.05)，但中剂量和高剂量姜黄素缓释药膜组ICP/MAP值无统计学差异。PLGA-PEG空白膜组和BCNC组大鼠在电刺激海绵体神经时均无明显阴茎勃起反应，两组大鼠ICP/MAP值无统计学差异(P>0.05)。

阴茎组织HE染色结果示(图15)，BCNC组和PLGA-PEG空白膜组可见阴茎海绵体局部疏松结构消失，组织水肿、变性，透光度增强，胶原纤维变性、排列不规则，少量的炎细胞浸润，血管管腔狭窄或闭塞。Sham组与各姜黄素缓释药膜组海绵体血窦、小梁平滑肌及血管等结构清晰，海绵体表面呈疏松样结构，血窦形态清晰，呈裂隙状，窦壁光滑，部分血窦充血扩张，见较多红细胞，少量胶原纤维组织，排列较为整齐；未见明显的细胞坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生。

阴茎组织Masson染色显示(图16)，Sham组的阴茎海绵体平滑肌排列分布规则、完整及延续性好，高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组和低剂量姜黄素缓释药膜组稍次之，而BCNC组和PLGA-PEGA空白膜组平滑肌排列紊乱、稀少及出现断裂；Sham组、高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组、低剂量姜黄素缓释药膜组、PLGA-PEGA空白膜组、BCNC组平滑肌/胶原纤维的比值分别为：0.36±0.03，0.29±0.06，0.25±0.05，0.23±0.02，0.19±0.04，0.20±0.03；高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组和低剂量姜黄素缓释药膜组平滑肌/胶原纤维比值均高于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组(P＜0.05)，但是低于Sham组(P＜0.05)。高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组和低剂量姜黄素缓释药膜组平滑肌/胶原纤维比值随着姜黄素剂量的增加而增加，三组间比较无明显统计学差异(P>0.05)。

采用免疫荧光染色法对各组SD大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌含量进行检测并比较(图17)。结果显示，高剂量姜黄素缓释药膜组、中剂量姜黄素缓释药膜组和低剂量姜黄素缓释药膜组平滑肌含量均高于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组，但是低于Sham组，结果均存在统计学差异(P＜0.05)。不同剂量姜黄素缓释药膜组平滑肌含量随着姜黄素剂量的增加而增加，但组间比较结果无统计学差异(P>0.05)。

Western blot检测结果显示(图18)，姜黄素缓释药膜组大鼠阴茎组织中Collagen-Ⅰ蛋白表达量低于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组，但高于Sham组；其中不同剂姜黄素缓释药膜组的Collagen-Ⅰ蛋白表达量随姜黄素剂量的增加而增加，Collagen-Ⅰ蛋白表达量与姜黄素缓释药膜存在一定稍微剂量依赖性，但不同剂量姜黄素缓释药膜组间比较无统计学差异(P>0.05)。另外，姜黄素缓释药膜组大鼠阴茎组织中α-SMA蛋白表达量高于BCNC组和PLGA-PEG空白膜组，但低于Sham组，不同剂量姜黄素缓释药膜组，α-SMA蛋白表达量随姜黄素剂量的增加而增加，α-SMA蛋白表达量与姜黄素缓释药膜存在一定剂量依赖性，但不同剂量姜黄素缓释药膜组间比较无统计学差异(P>0.05)。

上述实验结果表明，本发明提供的姜黄素缓释药膜促进海绵体神经损伤修复后，可以改善海绵体神经损伤大鼠的阴茎勃起功能，同时降低阴茎组织纤维化程度，能够有效促进海绵体神经损伤后的阴茎康复。

综上，本发明提供了姜黄素或其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍，特别是治疗海绵体神经损伤导致的神经性阴茎勃起功能障碍的药物中的新用途。实验证明姜黄素及姜黄素缓释药膜能够可通过上调GAP-43和MAP-2的表达来促进神经轴突的生长，通过上调Oct-6和Krox-20的表达来促进施万细胞合成分泌髓鞘相关蛋白，促进神经轴突髓鞘的形成。同时，姜黄素及姜黄素缓释药膜还能够有效促进大鼠海绵体神经损伤后的修复再生，恢复海绵体神经通路连续性，增加阴茎组织神经末梢nNOS mRNA和蛋白的表达；其还可以进一步改善海绵体神经损伤大鼠的阴茎勃起功能，同时降低阴茎组织纤维化程度，有效促进海绵体神经损伤后的阴茎康复。所以，姜黄素及其载药体系在制备治疗阴茎勃起功能障碍，特别是治疗海绵体神经损伤导致的神经性阴茎勃起功能障碍的药物中具有很好的应用前景。