四种具有抗癌活性的烈味脚骨脆二萜的制备方法和用途

摘要

本发明涉及四种具有抗癌活性的烈味脚骨脆二萜的制备方法和用途，所述的新化合物1‑4，具有如下结构。本发明的四个新化合物对于人肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性，可用于抗癌药物的开发和应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及烈味脚骨脆中新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的发生发展离不开癌细胞的增殖，基于此，目前临床上用于抗癌的药物大多是通过干扰肿瘤细胞增殖进而诱导细胞凋亡来发挥抗癌功效的。

肿瘤细胞可从增殖衰老机制中逃离, 从而获得无限增殖的能力。细胞增殖依赖于细胞的分裂，细胞分裂需要进行完整的周期循环，其中包括分裂间期和分裂期，分裂期又包括G1期、S期和G2期，药物作用于细胞周期的任何一个时期都会中断细胞的分裂，打破其永生的状态，通过诱导细胞凋亡来发挥抗癌的作用。

植物作为丰富的天然产物资源库为我们提供了大量的先导化合物，为了寻找新的高效抗肿瘤化合物，我们建立了人肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系HepG2细胞筛选模型。在细胞指数生长期加入不同浓度的受试药物，处理一定时间后加入MTT测定光密度值来评判化合物细胞毒性，从而筛选出有较强细胞毒活性的化合物并确定对其最敏感的细胞株，进一步通过流式细胞术分析该化合物对最敏感细胞株的诱导凋亡及周期阻滞作用，最终发现可能的抗癌先导化合物，为其进一步开发提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供烈味脚骨脆中4个新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和应用。

本发明提供的新化合物1-4属于克罗烷型二萜，其结构如图1所示。

本发明还提供了所述新化合物1-4的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）烈味脚骨脆（

（2）步骤（1）所得粗提物溶解于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，回收溶剂得到萃取物；

（3）步骤（2）所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱；

（4）上述步骤（3）中所得流份经MPLC（中压液相色谱, 色谱填料为ODS）分离，以甲醇/水，或乙腈/水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

（5）上述步骤（4）中所得流份经HPLC-RI（高效液相-示差检测）色谱分离，以甲醇/水为流动相洗脱，或以乙腈/水为流动相梯度洗脱，得到化合物1-4。

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，所述烈味脚骨脆为大风子科（Flacourtiaceae）脚骨脆属烈味脚骨脆（

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，步骤（1）所述的提取方法为加热回流提取或超声提取，所用溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的至少一种，药材：溶剂的重量体积比为1: 5~1: 15。

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，步骤（2）所述的萃取方法，所用有机溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一种，水溶液和有机溶剂体积比1: 1~1: 2。

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，步骤（3）中，洗脱溶剂为石油醚/丙酮或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，其比例为100: 2~100: 30。

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，步骤（4）中，所述甲醇/水混合溶剂的比例为6: 4~9: 1，优选7: 3~8: 2，或乙腈/水混合溶剂比例为6: 4~8: 1，优选7: 3~8: 2。

本发明提供的新化合物1-4的制备方法，步骤（5）中所述流动相甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂的体积比例为6: 4~9: 1，优选7: 3~9: 1。

本发明提供的四个新的萜类化合物对人肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性。用于制备抗癌药物或抗癌药物的先导化合物。

附图说明

图1 本发明化合物1-4的结构式；

图2 本发明化合物1的

图3 本发明化合物1的

图4 本发明化物1的DEPT135谱；

图5 本发明化合物1的HMQC谱；

图6 本发明化合物1的HMBC谱；

图7 本发明化合物1的

图8 本发明化合物2的

图9 本发明化合物2的

图10 本发明化合物2的HMQC谱；

图11 本发明化合物2的HMBC谱；

图12 本发明化合物3的

图13 本发明化合物3的

图14 本发明化合物3的HMQC谱；

图15 本发明化合物3的HMBC谱；

图16 本发明化合物4的

图17 本发明化合物4的

图18 本发明化合物4的HMQC谱；

图19 本发明化合物4的HMBC谱；

图20 本发明化合物1-4的HMBC与

图21 流式细胞仪检测本发明化合物 1 诱导 A549 细胞的凋亡；

图22 流式细胞仪检测本发明化合物 1 对A549细胞周期的影响。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

（1）烈味脚骨脆茎叶14.0 kg用甲醇提取3次（用量3 × 140 L），减压回收提取液得粗提物；

（2）步骤（1）所得甲醇提取物，加水制成混悬液，分别用乙酸乙酯和石油醚萃取，得乙酸乙酯和石油醚萃取物；

（3）步骤（2）石油醚和乙酸乙酯萃取物分别经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚: 丙酮100: 0, 100: 2, 100: 4, 100: 6, 100: 8, 100: 11, 100: 16, 100: 23, 100: 30洗脱；

（3）上述步骤（2）中所得的石油醚: 丙酮100: 2~100: 30流份经中压液相色谱（MPLC）分离，以甲醇/水6: 4~9: 1为流动相梯度洗脱；

（4）上述步骤（3）中所得甲醇/水6: 4~9: 1流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水60: 40~90:10为流动相洗脱得到新化合物1（收率0.002%），2（收率0.001%），3（收率0.001%），4（收率0.001%）。

根据化合物1-4的理化性质和波谱数据鉴定了其结构（化合物1-4的结构见图1；化合物1-4的波谱图见图2-图19）。

化合物1的结构鉴定数据如下：

无色油状; [

化合物2的结构鉴定数据如下：

无色油状; [

化合物3的结构鉴定数据如下：

无色油状; [

化合物4的结构鉴定数据如下：

无色油状; [

表1 化合物1-4的

表2 化合物1-4的

实施例2

（1）烈味脚骨脆茎叶10.0 kg用乙醇提取3次（用量3 × 30 L），减压回收提取液，得粗提物；

（2）步骤（1）所得乙醇提取物，加水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；

（3）步骤（2）经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚: 丙酮100: 4, 100: 6, 100: 8,100: 11, 100: 16, 100: 23, 100: 30洗脱；

（3）上述步骤（2）中所得的石油醚: 乙酸乙酯100: 2~100: 30流份经中压液相色谱（MPLC）分离，以甲醇/水7: 3~9: 1为流动相梯度洗脱；

（4）上述步骤（3）中所得甲醇/水（8: 2）流份经HPLC-RI分离，以甲醇/水70: 30~90: 10为流动相洗脱得到新化合物1（收率0.002%），2（收率0.002%），3（收率0.001%），4（收率0.001%）。

化合物1-4的结构鉴定方法见实施例1。

实施例3

（1）烈味脚骨脆茎叶10.0 kg用丙酮提取3次（用量3 × 30 L），减压回收提取液，得粗提物；

（2）步骤（1）所得丙酮提取物，加水制成混悬液，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷萃取物；

（3）步骤（2）经硅胶柱色谱法分离，依次以石油醚: 丙酮100: 4, 100: 6, 100: 8,100: 11, 100: 16, 100: 23, 100: 30洗脱；

（4）上述步骤（3）中所得的石油醚: 丙酮100: 2~100: 30流份经中压液相色谱（MPLC）分离，以甲醇/水7: 3~9: 1为流动相梯度洗脱；

（5）上述步骤（4）中所得甲醇/水（8: 2）流份经HPLC-RI分离，以乙腈/水70: 30~90: 10为流动相洗脱得到新化合物1（收率0.002%），2（收率0.001%），3（收率0.001%），4（收率0.001%）。

化合物1-4的结构鉴定方法见实施例1。

实施例4

烈味脚骨脆中新化合物1-4的细胞毒活性测试。

（1）实验原理

四甲基偶氮唑盐 （MTT），是一种可以接受氢离子的黄色染料，可结合到活细胞线粒体的呼吸链中，被琥珀酸脱氢酶和细胞色素还原，生成兰紫色的Formazan结晶。Formazan结晶生成量仅与活细胞数目成正相关，死细胞中相关酶发生降解，不能将MTT还原。生成的Formazan 结晶可被二甲基亚砜（DMSO）溶解，利用酶标仪在490 nm处测溶液的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反映出化合物对细胞增殖的影响。

（2）实验方法

① 肿瘤细胞的培养

以1640培养基（人肺癌细胞A549）或DMEM高糖培养基（人肝癌细胞HepG2）作为基础配制成内含10%胎牛血清及1%双抗（青霉素：链霉素=1:1）的细胞培养液，细胞于37℃，5% CO

② 化合物的配制方法

待测化合物用DMSO溶解，配成母液，浓度为30 mM，储存于-20℃。临用时用培养液将其进行稀释，依次稀释为60 μM、30 μM、6 μM，或依据情况稀释为更低的浓度。

③ 待测化合物的细胞毒活性测试

取指数生长期的细胞，调细胞密度为1×10

④ IC

将各剂量和抑制率参数用非线性回归拟合计算化合物抑制肿瘤细胞增殖的IC

（3）实验结果：化合物1-4的细胞毒活性IC

表3 新化合物1-4细胞毒活性IC

实施例5

烈味脚骨脆中新化合物1诱导A549细胞凋亡实验。

（1）实验原理

Annexin V可以选择性地结合磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)，磷脂酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，在细胞凋亡早期，细胞膜内侧的PS会发生外翻，PS暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。用带有绿色荧光探针FITC标记的Annexin V标记细胞，就可以通过流式细胞仪直接检测PS外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶 (PropidiumIodide, 简称PI) 可以穿过坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞膜结构，进入核内与DNA结合，用流式细胞仪检测呈现红色荧光。通过比较不同处理组凋亡细胞占比就可反映药物诱导细胞凋亡作用强度。

（2）实验方法

取指数生长期细胞，调整细胞密度为1×10

（3）实验结果：化合物1诱导细胞凋亡的活性如图21所示。

实施例6

烈味脚骨脆中新化合物1阻滞细胞周期实验。

（1）实验原理

碘化丙啶 (Propidium，PI) 和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪检测，然后根据DNA含量的分布情况，进行细胞周期分析。PI染色后，若G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双倍DNA的G2/M期细胞的荧光强度理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度在1-2之间。

（2）实验方法

取指数生长期细胞，调整细胞密度为1×10

（3）实验结果：化合物阻滞细胞周期结果如图22所示。

结果表明，实施例中所制备得到的新化合物1对A549细胞具有较强细胞毒性，化合物1是通过将A549细胞周期阻滞在G0/G1期来诱导凋亡从而发挥细胞毒性的作用。