一种泽泻汤UPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用

摘要

本发明涉及一种泽泻汤UPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用，利用超高效液相色谱法，以多个对照品作为参照峰，以乙腈‑磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定19个共有峰，构成了泽泻汤药物特征图谱的全貌，经过指认的共有峰有7个，使泽泻汤药物的质量控制从原来针对两个成分的含量测定或少数几个共有峰的检测上升到针对整个泽泻汤药物内在品质的把控，能够比较全面地反映泽泻汤药物的特征，避免了只检测单一或少数几个共有峰而带来的方法缺陷，为泽泻汤药物的内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制原药材白术、泽泻的目的。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种泽泻汤UPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用。

背景技术

泽泻汤，经典名方，出自《金匮要略》卷中。具有利水除饮，健脾制水之功效。主治饮停心下，头目眩晕，胸中痞满，咳逆水肿。方中泽泻甘淡，利水渗湿，使水湿从小便而出，为君药。白术甘苦，健脾益气，利水消肿，助脾运化水湿，为臣药。两药相须为用，重在利水，兼健脾以制水，为治脾虚水饮内停之良方。2018年4月，国家中医药管理局发布的《(第一批)古代经典名方目录》，泽泻汤作为首批100个经典名方之一。

为了有效地发挥泽泻汤经典名方的临床治疗作用，对于目前中药复方制剂的质量控制来说，能够做到对于处方中的每一味药物都有一个含量测定成分，是一种比较高的质量标准。

CN201910065029-泽泻汤标准煎液的质量检测方法和质量评价方法，公开了运用液相色谱检测白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B的含量；CN201611121475-一种检测泽泻汤标准颗粒中白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B含量的方法，公开了泽泻汤标准颗粒中白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B含量的方法。

刘协和，[J].中国药学杂志,1978,V13(1):0-0.主要化学成分是三萜类化合物泽泻醇(Alisol)类,包括泽泻醇A、24-乙酰基泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰基泽泻醇B、23-乙酰基泽泻醇C；于玲玲.白术化学成分及质量标准研究[D].辽宁中医药大学,2010.术中分离纯化出六个单体化合物:1)白术内酯Ⅰ(atractylenolideⅠ),2)白术内酯Ⅱ(atractylenolideⅡ),3)白术内酯Ⅲ(atractylenolideⅢ),4)蒲公英萜醇乙酸酯(taracetate),5)β-谷甾醇(β-sitosterol),6)豆甾醇(stigmasterol)。

目前对泽泻汤的质量检测都限于白术内酯III和23-乙酰泽泻醇B的含量，但针对泽泻汤含有多种的化学成分，只检测两种含量是不能够更好地控制产品的质量，为了确保泽泻汤的质量，发明人通过了大量的实验研究，对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定19个共有峰，构成了泽泻汤药物特征图谱的全貌，使泽泻汤质量控制从原来针对两个成分的含量测定或少数几个共有峰的检测上升到针对整个泽泻汤药物内在品质的把控，能够比较全面地反映泽泻汤特征，避免了只检测单一或少数几个共有峰而带来的方法缺陷，为泽泻汤内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制原药材白术、泽泻的目的。

发明内容

本发明的目的提供一种泽泻汤UPLC特征图谱的检测方法及该特征图谱的应用。

本发明所述泽泻汤药物由泽泻、白术组成，取泽泻、白术加水煎煮即得，所述UPLC特征图谱的检测方法包括下列步骤：

1)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片0.8～1.2g的泽泻汤，精密称定，置于50ml容量瓶中，加60～80％甲醇至接近刻度，超声处理5～15分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心3～7分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

2)对照品溶液的制备：精密称取适量23-乙酰泽泻醇B、环氧泽泻烯、泽泻醇A、泽泻醇B对照品，分别用乙腈溶解制成每1ml含0.01～0.03mg23-乙酰泽泻醇B、0.10～0.20mg环氧泽泻烯、0.03～0.07mg泽泻醇A、0.20～0.30mg泽泻醇B对照品溶液；精密称取适量白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C对照品，分别用甲醇溶解制成每1ml含0.8～1.2mg白术内酯Ⅱ、0.03～0.08mg白术内酯Ⅲ、0.008～0.013mg23-乙酰泽泻醇C对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.05-0.15％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：38～42℃，检测波长：205～215nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液8～12ul注入超高效液相色谱仪中测定，标定共有峰，即得所述泽泻汤药物UPLC特征图谱。

优选的，

1)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片0.9～1.1g的泽泻汤，精密称定，置于50ml容量瓶中，加65～74％甲醇至接近刻度，超声处理8～13分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心4～6分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

2)对照品溶液的制备：精密称取适量23-乙酰泽泻醇B、环氧泽泻烯、泽泻醇A、泽泻醇B对照品，分别用乙腈溶解制成每1ml含0.015～0.025mg23-乙酰泽泻醇B、0.13～0.18mg环氧泽泻烯、0.035～0.065mg泽泻醇A、0.23～0.28mg泽泻醇B对照品溶液；精密称取适量白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C对照品，分别用甲醇溶解制成每1ml含0.85～1.15mg白术内酯Ⅱ、0.04～0.07mg白术内酯Ⅲ、0.009～0.012mg23-乙酰泽泻醇C对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.07-0.13％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：39～41℃，检测波长：206～210nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液9～11ul注入超高效液相色谱仪中测定，标定共有峰，即得所述泽泻汤药物UPLC特征图谱。

进一步优选的，

1)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤，精密称定，置于50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

2)对照品溶液的制备：精密称取适量23-乙酰泽泻醇B、环氧泽泻烯、泽泻醇A、泽泻醇B对照品，分别用乙腈溶解制成每1ml含0.02mg23-乙酰泽泻醇B、0.16mg环氧泽泻烯、0.05mg泽泻醇A、0.25mg泽泻醇B对照品溶液；精密称取适量白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C对照品，，分别用甲醇溶解制成每1ml含1.0mg白术内酯Ⅱ、0.05mg白术内酯Ⅲ、0.01mg23-乙酰泽泻醇C对照品溶液；

3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.1％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：40℃，检测波长：208nm，流速：0.35ml/min。

4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入超高效液相色谱仪中测定，标定共有峰，即得所述泽泻汤药物UPLC特征图谱。

根据所述的的检测方法，步骤1)供试品溶液的制备中所述的取相当于泽泻饮片0.8～1.2g的泽泻汤，也可以是取相当于白术饮片0.2～0.6g的泽泻汤。

优选的，

根据所述的的检测方法，步骤1)供试品溶液的制备中所述的取相当于泽泻饮片0.9～1.1g的泽泻汤，也可以是取相当于白术饮片0.3～0.5g的泽泻汤。

进一步优选的，

根据所述的的检测方法，步骤1)供试品溶液的制备中所述的取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤，也可以是取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤。

根据所述的检测方法，所得的UPLC特征图谱中包含19个共有峰，以泽泻醇B参照物相应的峰为标准峰，其余峰的相对保留时间为：0.14±5％、0.41±5％、0.62±5％、0.65±5％、0.72±5％、1.16±5％、0.11±5％、0.13±5％、0.17±5％、0.18±5％、0.42±5％、0.64±5％、0.66±5％、0.70±5％、0.77±5％、0.90±5％、0.91±5％、1.15±5％。

优选的，

根据所述的检测方法，所得的UPLC特征图谱中包含19个共有峰，以泽泻醇B参照物相应的峰为标准峰，其余峰的相对保留时间为：0.14、0.41、0.62、0.65、0.72、1.16、0.11、0.13、0.17、0.18、0.42、0.64、0.66、0.70、0.77、0.90、0.91、1.15。

根据所述的检测方法，所得的UPLC特征图谱中包含19个共有峰，经过指认的有7个共有峰，分别为泽泻醇B、环氧泽泻烯、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C、白术内酯Ⅱ、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B；以泽泻醇B参照物相应的峰为标准峰，相对保留时间：环氧泽泻烯：0.14±5％；白术内酯：0.41±5％；23-乙酰泽泻醇C：0.62±5％；白术内酯Ⅱ：0.65±5％；泽泻醇A：0.72±5％；23-乙酰泽泻醇B：1.16±5％。

根据所述的检测方法，所述特征图谱在泽泻汤药物以及含泽泻药材、白术药材的制剂中检测的应用。

本发明的有益效果

1、本发明利用超高效液相色谱法，以对照品23-乙酰泽泻醇B、环氧泽泻烯、泽泻醇C、泽泻醇A、泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇C作为参照峰，以乙腈-磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定19个共有峰，构成了泽泻汤药物特征图谱的全貌，使泽泻汤质量控制从原来针对两个成分的含量测定或少数几个共有峰的检测上升到针对整个泽泻汤药物内在品质的把控，能够比较全面地反映泽泻汤特征，避免了只检测单一或少数几个共有峰而带来的方法缺陷，为泽泻汤内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制原药材白术、泽泻的目的。

2、本发明采用超高效液相色谱(UPLC)法构建泽泻汤特征图谱，引入白术单方、泽泻单方的特征图谱进行研究，针对饮片单方、与汤剂共有的成分进行研究，并作为特征图谱峰确定的依据。采用高效液相色谱和相关对照品指认了7个特征成分，分别为环氧泽泻烯，白术内酯Ⅱ，23-乙酰泽泻醇C，白术内酯Ⅲ，泽泻醇A，泽泻醇B，23-乙酰泽泻醇B，并作为泽泻汤药物特征图谱特征峰确定的依据。

3、本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，更加高效、快速、环保；采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对泽泻汤药物多个特征成分的质量监控，既提升了白术药材、泽泻的质量控制水平，又提升泽泻汤内在质量；保持了白术单方、泽泻单方与泽泻汤剂质量的一致性，为临床提供符合泽泻汤要求的原料，为泽泻汤药物用药安全提供了保障。

4、本发明用于构建特征图谱的方法简单易行，重现性好，准确可靠，在同一色谱条件下一次性最少确认7个成分，节约时间，节省检验成本，提高检测效率。

5、本发明针对目前泽泻汤药物检测手段较少的现状，提供了一种新的泽泻汤检测分析手段。

说明书附图

图1泽泻汤流动相及梯度选择特征UPLC图谱。

图2泽泻汤流动相及梯度选择优化后特征UPLC图谱。

图3泽泻汤波长选择特征图谱的PDA-3D图。

图4泽泻汤在波长200nm的特征UPLC图谱。

图5泽泻汤在波长208nm的特征UPLC图谱。

图6泽泻汤在波长220nm的特征UPLC图谱。

图7泽泻汤在波长240nm的特征UPLC图谱。

图8泽泻汤浓度用ZXT190708-2(50ml)的特征UPLC图谱。

图9泽泻汤浓度用ZXT190708-2(25ml)的特征UPLC图谱。

图10泽泻汤浓度用ZXT190708-2(6.8g-50ml)的特征UPLC图谱。

图11泽泻汤以甲醇作溶剂的特征UPLC图谱。

图12泽泻汤以70％甲醇作溶剂的特征UPLC图谱。

图13泽泻汤以乙腈作溶剂的特征UPLC图谱。

图14泽泻汤以70％乙腈作溶剂的特征UPLC图谱。

图15泽泻汤以乙醇作溶剂的特征UPLC图谱。

图16泽泻汤以丙酮作溶剂的特征UPLC图谱。

图17泽泻汤超声提取10分钟的特征UPLC图谱。

图18泽泻汤超声提取20分钟的特征UPLC图谱。

图19泽泻汤超声提取30分钟的特征UPLC图谱。

图20泽泻汤回流提取10分钟的特征UPLC图谱。

图21泽泻汤回流提取20分钟的特征UPLC图谱。

图22泽泻汤回流提取30分钟的特征UPLC图谱。

图23泽泻汤超声提取10分钟的特征UPLC图谱。

图24泽泻汤超声10分钟(冰浴)的特征UPLC图谱。

图25泽泻汤超声提取5分钟的特征UPLC图谱。

图26泽泻汤超声提取30分钟的特征UPLC图谱。

图27泽泻汤超声提取30分钟(冰浴)的特征UPLC图谱。

图28泽泻汤色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK的特征UPLC图谱。

图29泽泻汤色谱柱为ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm的特征UPLC图谱。

图30泽泻汤色谱柱为ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)的特征UPLC放大图谱。

图31泽泻汤色谱柱为CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm,1.6μm)的特征UPLC图谱。

图32泽泻汤图谱峰归属特征UPLC图谱。

图33对照品11-去氧泽泻醇B的特征UPLC图谱。

图34对照品11-去氧泽泻醇B的最大吸收图谱。

图35对照品23-乙酰泽泻醇B的特征UPLC图谱。

图36对照品23-乙酰泽泻醇B的最大吸收图谱。

图37对照品23-乙酰泽泻醇C的特征UPLC图谱。

图38对照品23-乙酰泽泻醇C的最大吸收图谱。

图39对照品泽泻醇A特征UPLC图谱。

图40对照品泽泻醇A的的最大吸收图谱。

图41对照品泽泻醇B特征UPLC图谱。

图42对照品泽泻醇B的最大吸收图谱。

图43对照品泽泻醇C特征UPLC图谱。

图44对照品泽泻醇C的最大吸收图谱。

图45对照品白术内酯Ⅰ特征UPLC图谱。

图46对照品白术内酯Ⅰ的最大吸收图谱。

图47对照品白术内酯Ⅱ特征UPLC图谱。

图48对照品白术内酯Ⅱ的最大吸收图谱。

图49对照品白术内酯Ⅲ特征UPLC图谱。

图50对照品白术内酯Ⅲ的最大吸收图谱。

图51对照品环氧泽泻烯的特征UPLC图谱。

图52对照品中环氧泽泻烯的最大吸收图谱。

图53对照品与泽泻汤的重叠特征UPLC图谱。

图54泽泻汤中经对照品指认的UPLC特征图谱。

图55泽泻汤中经对照品指认的色谱峰最大吸收图谱。

图56泽泻汤6批特征图谱共有模式图。

图57泽泻汤特征图谱共有峰图(峰1：未知峰1；峰2：未知峰2；峰3：环氧泽泻烯；峰4：未知峰3；峰5：未知峰4；峰6：白术内酯Ⅲ；峰7：未知峰5；峰8：23-乙酰泽泻醇C；峰9：未知峰6；峰10：白术内酯Ⅱ；峰11：未知峰7；峰12：未知峰8；峰13：泽泻醇A；峰14：未知峰9；峰15：未知峰10；峰16：未知峰11；峰17：泽泻醇B；峰18：未知峰12；峰19：23-乙酰泽泻醇B)。

具体实施方式

仪器：

G18QSM448A高效液相色谱仪(沃特世公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(沃特世公司)；ACQUITY UPLC BEH色谱柱(沃特世公司)；CORTECS UPLC T3色谱柱(沃特世公司)；MS105十万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；TG16-WS高速离心机(常州金坛良友仪器有限公司)；C3816超声清洗机。

试剂：

磷酸：批号170414，天津百世化工有限公司；色谱级乙腈：批号10C03829，默克股份两合公司；纯净水：屈臣氏；色谱级甲醇：批号：654833，默克股份两合公司；无水乙醇：批号20160808,天津科密欧化学试剂有限公司；乙醚:批号170808，白银良友化学试剂；乙酸乙酯：批号120202，天津富宇精细化工有限公司；丙酮：批号170218，白银良友化学试剂。

对照品：

白术内酯Ⅱ：来源中国食品药品检定研究院，批号111976-201501，纯度99.90％，规格20mg/瓶；

白术内酯Ⅲ：来源中国食品药品检定研究院，批号111978-201501，纯度99.90％；规格20mg/瓶；

23-乙酰泽泻醇B：来源中国食品药品检定研究院，批号111846-201705，纯度99.70％，规格20mg/瓶；

环氧泽泻烯：来源成都普菲德生物科技有限公司，批号：17060102，纯度98％，规格20mg/瓶；

泽泻醇A：来源成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-18080105，纯度99.49％，规格20mg/瓶；

泽泻醇B：来源成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-18070305，纯度99.38％，规格20mg/瓶；

23-乙酰泽泻醇C：来源NATURE，批号26575-93-9，纯度98.00％，规格5mg/瓶。

供试品：

泽泻汤(批号：ZXT190708-2)

取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤：指根据每次投料量计算泽泻汤的取样量，即泽泻汤的取样量相当于泽泻汤中泽泻饮片1.0g的量。

取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤：指根据每次投料量计算泽泻汤的取样量，即泽泻汤的取样量相当于泽泻汤中白术饮片0.4g的量。

实施例1

(1)对照品溶液的制备：

白术内酯Ⅱ：精密称取白术内酯Ⅱ对照品0.1003g至100ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度。

白术内酯Ⅲ：精密称取白术内酯Ⅲ对照品0.01015g至100ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度，精密吸取50ml至100ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。

23-酰泽泻醇B：精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品0.01008g至100ml容量瓶中，乙腈溶剂并定容至刻度，精密吸取25ml至100ml容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。

环氧泽泻烯：精密称取环氧泽泻烯对照品0.0041g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

泽泻醇A：精密称取泽泻醇A对照品0.00243g至50ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

泽泻醇B：精密称取泽泻醇B对照品0.00631g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

23-乙酰泽泻醇C：精密称取23-乙酰泽泻醇C对照品5.10mg至500ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度。

(2)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤、精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.1％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：40℃，检测波长：208nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入超高效液相色谱仪中测定，标定共有峰，即得所述泽泻汤药物UPLC特征图谱。

实施例2

(1)对照品溶液的制备：同实施例1。

(2)供试品溶液的制备：取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤、精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.1％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：40℃，检测波长：208nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法同实施例1。

实施例3

(1)对照品溶液的制备：同实施例1。

(2)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤，精密称定，置50ml容量瓶中，加60％甲醇至接近刻度，超声处理5分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心3分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.05％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：38℃，检测波长：205nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法同实施例1。

实施例4

(1)对照品溶液的制备：同实施例1。

(2)供试品溶液的制备：取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤，精密称定，置50ml容量瓶中，加60％甲醇至接近刻度，超声处理5分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心3分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.05％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：38℃，检测波长：205nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法同实施例1。

实施例5

(1)对照品溶液的制备：同实施例1。

(2)供试品溶液的制备：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤，精密称定，置50ml容量瓶中，加80％甲醇至接近刻度，超声处理15分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心7分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.15％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：42℃，检测波长：215nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法同实施例1。

实施例6

(1)对照品溶液的制备：同实施例1。

(2)供试品溶液的制备：取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤，精密称定，置50ml容量瓶中，加80％甲醇至接近刻度，超声处理15分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心7分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得；

(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.15％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：42℃，检测波长：215nm，流速：0.35ml/min。

(4)测定法同实施例1。

实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

1、仪器与试剂、对照品

仪器：

G18QSM448A高效液相色谱仪(沃特世公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(沃特世公司)；ACQUITY UPLC BEH色谱柱(沃特世公司)；CORTECS UPLC T3色谱柱(沃特世公司)；MS105十万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；TG16-WS高速离心机(常州金坛良友仪器有限公司)；C3816超声清洗机；

试剂：

磷酸：批号190414，天津百世化工有限公司；色谱级乙腈：批号10C03829，默克股份两合公司；纯净水：屈臣氏；色谱级甲醇：批号：654833，默克股份两合公司；无水乙醇：批号20160808,天津科密欧化学试剂有限公司；乙醚:批号170808，白银良友化学试剂；乙酸乙酯：批号120202，天津富宇精细化工有限公司；丙酮：批号170218，白银良友化学试剂。

对照品：

白术内酯Ⅰ：来源中国食品药品检定研究院，批号111975-201501，纯度99.90％，规格20mg/瓶；白术内酯Ⅱ：来源中国食品药品检定研究院，批号111976-201501，纯度99.90％，规格20mg/瓶；白术内酯Ⅲ：来源中国食品药品检定研究院，批号111978-201501，纯度99.90；规格20mg/瓶；23-乙酰泽泻醇B：来源中国食品药品检定研究院，批号111846-201705，纯度99.70％，规格20mg/瓶；环氧泽泻烯：来源成都普菲德生物科技有限公司，批号：17060102，纯度98％，规格20mg/瓶；泽泻醇C：来源西力生物，批号：30489-27-1，纯度98％，规格20mg/瓶；泽泻醇A：来源成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-18080105，纯度99.49％，规格20mg/瓶；泽泻醇B：来源成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-18070305，纯度99.38％，规格20mg/瓶；11-去氧泽泻醇B：来源Fifan，批号M05M10S87221，纯度95.00％，规格20mg/瓶；23-乙酰泽泻醇C：来源NATURE，批号26575-93-9，纯度98.00％，规格5mg/瓶。

2、泽泻汤特征图谱方法的确立

2.1泽泻汤特征图谱方法流动相及梯度的选择

(1)参考中药饮片标准汤剂泽泻标准汤剂的色谱条件，(条件转化成适用于H-CLASS仪器)采用乙腈-水系统洗脱，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，柱温：40℃；进样体积：10μl；流速：0.25ml/min，波长：210nm；按表1中的规定进行梯度洗脱：结果见图1。

表1梯度洗脱表

(2)优化后梯度，现在乙腈－水系统优化后的峰形较胖，甲醇体系因产生的柱压较高，故不考虑；在水中加入0.1％磷酸的色谱图较为理想。故选择乙腈－0.1％磷酸系统，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，柱温：40℃，检测波长：208nm，流速：0.35ml/min，进样体积：10ul；优化后梯度见表2：结果见图2。

表2优化后的梯度洗脱表

2.2泽泻汤特征图谱方法检测波长的确定

取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190813HB)，精密称定，置50ml容量瓶中，加乙腈至接近刻度，超声处理30分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，上清液用0.22μm有机膜过滤，取续滤液作为供试液，记录190～400nm范围内的吸收光谱，见图3、图4、图5、图6、图7。

结论：在208nm左右，泽泻汤可以检测到的色谱峰较多，色谱峰的峰面积较大，基线平稳，可兼顾白术中的成分，因此选择208nm为泽泻汤特征图谱检测波长。

2.3泽泻汤特征图谱方法供试品浓度考察

取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190708-2)，精密称定，分别置50ml容量瓶和25ml容量瓶中，分别加纯甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，ZXT190708-2(50ml)，ZXT190708-2(25ml)

取相当于泽泻饮片0.5g的泽泻汤(批号：ZXT190708-2)，精密称定，置50ml容量瓶中，加纯甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，ZXT190708-2(6.8g-50ml)按上述色谱条件进行测定，见图8、图9、图10；表3、表4、表5、表6、表7。

表3泽泻汤特征图谱方法浓度考察表(一)

表4泽泻汤特征图谱方法浓度考察表(二)

表5泽泻汤特征图谱方法浓度考察表(三)

表6泽泻汤特征图谱方法浓度考察表(四)

表7泽泻汤特征图谱方法浓度考察表(五)

结论：ZXT190708-2(25ml)的各个峰的面积应是ZXT190708-2(50ml)的两倍，ZXT190708-2(50ml)的各个峰的面积应是ZXT190708-2(6.8g-50ml)的两倍，需折合成相同的药材量进行比较，折合后见表8、表9。

表8泽泻汤特征图谱方法浓度考察(一)(折合后)

表9泽泻汤特征图谱方法浓度考察(二)(折合后)

结论：从上表中可得出取相当于泽泻饮片0.5g的泽泻汤置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度与取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，峰的响应值差不多，但是整体比较而言取相当于泽泻饮片0.5g的泽泻汤置50ml容量瓶中峰高较低，所以泽泻汤特征图谱供试品取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤于50ml的容量瓶中溶解。

2.4泽泻汤特征图谱方法提取溶剂考察

取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190813HB)，精密称定，置50ml容量瓶中，分别加入纯甲醇，70％甲醇，乙腈，70％乙腈，乙醇，乙醚，乙酸乙酯，丙酮至接近刻度，超声处理30分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，见图11、图12、图13、图14、图15、图16；表10、表11、表12。

表10泽泻汤特征图谱溶剂提取考察(一)

表11泽泻汤特征图谱溶剂提取考察表(二)

表12泽泻汤特征图谱溶剂提取考察表(三)

结论：用乙腈处理特征图谱供试品时，峰形矮胖，70％甲醇处理的泽泻汤，峰形较好，所以选择70％甲醇作为泽泻汤特征图谱供试品处理溶剂。

2.5泽泻汤特征图谱方法溶剂提取方式及提取时间的考察

(1)取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190813HB)，精密称定，置50ml容量瓶和50ml的锥形瓶中，分别加25ml 70％甲醇，超声10分钟，20分钟，30分钟，回流提取10分钟，20分钟，30分钟，冷却后在50ml容量瓶中定容，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，见图17、图18、图19、图20、图21、图22；表13、表14、表15。

表13泽泻汤特征图谱溶剂提取时间及方式考察表(一)

表14泽泻汤特征图谱溶剂提取时间及方式考察表(二)

表15泽泻汤特征图谱溶剂提取时间及方式考察表(三)

结论：采用超声处理10分钟，20分钟，30分钟，回流提取10分钟，20分钟，30分钟，所得的色谱峰数目无明显差异，但超声10分钟处理的泽泻汤特征图谱峰响应值较高，选择超声10分钟处理泽泻汤特征图谱供试品。

(2)取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190813HB)，精密称定，置50ml容量瓶中，分别加70％甲醇至接近刻度，超声5分钟，10分钟，30分钟，10分钟(冰浴)，30分钟(冰浴)，冷却，定容，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，按上述色谱条件进行测定，见图23、图24、图25、图26、图27；表16、表17、表18。

表16泽泻汤特征图谱溶剂提取考察表(一)

表17泽泻汤特征图谱溶剂提取考察表(二)

表18泽泻汤特征图谱溶剂提取考察表(三)

结论：从上表中得出超声5分钟，超声10分钟，超声10分钟(冰浴)，回流30分钟，回流30分钟(冰浴)结果相差无几，采用超声处理10分钟处理泽泻汤特征图谱峰简洁方便，所以选择超声10分钟处理泽泻汤特征图谱供试品。

2.6泽泻汤特征图谱方法色谱柱的考察

取相当于白术饮片0.4g的泽泻汤(批号：ZXT190813HB)，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，分别用：CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm,1.6μm)；ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)；ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK，按上述色谱条件进行测定：见图28、图29、图30、图31。

结论：泽泻汤特征图谱在用CORTECS UPLC T3(100mm×2.1mm,1.6μm)色谱柱时，环氧泽泻烯出峰时间太早，用ACQUITY UPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)色谱柱时，环氧泽泻烯与相邻峰分离度不够，用ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK色谱柱时，峰的个数较多，峰形较好，且峰之间分离程度较好，所以泽泻汤特征图谱用ACQUITY UPLC HSST3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK色谱柱。

2.7泽泻汤特征图谱方法色谱峰的归属

对照品的配制：

白术内酯Ⅰ：精密称取白术内酯Ⅰ对照品0.0019g至25ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度。

白术内酯Ⅱ：精密称取白术内酯Ⅱ对照品0.1003g至100ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度。

白术内酯Ⅲ：精密称取白术内酯Ⅲ对照品0.01015g至100ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度，精密吸取50ml至100ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。

23-酰泽泻醇B：精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品0.01008g至100ml容量瓶中，乙腈溶剂并定容至刻度，精密吸取25ml至100ml容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。

环氧泽泻烯：精密称取环氧泽泻烯对照品0.0041g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

泽泻醇C：精密称取泽泻醇C对照品0.0019g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

泽泻醇A：精密称取泽泻醇A对照品0.00243g至50ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

泽泻醇B：精密称取泽泻醇B对照品0.00631g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

11-去氧泽泻醇B：精密称取11-去氧泽泻醇B对照品0.0018g至25ml容量瓶中，用乙腈溶剂并定容至刻度。

23-乙酰泽泻醇C：精密称取23-乙酰泽泻醇C对照品5.10mg至500ml容量瓶中，用甲醇溶剂并定容至刻度。

供试品的配制：

泽泻单方：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻单方(批号：ZXT190826D-ZX)，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，按上述色谱条件进行测定；

白术单方：取相当于白术饮片0.4g的泽白术单方(批号：ZXT190731D-BZ)，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得，按上述色谱条件进行测定；

泽泻汤：取相当于泽泻饮片1.0g的泽泻汤(批号：ZXT190829HB)，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得。

色谱条件与系统适应性试验：

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 MVK，色谱柱规格：100mm×2.1mm,1.8μm；流动相：以乙腈为流动相A，流动相B为0.1％磷酸水，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～4min，45％A，55％B；4～6min，45％～60％A,55％～40％B；6～10min，60％～70％A,40％～30％B；10～13min，70％～85％A,30％～15％B；13～18min，85％～90％A,15％～10％B；18～19min，90％～45％A,10％～55％B；19～24min，45％A,55％B；柱温：38～42℃，检测波长：205～215nm，流速：0.35ml/min。

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入超高效液相色谱仪中测定，标定共有峰，即得所述泽泻汤药物UPLC特征图谱、对照品溶液色谱峰图谱及最大吸收图谱，对照品与泽泻汤的重叠图谱，样品溶液中经对照品指认的色谱峰最大吸收图谱，见图32、图33、图34、图35、图36、图37、图38、图39、图40、图41、图42、图43、图44、图45、图46、图47、图48、图49、图50、图51、图52、图53、图54、图55、图56、图57；表19、表20。

表19泽泻汤特征图谱阴性干扰考察表(一)

表20泽泻汤特征图谱阴性干扰考察表(二)

结论：泽泻汤特征图谱检测方法中泽泻单方和白术单方中没有共有成分，互不干扰。

2.8泽泻汤特征图谱方法共有峰的确定

取6批泽泻汤，称相当于白术饮片0.4g的泽泻汤(批号ZXT190829HB，ZXTQG190813-1，ZXTQG190813-3，ZXTQG190813-4，ZXTQG190830-1，ZXTQG190830-2)，精密称定，置50ml容量瓶中，分别加70％甲醇至接近刻度，超声处理10分钟，冷却，定容至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液用0.22um的有机膜过滤，取滤液，即得按上述色谱条件进行测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对6批泽泻汤特征图谱进行全峰匹配，见图45、图46。

实验结果：对6批泽泻汤标准汤剂特征图谱进行分析，可确定的共有峰有19个，其中7个峰与对应的参照物保留时间相同：与泽泻醇B参照物相应的峰为对照峰(S峰)，计算特征峰1～峰16、峰18～峰19的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。已知峰为：0.14(环氧泽泻烯)，0.41(白术内酯Ⅲ)，0.62(23-乙酰泽泻醇C)，0.65(白术内酯Ⅱ)，0.72(泽泻醇A)，1.16(23-乙酰泽泻醇B)；未知峰规定值为：0.11(未知峰1)，0.13(未知峰2)，0.17(未知峰3)，0.18(未知峰4)，0.42(未知峰5)，0.64(未知峰6)，0.66(未知峰7)，0.70(未知峰8)，0.77(未知峰9)，0.90(未知峰10)，0.91(未知峰11)，1.15(未知峰12)。

经过指认的共有峰有7个，且百分面积占比均较高，所以选择特征图谱的方式作为泽泻汤检测的指标。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。