一种基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料及其制备方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于ε‑聚赖氨酸的甲强龙递送材料及其制备方法和试剂盒。本发明的甲强龙递送材料可以延长甲强龙在关节腔内的驻留时间、增加甲强龙的半衰期，同时该材料具备软骨渗透型和细胞膜渗透性，可以以整体材料的形式渗透进入软骨组织和软骨组织中的干细胞和软骨细胞，在细胞内酶的作用下发生降解，释放甲强龙，提高甲强龙的生物利用率。本发明的甲强龙递送材料具有优异的组织和细胞相容性，不会引起毒副作用，具有良好的生物降解性，降解产物无毒性；同时该材料制备简单，且其使用过程非常简单，可以直接进行关节腔注射给药。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料及其制备方法和试剂盒。

背景技术

骨关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，临床表现为关节的疼痛和活动障碍。据统计，在我国60岁以上的人群中骨关节炎患病率可达50％，在75岁的人群中则达80％，该病致残率可高达53％。研究者预测，世界患骨关节炎的人数预计会在未来几十年内持续增加。目前，骨关节炎的干预主要以缓解疼痛和恢复功能为目标，并没有改善关节炎病理表现的临床治疗药物。抗炎止痛药的使用在骨关节炎的治疗中有着不可替代的地位，其中，甲强龙是临床使用较成熟的糖皮质激素。临床上常通过关节腔内注射的方式给药，短期缓解疼痛效果显著，是早期治疗中最常用的药物之一。

对于骨关节炎的治疗来说，关节腔注射优于系统给药：一方面软骨组织无血管，药物无法经血液循环作用于该处；另一方面，关节腔注射可以减少药物对其他组织的影响。然而，糖皮质激素的应用中也存在一定的问题。由于软骨的三重阻碍(软骨结构、毛细血管和淋巴管的清除和静电作用)和药物载体的局限性，糖皮质激素进入关节腔后，大多数悬浮在滑膜液中而无法有效进入软骨，往往很快就被血管和淋巴管清除，导致其只能发挥短期作用；此外，由于药物难以进入软骨，为保证其疗效只能以高浓度注射进关节腔内，频繁使用可能发生严重的副反应，包括全身反应和局部软骨损伤，非常不利于疾病的治疗。药效短和副反应大的问题使糖皮质激素的使用受到严重限制，两次注射间隔时间可有数月之久。期间患者的疼痛症状只能通过弱效止痛药部分缓解，仍然影响生活质量。目前，研究人员提出利用甲强龙结合控释材料的方案解决上述问题。

基于甲强龙干预关节炎的药理学特征，理想的甲强龙递送材料应该具有以下特性：可有效增加关节腔驻留时间，延长甲强龙半衰期；可协助甲强龙渗透软骨全层；对人体无毒，生物相容性强且具有生物可降解性。但目前并没有技术方案能够同时满足以上要求。

发明内容

本发明为解决现有技术的问题，提供一种基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料及其制备方法和试剂盒，该递送材料可增加甲强龙关节腔滞留时间、提高甲强龙渗透性、并对人体没有毒性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面是提供一种基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料，具有如式(I)的结构：

其中，n为正整数，且5≤n≤200，a、b为正整数与0的集合，且a+b＝n；

R

R

本发明的第二方面是提供一种甲强龙递送材料的制备方法，包括如下步骤：

S1：将甲强龙琥珀酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合溶解于二氯甲烷中，室温搅拌2小时；随后，蒸发掉二氯甲烷，并进行柱层析色谱分离，得到如式(Ⅱ)结构的化合物；

S2：将ε-聚赖氨酸盐酸盐充分溶解于有机溶剂/水的混合溶剂中，并调节pH至8-9，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液；

S3：采用有机溶剂溶解S1得到的式(Ⅱ)结构的化合物，然后缓慢滴加入所述ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液中，并且所述式(Ⅱ)结构的化合物与ε-聚赖氨酸分子中氨基的摩尔比为1：(0.01-5)，在25℃～60℃温度下搅拌反应2～10小时，随后向反应溶液中加入2～5倍体积的水，然后透析、冷冻干燥，即得所述甲强龙递送材料。

进一步地，所述有机溶剂/水中有机溶剂与水的体积比为1：(0.5-5)。

进一步优选地，所述有机溶剂/水中有机溶剂与水的体积比为1：(1.5-3)。

进一步地，所述有机溶剂为N.N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。

进一步地，步骤S3中，采用有机溶剂溶解S1得到的式(Ⅱ)结构的化合物，然后缓慢滴加入所述ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液中，在25℃温度下搅拌反应8小时。

进一步地，步骤S3中，所述透析采用1000Da截留分子量的透析袋。

本发明第三发明是提供一种试剂盒，所述试剂盒由式(I)所示化合物的冻干粉作为组分A，由生物相容性溶剂作为组分B。

进一步地，所述生物相容性溶剂为生理盐水、生理缓冲液或细胞培养液中的一种或几种混合。

本发明第四方面是提供所述试剂盒在关节炎干预、软骨损伤修复中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的甲强龙递送材料可以延长甲强龙在关节腔内的驻留时间、增加甲强龙的半衰期，同时该材料具备软骨渗透型和细胞膜渗透性，可以以整体材料的形式渗透进入软骨组织和软骨组织中的干细胞和软骨细胞，在细胞内酶的作用下发生降解，释放甲强龙，提高甲强龙的生物利用率。

本发明的甲强龙递送材料具有优异的组织和细胞相容性，不会引起毒副作用，具有良好的生物降解性，降解产物无毒性；同时该材料制备简单，且其使用过程非常简单，可以直接进行关节腔注射给药。

附图说明

图1是本发明甲强龙递送材料的软骨渗透性试验的显微镜照片；

图2是本发明甲强龙递送材料体外释放甲强龙的动力学曲线；

图3是本发明甲强龙递送材料干预小鼠关节炎的番红-O染色显微镜照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例以及附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施例提供一种基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料，具有如式(I)的结构：

其中，n为正整数，且5≤n≤200，a、b为正整数与0的集合，且a+b＝n；

R

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实施例2

本实施例提供上述实施例1中具有式(I)结构的基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料的制备方法：

准确称取0.475g(1mmol)甲强龙琥珀酸钠、0.138g(1.2mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和0.286g(1.5mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，充分溶解于25mL的二氯甲烷中，25℃搅拌2小时。随后，在200Pa、30℃下蒸发掉二氯甲烷，得到的固体粉末用2mL的二氯甲烷溶解。最后进行柱层析分离，分离条件：200-300目柱层析硅胶，洗脱液为体积比1:2的二氯甲烷/石油醚混合溶剂，得到如式(Ⅱ)结构的白色粉末活性中间体0.521g(0.912mmol)，产率91.2％。

准确称取1g(氨基的摩尔量为6.1～6.2mmol)的ε-聚赖氨酸盐酸盐(聚合度为25～30)，充分溶解于50mL的DMF/水混合溶剂(DMF与水的体积比为1：1.5)中，并利用2M的NaOH水溶液调节溶液的pH至8.5，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液。

准确称取0.348g(0.61mmol)的式(Ⅱ)结构的化合物溶解于10mL的DMF中，然后缓慢滴加入上述ε-聚赖氨酸盐酸盐溶液中，在25℃温度下搅拌反应8小时，随后向反应溶液中加入150mL的水。将上述液体放入截留分子量为1000Da的透析袋中，纯水透析48小时，每6小时更换一次透析液。最后，将透析后的液体进行冷冻干燥，得到1.291g如式(I)结构所示的甲强龙递送材料。由投料量计算，90％质量投入的中间体接枝到ε-聚赖氨酸的分子骨架上。

验证例

1.1本发明基于ε-聚赖氨酸的甲强龙递送材料可显著提高甲强龙在水中的溶解度验证试验：

实施例2中制备的1.291g甲强龙递送材料中，甲强龙分子结构所占质量为0.291g。准确称取0.11g实例2中制备的甲强龙递送材料，将其溶解于50mL的生理盐水中，对溶液进行了动态光散射实验，没有检测到任何粒径的纳米颗粒，该结果说明本发明制备的的甲强龙递送材料使其结构中的甲强龙完全溶解于水中，该状态下甲强龙对应溶解浓度为5.82mg/mL。而通过紫外-可见分光光度计，测得同等温度下，甲强龙琥珀酸钠溶解度为1.2mg/mL。由此可见本发明的甲强龙递送材料可显著提高甲强龙在水中的溶解度。

1.2软骨渗透性测试

利用具有氨基反应活性的荧光染料FITC标记实施例2中制备的甲强龙递送材料，并将其溶解于生理盐水中，配制成10μg/mL的溶液。另取新鲜提取的迷你猪关节，利用骨钻取直径4mm、厚1mm的关节软骨组织片；定制聚四氟乙烯模具，该模具上有若干直径4mm的贯穿圆孔；将关节软骨组织片卡于模具的圆孔中，模具上方加入配置好的荧光标记的甲强龙递送材料，下方加入生理盐水，并使液体与关节软骨组织片下部接触。24小时后，对组织样本进行冰冻切片和共聚焦显微镜观察，如图1所示。

图1的实验结果显示，24小时后，甲强龙递送材料高效的渗透进入软骨组织，并在整个软骨组织均有分布；同时，在软骨组织的细胞中也观察到了荧光信号。可见本发明构建的甲强龙递送材料可以高效的渗透软骨组织，并进入软骨组织中的细胞。

1.3关节腔驻留性

利用具有氨基反应活性的荧光染料Alex Fluor 680-NHS-标记实施例2中制备的甲强龙递送材料，并溶解于生理盐水中，制备成10μg/mL的溶液。利用微量注射器将10μL的上述溶液注射到C57小鼠的右膝关节腔中，而小鼠的左膝关节腔注射10μL同等荧光强度的Alex Fluor 680染料，不同时间点利用活体成像仪对小鼠关节腔内的荧光信号进行分析。实验过程中发现，甲强龙递送材料组中9天后依旧可以观察到关节腔内的荧光信号，而单纯染料组2天后基本就观察不到关节腔中的荧光信号。

1.4甲强龙的释放

将实施例2中制备的甲强龙递送材料分别溶解于含有和不含10U蛋白酶的pH＝7.4的生理缓冲溶液中，分别配制成1mg/mL的溶液，随后将配置好的溶液500μL置于截留分子量为1000Da的透析管中，并将透析管中置于5mL的pH＝7.4的PBS中进行透析，在固定时间点提取透析液，利用紫外-可见分光光度计检测透析液中的甲强龙，结果如图2所示。

实验结果显示，在没有蛋白酶条件下，透析液中基本检测不到甲强龙，说明本发明的甲强龙递送材料具有较好的水解稳定性；而在蛋白酶存在下，透析液中检测到了甲强龙分子，说明本发明的甲强龙递送材料在蛋白酶的作用下可以发生降解，释放甲强龙。

应用例

2.1甲强龙递送材料试剂盒的制备

配置1.291mg/mL实施例2制备的甲强龙送材料的水溶液；无菌环境下利用孔径220nm的滤膜对上述溶液进行过滤除菌；取2mL灭菌的上述水溶液装入5mL的西林瓶中，无菌环境下冷冻干燥后封瓶。

另取一西林瓶，装入2mL的生理盐水，直接封瓶，在120℃、205.8KPa下灭菌15分钟。

上述两瓶样品即组成一个试剂盒，其使用方法如下：利用无菌注射器吸出全部的生理盐水，加入甲强龙递送材料冻干粉中，室温下进行溶解，随后用无菌注射器吸出溶解的液体进行注射使用。

2.2甲强龙递送材料干预C57小鼠关节炎的效果评估

取20只重量为25g±5g的雌性C57小鼠，其中15只将它们的左、右膝关节十字韧带剪断，在SPF级动物实验室饲养1周，构建小鼠的关节炎模型，剩余5只不作手术处理。将上述15只关节炎模型小鼠随机等分成3组，第1组右膝关节腔注射10μL上述应用例提供的试剂盒中的甲强龙递送材料注射液；第2组右膝关节腔注射10μL含有1μg的甲强龙的生理盐水液体；第3组注射10μL生理盐水；5只假手术组为第4组，不对关节腔进行注射。在14天时依照上述注射剂量给予各组实验动物第二针注射。分别在第一针注射4周及8周后，对每只小鼠进行双足平衡试验，比较左右下肢负重情况，以评估不同干预组小鼠的功能学改变，结果如图3所示。

甲强龙软骨递送材料干预的第1组右肢/左肢数值接近1，即左右后肢无明显差异，与正常假手术组(第4组)小鼠较接近。第2组的功能学表现较优于第3组对照组。以上结果表明，本发明甲强龙递送材料干预骨关节炎功能学效果显著优于单纯的甲强龙关节腔注射组，证实本发明的甲强龙递送材料的高效性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。