含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方法和该注射剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用

摘要

本发明公开了一种含有硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐的注射剂及其制备方法和该注射剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用，所述注射剂由注射液和专用溶媒组成，临用时将所述注射液和所述专用溶媒液配对使用，所述注射液含有硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐，盐酸利多卡因和适量盐酸；所述专用溶媒为由碱性溶媒和注射用水组成。本发明的制剂稳定性更好、更高的有效性和安全性。另外，本发明的制备方法具有更好的稳定性和重现性，特别适合大批量扩大生产；本发明的制备方法更加简便，更利于操作和质量安全等方面的控制；本发明的制备方法很好的控制了制剂中有效成分的稳定性，有效减少降解，并控制有关杂质、金属离子等引入。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体地，涉及一种含有硫酸氨基葡萄糖的注 射剂及其制备方法和该注射剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

背景技术

氨基葡聚糖是来源于甲壳素的一种天然糖类，为软骨基质中的主要成 份，通过改变其侧链结构，在关节软骨中更易与水结合，保持关节腔润滑和 缓冲压力的作用，对受损的软骨细胞具有一定的保护作用，可以人工合成应 用，现在常用的有氨基葡萄糖，主要有盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖及 硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐或氯化钾复盐等。氨基葡萄糖是组成聚氨基葡萄 糖的最小单位之一，它和糖醛酸组成了聚氨基葡萄糖，包括硫酸软骨素、硫 酸角质素、硫酸皮肤素以及透明质酸。

抗炎类药物仅可以改善骨性关节炎的症状，而氨基葡聚糖还可控制症状 发展，有利于软骨的修复。在美国氨基葡聚糖和硫酸软骨素的制剂己添加至 食品中，具有非常高的安全信度。口服该类药物即可达到治疗目的，对于一 些伴有循环系统疾病、肝肾功能差、肺部疾病、糖尿病的患者，同样具有安 全性，对于服用添加镁、锌、硒等金属元素的制剂，应注意这些金属电解后 产生的对心血管的抑制作用。每日口服剂量达到1500mg即可达到治疗效果， 对于肥胖或长期口服利尿剂的患者还要追加剂量至2000～2500mg，实验中 证实服用4～6周后才可达到治疗效果，因此应坚持服用至少1个月。长期 服用后的副反应较小，也较温和。

CN102961389B中公开了一种含有硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐以及盐酸 利多卡因的注射液及其制备方法和检测方法，但是该注射液制剂在长期测试 中发现稳定性欠佳，长期保存有效成分会发生部分降解，而这些降解物质不 仅影响药物的疗效，并相应带来各种毒副作用，进而影响注射液的安全性和 有效性。另外，该注射液的制备方法必须经过长时间高温灭菌操作，进一步 加快了有效成分的氧化、降解，影响注射液的安全性和有效性，并且过程繁 琐，条件限制严格，稳定性和重现性较差，不适合大批量扩大生产。

因此，本领域亟需开发一种稳定性好、安全性和有效性高的含有硫酸氨 基葡萄糖的注射液，以及稳定性和重现性好并适合大批量生产的制备方法。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有的含有硫酸氨基葡萄糖的注射液稳定 性差的缺陷，提供一种含有硫酸氨基葡萄糖的注射液，该注射液具有更好的 稳定性，更高的安全性和有效性。

本发明的目的之二在于克服现有的制备含有硫酸氨基葡萄糖的注射液 的方法过程繁琐、稳定性和重现性较差的缺陷，提供一种制备含有硫酸氨基 葡萄糖的注射液的方法，该制备方法具有更简便的操作，同时具有更好的稳 定性和重现性，特别适合大批量生产。

本发明的目的之三是提供一种上述含有硫酸氨基葡萄糖的注射液在制 备治疗骨性关节炎药物中的应用。

基于现有技术，本发明的发明人通过大量研究发现，通过控制制备过程 的pH值、温度以及活性炭用量等能够控制含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂更 好的稳定性，并且通过优化制备条件实现制备过程的简化，在提供稳定性更 好、有效性和安全性更高的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂的同时，使得该制 备方法具有更好的稳定性和重现性。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种含有硫酸氨基葡萄糖氯化 钠复盐的注射剂，所述注射剂由注射液和专用溶媒组成，临用时将所述注射 液和所述专用溶媒液配对使用，其中，1)所述注射液由以下组分组成并加 注射用水至2000ml，制成1000支：

硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐，以硫酸氨基葡萄糖计400g，

盐酸利多卡因10g，

盐酸适量；

2)所述专用溶媒为0.5-10ml，其组成为碱性溶媒和注射用水，所述碱 性溶媒为二乙醇胺，三乙醇胺或乙二胺；

所述注射液装入棕色安瓿，所述专用溶媒装入无色安瓿。

另一方面，本发明还提供一种制备上述注射剂的方法，其中，所述制备 方法包括：在温度为20-40℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸至 pH为1.5-2.1，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加 入盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.05-0.08％的活性炭， 搅拌10-15min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照 2ml/支灌封。

优选情况下，所述注射液的制备方法包括：在温度为25-35℃的条件下， 取80％水量注射用水，加入盐酸至pH为1.6-1.8，加入硫酸氨基葡萄糖氯化 钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至 2000ml，加入0.06-0.07％的活性炭，搅拌10-15min，脱炭，经0.45μm、0.22μm 微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌封。

进一步优选情况下，所述注射液的制备方法包括：在温度为30℃的条件 下，取80％水量注射用水，加入盐酸至pH为1.7，加入硫酸氨基葡萄糖氯 化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至 2000ml，加入0.06％的活性炭，搅拌12min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微 孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌封。

在本发明中，所述专用溶媒的配制可以根据本领域常规的配制方法进行 配制。

根据本发明提供的制备方法，无菌条件下直接灌封，而无需进行灭菌操 作即可，大大简化了操作，减少因高温灭菌带来的影响，并且所得注射液都 能符合无菌检查的要求。

第三方面，本发明还提供一种上述含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂在制备 治疗骨性关节炎药物中的应用。

在本发明中，所述含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂的使用方式可以为静脉 注射、肌肉注射或穴位注射。

在本发明中，以硫酸氨基葡萄糖计，当所述含有硫酸氨基葡萄糖的注射 剂日使用量为4mg-4000mg时，可以改善骨性关节炎；当所述含有硫酸氨基 葡萄糖的注射剂日使用量为200mg-2400mg，可以明显改善骨性关节炎。

在本发明中，尽管上述日使用量的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂能够起 到改善骨性关节炎的效果，但是发明人在研究中发现，以硫酸氨基葡萄糖计， 当所述含硫酸氨基葡萄糖的注射剂日使用量大于800mg时，作为治疗骨性关 节炎的药物效果没有提高反而变差，因此，基于安全性以及成本等问题，所 述含硫酸氨基葡萄糖的注射剂日使用量进一步优选为400mg-800mg，该日使 用量的上述注射剂能够对骨性关节炎起到效果非常好的治疗作用。

在本发明中，硫酸氨基葡萄糖能被很好的吸收，能分布到全身各处的关 节组织中，以减轻骨关节炎症状，阻断关节退行性变。

在本发明中，所述含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂的使用时间可以根据骨 性关节炎的实际情况选择，优选情况下，所述含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂 的使用时间为6-8周。

在本发明中，以硫酸氨基葡萄糖计，各种动物与人的所述注射剂的用量 可以根据Meeh-Rubner公式进行换算，其中体表面积可以参考《实验动物学》 (罗满林、顾为望，北京：中国农业出版社，2002)。

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨变性和丢失及关节 边缘和软骨下骨骨质增生为特征的慢性关节疾病，又称增生性关节炎、退行 性关节炎或骨关节病，是世界性的常见病和多发病，给患者带来极大的痛苦， 也给社会造成很大的压力。在我国骨关节炎发病率很高，约占人口的10％。 50岁以上的人口中发病率更是高达60-70％。作为最常见的关节疾病，OA 是导致成年人长期残疾的第二大病因，65岁的老年人中，70％有OA症状， 在这些OA患者中，46％严重丧失关节功能以及劳动能力。

在本发明中，对于所述骨性关节炎并没有特别的限定，例如膝关节、髋 关节、脊柱、手和其他部位的骨性关节炎，所述骨性关节炎可以为膝骨性关 节炎、髋骨性关节炎、脊椎骨性关节炎、踝骨性关节炎、腕骨性关节炎、指 /趾骨性关节炎、肘骨性关节炎、肩骨性关节炎、颈椎骨性关节炎等。

对于膝骨性关节炎，其早期症状为上下楼梯时的疼痛，尤其是下楼时为 甚，呈单侧或双侧交替出现，是出现关节肿大，多因骨性肥大造成，也可关 节腔积液。出现滑膜肥厚的很少见。严重者出现膝内翻畸形。

对于指/趾骨性关节炎，手指间关节最常受累，尤其是远端指间关节。 肿痛和压痛不太明显亦很少影响关节活动。特征性改变为在指关节背面的内 外侧，出现骨性增生而形成硬结节，位于远端指肩关节的结节称为Heberden 结节，位于近端指肩关节称为Bouchard结节。这种结节发展很慢。只有少 数患者最终会出现远指关节的屈曲或外斜畸形。当第一腕掌关节受累而有骨 质增生时就形成“方”形手，这种畸形在中国人中少见。足第一趾关节是病 变出现的常见部位。穿紧足鞋和反复外伤是其病因。症状为局部疼痛、骨性 肥大和拇外翻。

对于髋骨性关节炎，表现为大粗隆、臀外侧、腹股沟等部位疼痛，可放 射至膝。髋的内旋和伸直活动受限。我国人群中发生髋的骨性关节炎者较白 种人为少。

对于颈椎骨性关节炎，通常是由脊柱椎体、椎间盘、骨突关节的退性性 病变引起颈、腰段椎体的病变。局部出现疼痛、僵硬。少数严重者因椎体缘 的唇样增生和骨骜压迫局部神经根、脊髓或局部血管而出现各种放射性痛或 神经系症状。

与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明的制剂稳定性更好； (2)本发明的制剂有效性和安全性更好。

与现有技术相比，本发明的特点在于：(1)本发明的制备方法具有更好 的稳定性和重现性，特别适合大批量扩大生产；(2)本发明的制备方法更加 简便，更利于操作和质量安全等方面的控制；(3)本发明的制备方法控制pH 值、温度、活性炭用量等参数，很好的控制了制剂中有效成分的稳定性，有 效减少降解，并控制有关杂质、金属离子等引入。

就本发明制备方法的现象以及所带来的有益效果，尽管部分并没有确定 的理论，但本发明提供的制备方法都能规律性的重现。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方 法。

1)所述注射液由以下组分组成：

配制方法：在温度为30℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸 至pH为1.9，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入 盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.06％的活性炭，搅拌 15min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌 封。

2)专用溶媒的配制：取碱性调节剂(乙二醇胺)24g，加水1000ml， 搅拌均匀，加入0.05％的活性炭，搅拌20min，脱碳，经0.45μm、0.22μm微 孔滤膜过滤至澄清，按照1ml/支灌封，最后在121℃下灭菌15min。

实施例2

本实施例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方 法。

1)所述注射液由以下组分组成：

配制方法：在温度为35℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸 至pH为1.8，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入 盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.07％的活性炭，搅拌 10min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌 封。

2)专用溶媒的配制：同实施例1中2)专用溶媒的配制。

实施例3

本实施例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方 法。

1)所述注射液由以下组分组成：

配制方法：在温度为25℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸 至pH为1.7，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入 盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.065％的活性炭，搅拌 12min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌 封。

2)专用溶媒的配制：同实施例1中2)专用溶媒的配制。

实施例4

本实施例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方 法。

1)所述注射液由以下组分组成：

配制方法：在温度为45℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸 至pH为1.5，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入 盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.08％的活性炭，搅拌 12min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌 封。

2)专用溶媒的配制：同实施例1中2)专用溶媒的配制。

实施例5

本实施例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂及其制备方 法。

1)所述注射液由以下组分组成：

配制方法：在温度为20℃的条件下，取80％水量注射用水，加入盐酸 至pH为2.1，加入硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐并搅拌使其完全溶解，再加入 盐酸利多卡因，完全溶解后，加水至2000ml，加入0.05％的活性炭，搅拌 12min，脱炭，经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，无菌条件下按照2ml/支灌 封。

2)专用溶媒的配制：同实施例1中2)专用溶媒的配制。

为了进一步说明本发明的技术效果，进行了如下试验：

试验1：注射液的制备方法与实施例1相同，不同的是，各试验的pH 有所不同，具体结果如表1所示。

表1

在表1中，颜色的检查采用中国药典2010版二部附录IX A溶液颜色检 查法第一法测定。

从表1中的结果可以看出，制备方法中采用pH为1.5-2.1时，硫酸氨基 葡萄糖氯化钠复盐等均能较好溶解并稳定存在，有关物质以及最大杂质也能 符合规定；特别地，当采用pH为1.6-1.8时，硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐等 均能很好溶解并特别稳定存在，有关物质以及最大杂质的含量也能控制的较 低水平。

试验2：注射液的制备方法与实施例1相同，不同的是，各试验的温度 有所不同，具体结果如表2所示。

表2

在表2中，颜色的检查采用中国药典2010版二部附录IX A溶液颜色检 查法第一法测定。

从表2中的结果可以看出，制备方法中温度为20-45℃时，硫酸氨基葡 萄糖氯化钠复盐等均能较好溶解并稳定存在，有关物质以及最大杂质也能符 合规定；特别地，当温度为25-35℃时，硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐等均能 很好溶解并特别稳定存在，并且有关物质以及最大杂质的含量均能得到较低 水平的控制。

试验3：注射液的制备方法与实施例1相同，不同的是，各试验的温度 有所不同，具体结果如表3所示。

表3

在表3中，颜色的检查采用中国药典2010版二部附录IX A溶液颜色检 查法第一法测定；铁离子含量通过硫氰酸钾比色法测定并在480nm下测定吸 光度，在表中以吸光度表示；热原通过按照《中国药典》2010版二部(附录 ⅪD)热原检查法，比较注射前后家兔体温的变化测定。

从表3中的结果可以看出，活性炭用量在0.05-0.08％时，特别是在 0.06-0.07％时，能够保证热原合格，既不会对有效成分过多的吸附，同时也 保证不会引入过多的金属离子。

试验4：发明人将本发明的实施例1和实施例2与在实施例1处方中加 入保护剂的比较例1、2和3的注射液进行了对比，具体结果如表4所示。

表4

在表4中，颜色的检查采用中国药典2010版二部附录IX A溶液颜色检 查法第一法测定。

从表4中的结果可以看出，加入不同稳定剂的样品与本发明不加入稳定 剂的注射剂的有关物质相近，从数据分析没有明显的变化，说明根据本发明 方法制备的硫酸氨基葡萄糖注射液十分稳定，无需加入稳定剂，避免了杂质 的引入。

试验5：根据《化学药物制剂研究技术指导原则》，考察本发明硫酸氨基 葡萄糖氯化钠复盐与盐酸利多卡因的相容性试验，具体结果如表5所示。

表5

从表5中的结果可以看出，本发明提供的方法制备的硫酸氨基葡萄糖注 射液中，硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐与盐酸利多卡因各成分保持稳定，具有 优异的相容性。

试验6：根据本发明提供的实施例1的制备方法和对比例1 (CN102961389B专利文献中的实施例1)，放大生产4批样品，每批1000 支，结果如表6所示。

表6

从表6的结果可以看出，本发明的注射液的制备方法切实可行，并且具 有更好的稳定性和重现性，特别适合大批量扩大生产。

试验7：分装实施例1制备的样品批号为20100101、20100102、20100103， 对比例1(CN102961389B专利文献中的实施例1)制备的样品批号为 20100201、20100202、20100203以及对比例2(CN102961389B专利文献中 的实施例1不进行高温灭菌步骤而直接灌封)制备的样品批号为20100301、 20100302、20100303，按照《中国药典》2010版二部(附录ⅪH)无菌检 查法检查，记录培养14天后全部样品的无菌情况，结果如表7所示。

表7

在表7中，“-”为无菌生长，“+”为有菌生长。结果表明，实施例1和 对比例1方法制备的样品均符合无菌要求，而不进行高温灭菌的对比例2不 符合无菌要求，因此，本发明提供的制备方法在不进行高温灭菌操作的情况 下，生产均能达到无菌要求。

试验8：比较实施例1、2的硫酸氨基葡萄糖注射液以及对比例1 (CN102961389B专利文献中的实施例1)置于温度40±2℃的密闭容器中进 行加速实验(6个月)，以及置于温度25±2℃的密闭容器中进行长期实验(24 个月)，以考察其稳定性，具体结果如表8和表9所示。

表8加速实验

表9长期实验

从上述加速6个月(40±2℃)和长期24个月(25±2℃)的结果来看， 本发明提供的方法制备的硫酸氨基葡萄糖注射液具有非常稳定的性质，避免 了放样不稳定降解等导致的其它如安全性和有效性等问题。

上述试验涉及硫酸氨基葡萄糖的含量、盐酸利多卡因的含量、有关物质 及最大杂质的含量等测定方法参照CN102961389B专利文献中的硫酸氨基 葡萄糖的含量、盐酸利多卡因的含量、有关物质及最大杂质的含量。

试验例9

本试验例用于说明本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂在制备治疗 骨性关节炎药物中的应用。

在本试验中，使用实施例1中的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂，临用时 将注射液和专用溶媒液配对使用。新西兰兔由北京维通利华实验动物技术有 限公司提供。

健康新西兰兔132只，雌雄不限，兔龄6-8个月，平均体重2.5±0.5kg， 随机分为11组(n＝12)：对照组(A组)、试验B组、试验C组、试验D组、 试验E组、试验F组、试验G组、试验H组、试验I组、试验J组和正常K 组。造模前一天将术区备皮：用硫化纳将所有实验兔右膝关节脱毛。按改良 Hulth法制备骨性关节炎模型,具体方法为：3％戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉生 效后,将兔绑缚于兔手术台上,触及兔髌骨,沿髌骨正中线做一纵形切口(长约 3-4cm)显露深层结构，沿髌骨内侧缘切开髌韧带及部分股四头肌,向外侧翻开 髌骨，屈曲牵拉膝关节充分暴露其交叉韧带及半月板，直视下切断前交叉韧 带，切除内侧半月板。术中注意勿损伤后方血管、神经及股骨软骨面，在术 中行前抽屉试验检查，结果阳性确认交叉朝带已切断，冲洗后逐层缝合。术 后给予肌肉注射头孢唑啉(50mg/kg)，连续3天，预防感染。根据Meeh-Rubner 公式计算兔的给药剂量，B、C、D、E、F、G、H、I和J组于术后第2天开 始每天分别肌肉注射硫酸氨基葡萄糖0.12mg、0.47mg、23.47mg、46.95mg、 70.41mg、93.88mg、281.64mg、469.5mg和586.87mg，连续注射8周，注射 量以硫酸氨基葡萄糖计；A组、K组正常饲养。术后1周开始将全部试验兔 每天驱赶行走2次，30min/次。

上述模型及方法参照王攀2013年遵义医学院硕士学位论文《两种氨基 葡萄糖对兔膝骨性关节炎模型关节液中IL-1和TNF-α含量影响的实验研 究》。

给药8周后从A组随机抽取6只拍摄双侧膝关节DR片。方法为：麻醉 满意后将兔子绑缚于木板上拍摄膝关节DR片(双侧)，照片条件为：距离1.2m, 电压50KV，电流2.5mAs。将对照组A组左右侧膝关节DR片对比可见右膝 关节周软组织肿胀较明显，内侧关节间隙狭窄，呈膝骨性关节炎改变，确定 造模成功。

兔股骨髁大体观察给药8周后处死所有实验兔，解剖兔膝关节(在此之 前先收集右膝关节液)。肉眼观察A组兔双侧股骨髁软骨病变情况，并按以 下标准进行软骨评分，0分，关节面平整，色泽正常；1分，关节面粗糙,有 裂隙,色泽灰暗；2分，关节面可见龟裂,软骨缺损达软骨表、中层；3分，关 节面溃疡形成,软骨缺损达软骨深层；4分，软骨剥脱，软骨下骨暴露。

A组右膝关节肿胀明显，关节液量多且浑浊，右股骨髁软骨面剥落、缺 损严重，可见软骨下骨质外露，以股骨内侧髁为重；A组左侧膝关节未见肿 胀、畸形，关节液清澈透亮，股骨髁软骨面光滑、色泽正常；双侧膝关节软 骨评分有统计学差异(P<0.05)；K组为正常组，右侧膝关节未见肿胀、畸 形，关节液清澈透亮，股骨髁软骨面光滑、色泽正常。A-J组右膝关节股骨 髁观察结果，具体如表10所示。

表10

组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 4 3 4 2 3 4 3 3 2 3 3 4 B 4 2 3 3 4 2 3 4 2 3 4 3 C 3 2 3 2 3 2 2 3 3 3 3 2 D 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 E 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 F 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 G 1 0 2 0 0 1 0 2 1 1 0 1 H 1 2 1 2 1 2 2 1 2 2 1 2 I 2 1 2 2 2 2 3 3 2 3 3 2 J 3 2 4 2 2 3 3 4 2 3 3 3 K 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1

上表采用秩和检验，B组和J组与A组间分别比较无统计学意义 (P>0.05)，而C组、D组、E组、F组、G组、H组、I组与A组分别比较 具有显著的差异(P<0.05)具有统计学意义。

A-J组IL-1和TNF-α含量检测：

IL-1和TNF-α在关节炎中的含量已经被证明与骨性关节炎呈正相关性， 因此，对A-J组的IL-1和TNF-α含量进行了检测。在本检测中使用的兔IL-1 和TNF-αELISA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

(1)标本收集：给药8周后，空气栓塞法处死所有实验兔，在解剖兔 膝关节前将每只兔子右膝关节注入蒸馏水1.0ml，活动右膝关节使其和关节 液混合均匀后抽出，12000R/min离心15min后取上层清液置于EP管中， -20℃保存待测。

(2)IL-1和TNF-α含量检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，具体步骤为:

①标准品的稀释与加样：在酶标板上设标准孔10孔，在第一、二孔中 分别加标准品100μl，然后在第一、二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后 从第一、二孔中个取100μl分别加到第三、四孔,再在第三、四孔分别加入标 准品稀释液50μl，混匀；然后在第三、四孔中先取50μl弃掉，再各取50μl 分别加到第五、六孔中，再在第五、六孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀； 混匀后从第五、六孔中各取50μl分别加到第七、八孔，再在第七、八孔中 加入标准品稀释液50μl，混匀；混匀后从第七、八孔中分别取50μl加到第 九、第十孔，再在第九、第十孔中加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第 十孔中各取50μl弃掉。(这样每个孔中加样量都为50μl，浓度分别为240ng/L， l60ng/L，80ng/L，40ng/L，20ng/L)。

②待测孔加样：设置标准孔、空白孔和待测样品孔，首先在待测孔中加 样品稀释液40μl，然后加待测样品(即关节液体10μl)，样品稀释5倍。尽量 不碰及孔壁。

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

⑤洗涤：小心揭下封板膜，弃去液体，甩干每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5次。

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

⑦温育：同步骤③。

⑧洗涤：同步骤⑤。

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混 匀，37℃避光显色15分钟。

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色变为黄色。

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测定各孔吸光度。应在终止后 15分钟内完成。

⑶计算样品浓度：采用酶标仪450nm波长依序测量各孔处的吸光度 (optical density，OD值)。以测得标准品的OD值为横坐标，对应标准品浓度 为纵坐标，绘制标准曲线，计算出标准曲线的方程式。再将所测样品OD值 带入方程式计算样品中IL-1和TNF-α的浓度，具体结果如表11所示。

表11A-J组实验兔右膝关节液中IL-1和TNF-α含量比较(ng/mL)

组别 N IL-1(ng/mL) TNF-α(ng/mL) A 12 110.01±5.94 288.82±11.12 B 12 103.88±4.89 253.29±10.74 C 12 88.48±5.12 241.84±9.27 D 12 85.48±4.92 177.84±9.83 E 12 65.53±4.76 157.06±10.15 F 12 40.48±5.07 120.84±9.63 G 12 51.48±5.10 128.79±10.07 H 12 80.53±6.31 169.06±10.38 I 12 72.48±5.92 187.84±9.69 J 12 95.48±4.96 215.84±11.14 K 12 38.55±3.66 110.48±8.36

上表采用方SNK检验，方差齐；B组与A组间分别比较无统计学意义 (P>0.05)，而C组、D组、E组、F组、G组、H组、I组与A组分别比较 具有显著的差异(P<0.05)具有统计学意义，其中，E组、F组、G组与A 组比较具有非常显著的差异(P<0.01)具有统计学意义。

在本发明中的统计学方法采用SPSS19.0统计软件包进行分析。符合正 态分布的数据以均数±标准差表示，两两比较采用SNK检验；不符合正态分 布的采用轶和检验。

综上，使用本发明的含有硫酸氨基葡萄糖的注射剂在本发明的日使用量 范围内能够对骨性关节炎起到有效治疗效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。