一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法

摘要

本发明公开了一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法。该PCR仪包括光学系统、温控系统、荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。所述温控系统包括N个退火温控模块，所述荧光信号采集系统同时收集在N个退火温度下对应M个引物探针组的荧光强度，所述荧光信号采集系统将实时采集到的荧光信号连接输送到计算机分析处理系统，所述计算机分析处理系统对荧光强度值进行处理，所述计算机分析处理系统根据计算得到的N个不同退火温度下的荧光强度值绘制不同引物探针的多条扩增曲线。本发明能在多个退火温度或延伸温度进行荧光信号收集和数据分析，配合上述的不同Tm值引物设计方案，从而实现单个通道多温度多重荧光定量PCR检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体为一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法。

背景技术

PCR的基本原理是利用DNA在体外变性时会变成单链、低温时引物和单链按照碱基互补配对的原则退火，再调温度到DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到无碳糖的方向合成互补链的过程。

PCR反应基本由变性——退火——延伸三部分构成：

1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃以上一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA片段解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2)模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3)引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性、退火和延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需1～4分钟，2小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。

现有各种优化改良后的PCR技术基本都遵从DNA模板解链、引物与解链模板的结合和聚合酶延伸三个步骤的基本原理。例如，等温扩增PCR通过多种酶解链DNA双链，引物与模板DNA结合，然后在聚合酶的作用下进行延伸。两步法PCR采用95℃变性，退火和延伸采用同一温度(50～65℃)，采用低温聚合酶在50～60℃下就能延伸，从而节约了反应时间。

1996年由美国公司推出的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种采用荧光定量PCR仪对PCR反应温度进行控制，同时在扩增反应中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针对PCR产物进行荧光信号搜集和分析，实现对初始模板核酸进行定量和定性检测的技术。

qPCR反应程序遵守PCR反应的变性、退火和延伸三个基本步骤。通常变性温度设置为95℃，退火设置为50～65℃，延伸温度设置为72℃，退火温度和延伸温度可以设置为同一温度(50～65℃)。在延伸程序中进行荧光信号收集。

qPCR检测结果数据通过软件分析，呈现，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度数据图形，如图1所示；图形内包含S形荧光扩增曲线、阈值线。S形荧光扩增曲线一般包括基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。由于扩增效率、引物设计、模板浓度等原因，该扩增曲线可缺少线性增长期和平台期，不会缺少基线期和指数增长期。

qPCR采用激发光源对荧光染料或荧光基团进行激发，荧光染料或荧光基团发射荧光，采用电荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD)对发射的荧光信号进行收集。荧光激发和发射波长存在重叠时，往往会干扰荧光信号数据。现有的荧光定量PCR仪器一般最大5个荧光通道，如图2所示，通道1：激发波长450-490nm，发射波长510-530nm；通道2：激发波长515-535nm，发射波长560-580nm；通道3：激发波长560-590nm，发射波长610-650nm；通道4:激发波长620-650nm，发射波长675-690nm；通道5：激发波长672-684nm，发射波长705-730nm。在相应的激发波长和发射波长选择合适的荧光染料或荧光基团进行qPCR反应，从而可以避免荧光信号的相互干扰。

多重荧光定量PCR通过加入多对引物和荧光探针来实现单个PCR反应体系中对多个目标核酸片段的扩增和检测。同步的扩增减小了实验的成本，缩短和PCR检测的总时间，同时能够减小反应之间的差异，降低了交叉污染的风险，最重要的是能够提高检测目标片段的通量，实现多个核酸片段的检测，因此在核酸检测领域有着广泛的应用。

现有技术qPCR技术由于检测通道数量和染料种类的限制，一个PCR反应孔最大可以进行5重荧光定量PCR反应。继续增加PCR反应重数往往需要增加荧光通道，通常会大幅度增加qPCR仪器和荧光染料或基团的成本，因此5重以上的荧光定量PCR检测往往不能实现。

因此，需要一种新的多重荧光定量PCR的检测方法，实现在单个荧光检测通道下进行多重qPCR检测。

为了解决这一状况，较多采用多温度溶解曲线进行多重荧光定量分析。通过引物设计，扩增产物可以设置为不同的熔解温度，在PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，由于扩增产物具有不同的溶解温度，从而能够对检测靶点进行定性分析。然而，该方案具有几个缺点：1.不能够进行定量分析；2.增加了一个熔解曲线分析，增加PCR检测总体时间；3.熔解曲线在未知样本检测时通常不标准，结果判断困难。4.存在引物二聚体、非特异性扩增产物等干扰。这些缺点大大限制了多重熔解曲线PCR分析在核酸检测中的应用。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪，所述PCR仪包括光学系统、温控系统、荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，所述温控系统包括N个退火温控模块，所述荧光信号采集系统同时收集在N个退火温度下对应M个引物探针组的荧光强度

一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

提供所述的多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪；

针对多个目的基因分别设计第一引物探针组至第M个引物探针组，所述每个引物探针组包括至少一个或多个引物探针，所述至少一个或多个引物探针分别对应1到N个不同的退火温度，不同的引物探针组之间均对应设置有相近退火温度的引物探针；

在一个反应孔中配制包括上述多个目的基因和M组引物探针的qPCR反应液；

通过所述的荧光定量PCR仪在第一个退火温度下退火延伸，并收集第一退火温度下每个引物探针组中具有对应所述退火温度的引物探针的荧光强度值为

所述计算机分析处理系统对N个退火温度下收集到的荧光信号值进行处理，第一退火温度下每个引物探针组中具有对应所述退火温度的引物探针的荧光强度值为

优选地，当N为2时，所述第一退火温度下的荧光强度值的计算公式为：

R

所述第二退火温度下收集到的总荧光强度值的计算公式为：

R

上述公式(1)和公式(2)中，R

R

第二退火温度下实际的荧光强度值为：R

优选地，所述每个引物探针组的多个探针采取相同的荧光染料。

优选地，N个退火温度中相邻两个退火温度的差值为5～20℃之间。

优选地，所述每个引物探针组的每两个引物探针的Tm值的差值为5～20℃之间。

优选地，不同的引物探针组之间均对应设置有基本相同Tm值的引物探针，可在同一退火温度下扩增。

优选地，所述荧光定量PCR仪在一个PCR循环内对多个退火温度进行荧光信号收集。

优选地，所述荧光定量PCR仪具有多个荧光通道，每个单独荧光通道可实现多温度多重荧光定量PCR检测。

优选地，通过在qPCR反应体系中添加极高热稳定性单链DNA结合蛋白，用于保持模板DNA在多个退火温度时为单链状态。

优选地，所述极高热稳定性单链DNA结合蛋白为ET SSB。

优选地，通过增加引物长度、增加引物GC含量或对引物进行PNA或LNA修饰或插入来提高引物探针的Tm值。

优选地，通过减少引物长度、对引物进行dI修饰或降低GC含量来降低引物探针的Tm值。

本发明的有益果是：本发明能在多个退火温度或延伸温度进行荧光信号收集和数据分析，配合上述的不同Tm值引物设计方案，从而实现单个通道多温度多重荧光定量PCR检测。

附图说明

图1为现有技术中qPCR荧光定量扩增曲线。

图2为现有技术中荧光定量PCR仪通道与荧光基团的示意图。

图3为实施例1中本发明所述的荧光定量PCR曲线。

图4为实施例1中现有技术的ABI 7500的荧光定量PCR曲线。

图5为实施例2中全部9条荧光定量PCR曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

本发明涉及的名称解释：

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)在PCR反应体系中将加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量和定性分析。

扩增曲线：PCR扩增过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中显示目标片段含量的实时荧光强度为纵坐标所建立的曲线。

基线：指PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，在扩增曲线上呈现水平，该水平部分为基线，表示反应荧光明显增加前的背景荧光值。该时期成为基线期。

阈值线：在荧光扩增曲线上认为设定的一个值，它作为荧光检出线，一般设定为PCR反应3～15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍。

Ct值(Cycle Threshold)：每个反应管内的扩增曲线与阈值线相交所经历的PCR循环数。

Tm值(Melting Temperature)：DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。变性(denaturation)：在高温或解链酶作用下模板核酸双链解旋为单链的过程。该温度为变性温度。

退火(annealing)：单链与单链、引物与模板碱基配对结合的过程。该温度为退火温度。

延伸(extension)：聚合酶结合在引物与模板复合体，以多种脱氧核糖核酸为原料，合成DNA双链的过程。该温度为延伸温度。

熔解曲线(Melting curve)：存在双良DNA结合染料是，对双链扩增产物进行加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，达到Tm温度值，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及补充PCR产物的Tm值不同，可以用来鉴别不同PCR产物。

实施例1

本实施例提供一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪，所述PCR仪包括光学系统、温控系统、荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。该温控系统包括N个退火温控模块，该荧光信号采集系统同时收集在N个退火温度下对应M个引物探针组的荧光强度

在本实施例中，N为2，M为1，该引物探针组包括两个引物探针，即N基因高Tm值引物探针和E基因低Tm值引物探针。第一退火温度为表3所示的72℃，第二退火温度为表3所示的55℃。下面具体说明具体的检测过程和检测方法。

本实施例提供一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR检测方法，在同一通道检测新型冠状病毒(COVID-19)N基因和E基因。

实施例1采用相同的反应体系溶液，分别使用本发明所述的实时荧光定量PCR仪器进行高退火温度(即第一退火温度)和低退火温度(即第二退火温度)荧光信号收集，采用常规实时荧光定量PCR仪器(ABI 7500)进行单一退火温度(退火温度为55℃)荧光信号收集。

1.引物设计

针对新型冠状病毒N基因设计高Tm值引物探针、N基因正常Tm值引物探针、E基因设计低Tm值引物探针。用于扩增的引物和探针序列共9条，具体见表1：

表1引物探针序列

表1中，下划线碱基为LNA修饰碱基。

2.样品准备

COVID-19的N基因和E基因片段假病毒采购于南京钟鼎生物公司，使用MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit(Takara bio LLC，China)进行RNA提取，提取后RNA浓度为23ng/μl。

3.反应液配置

分别在两个反应孔中配置如下表2的qPCR反应液。其中一个反应孔采用N基因的高Tm值引物探针与E基因低Tm值引物探针混合；另一个反应孔采用N基因的正常Tm值引物探针与E基因低Tm值引物探针混合。表中的试剂均来源于Takara公司One Step PrimeScript

表2反应体系统配置

4.本发明所述PCR仪反应程序设置

采用如上所述的实时荧光定量PCR仪进行反应程序设置，在高退火温度和低退火温度同时收集荧光信号。具体见表3。

表3 PCR反应程序

为了准确区分单个荧光通道内高Tm值引物扩增产生的荧光信号和低Tm值引物扩增产生的荧光信号。该反应程序可以设定为两部分，前一部分为高退火温度，收集荧光信号；后一部分低退火温度，收集荧光信号，两部分贯续进行。由于低Tm引物不能在高退火温度时进行PCR反应，前一部分在Ct值时荧光强度如公式(1)：

R

其中，R

由于在低退火温度下，高Tm值引物通过前一部分，已完成了PCR扩增，在后一部分退火温度内不会进一步产生PCR产物和新的荧光基团。虽然高Tm值引物不会产生新的荧光基团，但是在前一部分产生的荧光基团，在后一部分荧光收集过程中同样会产生荧光信号，于是，同一PCR循环的后一部分收集到的荧光强度如公式(2)，

R

其中，R

低退火温度时，低Tm值引物产生的荧光信号如公式(3)，

R

其中，R

进一步的，通过对数据进行处理，可以单独模拟低Tm值引物产生的荧光信号如公式(4)，

R

其中，R

同时对公式(1)和公式(4)推导得：

lg(R

进一步Ct＝-lgX

进一步Ct＝-k

lg(R

进一步Ct＝-lgX

进一步Ct＝-k

上述公式(5)和(6)中，K

5.常规PCR仪反应程序设置

采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行反应程序设置，由于该仪器不能在多个退火温度下进行荧光信号收集，本次反应程序设定为低退火温度收集荧光信号。具体见表4。

表4 PCR反应程序

结果分析

查看反应荧光定量PCR曲线，选取不同荧光信号收集温度模式。如图3所示，可见两条荧光定量曲线，其中黑色曲线为72℃退火温度下N基因的S形扩增曲线，Ct值为27.42；灰色曲线为55℃退火温度下E基因的S形扩增曲线，Ct值为24.88。

ABI 7500荧光定量PCR仪仅可见一条荧光定量曲线，该曲线不能判断由N基因或E基因扩增产生的曲线。

结果分析表明，本专利所述的检测方法采用单个FAM荧光通道可以实现双重qPCR检测，而常规PCR仪器不能实现多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR。

实施例2

本实施例提供一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR检测方法，在单一反应孔检测9种常见呼吸道病原体。

在本实施例中，N为3，M为4。如下表8所示，本实施例的第一退火温度为72℃，第二退火温度为60℃，第三退火温度为50℃。本实施例包括4个引物探针组，分别对应4个荧光通道，即FAM荧光通道、VIC荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道。其中，第一个引物探针组，即FAM荧光通道内设置三种引物探针，其余三个引物探针组内均设置两种引物探针。

下面具体说明具体的检测过程和检测方法。呼吸道感染大部分是由病毒感染引起，它是临床最常见的疾病之一。常见的呼吸道病原体有副流感病毒1、2、3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲流病毒和乙流病毒。采用传统qPCR检测上述9种病原体，往往需要多孔(组)PCR进行反应。如王玉月等(多重实时荧光定量PCR对9种常见呼吸道病原体检测)所述，需要4组PCR反应才能完成，第一组：呼吸道合胞病毒、副流感病毒2型；第二组：副流感病毒1型、2与3型；第三组：肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒；第四组：甲型流感病毒、乙型流感病毒。

本发明内容可以在一个反应孔内完成上述9种病原体检测。采用FAM通道检测副流感病毒1、2、3型；VIC通道检测肺炎衣原体和肺炎支原体；采用ROX通道检测呼吸道合胞病毒和腺病毒；采用CY5通道检测甲型流感病毒和乙型流感病毒。

1.引物设计

针对副流感病毒1、2、3型HN基因、呼吸道合胞病毒的M基因、肺炎支原体P1cytadhesin基因，肺炎衣原体外壳主蛋白ompA基因，腺病毒penton基因，甲型流感病毒的M基因，乙型流感病毒的M基因设计不同Tm值的引物和不同荧光标记的探针。用于扩增的引物和探针序列共27条，具体见表5。

表5引物探针序列

表5中下划线碱基为LNA修饰碱基。

2.样品准备

根据上述的扩增片段合成相应的自理，质粒合成委托上海生工生物公司。质粒分别使用MiniBEST Plasmid Purification Kit(Takara bio LLC，China)进行质粒提取，提取后平均浓度为36ng/μl。取混合质粒2μl加入下述的反应液。

3.反应液配置

配置如下表6的qPCR反应液。表中的试剂均来源于Takara公司Premix Ex Taq，极高热稳定性单链DNA结合蛋白(ET SSB)来源于NEB公司。

表6反应体系配置

4.反应程序设置

采用本发明所述的实时荧光定量PCR仪进行反应程序设置，具体见表7。

表7 PCR反应程序

5.结果分析

查看反应荧光定量PCR曲线，4个通道中9种质粒均全部有S型扩增曲线，其检测结果如图5所示。

结果分析表明，通过对引物和探针退火温度进行合理控制，配合多次退火温度荧光信号收集的实时荧光电量PCR仪器可以在单个反应孔内实现多达9重荧光定量检测，大大降低了检测成本，显著提高了荧光定量PCR仪检测通量。

可以理解的是，本发明的多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法除了能对实施例1和实施例2的病毒、支原体、衣原体检测外，还适用于人类基因、动物基因、植物基因、细菌基因、真菌基因分析。