在疾病和发展中基于纳米抗体的ECM成像和靶向

摘要

提供了用于开发与疾病有关的纳米抗体的方法以及相关产品和试剂盒。疾病特异性蛋白质是与疾病的各个方面相关的细胞外基质(ECM)蛋白、结构域或表位，并且在无病个体中不存在或以非常低的量存在。本文提供了能够特异性结合这些ECM蛋白表位的高效纳米抗体，其可用于体内成像测定，疾病的检测、诊断和治疗以及监测患有疾病的患者的治疗进展。

说明书

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119要求2018年1月25日提交的美国临时申请序列号62/621,811的申请日的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

在一些方面，本发明涉及产生和鉴定对患病状态细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白特异的纳米抗体(nanobody)，以及此类纳米抗体在诊断、预后和治疗目的中的用途，以及相关的试剂、产品和试剂盒。

发明背景

细胞外基质(ECM)和ECM蛋白在生长、伤口愈合、细胞迁移和分化等过程中起着重要的生理作用。此外，在患病状态下，ECM的组成改变并且早先的观察结果表明，细胞外基质(ECM)蛋白的这些改变可以在癌症进展和转移、在心血管疾病和在纤维化中发挥重要作用。蛋白质组学领域涉及复杂生理系统中的蛋白质的研究及它们在这些系统中的作用。使用基因组学和蛋白质组学方法已经产生了大数据集，但是使用该信息来鉴定细胞外基质(ECM)蛋白在疾病中的作用受到了限制。这是因为ECM是不溶且交联的，并且其组成在最近应用特异性靶向ECM蛋白质的蛋白质组学之前是难以确定的。

发明内容

本发明涵盖开发、分离和使用针对ECM蛋白的纳米抗体(即，来自羊驼(alpacas)的单结构域抗体(single-domain antibody))，用于成像和靶向疾病状态的方法。感兴趣的ECM表位在癌症、转移和其他疾病状态中特异性表达。这些纳米抗体可用于多种目的，例如靶向肿瘤、转移或其他疾病位点(loci)的ECM，并利用纳米抗体的特异性来递送[1]成像剂；[2]不同类型的治疗剂；[3]免疫调节剂，包括修饰的T细胞；或[4]利用纳米抗体本身的功能特性来影响疾病状态。

本发明还涉及通过用富含肿瘤的ECM蛋白和/或结构域(统称为ECM表位)免疫骆驼科(camelids)来生产纳米抗体的方法，所述ECM蛋白和/或结构域已由先前对肿瘤和转移的蛋白质组学分析确定。使用这些方法生成的库提供了针对其他肿瘤增强型ECM表位的抗ECM抗体的可再生来源，用于生成靶向转移和其他患病状态的另外的肿瘤选择性抗ECM纳米抗体。

本公开的方面涉及组合物，其包含对患病状态细胞外基质(ECM)表位特异的并直接与其结合的纳米抗体，其中患病状态(diseased state)ECM表位以在患病组织中比在正常组织中更高的量存在，并且其中纳米抗体与一种或多种活性剂缀合。

在一些实施方案中，活性剂连接至纳米抗体的N-端。在其他实施方案中，活性剂连接至纳米抗体的C-端。在一个实施方案中，活性剂是成像探针。在一些实施方案中，成像探针选自荧光团、PET示踪剂、SPECT、NIR、磁性粒子成像或放射性同位素。在其他实施方案中，活性剂选自药物、毒素、细胞因子、免疫调节剂、ECM重构酶(ECM remodeling enzyme)、siRNA、shRNA、纳米颗粒、CAR-T细胞或用于靶向疗法的放射性同位素。

在一些实施方案中，纳米抗体一旦施用受试者，就以足以将纳米抗体和任何结合的活性剂集中在肿瘤或其他疾病位点的区域中的结合亲和力与患病状态的ECM蛋白表位特异性结合，使得在该疾病部位的水平远高于在身体其他部位的水平。纳米抗体的亲和力在nM到亚pM范围内(即，在实施例中测试的抗体，NJB2按BLI计具有

在一些实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白(fibronection)的EIIIA或EIIIB结构域中的表位。在其他实施方案中，患病状态ECM表位是生腱蛋白(Tenascin)C或生腱蛋白C的表位。在一个实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO：1-4所示的序列或为改善其亲和力或功效对该序列进行的修饰。

本公开的其他方面涉及一种组合物，其包含配制在药学上可接受的载体中的纳米抗体，该纳米抗体包含SEQ ID NO：1-4中所示的序列之一或序列中具有较小差异的衍生物。在一些实施方案中，纳米抗体与活性剂缀合。在其他实施方案中，将纳米抗体掺入单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或抗体片段或诸如嵌合抗原受体的另一种蛋白质中或者与它们缀合，以靶向另外的表位。

本公开的另一方面包括一种方法，其包括以有效量向具有肿瘤或其他疾病状态的受试者施用本文所述的组合物，以将活性剂递送至肿瘤/疾病部位。在一些实施方案中，该方法包括确定受试者中患病状态特征性的一种或多种ECM蛋白或表位的存在或不存在，并确定受试者是否患有疾病以及在体内哪里患有疾病。在这样的实施方案中，一种或多种ECM蛋白或表位的存在或不存在通过免疫组织化学或免疫荧光或其他成像方式(modality)如非侵入性体内成像方式(noninvasive in vivo imaging modality)如Immuno-PET/CT来确定。

在另一个实施方案中，该方法是通过评估患病状态特征性的一种或多种ECM蛋白或表位的存在、量或不存在以随时间追踪疾病进展至晚期阶段的方法。在一个实施方案中，该方法是在第一时间点和第二时间点测量从受试者分离的组织样品中与患病状态相关的一种或多种ECM蛋白或表位的存在、量或不存在并基于在第一时间点和第二时间点与患病状态相关的一个或多个ECM表位的存在、量或不存在的变化，确定疾病进展至更晚期。在一些实施方案中，患病状态是癌症、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、心肌梗塞(myocardialinfarction)、纤维化(fibrosis)、慢性炎症或伤口。在一个实施方案中，癌症是转移性癌症。

在一些实施方案中，当与患病状态相关的ECM表位以较高水平存在于来自所述第二时间点的分离的组织样品中时，该疾病已经进展到更晚期阶段。在另一个实施方案中，当与患病状态相关的ECM表位以较低水平存在于来自所述第二时间点的分离的组织样品中时，该疾病已经退行至次晚期阶段(less advanced stage)。在一些实施方案中，当与患病状态相关的ECM表位以较高水平存在于来自所述第二时间点的分离的组织样品中时，癌症已经进展成转移性癌症或已经生长。在其他实施方案中，当与患病状态相关的ECM表位以较低的水平存在于来自所述第二时间点的分离的组织样品中时，癌症已经消退为次晚期阶段的恶性状态。

在一些实施方案中，使用一种或多种特异性结合ECM表位的纳米抗体来检测ECM表位。在一个实施方案中，使用定量ELISA或Western印迹分析ECM蛋白或表位。在一些实施方案中，使用质谱法和/或色谱法检测ECM表位。

本公开的另一方面包括一种生成ECM蛋白及其表位特异的纳米抗体的多样化库的方法，其中ECM制备物是来自一个或多个富含转移相关蛋白的人类癌症转移的ECM。这样的库是通过从骆驼科的血液中分离淋巴细胞而得到的，该骆驼科已经用复合的富含ECM制备物进行了免疫，提取了淋巴细胞RNA，并从淋巴细胞RNA构建了基于M13噬菌体展示的纳米抗体库，其中该库是ECM特异性纳米抗体的多样化且可更新的库，可以根据需要从中分离许多特定的抗ECM纳米抗体。

在一些实施方案中，骆驼科是羊驼。在另一个实施方案中，从库分离纳米抗体，并将其用作体外亲和力成熟的支架，以进一步优化与ECM表位的结合。

本公开的另一方面提供了核酸载体库，其包含多个载体，每个载体在载体内具有不同的DNA序列，其中每个DNA序列与载体中的一个或多个其他DNA序列具有至少80％的序列同一性，并且其中该库具有10

在一些实施方案中，ECM表位是患病状态ECM表位。在另一个实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域。在其他实施方案中，患病状态ECM表位是生腱蛋白C或生腱蛋白C的表位。在一个实施方案中，纳米抗体包含与SEQ ID NO：1-4的序列具有至少70％序列同一性的序列。

在一些方面，本公开是用于产生嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)的方法，其涉及产生嵌合抗原受体(CAR)构建体，转染从受试者血液中取出的T细胞，并表达所述CAR构建体以在所述T细胞中产生功能性CAR，从而产生CART细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)构建体具有胞外结构域(ectodomain)、跨膜结构域和胞内结构域(endodomain)，所述胞外结构域包含对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合的纳米抗体，其中所述患病状态ECM表位以在患病组织中比在正常组织中更大的量存在。

在其他方面，本公开提供了嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)，其具有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合的纳米抗体，其中所述患病状态ECM表位以在患病组织中比在正常组织中更大的量存在

在另一方面，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包括编码具有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的CAR的核酸，所述胞外结构域包含对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合的纳米抗体，其中所述患病状态ECM表位以在患病组织中比正常组织中更大的量存在。

在一些实施方案中，如通过双层干涉法(Bilayer Interferometry(BLI))或其他方法所测量的，纳米抗体以在nM至亚-pM范围内的结合亲和力特异性结合患病状态ECM表位。

在一些实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域中的表位。在其他实施方案中，患病状态的ECM蛋白是生腱蛋白C或生腱蛋白C的表位。在其他实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO：1-4所示的序列或为改善其亲和力或功效而对该序列进行的修饰。

在其他方面，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包括编码CAR的核酸，所述CAR具有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含含有SEQ ID NO：1-4中所示的序列的肽或其片段，其对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合，其中所述患病状态ECM表位以在患病组织中比在正常组织中更大的量存在。

在一些实施方案中，肽是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，该片段是CDR。

在一些实施方案中，如通过双层干涉法(BLI)或其他方法所测量的，该肽以nM至亚-pM范围的结合亲和力特异性结合患病状态ECM表位。在一些实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域中的表位。在其他实施方案中，患病状态的ECM蛋白是生腱蛋白C或生腱蛋白C的表位。在另一个实施方案中，该肽靶向可变剪接的ECM蛋白内由患病状态的外显子表达的表位。

本公开的其他方面提供了一种用于治疗患有实体瘤的受试者的方法，包括以用于治疗患有实体瘤的受试者的有效量，向患有所述实体瘤的受试者施用嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)，其中所述CAR T细胞包括具有嵌合抗原受体(CAR)构建体的T细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)构建体具有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含纳米抗体肽，该纳米抗体肽包含SEQ ID NO：1-4所示的序列或其片段，其对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合，其中患病状态ECM表位以在患病组织中比正常组织中更大的量存在。

在一些实施方案中，该肽是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该肽是纳米抗体。在另一个实施方案中，该片段是CDR。

在一些实施方案中，如通过双层干涉法(BLI)或其他方法所测量的，该肽以nM至亚-pM范围的结合亲和力特异性结合患病状态ECM表位。在一些实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域中的表位。在其他实施方案中，患病状态的ECM蛋白是生腱蛋白C或生腱蛋白C的表位。在另一个实施方案中，该肽靶向可变剪接的ECM蛋白内由患病状态的外显子表达的表位。

在一些实施方案中，CAR在T细胞中表达。在另一个实施方案中，CAR在NK细胞中表达。

本公开的另一方面提供了一种在受试者中将免疫细胞募集到实体瘤的方法，涉及以将免疫细胞募集到实体瘤的有效量向患有所述实体瘤的所述受试者施用嵌合抗原受体T细胞(CART细胞)或嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)，其中所述CART或CAR-NK细胞包含具有嵌合抗原受体(CAR)构建体的T细胞或NK细胞，所述构建体具有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含含有SEQ ID NO：1-4中所示的序列的纳米抗体肽或其片段，其对患病状态细胞外基质(ECM)表位具有特异性并直接与其结合，其中所述患病状态ECM表位以在患病组织中比在正常组织中更大的量存在。

在一些实施方案中，该肽是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该肽是纳米抗体。在另一个实施方案中，该片段是CDR。

在一些实施方案中，如通过双层干涉法(BLI)或其他方法所测量的，该肽以nM至亚-pM范围的结合亲和力特异性结合患病状态ECM表位。在一些实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域中的表位。在其他实施方案中，患病状态的ECM蛋白是生腱蛋白C或生腱蛋白C的表位。在另一个实施方案中，该肽靶向可变剪接的ECM蛋白内由患病状态外显子表达的表位。

本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的构造细节和部件的布置。本发明能够具有其他实施方式并且能够以各种方式实践或执行。另外，本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，并且不应被视为限制。本文中“包括(including)”，“包含(comprising)”或“具有(having)”，“包含(containing)”，“涉及(involving)”及其变体的使用旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及另外的项目。

附图简述

图1A-1B示出了基于ClustalW的αEIIIBVHH序列(图1A)和αTNCVHH序列(图1B)的比对，它们各从2轮生物淘选中分离出来。不同的纳米抗体之间可区分互补决定区、CDR3或纳米抗体内其他地方的差异。CDR是决定互补性的区域。图1A中的序列从上至下，从左至右对应于SEQ ID NO：5、1、6、7、8和9。图1B中的序列从上至下，从左至右对应于SEQ ID NO：10、12、11、16、3、13、14、17、15、2、4。

图2示出了纳米抗体NJB2特异性结合纤连蛋白(FN)的EIIIB结构域中的表位。NJB2通过分选标记(sortagging)用生物素位点特异性标记，并用链霉亲和素-Alexa488检测。右图示出VHH NJB2特异性识别源自对照/野生型小鼠的主动脉内皮细胞ECM中FN的EIIIB结构域中的表位。然而，如左图所示，NJB2无法识别在源自缺乏FN的EIIIA和EIIIB结构域的小鼠(AB空小鼠)的内皮细胞的ECM中的FN。用对FN的EIIIB结构域中的表位具有特异性的小鼠单克隆IgG对αEIIIB对照进行染色。阴性对照C是未染色的细胞。

图3示出了VHH NJB2特异性识别肿瘤ECM。NJB2通过分选标记用德克萨斯红(Texasred)位点特异性标记，并引入小鼠中以标记肿瘤ECM。使用解剖的肿瘤的离体双光子显微镜术获得图像，并显示不同通道的重叠。细胞(原稿中的绿色)显示为白色的圆形物体。ECM(德克萨斯红染色的)显示为原纤维。左图示出了在成像前120分钟在NOD-SCID Gamma(NSG)小鼠中生长随后注射20ug NJB2-德克萨斯红的原位移植的LM2-Zs-绿色荧光素酶肿瘤的图像。右图示出了在成像前120分钟在注射了20ug NJB2-德克萨斯红的NSG小鼠中观察到的LM2-Zs-绿色荧光素酶肿瘤的肺转移图像。在这两种情况下，可以清楚地看到肿瘤细胞周围被纳米抗体结合的ECM纤维(箭头)。

图4A-4C示出了

图5A-5B示出了

图6示出了小鼠的代表性PET-CT图像，用

图7A示出了对照BALB/c小鼠和具有源自4T1三阴性乳腺癌细胞的原发性肿瘤和肺转移的小鼠。图7B示出了对照C57Bl/6小鼠和具有源自B16F10黑素瘤细胞的皮下肿瘤或肺转移的小鼠。代表性的PET/CT图像示出了来自原发性肿瘤“T”，肺转移瘤“LM”，肾脏“K”和膀胱“B”的PET信号。

图8示出了通过向C57BL/6小鼠单次气管内施用0.035U硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)诱导的肺纤维化。用

图9示出了由

图10示出了在转移组织阵列上用生物素化的NJB2进行免疫组织化学的结果，该转移组织阵列具有来自多个器官的104位患者的活检样品(2个活检/患者)。图示出44％的患者具有对于间质FN-EIIIB阳性的转移。这包括2个活检阳性(29％)和单活检阳性(15％)的患者。这是对阳性转移数目的低估，因为在小活检中并未完全捕获肿瘤异质性。表4列出了原发性肿瘤来源和得分的(scored)转移部位。

图11A-11B示出了使用αTNC纳米抗体NJT3，NJT4和NJT6的ELISA测定的结果。将ELISA板用3ug/ml纯化的人TNC蛋白包被，并测试增加浓度的VHH NJT4(图6A)和NJT3和NJT6(图6B)与TNC的结合并确定结合亲和力。

图12示出了αTNC纳米抗体NJT3，NJT4和NJT6特异性结合肿瘤ECM。在NSG小鼠中发展的LM2-Zs绿色-萤光素荧光素酶细胞肺转移的免疫组织化学揭示，纳米抗体特异性识别转移性ECM中的TNC。

图13示出了三种不同的特异性识别肿瘤ECM的抗TNC VHH。VHH通过分选酶介导的标记用德克萨斯红进行位点特异性标记并注射到荷瘤小鼠体内。使用离体双光子显微镜获取图像，并显示绿色和红色通道的重叠；肿瘤细胞(原稿中为绿色)被德克萨斯红标记的ECM纤维(箭头)包围。来自NSG小鼠的原位LM2-Zs-绿色荧光素酶肿瘤的图像，在成像前120分钟，所述小鼠注射了20ug所示的用德克萨斯红标记的VHH。

图14示出了

图15A示出了将B16F10细胞皮下植入C57BL/6免疫活性小鼠中并在左侧未处理(无)或在第4和11天用CAR-T细胞处理后的肿瘤大小，识别了纤连蛋白的EIIIB结构域(B2)。用抗EIIIB-FN CAR-T细胞处理的肿瘤显示出明显降低的生长速度。在免疫缺陷RAG2基因敲除小鼠中进行的平行实验显示，肿瘤生长几乎没有抑制作用，表明宿主免疫细胞对此抑制作用有贡献。图15B：未处理的肿瘤(C)或CAR-T处理的肿瘤的免疫宿主化学，显示出脉管系统(CD31)以及T细胞向处理后的肿瘤募集的显著增强；总T细胞(CD3)和CD4+和CD8+T细胞。图15C：T细胞浸润的定量显示出在CAR-T细胞处理的肿瘤中大大增加的T细胞数量。

发明详述

细胞外基质(ECM)，包括细胞分泌的细胞外分子，为周围细胞提供了结构和生化支持。它用作多种另外的用途，包括将组织彼此隔离(segregate)，调节细胞间通讯，为细胞提供生物力学和生化支持以及隔离(sequester)生长因子，此外还涉及诸如伤口愈合、血管生成和生长的生理过程。ECM还参与病理生理过程，包括肿瘤侵袭和转移以及与ECM重构相关的其他疾病。ECM的组成、硬度和弹性已显示出导致对基因表达、细胞存活、增殖和分化以及癌症进展的影响。

癌症是一种复杂的疾病，通常是通过一个或多个导致原发性肿瘤过度生长的突变事件而从原发性肿瘤开始进展。只要原发性肿瘤仍然局限于其起源部位，通常就能通过手术切除它，并且它通常被称为良性肿瘤。然而，肿瘤细胞本身固有的和通过募集与肿瘤细胞相互作用的非肿瘤细胞(通常称为“基质(stromal)”细胞)的进一步变化，导致肿瘤状态的进展，最终导致侵袭到基础组织(underlying tissue)中。这样的肿瘤被称为浸润性或恶性的，并且由于其已经侵入并扩散而难以确保去除所有肿瘤细胞，因此很难通过手术治疗。转移过程加剧了这个问题，在转移过程中，肿瘤细胞从原发性肿瘤中分离并从原发性肿瘤中迁移出来，最终渗透到脉管系统和/或淋巴管中，并在体内广泛传播，在远端部位播种继发性肿瘤或转移灶。尽管某些转移可以通过手术切除，但它们通常很多，可能很小且难以检测，并因此无法通过手术切除。然后，治疗需要放疗或化学疗法，且尽管付出了数十年的努力，但这些方法仍然无效，并且转移性癌症导致90％的癌症死亡。因此，迫切需要更好地了解转移的机制以及开发检测和根除转移的方法。

在某些方面，本文所述的发明包括开发对存在于诸如肿瘤、纤维化组织和动脉粥样硬化等患病组织的细胞外基质(ECM)中的蛋白质具有特异性的纳米抗体的方法。这些蛋白质在肿瘤、转移部位、纤维化、动脉粥样硬化、炎性病症、动脉瘤和其他以ECM重构为特征的疾病中表达，并且重要的是，正常成人组织中几乎没有这些蛋白。例如，开发了对纤连蛋白(FN)的EIIIB结构域中的表位和对生腱蛋白C(TNC)具有高度特异性的纳米抗体，其存在于患病组织的ECM中，但不存在于正常健康的成年组织中。因此，产生的纳米抗体可用于体内和体外诊断成像(例如但不限于IF、IHC、PET/CT)，以及用于广谱疾病的多种靶向治疗。

如本文所用，细胞外基质(ECM)蛋白是指被认为是ECM的一部分的任何蛋白。ECM是后生(metazoan)生物的基本且重要组分，为细胞提供结构支持和锚固。ECM由高度交联的蛋白质的复杂网状物(meshwork)组成，并以器官内的间隙形式和以特殊形式存在，例如上皮，血管内皮下的基底膜以及某些其他组织和细胞类型(例如神经元，肌肉)周围的基底膜。细胞通过跨膜受体(其中整合素最为突出)粘附到ECM。这些细胞-基质相互作用导致刺激各种信号通路，从而控制增殖和存活、分化、迁移等。ECM的组成和ECM受体的所有组成成分(repertoire)决定了细胞的反应。还显示了ECM的生物物理特性(可变形性或刚度)调控这些细胞功能。除了核心ECM组分(纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白(laminin)、蛋白聚糖等)外，ECM还用作生长因子和细胞因子以及与ECM蛋白协同作用向细胞发出信号的ECM重构酶的储存库(reservoir)。

特别是，以在诸如癌症和转移等疾病状态下增强存在性为特征的ECM蛋白，例如纤连蛋白(FN)EIIIA和/或EIIIB结构域和生腱蛋白C(TNC)，可以用作结合纳米抗体的靶标。已发现FN的EIIIA和EIIIB结构域和TNC在患病状态下表达，例如在肿瘤，转移部位，纤维化，动脉粥样硬化，炎性病症，动脉瘤和其他疾病中表达，而在健康(未患病)成人组织中几乎不存在。因此，针对这些选择的结构域的纳米抗体的开发可用于识别患病组织(和受试者的患病状态)以及将治疗剂或其他货物递送至该区域。还已经显示其他ECM蛋白或其表位在肿瘤和/或转移瘤中选择性表达，并且可以类似地使用特异性纳米抗体检测。

如以下实施例所示，产生了针对ECM蛋白的纳米抗体库并筛选，导致针对疾病特异性ECM表位的新型和特异性纳米抗体(例如，NJB2，NJT3，NJT4和NJT6)的发现。特别地，例如，NJB2纳米抗体对纤连蛋白的EIIIB结构域中的表位具有特异性，并且NJT3，NJT4和NJT6纳米抗体对人生腱蛋白C蛋白具有特异性。还使用相同的蛋白质组学方法描述了在肿瘤或转移中选择性表达的其他肿瘤和/或转移性ECM蛋白和结构域(在本文中统称为ECM表位)，并且可以使用本文所述的任何方法对其进行检测和监控。

根据本发明使用的方法利用了技术的最新进步，其结合ECM的选择性富集、基因组中编码的ECM蛋白质完整清单(inventory)的生物信息学定义以及质谱分析学的应用。这些方法使得从少量组织样品中确定任何组织的ECM补体成为可能。这种方法已经证实，某些ECM蛋白和结构域(ECM表位)以比健康组织中更高的浓度存在于患病组织中。

本文描述了用于回收特异性结合在患病组织中选择性存在的ECM表位的纳米抗体的方法。本文描述了基于这些纳米抗体的应用和开发(exploitation)的几种方法。还提供了从患者样品中确定这些ECM表位的存在的方法，因而提供有关受试者是否患有特定疾病和/或疾病进展或消退的证据。可以使用偶联至活性剂的特定纳米抗体，使用标准免疫学方法(包括免疫组织化学，免疫荧光，ELISA，Western印迹，蛋白质阵列，非侵入性成像方法(例如Immuno-PET/CT)和类似方法)确定受试者的状态。使用此类方法可以提供诊断、预后和监控信息，从而允许对患者护理和治疗的改善的管理。

在本发明内也包括用于将活性剂(例如成像剂(例如，用于PET成像或其他成像方式等的放射性核素，荧光报告物或其他可检测试剂))特异性地靶向患病状态细胞外基质内单个ECM表位以检测疾病例如原发性肿瘤和/或转移的位置、程度和进展的方法。

将诸如治疗剂(例如放射性核素、化学治疗药物、毒素、细胞因子、siRNA、shRNA、纳米颗粒、CAR-T细胞等)的活性剂特异性地靶向单个ECM表位，以便将此类治疗剂集中到患病组织，例如，原发性肿瘤和/或转移，从而改善治疗指数的方法也是本发明的方面。可通过将治疗剂结合到针对上述方面中定义的ECM表位的特定纳米抗体来实现治疗剂的靶向。

本发明还涵盖能够任选地以缀合物形式与ECM表位相互作用的结合肽或多肽，例如纳米抗体，如下所述。本发明的结合肽或多肽优选以选择性方式结合至ECM表位。如本文所用，“ECM表位”是指患病状态的ECM中的与纳米抗体或肽相互作用的部分。该表位可以包含ECM蛋白的结构域，ECM蛋白的结构域的一部分，特异性翻译后修饰或可以涉及来自ECM蛋白的一个以上结构域的区域。如本文所用，术语“选择性结合”和“特异性结合”相对于结合肽或多肽可互换使用，是指结合肽或多肽对特异性ECM蛋白及其片段比对非ECM蛋白质或其他ECM组分更大的亲和力结合的能力。即，选择性结合ECM表位的结合肽或多肽将不会以与它们结合特定ECM表位相同的程度和相同的亲和力来结合非ECM蛋白或其他ECM蛋白。在一些实施方案中，本发明的结合肽或多肽仅结合特异性ECM表位。如本文所用，选择性地或特异性地结合特定ECM表位的结合肽或多肽将以较小的亲和力(如果有的话)结合至非ECM蛋白或其他不同的ECM蛋白。较小的亲和力可包括至少少10％，少20％，少30％，少40％，少50％，少60％，少70％，少80％，少90％或少95％。

优选地，ECM结合肽或多肽是纳米抗体。本文所述的纳米抗体对ECM表位具有选择性，所述ECM表位在诸如癌症的患病组织中特异性表达，并且在正常成人组织中基本上不存在或以标称浓度存在。纳米抗体具有许多重要特性，使得它们与其他抗体平台相比，在体内诊断成像和靶向递送方面具有优势。与抗体相比，纳米抗体更小(约15kDa)，从而允许更快的清除速度，因为肾小球滤过的肾脏截止值为60kDa(De Vos等人，Expert Opin BiolTher.13(8))：1149-60(2013))。与全尺寸抗体相比，纳米抗体还具有更好的组织渗透性和较短的循环半衰期。此外，与scFv或人造支架不同，纳米抗体是体内亲和力成熟的，其允许分离高功能(即高亲和力)的结合剂。纳米抗体比scFv更适合与抗原表面的凹槽(例如酶的催化位点)相互作用(Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomed.8(6)：1012-36(2013))。骆驼科单结构域抗体(VHH)与人VH共有高度的序列同一性，并且尚未发现其会触发小鼠的免疫原性应答。同样，在当前的临床试验中也没有报道人的免疫原性不良反应。纳米抗体可以被人源化(Rashidian等人，PNAS，112(19)：6146-6151(2015))，是可再生资源，并且在添加活性剂例如成像探针后通常是稳定的。稳定的缀合纳米抗体可以快速且可重复地产生和纯化。

在一些实施方案中，纳米抗体具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应的氨基酸序列，但是已经被“人源化”，即通过用在人类的常规四链抗体的VH结构域的相应位置出现的一个或多个氨基酸残基取代天然存在的VHH序列的氨基酸序列(特别是在框架序列中)中的一个或多个氨基酸残基。人源化的方法是众所周知的。与相应的天然存在的VHH结构域相比，人源化的纳米抗体可能具有多种优势，例如降低的免疫原性。“人源化”可以通过如下进行：提供编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列，然后以使新核苷酸序列编码“人源化”纳米抗体的方式改变核苷酸序列中的一个或多个密码子。然后可以表达该核酸以提供纳米抗体。备选地，基于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列，可以设计人源化纳米抗体的氨基酸序列，然后使用肽合成技术从头合成。熟练的技术人员还可以以合适的方式组合一个或多个天然存在的VHH序列(例如一个或多个FR序列或CDR序列)和/或一个或多个合成或半合成序列的一个或多个部分，以便提供纳米抗体或核苷酸序列或编码该核酸的核酸。

在一些实施方案中，术语纳米抗体是指本文所述的纳米抗体的类似物，突变体，变体，等位基因，同源物和直系同源物。通常，与本文公开的纳米抗体相比，在此类类似物中，一个或多个氨基酸残基可能已经被取代、缺失和/或添加。此类取代、插入、缺失或添加可以在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中，特别是在本文公开的序列(包括SEQ ID NO：1-4)的纳米抗体的CDR的类似物中进行。表3呈现了示例性CDR。

在一些实施方案中，纳米抗体包含与本文提供的任何氨基酸序列共有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，纳米抗体的氨基酸序列包含本文提供的氨基酸序列。

备选地，本文所述的纳米抗体可在本文举例说明的抗体之一的一个或多个CDR区域中包含多达5(例如4、3、2或1)个氨基酸残基变异，并与抗原的相同表位以基本相似的亲和力(例如，具有相同顺序的KD值)结合。在一实例中，氨基酸残基变异是保守的氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。

如本文所用，“类似物”是如在BLASTp比对中测量的，其中每个或任何框架区以及每个或任何互补决定区与参考序列中的相应区域显示至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选90％同一性，甚至更优选95％同一性(即FR1_类似物对FR1_参考，CDR1_类似物对CDR1_参考，FR2_类似物对FR2_参考，CDR2_类似物对CDR2_参考，FR3_类似物对FR3_参考，CDR3_类似物对CDR3_参考，FR4_类似物对FR4_类似物)的序列。

取代可以是例如保守取代和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置的另一个氨基酸残基取代。缺失和/或取代可以以这样的方式设计：除去一个或多个用于翻译后修饰的位点(例如一个或多个糖基化位点)或引入一个或多个用于连接官能团的位点，例如，允许位点特异性的聚乙二醇化。

可以修饰纳米抗体的氨基酸残基，即在蛋白质骨架上或在侧链上)。修饰包括将一种或多种官能团、残基或部分引入纳米抗体之内或之上。官能团可直接连接至纳米抗体或通过接头(linker)或间隔物(spacer)间接连接。增加药物蛋白的半衰期和/或降低其免疫原性的方法涉及连接聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚乙二醇(methoxypoly(ethyleneglycol))或mPEG)。例如，PEG可以连接至天然存在于纳米抗体内的半胱氨酸残基或在末端或纳米抗体内合成添加至纳米抗体。在一些实施方案中，PEG具有大于5000且小于100,000或大于10,000且小于200,000的分子量。其他修饰包括N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达纳米抗体的宿主细胞。纳米抗体可通过从此类VHH结构域的库例如噬菌体库中选择而获得。可以通过从免疫动物的B细胞中插入含有抗体VHH结构域的多核苷酸库来创建噬菌体库。可以操纵噬菌粒库的多样性以增加和/或改变库的多肽的特异性，以产生并随后鉴定另外的、所需的分子性质和编码它们的多核苷酸。库涉及高水平的多样性，因为有可能在每个位置引入32个不同的密码子之一，并引入所有20个氨基酸。理论上，这样的库每n个残基增长32

制备纳米抗体库的方法通常涉及用针对(即)患病组织的制备物要免疫的材料免疫骆驼科(例如骆驼、单峰骆驼(dromedary)、羊驼、骆马(vicuna)、美洲驼(llama)等)。例如，如实施例部分中所述，可以用来自人类癌症患者的特定ECM制备物免疫羊驼，以产生羊驼来源的纳米抗体，该纳米抗体对与疾病相关的ECM蛋白表位具有特异性。然后可以从血液样品中分离淋巴细胞，然后可以使用淋巴细胞RNA来构建基于噬菌体展示的纳米抗体库，例如使用M13噬菌体。然后可以针对疾病涉及的多组(diverse set of)ECM和ECM相关抗原来筛选新型纳米抗体的库。该方法涉及收获可以从其分离核酸的外周血淋巴细胞。VH结构域序列所来源的核酸可以是总RNA，或更具体地，是从自宿主获得的样品中的细胞中分离的mRNA。表达载体可以是用于库构建的任何合适的载体，并且优选是允许使用基于噬菌体展示的选择方法来选择靶标特异性抗体片段的噬菌体或噬菌粒载体。从这些库分离的抗体序列然后可用作体外亲和力成熟的支架，以进一步改善与靶抗原的结合。所使用的免疫原直接来源于人类癌症转移标本的患病ECM，或者是存在于疾病部位的一组ECM蛋白，单独混合以制备用于免疫的混合物(cocktail)。这些库包含结合该患病ECM的多种组分的VHH序列。纳米抗体可以在其N或C-端容易地用不同的活性剂进行位点特异性标记，从而有助于它们在成像和/或治疗应用中的使用。

本发明涵盖以高通量方式产生针对ECM表位的纳米抗体的方法。作为非限制性实例，提供了一种方法，其通过(i)用从患病组织中分离的ECM蛋白免疫动物和(ii)筛选与患病组织中的ECM蛋白的表位特异性结合的纳米抗体，来产生ECM蛋白结合剂，例如纳米抗体，其特异性结合与疾病状态相关的ECM蛋白的表位，并优选从患病组织中分离。

在一些实施方案中，本文所述的纳米抗体或其他肽特异性结合相应的靶表位。“特异性结合”表位的纳米抗体或肽，例如抗体，是本领域众所周知的术语。如果某个分子与特定靶抗原的反应比与其他(alternative)靶抗原的反应更频繁、更快速、以更长持续时间和/或具有更大的亲和力，则该分子被认为表现出“特异性结合”。如果与结合其他物质相比，纳米抗体以更大的亲和力(affinity)、亲和力(avidity)、更容易和/或以更长持续时间结合，则该纳米抗体“特异性结合”靶抗原或表位。例如，特异性地(或优先地)结合抗原或其抗原表位的纳米抗体是这样的纳米抗体，该纳米抗体以比其结合其他抗原或相同抗原中的其他表位更大的亲和力、亲和力、更容易和/或以更长持续时间结合该靶抗原。同一抗原中的其他表位。通过该定义还应理解，例如，特异性结合第一靶抗原的纳米抗体可以或可以不特异性地或优先地结合第二靶抗原。这样，“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。在一些实例中，“特异性结合”靶抗原或其表位的纳米抗体可不结合其他抗原或相同抗原中的其他表位。

在一些实施方案中，本文所述的纳米抗体对靶抗原或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或K

例如，在一些实施方案中，与对第二ECM表位的结合亲和力相比，本文所述的抗ECM纳米抗体具有对第一ECM表位更高的结合亲和力(更高的K

结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法确定，包括平衡透析，平衡结合，凝胶过滤，ELISA，表面等离振子共振或光谱法(例如，使用荧光测定法)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于测量结合的结合蛋白的浓度作为目标蛋白浓度的函数。结合结合蛋白([结合，Bound])的浓度通常与游离目标蛋白([游离，Free])的浓度有关，其关系式如下：

[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])

但是并非总是必须进行K

进一步的步骤可以包括例如但不限于亲和力成熟的步骤，表达和/或修饰所需氨基酸序列的步骤，筛选与所需抗原(ECM表位)结合和/或针对所需抗原(ECM表位)的活性的步骤，确定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个人源化取代的步骤，以合适的多价和/或多特异性格式进行格式化的步骤，筛选特定的所需生物学和/或生理学性质的步骤。

ECM重构是多种疾病的典型特征，并且这些疾病中至少共有一些ECM生物标志物表位。因此，如以下实施例所述生物淘选的纳米抗体可以适用于以ECM重构为特征的多种疾病。

在一些实施方案中，根据本发明有用的结合试剂是分离的VHH抗体片段，所谓的纳米抗体。如本文所用，“分离的纳米抗体”是指与其他细胞材料基本上物理分离的多肽(例如，与产生纳米抗体的细胞分离)或与其他阻碍其在本发明的诊断或治疗方法中使用的材料分离的多肽。特别地，所述肽足够纯，并且充分不含其宿主细胞的其他生物学组分，从而可用于例如生产药物制剂或测序。因为本发明的分离的纳米抗体可以在药物制剂中与药学上可接受的载体混合，所以它们按制剂重量计可以仅占小百分比。然而，纳米抗体基本上是纯的，因为它已与可能与生物系统结合的物质基本分离。

在一些实施方案中，本文公开的纳米抗体的CDR或其他部分并入除纳米抗体以外的结构中。例如，可以根据本发明生产和使用包含本文公开的纳米抗体的一个或多个CDR的人源化抗体或其类似物。因此，该肽可以是抗体。

在其他实施方案中，本文所述的纳米抗体的肽可以与其他分子缀合，例如以增强递送。在一些实施方案中，肽或纳米抗体可以与抗体缀合。

本文中术语“抗体”以最广义使用，并且特别涵盖完整的单克隆抗体、由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性，以及抗体样分子，例如scFv。天然抗体通常是指由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白。每条重链和轻链具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，其后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，而轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。相信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

活性剂，例如成像探针(荧光团、PET示踪剂、放射性同位素等)，细胞因子，ECM重构酶，毒素，siRNA，shRNA，纳米颗粒，CAR-T细胞，药物或其他形式，可以非常易于位点特异性附着在纳米抗体上，以有针对性地递送到患病部位。例如，可以通过分选酶介导的反应(“分选标记”)在纳米抗体的N或C-端进行位点特异性标记(Guimaraes等人-Site-specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediatedreactions)。这种附着极大地促进了将附着于纳米抗体的任何货物靶向递送至患病的ECM表位。

与传统的全身疗法相比，这种靶向方法提供了许多优势，因为它允许在肿瘤和疾病ECM中选择性积聚，导致提高的检测和/或治疗的特异性和敏感性，以及背景毒性和脱靶毒性的降低。此外，尽管由于靶向蛋白的更广泛表达，其他靶向疗法经常受到全身毒性的挑战(Hansel等人，Nat Rev Drug Discov，9(4)：325-338(2010))；FN的EIIIB结构域和TNC在患病部位(或其他肿瘤特异性ECM表位)的选择性表达以及纳米抗体与各自目标蛋白的特异性结合避免了其他靶向疗法所面临的全身毒性。纳米抗体的尺寸也很小(约15kDa)，因此可以迅速从受试者清除，导致降低的全身作用。

与其他靶向疗法不同，例如乳腺癌和卵巢癌的HER2特异性纳米抗体和淋巴样肿瘤的利妥昔(Rituximab)单抗，本文所述的纳米抗体可以广泛地用作治疗/靶向剂，因为它们识别与患病ECM相关的抗原，而不仅限于特定的癌症类型。另外，本文公开的一些纳米抗体可以识别在以ECM重构为特征的其他疾病状态中表达的靶抗原。此类疾病状态包括但不限于心血管疾病，例如动脉粥样硬化、动脉瘤和心肌梗塞、纤维化和炎性疾病。与肿瘤细胞靶向疗法(例如抗CD30和抗CD20，由于肿瘤细胞异质性和肿瘤细胞的基因组不稳定性而可能具有有限的功效)相比，本文所述的纳米抗体靶向异源性较低且更稳定的特定ECM蛋白表位。由于降低或异源性的靶标表达、受体内在化(internalization)和药物外排(efflux)，肿瘤细胞靶向疗法也缺乏疗效。相反，ECM蛋白在癌症中很少具有突变，并且ECM冗余且易于获取。在给出的具体实例中，纤连蛋白和生腱蛋白C是肿瘤ECM的主要组分。使用本文和其他地方描述的蛋白质组学数据，可以类似地从M13噬菌体库中分离并鉴定其他肿瘤和/或转移特异性ECM蛋白和相关纳米抗体。

局部施用疗法经历不同的缺点：它们在治疗转移时不太有效，转移通常是多个且广泛分布的。然而，纳米抗体的全身性施用使它们能够进入整个身体的所有患病组织，包括原发性肿瘤和转移部位，并选择性地与肿瘤和/或患病的ECM结合。

如本文所用，分离的组织样品是使用相关医学领域的普通技术人员公知的方法从组织活检、手术切除的肿瘤或从身体去除的任何其他肿瘤块获得的组织。该组织可以被知晓为患病或怀疑为患病，例如，该组织可以被知晓为癌性的或疑似为癌性的。如本文所用，短语“怀疑为癌性”是指医学领域的普通技术人员认为含有癌细胞的癌组织样品。从活组织检查中获得样品的方法包括质量的总分配(gross apportioning of a mass)，显微解剖，基于激光的显微解剖或其他本领域已知的细胞分离方法。组织也可以是组织学切片。

由于患病组织活检材料中细胞类型的差异性以及所使用的预测方法的敏感性的差异性，因此分析所需的样品量可能是5mg，10mg，15mg，25mg，30mg或50mg或更大的组织。备选地，可以是活检尺寸的组织样品的部分或切片。可以基于活检的细胞组成和条件来确定适当的样品大小，并且用于该确定的标准制备步骤以及随后用于本发明的蛋白质的分离是本领域普通技术人员众所周知的。

备选地，可以在体内直接分析ECM蛋白。例如，可以将一种或多种能够识别一种或多种或患病的ECM蛋白表位的结合肽或多肽例如纳米抗体直接施用于受试者。可以用例如荧光、NIR、发光或PET探针标记结合肽或多肽，以辅助ECM的可视化。备选地，可以使用其他结合肽或多肽来提供ECM的可视化。在其他实施方案中，可以在暴露于结合肽或多肽之前从受试者中去除组织。

本发明可以用于检查受试者的患病状态的变化。患病状态是由受试者中生化物质的生产不足或生产过、外来生物体(即产生对宿主有毒的物质的生物体)的入侵或受试者的一部分的异常增殖引起的受试者的任何生理状况。例如，疾病状态包括与感染、癌症、转移等有关的疾病，并且这些疾病状态中的许多与ECM的过量产生和改变有关，而它们可以被本发明的纳米抗体靶向。可以随着时间和/或响应治疗干预来检查肿瘤转移状态的变化。为了实现这些方法，可以在不同时间和/或在有或没有药物治疗的情况下从受试者分离组织样品。可以分析不同组织样品的患病状态ECM表位的存在。然后，可以评估两个或多个样品之间ECM表位表达的差异。通过评估存在的不同蛋白质或通过测量蛋白质表达水平或近似水平(例如，通过ELISA)，可以定性地(例如通过免疫组织化学，IHC)分析差异。备选地，本发明的方法也可以在体内进行而无需去除组织样品。

本发明的方法涉及对在癌症、转移和其他疾病状态中特异性表达的ECM表位高度特异性的纳米抗体的衍生、验证和部署。这些独特、高效的抗体可用作缀合的纳米抗体，以允许成像探针(荧光、放射性、PET等)和其他试剂(包括但不限于药物、毒素、抗体、免疫调节剂、siRNA、shRNA、纳米颗粒、CAR-T细胞)向患病组织可及、普遍、稳定的细胞外组分的高度有效的递送方式(以低系统背景)。缀合技术、成像剂、活性剂、制备和成像这些独特抗体的方法在本领域中是已知的，并且在此包括它们的简要概述。

可以使用本领域中任何已知的方法来评估组织样品中蛋白质的存在或组织样品中蛋白质的水平。这样的方法学是众所周知的。临床和病理评估中常用的方法是免疫组织化学或免疫荧光法，它允许确定组织样品中特定蛋白质或蛋白质组的存在。免疫组织化学和免疫荧光的方法是众所周知的并且被广泛实践。当对蛋白质水平进行定量评估时，可以将蛋白质水平与参考量或阈值量或与其他样品中发现的量进行比较。例如，如果在原发性肿瘤及其转移或相应的正常组织中测量蛋白质的存在或水平，则可以将它们进行比较以提供对肿瘤或其转移进展的相对评估。备选地，可以将该水平与已知(或示出)为高于或低于肿瘤正常表达蛋白质的量进行比较。比较中使用的值称为参考或阈值水平。

阈值的特定确定中的实际数字可因不同的肿瘤或在不同的情况下(例如测定表达的测定条件)而异。然而，技术人员将能够基于情况识别正确的阈值。例如，可以在类似情况下使用正常的非癌性组织容易地生成阈值。

参考样品可以是可对其进行诊断评估的多种生物样品中的任何一种。参考样品的实例包括来自对照种群或对照样品的生物样品。可以通过制造来生成参考样品，以供与测试样品平行地进行测试，例如，可以在诊断试剂盒中提供参考样品。合适的参考样品对技术人员将是显而易见的。

在其他实施方案中，可以基于与参考水平的绝对值的直接比较来确定测试样品中蛋白质的表达水平。例如，高于参考中蛋白质的表达水平至少10％，至少20％，至少50％，至少100％，至少200％，至少500％，至少1000％或更高。在其他实施方案中，测试样品中蛋白质的表达水平为低于参考样品中蛋白质的表达水平至少10％，至少20％，至少50％，至少100％，至少200％，至少500％，至少1000％或更低。

在其他实施方案中，在第一时间点和随后的第二时间点确定受试者中一个或多个ECM表位的表达水平。一个或多个ECM表位的表达水平可以另外在其他随后的时间测量，使得测量的总数可以是3、4、5、6、7、8、9、10或更多。任意两次测量之间的时间间隔可以只有几天左右，或者也可以更长，例如数周、数月或数年。例如，获取样品之间的时间为6个月，8个月，10个月，1年，1.5年，2年，2.5年，3年，3.5年，4年，4.5年或5年。在获得受试者的第一(或更早)样品与获得后续或连续样品之间的时间可以是足以使改变疾病状态发生的时间。可以通过比较两个或更多个时间点之间分离的组织样品中的ECM表位表达水平来确定疾病的进展或消退。例如，在连续的时间点之间一种或多种ECM表位的存在或不存在或其表达水平的变化可以指示疾病的进展，例如疾病的晚期。特别地，在较晚的时间点获取的样品中一个或多个ECM表位的较高的表达水平和/或存在可以指示疾病已经进展到晚期。在某些情况下，该疾病可以是癌症，并且在较晚的时间点获取的样品中与患病状态相关的ECM表位的更高表达水平或更广泛的分布可以指示转移性癌症已经进展。相反，如果与来自第一时间点的分离的组织样品相比，来自第二时间点的分离的组织样品具有与患病状态相关的ECM表位的较低表达水平，则该疾病已经退步至次晚期。例如，连续较低的表达水平测量可指示癌症已经消退至转移较少的状态。

患病状态可以是任何非生理状态，例如癌症，动脉粥样硬化，心肌梗塞，纤维化或伤口。在某些情况下，癌症是转移性癌症。

可以使用本领域普通技术人员可用于蛋白质分析的多种技术中的任何一种来确定蛋白质或标记物的存在/不存在或水平，例如直接物理测量(例如质谱)或结合测定(例如，免疫组织化学，免疫测定，凝集测定和免疫色谱测定等)。该方法还可包括测量由化学反应产生的信号，例如，光吸收率的变化，荧光的变化，化学发光或电化学发光的产生，反射率、折射率或光散射的变化，可检测标记物从表面的累积或释放，氧化或还原或氧化还原物质，电流或电势，磁场的变化等。合适的检测技术可以利用通过其光致发光(photoluminescence)(通过其光敏性)来测量其发光(例如通过测量荧光，时间分辨荧光(time-resolved fluorescence)，消逝波荧光(evanescent wave fluorescence)，上转换荧光团(up-converting phosphors)，多光子荧光等)，化学发光，电化学发光，光散射，光吸收，放射性，磁场，酶活性(例如，通过引起光吸收或荧光变化或化学发光发射的酶促反应测量酶活性)测量标记，来测量标记的结合域的参与度，而检测结合事件。备选地，可以使用不需要使用标记的检测技术，例如，基于测量质量(例如，表面声波测量)，折射率(例如，表面等离振子共振测量)或分析物的固有发光的技术。

用于测量蛋白质表位水平的结合测定可以使用固相或同质形式。合适的测定方法包括夹心或竞争性结合测定。夹心免疫测定的例子描述于Grubb等人的美国专利号4,168,146和Tom等人的美国专利号4,366,241，其两篇通过引用并入本文。竞争性免疫测定的例子包括Deutsch等人的美国专利号4,235,601号，Liotta的美国专利号4,442,204和Buechler等人的美国专利号5,208,535，其全部通过引用并入本文。

可以使用多重测定形式来测量多个ECM表位，例如通过使用纳米抗体阵列进行多重测定(multiplex)，使用标记的光谱鉴别进行多重测定，通过对颗粒上进行的结合测定的流式细胞术分析进行多重测定。

样品中蛋白质表位的检测涉及常规方法。技术人员可以使用众所周知的方法来检测蛋白质的存在或不存在。这样的方法包括各种免疫测定。通常，免疫测定涉及抗体或类似探针与样品(例如组织学切片)中蛋白质的结合，或样品中蛋白质与固相支持物(例如塑料表面)的结合。然后加入可检测的抗体，该抗体选择性地结合至目的蛋白质。抗体的检测指示蛋白质的存在。可检测的抗体可以是标记的或未标记的抗体。可以使用与第一抗体特异性结合的第二标记抗体，或者第二未标记的抗体来检测未标记的抗体，该第二未标记的抗体可以使用与抗体复合的蛋白质A来检测。在80年代的免疫测定法，A.Voller等人编辑，University Park，1981中描述了各种免疫测定方法，其通过引用并入本文。

简单的免疫测定，例如斑点印迹和Western印迹，涉及使用与测试样品接触的固相支持物。测试样品中存在的任何蛋白质都结合固相支持物，并且可以通过特异性的可检测抗体制备物来检测。可以测量信号强度以获得定量读数，例如使用ELISA。其他更复杂的免疫测定包括用于检测蛋白质的正向测定法，其中将与固相支持物结合的第一抗蛋白质抗体与测试样品接触。在合适的温育期后，洗涤固相支持物以除去未结合的蛋白质。然后添加第二种独特的抗蛋白抗体，该抗体对第一抗体无法识别的一部分特定蛋白具有特异性。第二抗体优选是可检测的。在允许可检测抗体与通过第一抗体结合至固相支持物的特定蛋白质复合的第二温育期以后，第二次洗涤固相支持物以去除未结合的可检测抗体。备选地，在正向夹心测定中，将与第二抗体结合的第三种可检测抗体添加到系统中。其他类型的免疫测定包括同时和反向测定。同时测定涉及单个温育步骤，其中同时添加与固相支持物结合的第一抗体、可检测的第二抗体和测试样品。温育完成后，洗涤固相支持物以除去未结合的蛋白质。然后如在常规测定中那样确定与固相支持物相关的可检测抗体的存在。反向测定涉及将可检测抗体的溶液逐步添加至测试样品，然后是温育期，并在额外的温育期后添加与固相支持物结合的抗体。以常规方式洗涤固相支持物以去除未结合的蛋白质/抗体复合物和未反应的可检测抗体。

用于检测和定量抗体的许多方法是众所周知的。例如，可以通过将抗体连接到酶上并随后在酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如捕获ELISA)中使用抗体来可检测地标记抗体。酶随后暴露于其底物时，会与底物反应并生成化学部分，该化学部分可通过例如分光光度法，荧光法或目测手段进行检测。可以用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-甾体异构酶，酵母醇脱氢酶，α-甘油磷酸脱氢酶，磷酸三糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶，葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

本发明的方法包括使用具有可检测标记的纳米抗体进行体内成像的方法。例如，体内成像方法可以包括PET(正电子发射断层摄影(Positron Emission Tomography))成像。PET成像技术允许在分子水平上实时高质量地可视化生理过程。因此，PET在临床诊断和药物开发中非常有用。PET技术的许多技术改进已经开发，包括在示踪剂开发领域，标记策略以及选择性分子探针的智能设计两方面的进展，这些探针具有可视化涉及生理和病理生理过程的分子靶标的能力，但是，早期发现一些肿瘤和微转移仍然是一个挑战。申请人已经发现，与传统的FDG-PET/CT成像方式(modality)相比，使用根据本发明开发的独特纳米抗体的Immuno-PET/CT在技术上提供了意想不到的改进，并且显著改善了早期癌症和小转移的可视化。如图4所示，使用本发明的纳米抗体产生的图像的质量明显优于此类现有方法。

可检测标记是可以直接或间接确定其存在的部分。通常，标记物的检测涉及标记的能量发射。标记可以通过其发射和/或吸收特定波长的光子或其他原子粒子的能力(例如，放射性，发光，光学或电子密度等)直接检测。标记可以通过其结合、募集以及在一些情形下切割另一个本身可以发射或吸收特定波长的光的部分(例如，表位标签(例如FLAG表位)，酶标签(例如辣根过氧化物酶))等的能力来间接检测。间接检测的一个实例是使用第一酶标记，该酶将底物切割成可见产物。标记可以具有化学、肽或核酸分子的性质，但是不限于此。标记包括可以与成像技术一起使用的任何已知标记，例如PET同位素、闪烁成像、NMR等。其他可检测的标记包括放射性同位素(例如P

可以导致更高灵敏度的另一种标记技术包括将本文所述的分子偶联至低分子量的半抗原(hapten)。然后可以通过第二反应来具体改变这些半抗原。例如，通常使用诸如生物素的半抗原，其与抗生物素蛋白，或二硝基苯酚，吡哆醛(pyridoxal)或荧光素反应，它们可以与特定的抗半抗原抗体反应。

结合肽或多肽(包括抗体或其片段，例如本文所述的纳米抗体)与可检测标记的缀合尤其(among other things)促进了这类试剂在诊断测定中的使用。另一类可检测标记包括诊断和成像标记(通常称为体内可检测标记)，例如磁共振成像(MRI)：Gd(DOTA)；用于核医学：

如本文所用，“缀合的”是指通过任何生理化学手段彼此稳定结合的两个实体。重要的是，连接(attachment)的性质是实质上不会损害任一实体的有效性。牢记这些参数，可以采用本领域普通技术人员已知的任何共价或非共价键。在一些实施方案中，共价连接是优选的。非共价缀合包括疏水相互作用，离子相互作用，高亲和力相互作用，例如生物素-抗生物素蛋白和生物素-链霉亲和素复合以及其他亲和力相互作用。这种连接方式和方法是本领域普通技术人员众所周知的。

因此，本发明考虑ECM蛋白结合肽或多肽，例如纳米抗体，其可以任选地与活性剂缀合，例如用于本发明方法的可检测标记。可以将活性剂缀合至纳米抗体的N-端或C-端或内部氨基酸。在其他方面，本发明考虑直接缀合活性剂的ECM蛋白结合肽或多肽(例如，纳米抗体)。如果活性剂直接(例如，通过肽键)连接至氨基酸(即，N-端氨基酸，C-端氨基酸或内部氨基酸)，则ECM蛋白结合肽或多肽直接与活性剂缀合)。备选地，如果使用接头将活性剂与ECM蛋白结合肽或多肽连接，或者两种组分可以通过连接至共同载体分子而彼此间接连接，则ECM蛋白结合肽或多肽可以间接地与活性剂缀合。。

因此，接头分子(“接头”)可以任选地用于将ECM蛋白结合肽或多肽与另一分子连接(例如在多或双特异性抗体中)。接头可以是由一个或多个氨基酸组成的肽，或是非肽分子。可用于本发明的肽接头分子的实例包括富含甘氨酸的肽接头(参见，例如，US 5,908,626)，其中一半以上的氨基酸残基是甘氨酸。优选地，这种富含甘氨酸的肽接头由约20个或更少的氨基酸组成。纳米抗体的特殊优势是，在编码VHH结构域纳米抗体的克隆DNA序列的分离、亚克隆和表达过程中，掺入了短肽标签，这些短肽标签被分选酶识别，这些酶通过这些标签与其他实体进行便捷的缀合(Guimares等人)。

载体分子可包括例如PEG或TEG分子。PEG或TEG载体修饰的肽将被称为PEG化或TEG化的肽。

接头分子还可包括非肽或部分肽分子。例如，可以使用众所周知的交联分子例如戊二醛或EDC(Pierce，Rockford，Illinois)将ECM蛋白结合肽或多肽与其他分子连接。双功能交联分子是拥有两个不同反应位点的接头分子。例如，双功能接头分子的反应位点之一可以与肽上的官能团反应以形成共价键，而另一个反应位点可以与另一分子上的官能团反应以形成共价键。

同双功能交联剂分子具有两个化学上相同的反应位点。同双功能交联剂分子的例子包括但不限于戊二醛；N，N'-双(3-马来酰亚胺基-丙酰基-2-羟基-1,3-丙二醇(N,N'-bis(3-maleimido-propionyl-2-hydroxy-1,3-propanediol)(巯基特异性同双功能交联剂)；某些N-琥珀酰亚胺酯(例如，硬脂酸二琥珀酰亚胺酯(discuccinimyidyl suberate)，二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dithiobis(succinimidyl propionate))，以及可溶性双磺酸及其盐。

优选地，双功能交联剂分子是异双功能接头分子，这意味着该接头具有至少两个不同的反应位点，每个反应位点可以分别与肽或其他分子连接。此类异双功能接头的使用允许将每个反应位点化学分离地和逐步地添加(载体缀合(vectorial conjunction))至选定的肽序列。可用于本发明的异双功能连接分子包括但不限于间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)；间马来酰亚胺基-苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(m-maleimido-benzoylsulfosuccinimide ester)；γ-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(γ-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester)；和3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl 3-(2-pyridyl-dithio)propionate)。

本文所述的ECM蛋白结合肽或多肽的羧基末端氨基酸残基也可以被修饰以阻断或降低游离末端羧酸基团的反应性，例如，以防止形成酯、肽键和其他反应。这样的阻断基团(blocking group)包括形成羧酸基的酰胺。还可存在于多肽中的其他羧酸基团也可被阻断，只要该阻断不会引起不希望的免疫反应或显著改变ECM蛋白结合肽或多肽特异性发挥功能的能力即可。

天然或天然存在的ECM蛋白结合肽或多肽的合适的生物活性变体可以是该结合肽或多肽的片段、类似物和衍生物。“类似物”是指天然多肽或天然多肽的片段的类似物，其中该类似物包含具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的天然多肽序列和结构。ECM蛋白质纳米抗体或抗体片段是与小于全长ECM蛋白质结合纳米抗体或抗体相同或至少90％同源的肽，在本文中称为纳米抗体或抗体的部分。该纳米抗体或抗体的部分代表全长纳米抗体或抗体多肽。如果片段包含纳米抗体或抗体的至少2个氨基酸(连续或不连续)并与ECM蛋白结合，则代表全长纳米抗体或抗体。在一些实施方案中，该部分小于整个天然纳米抗体或抗体的90％。在其他实施方案中，该部分小于整个天然纳米抗体或抗体的50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％或5％。“衍生物”是指目标多肽、该多肽的片段或其各自类似物的任何合适的修饰，例如糖基化，磷酸化，聚合物缀合(例如与聚乙二醇)或其他外来部分的添加。只要保留了所需的纳米抗体或抗体的生物学活性。制备多肽片段、类似物和衍生物的方法通常是本领域可用的。

活性剂可以是如上所述的可检测标记。这样的化合物在体外或体内可用于检测和表征肿瘤细胞。

结合肽或多肽可以与作为药物或治疗剂例如抗癌药的活性剂缀合。这样的化合物可以用作治疗疾病和肿瘤的治疗性缀合物。

治疗性缀合物包括与细胞毒剂例如化学治疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素或其片段或小分子毒素)，放射性同位素(即放射性结合物)或CAR-T细胞缀合的结合肽或多肽，例如本文所述的纳米抗体)。可以与本发明的结合肽或多肽缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU，链脲佐菌素(streptozoicin)，长春新碱和5-氟尿嘧啶(它们是在美国专利号5,053,394，5,770,710中统称为LL-E33288复合物的试剂家族)以及伊司帕米星(esperamicins)(美国专利号5,877,296)。可以用于缀合物中的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素(exotoxin)A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒素蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒素(modeccin)A链，α-八叠球菌(α-sarcin)，油桐(Aleurites fordii)蛋白质，香石竹毒(dianthin)蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制备物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制备物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酹霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。

为了选择性破坏细胞，可以将抗体缀合高放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合的抗体。实例包括

在其他方面，细胞的选择性破坏可以由具有嵌合抗原受体的CAR-T细胞介导。如本文所用，CAR-T细胞是指已向其中引入嵌合受体以将其特异性重定向至所选抗原的T细胞。此类受体与细胞质信号传导结构域结合，包含识别独立于MHC限制而识别抗原的胞外结构域。可以将许多不同的肽作为嵌合抗原受体的胞外结构域引入T细胞。实例包括纳米抗体，单克隆抗体，人源化抗体，嵌合抗体，人抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该肽是纳米抗体。

在一个实施方案中，本公开提供了经工程改造以表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中CAR-T细胞表现出抗肿瘤特性。可以将CAR工程改造成包含与T细胞抗原受体复合物Zeta链(例如CD3 Zeta)的细胞内信号传导结构域融合的胞外结构域肽。CAR在T细胞中表达时能够基于抗原结合特异性来重定向抗原识别。示例性抗原是患病状态ECM表位，其在患病组织中比正常组织中以更大量存在。本发明包括任何抗原结合肽，其相关(cognate)抗原在患病组织中比在正常组织中以更大量存在，当所述抗原结合肽与其相关抗原结合时，其影响肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞无法生长、即刻死亡或受到其他影响，从而减轻或消除了患者的肿瘤负担。抗原结合肽优选与来自共刺激分子一种或多种的细胞内结构域和Zeta链的融合。在一些实施方案中，抗原结合肽与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域，CD28信号传导结构域，CD3 Zeta信号结构域及其任何组合的一个或多个胞内结构域融合。

在一些实施方案中，抗原结合肽是纳米抗体。在一些实施方案中，纳米抗体是对患病状态ECM表位具有特异性并直接结合的纳米抗体。在一实施方案中，患病状态ECM表位是纤连蛋白的EIIIA或EIIIB结构域。在另一个实施方案中，患病状态ECM表位是生腱蛋白C或生腱蛋白的表位。

在一些方面，本公开提供了通过产生嵌合抗原受体构建体来产生CAR-T细胞的方法。如本文所用，嵌合抗原受体构建体是指包含编码所需CAR的核酸的载体，所述CAR包括肽的胞外结构域、铰链和跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，例如人4-1BB和CD3-zeta的那些。这样的载体能够将所需CAR引入细胞。在某些情况下，载体是慢病毒载体。在一些方面，CAR的胞外结构域是纳米抗体。在其他方面，CAR的胞外结构域是单克隆抗体，人源化抗体，嵌合抗体，人抗体或抗体片段。在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗EIIIB纳米抗体，人CD8铰链和跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO：1-4所示的核酸序列。

天然杀伤细胞(NK Cells)是外周血淋巴细胞，在先天免疫功能中起作用。NK细胞表达各种活化和抑制受体，这些受体负责区分健康细胞和病毒感染的细胞或癌细胞。与T细胞不同，NK细胞以抗原独立的方式对靶细胞发挥细胞毒性作用。结果，NK细胞不需要抗原引发，并且在缺乏特异性抗原的情况下可以展现出强大的细胞毒性。

CAR可以将某种抗原特异性引入免疫效应细胞，例如NK细胞。因此，本发明的组合物包括药物组合物，其包含NK细胞、原代细胞和已经用至少一种嵌合抗原受体工程化的细胞系。

在某些实施方案中，工程化的NK细胞包含多个细胞，所述细胞对于被如本文所述的纳米抗体结合的ECM蛋白具有大于25％的阳性。在某些实施方案中，CAR包含靶向结构域氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1-4中任一项所示的序列具有至少80％的同一性。在某些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：1-4中任一项所列出的序列至少90％相同的靶向结构域氨基酸序列。在某些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：1-4中任何一个所示的序列至少95％相同的靶向结构域氨基酸序列。在某些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：1-4中任一项所列出的序列至少98％相同的靶向结构域氨基酸序列。在某些实施方案中，CAR包含与SEQ IDNO：1-4中任何一个所示的相同的靶向结构域氨基酸序列。

优选地，与表达ECM的特异性CAR表达的T和NK细胞对与癌症相关的ECM的亲和力相比，它们对与ECM蛋白相关的正常(非恶性)组织的ECM具有较低的亲和力。例如，这可能是由于癌细胞与正常细胞相比与更高水平的特异性靶向ECM蛋白相关和/或因为CAR的胞外结构域对与癌细胞相关的ECM特定形式具有更高的亲和力和/或对与正常细胞相关的ECM特定形式具有较低的亲和力。优选地，与CAR-T或NK细胞对正常ECM的亲和力相比，CAR-T或NK细胞对癌症ECM的更高亲和力为至少10％，至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％。优选地，与CAR-T或NK细胞对癌症ECM的亲和力相比，CAR-T或NK细胞对正常ECM的亲和力降低至少10％，至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％。至少90％，至少95％或至少100％。优选地，CAR-T或NK细胞对癌症ECM的亲和力增加至少1.5倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少100倍，更优选比CAR-T或NK细胞对正常ECM的亲和力大至少1000倍。

跨膜结构域连接细胞外结构域和细胞内信号结构域。跨膜结构域的实例包括但不限于CD28，CD3-ε，CD8-α，CD3，CD4和4-1BB。备选地，可以使用由人工多肽组成的跨膜结构域。

细胞内信号结构域传输T或NK细胞的效应子功能发挥作用所必需的信号。更具体地说，当细胞外结构域与靶ECM肽结合时，细胞内信号结构域传输激活细胞所需的信号。细胞内信号结构域包括用于通过例如TCR复合体传输信号的结构域，以及用于传输共刺激信号的结构域。共刺激分子的实例包括CD28、4-1BB(CD137)，CD2，CD4，CD5，CD134，OX-40和ICOS。

前导序列或信号肽也可用于促进CAR分泌。例如，可以使用GM-CSF受体的前导序列。另外，该结构优选由通过间隔物结构域连接在一起的细胞外结构域和跨膜结构域组成。更具体地，根据优选实施方式的CAR在细胞外结构域和跨膜结构域之间包含间隔结构域。间隔结构域用于促进CAR和靶ECM之间的连接。

工程改造的T或NK细胞可以是双特异性的，即表达双特异性CAR或多种不同的CAR，其中它们的亲和力是对两种不同的配体/抗原。双特异性CAR-T或NK可以用于增加癌细胞或癌症ECM中潜在结合位点的数目，或者备选地，用于将癌细胞定位于表达对T或NK-CAR特异性的配体的其他免疫效应细胞。为了用于癌症治疗中，双特异性CAR可以结合至靶肿瘤细胞或肿瘤ECM以及效应细胞，例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞。本公开的工程改造的T或NK细胞可以包含由相同T或NK细胞表达的双特异性CAR或多个CAR。这允许T或NK细胞同时靶向两种不同的抗原。

抗体和细胞毒剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯，亚氨基硫杂环戊烷(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,iminothiolane，IT)，亚氨酸酯(imidoesters)的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯盐酸盐(dimethyladipimidate HCl))，活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(disuccinimidylsuberate))，醛(例如戊二醛(glutaraldehyde))，双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))，双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))，二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯(toluene 2,6-diisocyanate))和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(Carbon-14-labeled1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid，MX-DTPA)是示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。接头可以是“可切割的接头”，其促进细胞毒性药物在细胞中的释放。例如，可使用酸不稳定的接头，肽酶敏感的接头，光不稳定的接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

另外，可以在治疗上使用细胞因子和抗体细胞因子缀合物。针对ECM蛋白的抗体可以用于递送细胞因子，所述细胞因子可以具有许多功能，包括增强对癌组织的免疫应答。细胞因子包括但不限于IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-18，TNF，IFN-γ，IFN-β，趋化因子和IFN-α。在一个实施方案中，可以将纳米抗体掺入嵌合抗原受体中，然后在T细胞(所谓的CAR-T细胞)的表面上表达，以将那些细胞靶向患病组织的ECM，从而在待被靶向的肿瘤细胞附近富集它们。

一方面，本发明提供了用于治疗与某些ECM蛋白表位的异常表达有关的其他病症或疾病的方法。与ECM表位的异常表达有关的病症或疾病的实例包括但不限于癌症，纤维化，动脉粥样硬化，炎性病症和动脉瘤。

一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。术语“肿瘤”，“癌症(cancer)”，“癌组织(cancerous tissue)”和“癌(carcinoma)”在本文中可互换使用，并且各是指细胞的不受控制的生长，其干扰身体器官和系统的正常功能。癌症，包括那些从其原始位置迁移并播种(seed)重要器官的癌症，最终可以通过受影响器官的功能消退而导致受试者死亡。癌症可以分为多种类别，包括癌、肉瘤(sarcomas)和造血系统癌症。癌是源自上皮细胞的恶性癌症，包括腺癌(adenocarcinoma)和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)。

如本文所用，受试者是人类，非人类的灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫或啮齿动物。在所有实施方案中，人类受试者是优选的。在与癌症中的预测疗法有关的本发明的方面中，受试者是被怀疑患有癌症或已经被诊断出患有癌症的人。识别怀疑患有癌症的受试者的方法可包括身体检查，受试者的家庭病史，受试者的病史，活检或许多成像技术，例如超声检查，计算机断层扫描，磁共振成像，磁共振波谱或正电子发射断层扫描。癌症的诊断方法和癌症诊断的临床描述是医学领域技术人员众所周知的。

癌症疗法及其剂量、施用途径和推荐用法是本领域已知的。在一些实施方案中，将本发明的治疗化合物配制成还包含一种或多种另外的抗癌剂的药物组合物。

将本发明的活性剂以治疗受试者的有效量施用受试者。例如，“有效量”是实现期望的生物学作用所必需或足够的量。例如，有效量是足以预防或抑制癌细胞生长或增殖的量，或者备选地是足以诱导癌细胞凋亡或诱导肿瘤消退的量。在一些优选的实施方案中，有效量是可用于减少转移性癌症发展的量。

本发明化合物在治疗受试者中的有效量可以根据所用的特定化合物、化合物的递送方式以及是单独使用还是组合使用而变化。对于任何特定应用的有效量也可以根据诸如受试者中癌症的类型和/或程度，用于治疗而施用的特定化合物，受试者的大小或疾病的严重性等因素而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定本发明的特定分子的有效量，而不必进行过度的实验。结合本文提供的教导，通过在各种活性化合物和权重因子(例如效力，相对生物利用度，患者体重，不良副作用的严重程度和优选的施用方式)之间进行选择，可以计划出有效的预防或治疗方案，其本身并不会引起实质性毒性，但对治疗特定受试者完全有效。

可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法来确定本发明方案的毒性和功效，所述标准药学方法例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50比率。表现大治疗指数的预防和/或治疗剂是优选的。虽然可以使用表现出毒副作用的预防和/或治疗剂，但应注意设计将这些试剂靶向到受影响组织部位的递送系统，以最大程度地减少对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用效果。

从细胞培养测定，动物研究和人类研究中获得的数据可以用于配制在人类中使用的预防和/或治疗剂的剂量范围。此类试剂的剂量优选在循环浓度范围内，包括几乎没有毒性或无毒性的ED50。取决于所采用的剂型和所采用的施用途径，剂量可在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何试剂，治疗有效剂量可以首先从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中制定剂量，以达到包括如在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状最大抑制一半的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。

如本文所用，术语“治疗(treat)”，“治疗的(treated)”或“治疗(treating)”是针对病症使用的，是指预防性治疗，与没有治疗的情况相比，其增加受试者对疾病发展的抵抗力，或者换句话说，降低受试者将发展该疾病的可能性，以及指在受试者发展该疾病后进行治疗以对抗疾病，防止疾病恶化或减缓疾病进展。

本文所述的诊断和治疗化合物可以与其他治疗剂组合施用，并且这种施用可以是同时或顺序的。当其他治疗剂同时施用时，它们可以以相同或分开的制剂施用，但确是同时施用。包括化学治疗剂在内的其他治疗剂的施用也可以在时间上分开，这意味着在本文所述的治疗剂的施用之前或之后的不同时间施用所述治疗剂。这些化合物施用之间的时间间隔可以是几分钟左右，或者也可能更长。当与本发明的疗法组合使用时，在某些情况下可以减少已知疗法的剂量以避免副作用。

因此，在某些情况下，本发明还涉及对受试者施用另一种癌症治疗(例如，放射疗法，化学疗法或手术)。常规癌症疗法的实例包括用诸如全反式维甲酸，放线菌素D，阿霉素，阿那曲唑(anastrozole)，阿扎胞苷(Azacitidine)，硫唑嘌呤(Azathioprine)，马法兰(Alkeran)，Ara-C，三氧化二砷(Trisenox)，BiCNU博来霉素(Bleomycin)，白消安(Busulfan)，CCNU，卡铂(Carboplatin)，卡培他滨(Capecitabine)，顺铂，氯丁酸，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，阿糖胞苷(Cytarabine)，环磷酰胺(Cytoxan)，DTIC，柔红霉素(Daunorubicin)，多西他赛(Docetaxel)，多西氟啶(Doxifluridine)，多柔比星(Doxorubicin)，5-氟尿嘧啶，表柔比星(Epirubicin)，埃博霉素(Epothilone)，依托泊苷(Etoposide)，依西美坦(exemestane)，厄洛替尼(Erlotinib)，氟达拉滨(Fludarabine)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)，吉西他滨(Gemcitabine)，羟基脲(Hydroxyurea)，赫赛汀(Herceptin)，羟基脲(Hydrea)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，伊立替康(Irinotecan)，依达比星(Idarubicin)，伊马替尼(Imatinib)，来曲唑(letrozole)，拉帕替尼(Lapatinib)，克拉屈滨(Leustatin)，6-MP，光辉霉素(Mithramycin)，丝裂霉素(Mitomycin)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，甲氯乙胺(Mechlorethamine)，孕酮(megestrol)，巯基嘌呤(Mercaptopurine)，甲氨蝶呤(Methotrexate)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，诺维本(Navelbine)，氮芥子碱(Nitrogen Mustard)，奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，帕米膦酸二钠(pamidronate disodium)，培美曲塞(Pemetrexed)，利妥昔单抗(Rituxan)，6-TG，紫杉醇(Taxol)，托泊替康(Topotecan)，他莫昔芬(tamoxifen)，泰索帝(taxotere)，替尼泊甙(Teniposide)，噻鸟嘌呤(Tioguanine)，托瑞米芬(toremifene)，曲美曲塞(trimetrexate)，曲妥珠单抗(trastuzumab)，缬沙(Valrubicin)，长春花碱(Vinblastine)，长春新碱(Vincristine)，长春地辛(Vindesine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，长春碱(Velban)，VP-16和希罗达(Xeloda)。

还考虑了多剂量的本发明分子。在一些情况下，当本发明的分子与另一种治疗剂例如化学治疗剂一起施用时，可以使用两个分子中任一个或两个的亚治疗剂量。如本文所用，“亚治疗剂量(sub-therapeutic dose)”是指这样的剂量，其小于在不存在其他药剂时在受试者中产生治疗结果的剂量。

本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的载体中的试剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物例如人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解，制备物应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性，热原性，一般安全性和纯度标准。该化合物通常适合于对人施用。该术语要求化合物或组合物是无毒的并且足够纯，以使得在施用于人类之前不需要对该化合物或组合物进行进一步的处理。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如，抗菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐剂，药物，药物稳定剂，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，此类材料及其组合，这对本领域普通技术人员是已知的(参见，例如Remington's PharmaceuticalSciences(1990)，以引用方式并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗或药物组合物中。所述化合物可以是无菌的或非无菌的。

本文所述的化合物可包含不同类型的载体，这取决于它是以固体，液体或气雾剂形式施用，以及对于诸如注射等施用途径是否需要无菌。本发明可以静脉内，皮内，动脉内，病变内，肿瘤内，颅内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，肿瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下，囊内(intravesicularlly)，经粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，外用，局部，吸入(例如，气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，局部灌注，直接局部灌注浸浴靶细胞，通过导管，通过灌洗，以乳膏，以脂质组合物(例如，脂质体)，或通过其他方法或上述方法的任何组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)，通过引用并入本文)。在一个具体的实施方案中，考虑腹膜内注射。

在任何情况下，组合物可包含各种抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。另外，可以通过诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂的防腐剂来预防微生物的作用，所述防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞(thimerosal)或其组合。

所述试剂可以以游离碱，中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物(proteinaceous composition)的游离氨基形成的那些，或与无机酸，诸如例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠，钾，铵，钙或铁的氢氧化物；或有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因(procaine)。

在组合物为液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，其包括但不限于水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)，脂质(例如，甘油三酸酯，植物油，脂质体)及其组合。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣；通过分散在例如诸如液体多元醇或脂质的载体中维持所需的粒度；通过使用表面活性剂，例如羟丙基纤维素；或其组合此类方法来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选包括等渗剂，诸如例如糖，氯化钠或其组合。

本发明的化合物可以直接施用于组织。直接组织施用可以通过直接注射来实现。化合物可以被施用一次，或者备选地它们可以以多个施用来施用。如果多次施用，则化合物可以通过不同途径施用。例如，最初(或最初的几次)施用可以直接对受影响的组织进行，而随后的施用可以是全身性的。

本发明的制剂在药学上可接受的溶液中施用，该溶液可以常规地包含药学上可接受浓度的盐，缓冲剂，防腐剂，相容性载体，佐剂和任选地其他治疗成分。通常，药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。核酸，小分子，肽，单克隆抗体和抗体片段的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员众所周知的。如本文所用，药学上可接受的载体是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。

药学上可接受的载体包括稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，稳定剂，增溶剂和其他本领域众所周知的材料。特别用于肽的示例性药学上可接受的载体在美国专利号5,211,657中描述。这样的制备物可以常规地包含盐，缓冲剂，防腐剂，相容性载体和任选地其他治疗剂。当在药物中使用时，盐应该是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐，并且不排除在本发明的范围之外。这样的药理和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，柠檬酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸等。同样，药学上可接受的盐可以制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠盐，钾盐或钙盐。

本发明的化合物可以固体，半固体，液体或气体形式配制成制剂，例如片剂，胶囊剂，散剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，贮存剂(depository)，吸入剂和注射剂，以及用于口服，肠胃外或外科手术施用的常用方法。本发明还涵盖配制用于局部施用的药物组合物，例如通过植入物，包括设计用于缓释或控释的那些。

适用于口服施用的组合物可以离散单位存在，例如胶囊，片剂，锭剂，每个均含有预定量的活性剂。其他组合物包括在水性液体或非水性液体如糖浆，酏剂或乳液中的悬浮液。

对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体混合来容易地配制化合物。这样的载体使得本发明的化合物能够被配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等，以被待治疗的受试者口服摄取。可以以固体赋形剂的形式获得用于口服的药物制剂，如果需要，任选地可以研磨所得混合物，并在加入合适的助剂之后，处理颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如例如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。任选地，口服制剂也可以在盐水或缓冲液中配制以中和内部酸性条件，或者可以不使用任何载体来施用。

糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封的软胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。也可以使用配制用于口服的微球。这样的微球在本领域中已经被很好地定义。所有口服施用的制剂应以适合于这种施用的剂量。

对于口腔施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

对于通过吸入施用，可以利用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体，以气雾剂喷雾形式从加压包装或喷雾器中方便地递送根据本发明使用的化合物。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀来递送计量的量而确定。胶囊和药筒可以配制用于吸入器或吹入器的明胶，其含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。制备气雾剂输送系统的技术是本领域技术人员众所周知的。通常，这样的系统应该利用不会显著损害活性剂生物学特性的组分(参见，例如，Sciarra和Cutie，“Aerosols”，在《Remington’s Pharmaceutical Sciences》，第18版，1990，第1694-1712页；通过引用并入本文)。本领域技术人员可以容易地确定用于生产气雾剂的各种参数和条件，而无需过度实验。

当需要全身递送时，可以将所述化合物配制成用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用的形式。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，并有添加的防腐剂。该组合物可以采取诸如在油性或水性运载体中的悬浮液，溶液或乳液的形式，并且可以含有诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂的配制剂。

肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉介载体包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。较低的剂量将由其他施用形式产生，例如静脉内施用。在施用初始剂量下受试者的反应不足的情况下，可以在患者耐受性允许的范围内采用更高剂量(或通过不同的、更局部的递送途径有效地更高的剂量)。考虑每天多剂量以达到合适的全身性化合物水平。

不可生物降解的和可生物降解的聚合物基质均可以用于将本发明的试剂递送至受试者。优选可生物降解的基质。这样的聚合物可以是天然或合成的聚合物。优选合成聚合物。基于需要释放的时间段选择聚合物，通常在几小时到一年或更长时间的数量级。通常，最希望在几小时到三到十二个月之间的时间内释放。聚合物任选地为水凝胶形式，其可以吸收高达其重量的约90％的水，并且此外，任选地与多价离子或其他聚合物交联。

在一个实施方案中，本公开提供了一种通过施用表达CAR的CAR-T细胞来治疗患有实体瘤的患者的方法。在另一个实施方案中，本公开提供了通过施用表达CAR的CAR-T细胞来将免疫细胞募集到患者体内的实体瘤的方法。在一些情况下，可以使用淋巴细胞输注来施用CAR-T细胞。优选地，治疗中使用自体淋巴细胞输注。使用本文所述和本领域已知的方法从需要治疗的患者中收集自体PBMC，并活化和扩增T细胞，然后将其注入回患者体内。在另一个实施方案中，本公开提供了一种通过施用与细胞因子或其他募集免疫细胞的结合剂偶联的抗ECM纳米抗体，将免疫细胞募集至患者实体瘤的方法。

本发明还包括由本文所述的各种试剂组成、组装完成本发明的方法的试剂盒。例如，试剂盒可包括用于检测一种或多种ECM蛋白表位，例如FN的EIIIB结构域和/或TNC的一种或多种试剂。试剂盒可进一步包含测定稀释剂，标准品，对照和/或可检测标记。可以针对特定样品优化测定稀释剂，标准品和/或对照。结合肽或多肽包括例如纳米抗体，抗体，核酸，标记的第二试剂。本领域技术人员将容易认识到，本发明的试剂可以容易地掺入本领域熟知的已建立的试剂盒形式之一中。

如本文所用，“促销的(promoted)”包括所有经商方法，包括包括教育，医院和其他临床指导方法，制药行业活动(包括药品销售)以及任何广告或其他促销活动，包括关于与癌症的治疗或表征有关的本发明的组合物的任何形式的书面、口头和电子通讯。

“说明书”可以定义促销的组件，并且通常涉及关于本发明的组合物的包装或与之相关的书面说明书。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明。

因此，在一些实施方案中，本文所述的试剂可以组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进它们在治疗，诊断或研究应用中的使用。试剂盒可以包括一个或多个容纳本发明的组件和使用说明的容器。具体地，此类试剂盒可包括一种或多种本文所述的试剂，以及描述预期的治疗应用和这些试剂的正确施用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的试剂可以是适合特定应用和试剂施用方法的药物制剂和剂量。

试剂盒可以被设计成促进医师使用本文所述的方法，并且可以采取多种形式。试剂盒的每种组合物，如果适用，可以以液体形式(例如溶液)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，某些组合物可以是可组成的或可加工的(例如，制成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如水或细胞培养基)，或可以或可以不随试剂盒一起提供。如本文中所使用的，“说明书”可以定义说明书和/或促销的组件，并且通常涉及在本发明的包装上或与本发明的包装相关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，以使用户清楚地认识到该说明书将与试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带，DVD等)，互联网和/基于网络的通讯等。书面说明书可以采用规范药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书还可以反映出该机构生产、使用或销售药品用于人类施用的许可。

试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的任何一种或多种组分。作为示例，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用受试者的说明书。该试剂盒可包括本文所述的容器容纳剂。所述试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运输。备选地，可以将其容纳在小瓶或其他容器中以进行存储。第二容器可具有无菌制备的其他试剂。备选地，试剂盒可以包括在注射器，小瓶，管或其他容器中预混合并运输的活性剂。

提供以下实施例以阐明本发明的实施的具体实例，而无意于限制本发明的范围。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，本发明将可应用于各种组合物和方法中。

实施例

实施例1：细胞外基质富集和LC/MS

获得了三阴性乳腺癌(TNBC)患者的肺和肝转移以及结直肠癌患者的肝转移。使用先前描述的方法，对样品进行这些组织的ECM富集(Naba等人，Mol Cell Proteomics.11：M111 014647(2012)。对一部分ECM制备物进行LC-MS/MS分析，然后剩余的部分用于免疫接种的羊驼，用于使用已经建立的方法来生成纳米抗体库的目的(Pardon等人，Nat Protoc.9(3)：674-93(2014)。

实施例2：羊驼免疫

已知患病组织的细胞外基质与正常组织不同，并且通常含有ECM蛋白和ECM蛋白表位，这些蛋白质专门或选择性地存在于患病部位(如LC/MS/MS所示，并通过免疫组织化学证实)。为了开发对与患病组织如癌症有关的ECM蛋白表位具有特异性的羊驼来源的纳米抗体，用以下免疫接种了四种不同的羊驼：(a)ECM蛋白和来自与患病的ECM有关的蛋白的合成肽的混合物；(b)从人类患者结肠癌转移到肝脏的ECM制备物；(c)从人类患者三阴性乳腺癌转移到肝脏的ECM制备物；和(d)人三阴性乳腺癌转移到肺的ECM制备物。

实施例3：纳米抗体库的构建

除了制造常规的免疫球蛋白外，骆驼科例如羊驼也制造仅重链抗体，其通过其VHH(仅重链抗体的重链可变区)结构域结合其抗原。重组VHH结构域称为纳米抗体，是在15kDa的单个蛋白质结构域中含有完整抗体的全部特异性的单结构域抗体。从自羊驼收集的血液中分离淋巴细胞，该羊驼经免疫后用ECM制备物加强免疫。提取淋巴细胞RNA，并通过PCR扩增编码VHH结构域的cDNA，并将其用于基于M13噬菌体展示的纳米抗体库的构建。针对上述细胞外基质蛋白制备物生成了四个M13库。库在表1中示出。这些库具有10

表1

实施例4：针对纤连蛋白EIIIB结构域的纳米抗体的开发和应用

纤连蛋白(FN)是大的多功能糖蛋白，其形成组织的细胞外基质(ECM)的主要组分(Hynes，Annu Rev Cell Biol.1：67-90(1985；Hynes 1990)。FN在发育、伤口愈合、组织修复、纤维化、心血管疾病、血管生成和肿瘤形成期间经历可变剪接(alternativesplicing)。这种可变剪接导致在疾病ECM中包含结构域EIIIA和EIIIB，但在正常ECM中却不包括(White和Muro，JUBMB Life，63(7)：538-46(2011))。这些结构域在疾病ECM中的表达，以及它们在正常组织和血浆中的缺失，使其成为基于纳米抗体的成像和疗法的有希望的靶标。

使用建立的噬菌体展示淘选方法，使用A库淘选对FN的重组表达的EIIIB结构域特异的纳米抗体。基于CDR3(互补决定区3)中的序列多样性，从淘选中分离出六个独特的克隆，其序列示于图1A和表2。CDR示于表3。加工这些克隆以表达编码的VHH纳米抗体，并使用各种体外测定(包括免疫印迹，ELISA，免疫荧光和免疫组化)测试其对EIIIB结构域中表位的特异性。图2证明了克隆NJB2对EIIIB结构域中的表位的特异性。

为了进一步测试NJB2与在肿瘤和转移部位表达的EIIIB的特异性和结合，使用2光子显微镜进行了离体荧光成像，并发现NJB2特异地定位于肿瘤ECM(图3)。通过免疫PET/CT进一步测试体内结合，将

胰腺导管腺癌(PDAC)通过明确的(well-defined)肿瘤形成阶段发展，且其特征是粘连形成(desmoplasia)和显著的ECM沉积。PDAC从初始到转移性疾病的进展能需要近20年的时间，这为早期检测提供了广阔的机会窗口。感兴趣的是测试NJB2是否可以用于PDAC进展的早期检测和跟踪。使用PDAC的KPC小鼠模型，该模型概括了PDAC进展的不同阶段，包括胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasias，PanINs)，它们是后来进展为PDAC的前体病变。为了测试PDAC进展过程中EIIIB的表达，观察到PanIN病变基质中EIIIB的表达以及PDAC基质中非常强的EIIIB染色，而正常胰腺中未检测到EIIIB。这些结果表明，在小鼠的PDAC进展过程中，含FN的EIIIB的纳入/表达增加。此外，在人PDAC患者样品的组织切片上用NJB2-生物素的IHC显示，纳米抗体与人PDAC基质中表达的EIIIB结合。为了体内测试NJB2与PDAC肿瘤的结合，通过尾静脉向2-8个月大的KPC小鼠注射

4.3：

接下来探讨NJB2纳米抗体是否可以靶向并检测具有免疫能力的乳腺癌(BALB/c中为4T1)和黑素瘤(C57BL/6中为B16F10)的同基因模型中的肿瘤和转移。4T1肿瘤是三阴性乳腺癌的模型，可以自发转移至远端部位，包括肺、肝和淋巴结。用

纤维化的特征是含有纤连蛋白的ECM的过多沉积。含FN的EIIIB/EIIIA在正常组织中的表达较低/不存在，但在纤维化部位的表达高。博来霉素已被广泛用于诱导实验性肺纤维化，其模仿了临床肺纤维化的许多方面。用

疾病进展的非侵入性监控(例如对疗法的反应)是体内成像的重要应用。为了评估

已经证明了纳米抗体可以检测到小的转移，这在使用常规成像(例如

表4

实施例5：针对人生腱蛋白C的纳米抗体的淘选

生腱蛋白C(TNC)是大的ECM蛋白，在成年人类组织中(腱和韧带中低表达水平以及CNS的室管膜下区(sub-ventricular zone)除外)基本上不存在(Giblin和Midwood，CellAdh Migr.9：48-82(2015))。但是，该蛋白质在与ECM重构相关的患病组织(例如炎症和癌症部位)中特异性表达。其在活化的基质/疾病相关ECM中的表达受限模式使其成为基于纳米抗体的成像和治疗方法的诱人靶标(Giblin和Midwood，Cell Adh Migr.9：48-82(2015)；Gocheva等人，2017)。

表1中描绘的库B和C用于淘选对人生腱蛋白C特异的纳米抗体。分离了11个独特的克隆(基于总体序列多样性)，其中8个基于其CDR3区是独特的，其序列在图1B和表2中示出。表3中示出了CDR。表达了这些克隆，随后使用包括免疫印迹，ELISA和免疫组织化学的各种体外测定测试了它们对生腱蛋白C的特异性。图11描绘了在ELISA测定中对人生腱蛋白C蛋白特异的三个纳米抗体(NJT3，NJT4和NJT6)。发现这些纳米抗体与肿瘤ECM中的生腱蛋白C特异性结合(图12)。

为了进一步测试VHH与肿瘤中表达的生腱蛋白C的特异性和结合性，通过分选酶介导的标签化，用德克萨斯红对NJT3，NJT4和NJT6进行位点特异性标记。使用2-光子显微镜进行离体荧光成像，并发现生腱蛋白C的VHH特异性定位于肿瘤ECM(图13)。体内结合通过免疫PET/CT进一步测试，将

实施例6：基于纳米抗体的CAR-T细胞抑制肿瘤生长和募集T细胞

尽管在处理血液系统癌症方面取得了成功，但是通过嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法很难轻易消除实体瘤。实体瘤通常在高度免疫抑制的环境中发展且难以靶向，主要是由于缺乏肿瘤特异性抗原表达，但其他因素也有贡献。识别这些标志物的基于单结构域抗体(VHH)的CAR-T细胞的使用避免了对癌细胞本身的肿瘤特异性靶标的需求。通过间质和ECM标志物靶向肿瘤微环境的基于VHH的CAR-T细胞在同基因的(syngeneic)、具有免疫能力(immunocompetent)的动物模型中有效对抗实体瘤。

在这项研究中生成的基于VHH的CART细胞遵循基于scFv的CAR-T细胞的原理设计，其中用编码带有跨膜和信号结构域的嵌合体中识别模块的慢病毒载体转导T细胞。在这种情况下，VHH取代了scFv作为识别模块。使用对纤连蛋白(NJB2)的EIIIB剪接变体特异的VHH通过本领域中使用的标准方法生成CAR构建体。使用慢病毒载体骨架以转导小鼠T细胞，从而使它们在其表面表达NJB2 CAR以产生肿瘤微环境特异的CAR-T细胞(以下称为B2CAR-T细胞)，该慢病毒载体骨架来源于鼠干细胞病毒，除了为测定(gauge)转导效率的IRES驱动的荧光标志物盒外，其还编码CAR构建体。

在确认了B2 CAR-T细胞与EIIIB的结合特异性之后，使用了B16F10黑色素瘤模型来表明，用B2 CAR-T细胞进行的处理会延迟肿瘤生长。小鼠皮下注射1x10

为了更密切地分析B2 CAR-T细胞处理的机制，对在接受处理时切除的肿瘤进行免疫组织化学(IHC)。用B16F10肿瘤接种野生型C57BL/6小鼠，然后对小鼠进行B2 CAR-T细胞处理或不进行处理。在第16天，当处理组和对照组之间的肿瘤大小有显著差异时(图15A)，将肿瘤切除，固定并进行IHC。然后对肿瘤样品进行CD31，CD3，CD4和CD8染色，以确定B2CAR-T细胞处理如何影响脉管系统和免疫细胞群。未经处理的肿瘤的结构看起来健康完整，而经过处理的肿瘤则显示出明显的破坏迹象。与对照相比，处理过的样品显示降低的CD31阳性脉管系统水平。由于B2 CAR-T细胞靶向EIIIB(在肿瘤基质和新脉管系统中表达)，因此在处理后的样品中，坏死性质和CD31表达缺乏可能是可以预期的。在所有肿瘤中平均而言，用B2 CAR-T细胞处理的患者具有升高的T细胞水平，这由与未处理的肿瘤相比，CD3，CD4和CD8的染色增加证明(图15B)。浸润的T细胞在图15C中定量。合理的解释是B2CAR-T细胞浸润肿瘤并可能还募集额外的免疫细胞。这些数据进一步证实了B2-CAR-T细胞浸润和破坏表达EIIIB的肿瘤的能力。肿瘤依靠由其基质和脉管系统提供的支持和营养，并且通过破坏这些相互作用，B2 CAR-T细胞显著延迟肿瘤的生长。

表2.纳米抗体的序列

表3.纳米抗体的CDR

这些实施例证实了分离靶向针对肿瘤富集的ECM蛋白表位的肿瘤选择性抗ECM纳米抗体的方法的功效，所述肿瘤富集的ECM蛋白表位已由先前对肿瘤和转移的蛋白质组学分析定义。生成的库将是针对其他肿瘤增强的ECM表位的多种其他抗ECM抗体的可再生来源(指出的是，用于免疫羊驼的富含ECM的制备物已通过质谱分析，因此知晓组成的ECM组分)。

因此，已经描述了本发明的实施方案的多个方面，应当理解，本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例。

序列表

<110> 麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)

<120> 在疾病和发展中基于纳米抗体的ECM成像和靶向

<130> M0656.70424WO00

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently herewith

<150> US 62/621,811

<151> 2018-01-25

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser His Asn

20 25 30

Ala Gly Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Asp Gly Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ser Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn

85 90 95

Ile Arg Gly Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Arg Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly His

115 120 125

His His His His His

130

<210> 2

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Asp Tyr Thr Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Ser Arg Ser Leu Asp Glu Phe Gly Asp Gly Tyr Glu Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Asp Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Glu Thr Gly Gly His His His His His His

130 135

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Phe Ile Gly Val Ala Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Ala Pro Leu Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His

115 120 125

<210> 4

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

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Ser Cys Ile Thr Pro Gln Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Asp Asp Ser Val

50 55 60

Met Gly Arg Phe Thr Ile Leu Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

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115 120 125

Gly Gly His His His His His His

130 135

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn

20 25 30

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<220>

<223> 合成多肽

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Met Ile Phe Ser Leu Asn

20 25 30

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<220>

<223> 合成多肽

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<220>

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<220>

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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Ser Gly Phe Arg Val Glu Gly Ser Ala Ile Gly

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<212> PRT

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 44

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 45

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 46

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 48

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<210> 50

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 51

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 52

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<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 53

Cys Asn Ile Arg Gly Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Arg Trp

1 5 10 15

<210> 54

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 54

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 55

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 56

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 57

Cys Ala Ala Asp Leu Trp Gly Ser Ser Cys Leu Val Glu Asp Phe Gly

1 5 10 15

Ser Trp

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 58

Cys Asn Ala Arg Gly Tyr Trp

1 5

<210> 59

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 59

Cys Ala Val Ser Arg Ser Leu Asp Glu Phe Gly Asp Gly Tyr Glu Met

1 5 10 15

Asp Tyr Trp

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 60

Cys Tyr Ala Pro Leu Thr Pro Tyr Trp

1 5

<210> 61

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 61

Cys His Gln Gly Trp Val Arg Ser Leu Gly Ala Asp Tyr Trp

1 5 10

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 62

Cys Ala Ala Ala Gly Ala Leu Thr Leu Asp Pro Ser Glu Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

Trp

<210> 63

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 63

Cys His Ala Thr Val Ser Asp Gln Ile Arg Pro Trp Val Ala Gly Asp

1 5 10 15

Tyr Trp

<210> 64

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 64

Cys Tyr Ala Lys Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Trp

1 5 10

<210> 65

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 65

Cys Tyr Ala Lys Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Trp

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 66

Cys Tyr Ala Lys Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Trp

1 5 10

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 67

Cys Asn Arg Lys Asn Leu Leu Leu Gly Ala Phe Thr Trp

1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 68

Cys Tyr Ala Lys Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Trp

1 5 10