一种注射剂、注射剂的制备方法及其在牙髓再生中的应用

摘要

本公开涉及生物材料与临床医学技术领域，提供了一种注射剂、注射剂的制备方法及其在牙髓再生中的应用。该注射剂包括作为分散相的复合制剂和作为连续相的分散液。复合制剂包括药物、微载体和干细胞，药物被包裹于微载体内部，干细胞贴附于微载体表面。分散液是选自平衡盐溶液、无血清培养基、可注射水凝胶所组成的群组中的至少一种。该注射剂主要应用于临床功能性牙髓组织再生，实现患牙根管内牙髓再生。利用本公开，能够实现根管内神经化及血管化的牙髓样组织形成，恢复牙髓组织的营养、防御、感觉功能，提高患牙使用寿命。

说明书

技术领域

本公开涉及生物材料与临床医学技术领域，具体涉及一种在牙髓再生中应用的注射剂、该注射剂的制备方法及该注射剂在牙髓再生中的应用，以实现患牙在根管内牙髓再生。

背景技术

牙齿遭受到龋病、牙周病或外伤等因素时，牙髓可能发生不可逆性炎症或坏死。临床上，对于发生牙髓坏死或根尖周炎的年轻恒牙，主要采用根尖诱导成形术或根尖屏障术。恒牙牙髓坏死采用根管治疗术去除根管中坏死感染组织，采用药物充填封闭根管，消除炎症。但根尖诱导形成术、根尖屏障术及根管治疗均不能实现根管内功能性牙髓组织形成，牙根不能继续发育，由于根管壁较薄，牙齿受力后存在折裂风险，影响牙齿的使用寿命。

2001年，牙髓再血管化引入牙髓病学中，2004年Banchs和Trope正式提出牙髓血管再生的概念。治疗主要通过充分的根管消毒，清除根管内坏死感染牙髓组织，然后刺破根尖引血，在根管内形成血凝块后进行良好的冠方封闭，以促进根管内新的类牙髓样组织的形成，促使牙根的继续发育。但是，研究发现根管内的新生组织为牙骨质、牙周膜、牙槽骨的混合物，与正常的牙髓组织存在较大差别。

2007年，再生牙髓病学的概念提出，再生牙髓病学被定义为以生物学为基础，旨在修复受损的牙齿组织，包括牙本质、牙根及牙髓-牙本质复合体。其主要包括三个主要因素：牙源性干细胞、支架和药物。其中，骨髓间充质干细胞和牙源性干细胞来源易得，具有较强的增殖能力和成牙向分化能力，体内植入后具有成牙髓组织的潜能；可注射性支架材料可作为干细胞及药物的载体，具有较强的诱导组织再生的潜能，并可采取多种工艺制备，可经注射器注入根管内，临床操作便捷；药物可优化干细胞生物学行为，并在可注射载体中实现缓释，可长期维持体内作用效果，最终实现功能化牙髓组织再生。

发明内容

牙齿在经受龋病、外伤或畸形中央尖导致的牙髓坏死及根尖周炎病变后，经临床传统治疗，如根尖诱导成形术及牙髓血运重建术，仍存在需二次根管治疗的缺点，牙齿因缺乏牙髓的营养供给及感觉防御功能，存在牙齿变色，受力折裂等临床并发症，牙齿的使用寿命有限。有鉴于此，本公开的主要目的在于提供一种注射剂、注射剂的制备方法及注射剂在牙髓再生中的应用。

为了达到上述目的，本公开采用的技术解决方案如下：

根据本公开的一个方面，提供了一种在牙髓再生中应用的注射剂，包括：作为分散相的复合制剂；以及作为连续相的分散液。

根据本公开的实施例，所述复合制剂包括药物、微载体和干细胞，所述药物被包裹于所述微载体内部，所述干细胞贴附于所述微载体表面。

根据本公开的实施例，所述药物是蛋白类生长因子或小分子药物，用于实现干细胞成牙向分化及成血管分化，促进再生血管化以及神经化的牙髓样组织。

根据本公开的实施例，所述蛋白类生长因子是选自基质细胞衍生因子(SDF)、牙釉蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-4(IL-4)或转化生长因子-β(TGF-β)所组成的群组中的至少一种；所述小分子药物是选自辛伐他汀、二甲双胍、瘦素或地塞米松所组成的群组中的至少一种。

根据本公开的实施例，所述药物直接负载在所述微载体内部，或者所述药物通过先使用纳米粒子负载后再载入所述微载体内部，以实现缓释。

根据本公开的实施例，所述纳米粒子是选自多孔硅、介孔二氧化硅、纳米黏土、碳纳米管、介孔生物活性玻璃、纳米金属氧化物或聚酯类纳米粒子所组成的群组中的至少一种。

根据本公开的实施例，所述微载体作为组织工程支架，用于负载干细胞和药物，注射入根管内后为根管内提供足量细胞支持，促进功能化牙髓样组织形成。

根据本公开的实施例，所述微载体是选自聚酯微球、水凝胶微球或晶胶微球所组成的群组中的至少一种；所述微载体是由天然聚合物及其衍生物或可生物降解聚酯中的一种或多种通过乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制得；所述微载体的直径为10至999微米。

根据本公开的实施例，所述天然聚合物及其衍生物是选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化海藻酸、壳聚糖、甲基丙烯酸酐化壳聚糖、透明质酸和甲基丙烯酸酐化透明质酸所组成的群组中的至少一种；所述可生物降解聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯，以及聚丙交酯、聚乙交酯和聚己内酯三者之中至少两者的共聚物中的一种。

根据本公开的实施例，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙源性干细胞，用于为根管内牙髓组织形成提供细胞来源。

根据本公开的实施例，所述牙源性干细胞是选自人牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞或根尖牙乳头干细胞所组成的群组中的至少一种。

根据本公开的实施例，所述分散液是选自平衡盐溶液、无血清培养基、可注射水凝胶所组成的群组中的至少一种。

根据本公开的另一方面，提供了一种注射剂的制备方法，包括：制备作为分散相的复合制剂；制备作为连续相的分散液；以及将复合制剂和分散液混合均匀，形成注射剂。

根据本公开的实施例，所述制备作为分散相的复合制剂的步骤中，所述复合制剂中的微载体是由天然聚合物及其衍生物或可生物降解聚酯中的一种或多种通过乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制得。

根据本公开的再一方面，还提供了所述的注射剂在牙髓再生中的应用，用于临床功能性牙髓组织再生。

根据本公开的实施例，本公开提供的在牙髓再生中应用的注射剂，包括作为分散相的复合制剂和作为连续相的分散液，复合制剂包括药物、微载体和干细胞，药物被包裹于微载体内部，干细胞贴附于微载体表面。药物用于实现干细胞成牙向分化及成血管分化，促进再生血管化以及神经化的牙髓样组织。微载体用于负载干细胞和药物，注射入根管内后为根管内提供足量细胞支持，促进功能化牙髓样组织形成。干细胞用于为根管内牙髓组织形成提供细胞来源。利用本公开，能够实现根管内神经化及血管化的牙髓样组织形成，恢复牙髓组织的营养、防御、感觉功能，提高患牙使用寿命。

附图说明

通过以下参照附图对本公开实施例的描述，本公开的上述以及其他目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1是依照本公开实施例的制备在牙髓再生中应用的注射剂的方法流程图；

图2为依照本公开实施例1中制备的可注射辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体的SMS-M扫描电子显微镜照片；

图3为依照本公开实施例4中使用实时定量聚合酶链式反应和免疫荧光染色对牙本质涎磷蛋白DSPP进行定量分析结果和染色的激光共聚焦显微镜照片；

图4为依照本公开实施例5中使用实时定量聚合酶链式反应测定血管内皮生长因子及受体表达的结果图；

图5为依照本公开实施例6中体内牙髓再生组织照片。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。

在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。

在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

本公开的实施例提供了一种注射剂、注射剂的制备方法及注射剂在牙髓再生中的应用。其中，一种在牙髓再生中应用的注射剂，包括：作为分散相的复合制剂；以及作为连续相的分散液。

在本公开的实施例中，复合制剂包括药物、微载体和干细胞，药物被包裹于微载体内部，干细胞贴附于微载体表面。

其中，药物是蛋白类生长因子或小分子药物，用于实现干细胞扩增、成牙向分化及成血管分化，促进再生血管化以及神经化的牙髓样组织。蛋白类生长因子是选自基质细胞衍生因子(SDF)、牙釉蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-4(IL-4)或转化生长因子-β(TGF-β)所组成的群组中的至少一种。小分子药物是选自辛伐他汀、二甲双胍、瘦素或地塞米松所组成的群组中的至少一种。

在本公开的实施例中，药物直接负载在所述微载体内部，或者药物通过先使用纳米粒子负载后再载入所述微载体内部，以实现缓释。纳米粒子是选自多孔硅、介孔二氧化硅、纳米黏土、碳纳米管、介孔生物活性玻璃、纳米金属氧化物或聚酯类纳米粒子所组成的群组中的至少一种。

在本公开的实施例中，缓释药物能够改善干细胞的增殖潜能、成牙向分化潜能、成血管潜能、成神经潜能。

在本公开的实施例中，微载体作为组织工程支架，用于负载干细胞和药物，注射入根管内后为根管内提供足量细胞支持，促进功能化牙髓样组织形成。微载体是选自聚酯微球、水凝胶微球或晶胶微球所组成的群组中的至少一种。微载体是由天然聚合物及其衍生物或可生物降解聚酯中的一种或多种通过乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制得。微载体的直径为10至999微米。天然聚合物及其衍生物是选自明胶、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化海藻酸、壳聚糖、甲基丙烯酸酐化壳聚糖、透明质酸和甲基丙烯酸酐化透明质酸所组成的群组中的至少一种。可生物降解聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯，以及聚丙交酯、聚乙交酯和聚己内酯三者之中至少两者的共聚物中的一种。

在本公开的实施例中，干细胞为骨髓间充质干细胞或牙源性干细胞，用于为根管内牙髓组织形成提供细胞来源。其中，牙源性干细胞是选自人牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞或根尖牙乳头干细胞所组成的群组中的至少一种。干细胞能够在微载体表面上实现大量扩增。

在本公开的实施例中，分散液是选自平衡盐溶液、无血清培养基、可注射水凝胶所组成的群组中的至少一种，复合制剂能够分散在平衡盐溶液、无血清培养基、可注射水凝胶中，然后通过注射器注射入根管内。

基于上述在牙髓再生中应用的注射剂，图1是依照本公开实施例的制备在牙髓再生中应用的注射剂的方法流程图，该方法包括：

步骤1：制备作为分散相的复合制剂；

步骤2：制备作为连续相的分散液；

步骤3：将复合制剂和分散液混合均匀，形成注射剂。

在本公开的实施例中，步骤1中所述复合制剂包括药物、微载体和干细胞，药物被包裹于微载体内部，干细胞贴附于微载体表面。其中，微载体是由天然聚合物及其衍生物或可生物降解聚酯中的一种或多种通过乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制得。

基于上述在牙髓再生中应用的注射剂及其制备方法，本公开还提供了一种注射剂在牙髓再生中的应用，用于临床功能性牙髓组织再生，以实现患牙根管内牙髓再生。

在本公开的实施例中，本公开提供的注射剂主要经过根管消毒、注射剂应用、定期复查临床诊疗程序，实现临床功能性牙髓再生，具体为临床应用步骤如下：

(1)根管消毒：按需行局部麻醉，橡皮障隔湿下进入根管，1％-1.5％次氯酸钠荡洗浸泡根管，避免药物溢出根尖孔。20ml生理盐水放于距根尖1mm处冲洗5min，消毒棉捻擦干根管。三联抗生素糊剂或氢氧化钙糊剂导入根管，上方覆盖无菌小棉球，氧化锌水门汀+GIC暂封窝洞。

(2)根管消毒1-4w后：用不含肾上腺素的局麻药进行麻醉，橡皮障下再次打开髓腔，20ml 17％EDTA冲洗根管，消毒棉捻擦干根管。根据术前X线片确定的牙根长度，用无菌40#根管锉超出根尖3-4mm刺破根尖组织引血，将注射剂经1ml/5ml注射器，迅速注入根管内，为盖髓剂预留出3-4mm空间，在其上方轻柔放置MTA材料2-3mm，矿化三氧化物聚合物(MTA)放置不应超过在釉质牙骨质下方1-2mm MTA上方放置湿棉球，用氧化锌水门汀+玻璃离子暂封。

(3)1天后，去除上方的暂封材料，检查MTA完全硬固，用玻璃离子垫底，常规进行树脂的充填修复。

(4)每3-6个月定期复查，拍摄放射线片评价牙根发育状态和根尖病变恢复情况。

通过采用上述临床应用步骤，本公开提供的这种在牙髓再生中应用的注射剂，能够用于临床功能性牙髓组织再生，实现患牙根管内牙髓再生。

实施例1：可注射辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体的制备

(1)将1克GelMA溶于20毫升去离子水中，加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到溶液A(水相)；在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80，混合均匀，得到溶液B(外油相)。分别将辛伐他汀(SIM)(0.1毫克、1毫克和10毫克)、100毫克脂肪族聚酯PLGA和50毫克油溶性表面活性剂Span 80溶于2毫升二氯甲烷溶液，得到药物溶液C(内油相)。

(2)将溶液C加入溶液A中，冰水浴环境，以200W的功率超声3min，得到PLGA(SIM)/GelMA的水包油初乳液D。

(3)将水包油初乳液D加入溶液B中，冰水浴环境，300rpm机械搅拌10分钟得到PLGA(SIM)/GelMA/油的油包水包油复乳液。

(4)将步骤(3)所得油包水包油复乳液依次放入-20℃中30min、-80℃中30min和液氮中10min程序降温，365nm紫外光交联得到负载药物GelMA晶胶微球。

(5)离心收集负载药物GelMA晶胶微球，丙酮洗涤3次后，去离子水洗3次，冷冻干燥，得到所述可注射负载药物GelMA晶胶微球细胞载体。图2为依照本公开实施例1中制备的可注射辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体的SMS-M扫描电子显微镜照片，其中负载0.1毫克辛伐他汀的GelMA晶胶微球记为SMS-L，负载1毫克辛伐他汀的GelMA晶胶微球记为SMS-M，负载10毫克辛伐他汀的GelMA晶胶微球记为SMS-H。

实施例2：可注射生长因子缓释GelMA晶胶微球微载体的制备

(1)将1克GelMA溶于20毫升去离子水中，加入0.02克光引发剂L2959、50毫克水溶性表面活性剂Tween 60和10微克VEGF混合均匀后得到溶液A(水相)；在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80，混合均匀，得到溶液B(油相)。

(2)将溶液A加入溶液B中，冰水浴环境，300rpm机械搅拌10分钟得到GelMA/油的油包水乳液。

(3)将步骤(2)所得油包水乳液依次放入-20℃中30min、-80℃中30min和液氮中10min程序降温，365nm紫外光交联得到负载生长因子GelMA品胶微球。

(4)离心收集负载生长因子GelMA晶胶微球，丙酮洗涤3次后，去离子水洗3次，冷冻干燥，得到所述可注射负载生长因子GelMA晶胶微球细胞载体CMS-VEGF。

实施例3：可注射生长因子缓释纳米粘土复合PLGA微球微载体的制备

(1)将1克丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA5050，丙交酯/乙交酯摩尔比50∶50，分子量5万)溶于20毫升二氯甲烷溶液，得到浓度为5wt.％的溶液A。

(2)称取20毫克纳米粘土(锂皂石，Laponite)和10微克VEGF溶于2毫升去离子水中，得到溶液B。

(2)向溶液A中加入0.02毫升Span 80，以及2毫升溶液B，在8000rpm下高速搅拌5分钟，得到分散液C。

(3)将0.2克Tween 60，2克聚乙烯醇(PVA 1788)溶于200毫升去离子水中得到溶液D，在300rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的分散液C，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4小时，进行二氯甲烷溶剂的挥发。

(4)停止搅拌，在4000rpm下离心10分钟收集硬化成型的微球，经去离子水洗涤3次后，冷冻干燥24小时，得到可注射生长因子缓释纳米复合PLGA微球微载体P-LAP-VEGF。

实施例4：辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体促进脱落乳牙牙髓干细胞成牙向分化

选取实施例1制备的辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体SMS-L、SMS-M和SMS-H，各取3毫克，经消毒后置于细胞培养24孔板中，选取脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)作为种子细胞，每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。于1天后更换诱导培养基，每隔2天更换一次诱导培养基，在第7天将培养基全部吸出，平衡盐溶液清洗3遍后，分别使用实时定量聚合酶链式反应和免疫荧光染色对牙本质涎磷蛋白DSPP进行染色。图3为依照本公开实施例4中使用实时定量聚合酶链式反应和免疫荧光染色对牙本质涎磷蛋白DSPP进行定量分析结果和染色的激光共聚焦显微镜照片，从图3所示的照片结果显示，SHEDs在SMS中DSPP表达增高。

实施例5：辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体促进脱落乳牙牙髓干细胞成血管向分化

选取实施例1制备的辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体SMS-L、SMS-M和SMS-H，各取3毫克，经消毒后置于细胞培养24孔板中，选取脱落乳牙牙髓干细胞SHEDs作为种子细胞，每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。每隔2天更换一次诱导培养基，在第7天将培养基全部吸出，平衡盐溶液清洗3遍后，分别使用实时定量聚合酶链式反应测定血管内皮生长因子及受体表达。图4为依照本公开实施例5中使用实时定量聚合酶链式反应测定血管内皮生长因子及受体表达的结果图。从图4所示的结果显示，SHEDs在SMS中VEGF及VEGF-R2表达增高。

实施例6：辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球细胞载体SMS负载脱落乳牙牙髓干细胞体内注射的应用

选取实施例1制备的辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球微载体SMS-M，取3毫克，置于24孔板中，于每孔滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)，体外贴附1小时后，混合形成注射剂，使用1ml注射器吸取注射剂，注射入离体牙根管中，并植入裸鼠皮下。裸鼠饲养三个月后安乐死，取背部移植离体牙，通过苏木素-伊红染色及免疫组织化学染色验证再生组织性质。图5示出了依照本公开实施例6中体内牙髓再生组织照片。

实施例7：辛伐他汀缓释GelMA晶胶微球细胞载体SMS负载脱落乳牙牙髓干细胞临床应用

选取实施例6混合的注射剂，放置于常温待用。发生牙髓坏死或根尖周炎患者患牙经过根管消毒4周后，用不含肾上腺素的局麻药进行麻醉，橡皮障下再次打开髓腔，20ml17％EDTA冲洗根管，消毒棉捻擦干根管。根据术前X线片确定的牙根长度，用无菌40#根管锉超出根尖3-4mm刺破根尖组织引血，将注射剂经1ml/5ml注射器，迅速注入根管内，为盖髓剂预留出3-4mm空间，在其上方轻柔放置MTA材料2-3mm，矿化三氧化物聚合物(MTA)放置不应超过在釉质牙骨质下方1-2mm MTA上方放置湿棉球，用氧化锌水门汀+玻璃离子暂封。1天后，去除上方的暂封材料，检查MTA完全硬固，用玻璃离子垫底，常规进行树脂的充填修复。每3-6个月定期复查，拍摄放射线片评价牙根发育状态和根尖病变恢复情况。

至此，已经结合附图对本公开进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本公开有了清楚的认识。

需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。

当然，根据实际需要，本公开还可以包含其他的部分，由于同本公开的创新之处无关，此处不再赘述。

类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本公开的示例性实施例的描述中，本公开的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本公开要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，公开方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本公开的单独实施例。

此外，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。说明书中示例的各个实施例中的技术特征在无冲突的前提下可以进行自由组合形成新的方案，另外每个权利要求可以单独作为一个实施例或者各个权利要求中的技术特征可以进行组合作为新的实施例，且在附图中，实施例的形状或是厚度可扩大，并以简化或是方便标示。再者，附图中未绘示或描述的元件或实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。

除非存在技术障碍或矛盾，本公开的上述各种实施方式可以自由组合以形成另外的实施例，这些另外的实施例均在本公开的保护范围中。

虽然结合附图对本公开进行了说明，但是附图中公开的实施例旨在对本公开优选实施方式进行示例性说明，而不能理解为对本公开的一种限制。附图中的尺寸比例仅仅是示意性的，并不能理解为对本公开的限制。

虽然本公开总体构思的一些实施例已被显示和说明，本领域普通技术人员将理解，在不背离本总体公开构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本公开的范围以权利要求和它们的等同物限定。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。