毛发中的毒品及其代谢物检测方法

摘要

本发明涉及一种采用高动能研磨‑固相微萃取‑液相色谱/质谱连用快速筛检毛发中多种毒品化学物质的检测方法，所述检测方法的主要以下步骤：1)清洗并处理毛发样品；2)离心管中破碎毛发样品，使毒品化学物质析出至溶液中；3)然后高速离心后取上清液，用固相微萃取针管进行取样萃取，进行液相色谱和质谱联合检测。本发现先采用高动能研磨将毛发研磨后用水溶液浸提目标物，再采用固相微萃取的方式富集溶液中的目标物，同时消除毛发基质干扰；同时本发明采用液相色谱/质谱法同时筛检毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品，回收率达90.2‑95.8％，检出限达到0.2‑10ng/mg。

说明书

技术领域

本发明属于化学品检测领域，具体而言，涉及一种毛发中的毒品及其代谢物的高动能研磨-固相微萃取-液相色谱/质谱检测方法。

背景技术

化学合成类毒品苯丙胺类和氯胺酮目前已成为中国滥用最广泛的毒品。这些毒品因具有导致中枢兴奋、迷幻的作用和后果，且与社会的快节奏合拍，特别成为年轻人增加精力、追求新奇、寻找刺激的手段。吸毒人员为了更好地减轻焦虑和紧张的状态，以及更好地体验各种毒品产生的协同刺激作用，往往将多种毒品混合服用，由此导致的因吸毒过量引起急性中毒或机体多系统多器官的病理性损害的事件时有发生。近几年，在中国的一些娱乐场所开始流行含有多种毒品名为“神仙水”的口服溶液或者速溶固体“奶茶”，这种新的伪装或者滥用方式一方面极具诱惑性，会是更多的年轻人跌入吸毒的深渊，另一方面以普通饮品的形式伪装也加大了公安机关打击毒品犯罪的难度。在我们以前的工作中，这类饮品中含有苯丙胺类、氯胺酮和其他精神药物以及一些新的精神活性物质，以苯丙胺类、氯胺酮含量最多。

国家禁毒办于2016年对《吸毒成瘾认定办法》进行了修订，自此毛发样本成为认定吸毒成瘾的新依据。2018年10月31日，公安部印发了《涉毒人员毛发样本检测规范》，明确规定了应用毛发样本进行检测，为公安机关认定吸毒行为提供科学依据。与血、尿、唾液等生物样品相比，毛发具有稳定、易获取、检测时间窗口长等优点，是证明是否吸毒的最佳检材。然而传统毛发前处理方法(强酸水解、强碱水解)步骤繁琐、耗时长、提取回收率低且易交叉污染。而高动能物理研磨技术可将毛发的角质层完全被破碎，有利于毛髓质中毒品及代谢物的释放，然后将研磨后的毛发用溶剂进行提取，溶液直接进行色谱/质谱分析。但是，毛发中的毒品及其代谢物含量较低，存在干扰物多，容易造成假阳性或假阴性的判断，为了得到更准确的定性和定量结果，开发具有更高灵敏度和专属性的方法极为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用高动能研磨-固相微萃取-液相色谱/质谱连用的检测方法，其可以同时快速筛检毛发中多种毒品化学物质，例如氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)和3,4-亚甲基二氧苯丙胺(MDA)。

为了实现上述目的，根据本发明的检测方法的主要以下步骤：

1)毛发样品先用异丙醇清洗一次、水清洗两次，在室温下自然干燥后剪成3mm长的小段。

2)称取50mg毛发碎屑置于2mL的离心管中，其中装填有含钇稳定氧化锆撞珠，加入1mL饱和碳酸钠溶液，然后将离心管放入研磨仪里进行破碎，在4℃温度下高频震荡后，毛发角质层完全破碎，毒品化学物质析出至溶液中。

3)然后离心管以10000rpm的速度高速离心，上清液转移至2mL进样瓶中，放入磁搅拌子，将样品瓶置于固相微萃取采样台上于60℃下加热搅拌，同时将经老化过的固相微萃取针管插入样品瓶中，推出萃取纤维头，使之浸入样品液中萃取15min后取出，再将固相微萃取针管插入固相微萃取/液相色谱接口解吸池中推出萃取纤维头解析1min后，进行液相色谱和质谱联合检测。

优选地，步骤2)中所述钇稳定氧化锆撞珠直径为3.2mm，装填8颗，直径为5.2mm的撞珠装填2颗。

优选地，步骤2)中所述毒品化学物质选自氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品化学物质。

优选地，步骤2)中饱和碳酸钠溶液包含浓度为50ng/mL的内标物3,4-二甲基苯丙胺。

优选地，步骤3)中所述液相色谱检测条件如下：

液相色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18液相色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)

柱温：40℃

流动相：A相：甲醇，B相：质量百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱方式：0-6分钟，70％B→30％B；6–7分钟，30％B→10％B；最后保持2分钟

流动相流速：0.2mL/min。

优选地，步骤3)中根据以下方程式计算各种物质的含量，

Ci％＝Aifi/Asfs*Ws/W×100％

其中Ci为组分i的含量；

Ai为组分i的峰面积；

fi为组分i的校正因子；

As为内标物的峰面积；

fs为内标物的校正因子；

Ws为内标物的重量；

W加入样品的总重量。

优选地，毛发样品中各种毒品化学物质的线性回归方程如下：

优选地，步骤3)中质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，SIM监测模式；干燥气(N

有益效果

本发现先采用高动能研磨将毛发研磨后用水溶液浸提目标物，再采用固相微萃取的方式富集溶液中的目标物，同时消除毛发基质干扰；同时本发明采用液相色谱/质谱法同时筛检毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品，回收率达90.2-95.8％，检出限达到0.2-10ng/mg。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品标准样品液相色谱/质谱选择离子流色谱图。从图中可看到上述毒品的保留时间和出峰位置。

具体实施方式

在下文中，将参照附图详细地描述本公开的优选的实施方式。在描述之前，应当了解在说明书和所附权利要求中使用的术语，并不应解释为局限于一般及辞典意义，而是应当基于允许发明人为最好的解释而适当定义术语的原则，基于对应于本发明技术层面的意义及概念进行解释。因此，在此的描述仅为说明目的的优选实例，而并非是意指限制本发明的范围，因而应当了解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以做出其他等同实施和修改。

以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。

本文所使用的术语“第一”、“第二”等是用来解释各种构成元件，并且它们仅用于将一种构成元件与另一种构成元件区分的目的。

并且，本文中所使用的术语仅用于解释示例性实施例，且并不旨在限制本发明。单数表达也包括其复数表达，除非在上下文中另有明确表示。在本文中所使用的“包含”、“配备有”或“具有”之类的术语用于指定实践特性、数目、步骤、构成元件或其组合的存在，并且应当理解为不排除一个或多个其他特性、数目、步骤、构成元件或其组合的添加或存在的可能。

在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为伪(或不存在)、A为伪(或不存在)且B为真(或存在)、A和B均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。

在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。

若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。

在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。

本发明通过对样品前处理方法的摸索及液相色谱/质谱分析条件的优化，可以同时检测氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品，回收率达90.2-95.8％，检出限达到0.2-10ng/mg。本法用色谱保留时间、质谱特征选择离子同时定性，以各毒药物的峰面积计算其在样品中的残留量。该方法最大限度消除了毛发中复杂基体的干扰，能快速准确对氯胺酮、去甲氯胺酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA和MDA等毒品进行定性定量分析，适用面广、操作简单、检测针对性强。可用于出入境检验检疫、疾病预防与控制中心，公安部门快速检测及阳性结果的确证。

根据本发明的检测方法中采用的仪器和试剂如无特别说明均为市售产品，例如可以采用如下仪器和试剂。

1.仪器

Agilent-1200series液相色谱仪，配G6130A质谱仪；固相微萃取进样器(美国Supelco公司)，固相微萃取采样台(美国Supelco公司)；高动能样品研磨仪(中国净信实业发展有限公司)。

2.试剂

2.1.毒品标准品：盐酸甲基苯丙胺(Methamphetamine hydrochloride，MA)，硫酸苯丙胺(amphetamine sulfate，AM),3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺盐酸盐(3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride，MDMA)，3,4-亚甲基二氧苯丙胺盐酸盐(3,4-methylenedioxyamphetamine hydrochloride，MDA)，盐酸氯胺酮(ketaminehydrochloride)和盐酸去甲氯胺酮(norketamine hydrochloride)均购自于Cerilliant标准品公司(Darmstadt，德国)。内标：盐酸甲基苯丙胺-d

2.2.试剂：甲醇、乙腈和甲酸均为液相色谱纯级别，购于Fluka试剂公司(MO，美国)。碳酸钠和氢氧化钠等其余试剂均为分析纯，购于国药集团(北京，中国)。

实施例1

毛发样品先用异丙醇清洗一次、水清洗两次，在室温下自然干燥后剪成3mm长的小段。称取50mg毛发碎屑置于2mL的离心管中(含钇稳定氧化锆撞珠，直径3.2mm×8，直径5.2mm×2)，加入1mL饱和碳酸钠溶液(含有内标物3,4-二甲基苯丙胺50ng/mL)，然后将离心管放入研磨仪里进行破碎，在4℃温度下高频震荡后，毛发角质层完全破碎，目标物析出至溶液中。然后离心管高速离心(10000rpm)后，上清液转移至2mL进样瓶中，放入磁搅拌子(直径5mm)，拧紧瓶盖，将样品瓶置于固相微萃取专用采样台上于60℃下加热搅拌，同时将经老化过的固相微萃取针管插入样品瓶中，推出萃取纤维头，使之浸入样品液中萃取15min后取出，再将固相微萃取针管插入固相微萃取/液相色谱接口解吸池中推出萃取纤维头解析1min后，进行仪器分析。

结果在头发样品中检出甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮和去甲氯胺酮的成分。采用本发明的检测方法可以对实际样品中3种毒品及其代谢物均准确定性，通过定量曲线获得的含量分别为5.4ng/mg,1.2ng/mg,9.7ng/mg和8.6ng/mg，证明该检测方法可靠实用。

液相色谱条件：Agilent Poroshell EC-C18液相色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)，柱温：40℃。流动相：A相：甲醇，B相：重量百分百0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱：0-6分钟，70％B→30％B；6–7分钟，30％B→10％B；最后保持2分钟；流速：0.2mL/min。

质谱条件：电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，SIM监测模式；干燥气(N

表1 3种毒品及其代谢物的SIM监测离子对、碰撞能和色谱保留时间

实施例2：毛发研磨条件优化

对影响破碎效果的主要因素包括破碎时间、破碎频率、撞珠类型和用量等进行了考查。经过实验优化，采用毛发研磨仪最高振动频率70Hz、振动时间为2min。为了避免溶液腐蚀和提高毛发破碎效率，使用钇稳定氧化锆撞珠(3.2mm×8，5.2mm×2)。

实施例3：固相微萃取条件优化

对固相微萃取萃取纤维种类(85μm聚丙烯(PA)、100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、60μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取头(PDMS/DVB))、萃取温度(30，40，50，60和70℃)和萃取时间(5，10，15，20和25min)进行优化，以及对4.1.1中毛发提取液中盐效应(NaCl和Na

实施例4：色谱/质谱条件优化

4.1色谱条件优化

色谱柱：比较了EC-C

流动相：考查了甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈-水溶液和甲酸乙腈-甲酸溶液体系等作为流动相。结果表明，在酸性条件下，有助于化合物母离子的形成。考查甲酸浓度为0.1％(v/v)、0.2％(v/v)、0.3％(v/v)时，发现增大甲酸浓度对化合物检测灵敏度影响不大，因此，最终选择甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液体系作为流动相。

4.2质谱条件优化

分别在正、负离子检测模式下，首先全扫描确定母离子的质荷比，并确定离子化方式。接着在选择离子模式下，输入母离子质荷比，考查不同碰撞能量值下子离子的响应，找到最大响应时的碰撞能量值。

结果分析

5.1以各毒品的相对保留时间和各毒品的选择离子对的丰度比为定性依据，各毒品的保留时间和选择离子对见表1；用内标法定量，以各毒品与相应的内标物的峰面积比计算其在样品中的残留量。根据实施例1至4的研究确定针对3种毒品及其代谢物的最优化色谱/质谱分析条件见表1。针对3种毒品及其代谢物的最优化选择离子流色谱图见图1。从图1中可看到3种毒品及其代谢物的保留时间和出峰位置。

5.2特异性

由于液相色谱/质谱分析方法的先进性，采用目标分析物的特征选择离子对进行定性定量分析，可最大程度的排除基质干扰提高对目标物检测的特异性。

5.3标准曲线及检测限

将3ng，10ng，20ng，50ng，100ng，200ng，500ng下表2中的目标待检测物添加到50mg空白毛发中，然后按照上述过程处理。每个浓度点重复5次(n＝5)。根据实验所得数据，得出目标物浓度(x)和目标物与内标的峰面积比值(y)之间的关系，计算线性范围、回归方程以及相关系数(r)。检出限为产生信号(峰高)为基线噪音标准3倍时的样品浓度。具体数据见表2。

表2 3种毒品及其代谢物的标准曲线方程、相关系数和检出限

5.4准确度和精密度

根据10ng，50ng和200ng三个浓度点实验所得数据考查实验方法的日内、日间(5d)的精密度和准确度。准确度要求真实值与测定值之间的平均相对误差(mean relativeerror，MRE)应在±15％以内。精密度要求相同条件下的相对标准偏差(relative standarddeviation，RSD)应在±15％以内。回收率是指上述浓度的目标物按照萃取过程处理后进样分析得到的峰面积与内标物峰面的比值和理论回收浓度直接进样分析得到的峰面积与内标物峰面积的比值之间的比值。结果见表3。

表3 3种毒品及其代谢物的回收率、日内和日间精密度和准确度

本发明建立了头发样品中苯丙胺类和氯胺酮混合毒品的高动能物理研磨-固相微萃取-液相色谱/质谱分析方法，该方法将毛发研磨与溶剂浸提操作同时进行，之后采用固相微萃取进一步净化和提取，提高了检测准确性和灵敏度。在选定的优化条件下，给出了3种毒品及其代谢物的线性范围、线性方程(所有线性相关系数r均大于0.99)、检测限为0.067ng/mg，所建立方法的回收率均在90.2％-95.8％之间，日内和日间精密度和准确度值均小于10％。

本方法操作简单，检测灵敏度高，结果准确可靠，选择性和重复性好，实际样品定性定量检测均获得满意结果，表明建立的分析方法准确可靠，能满足人毛发生物样品毒品检测的要求。