一种表达CD3抗体受体复合物的免疫细胞及其用途

摘要

一种改造的免疫细胞，其不表达T细胞受体(TCR)，并包含CD3抗体受体复合物。还涉及包含所述改造的免疫细胞和双特异性抗体的药物组合物，以及所述药物组合物在制备药物中的用途。

说明书

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种表达CD3抗体受体复合物的免疫细胞，所述所述CD3抗体受体复合物可以不依赖于TCR表达。

背景技术

近年来，因在癌症治疗领域明显的临床疗效，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法的免疫治疗方法逐渐成为世界范围内的研究热点。目前临床上制备CAR-T细胞发热来源一般都为病人本身，因此都是自体CAR-T细胞。但是自体CAR-T在临床应用上有很多问题，例如制备周期长，制备成本高。病人免疫功能状态比较差的时候不能成功制备CAR-T细胞。

也有采用CRISPR/Cas9 nucleases等基因编辑工具特异性的敲除某些免疫相关基因制备通用型CAR-T的方法。但是长期存在的CAR-T细胞可能导致正常B细胞和免疫球蛋白的缺失，针对实体瘤的CAR-T出现在靶但脱肿瘤的细胞毒性等安全性问题。

因此，仍需要开发一种更具安全性的可调控的细胞疗法。

发明内容

本申请提供了一种改造的免疫细胞，其包含CD3抗体受体复合物，且，其不表达T细胞受体(TCR)。本申请所述CD3抗体受体复合物能够以不依赖TCR的形式表达。且能够被常见的CD3抗体识别。在CD3抗体刺激下，本申请所述的改造的免疫细胞能够被激活，并分泌细胞因子。本申请所述的改造的免疫细胞还能够联合抗CD3抗CD19双特异性抗体杀伤肿瘤细胞。

一方面，本申请提供了一种改造的免疫细胞，其包含CD3抗体受体复合物，所述CD3抗体受体复合物包含第一CD3重组蛋白和第二CD3重组蛋白，其中所述第一CD3重组蛋白包含：(1)第一胞外域，所述第一胞外域包含源自CD3 epsilon结构域的胞外域，(2)第一跨膜域，(3)第一胞内结构域；所述第二CD3重组蛋白包含：(1)第二胞外域，所述第二胞外域包含源自选自CD3 gamma结构域和CD3 delta结构域中任意一种的胞外域，(2)第二跨膜域，(3)第二胞内结构域，且，其不表达T细胞受体(TCR)。

在某些实施方式中，所述的改造的免疫细包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。

在某些实施方式中，所述CD3 epsilon结构域的胞外域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第二胞外域包含源自CD3 gamma结构域的胞外域。

在某些实施方式中，所述CD3 gamma结构域的胞外域包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第二胞外域包含源自CD3 delta结构域的胞外域。

在某些实施方式中，所述CD3 delta结构域的胞外域包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一跨膜域和所述第二跨膜域相同或不同。

在某些实施方式中，所述跨膜域不包含源自CD3的跨膜域

在某些实施方式中，所述跨膜域包含源自选自下组任意一种蛋白的跨膜域：CD8α、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。

在某些实施方式中，所述跨膜域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一胞内结构域和所述第二胞内结构域相同或不同。

在某些实施方式中，所述第一胞内结构域和所述第二胞内结构域中的至少一种包含共刺激结构域和/或信号转导结构域。

在某些实施方式中，所述第一胞内结构域中包含的共刺激结构域和所述第二胞内结构域中包含的共刺激结构域相同或不同。

在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含源自选自下组任意一种或多种蛋白的共刺激结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。

在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一胞内结构域中包含的信号转导结构域和所述第二胞内结构域中包含的信号转导结构域相同或不同。

在某些实施方式中，所述信号转导结构域包含至少包含一个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。

在某些实施方式中，所述信号转导结构域包含源自选自下组任意一种或多种蛋白的信号转导结构域：CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。

在某些实施方式中，所述信号转导结构域包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述胞外域和跨膜域之间还包含铰链区。

在某些实施方式中，所述铰链区包含源自选自下组任意一种或多种蛋白的铰链区：CD8α、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1。

在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:6中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第一胞内结构域和所述第二胞内结构域中的一种包含至少两个氨基酸的肽段。

在某些实施方式中，所述第一CD3重组蛋白包括源自CD3 epsilon结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区、源自CD28的胞内域和源自CD3 zeta的胞内域。在某些实施方式中，所述第一CD3重组蛋白包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第二CD3重组蛋白包括源自CD3 gamma结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区和源自CD3 gamma的胞内域。

在某些实施方式中，所述第二CD3重组蛋白包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述第二CD3重组蛋白包括源自CD3 gamma结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区和所述肽段。

在某些实施方式中，所述第二CD3重组蛋白包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的改造的免疫细胞还包含第三CD3重组蛋白，所述第三CD3重组蛋白包含：(1)第三胞外域，所述第三胞外域包含源自选自CD3 gamma结构域或CD3delta结构域中任意一种的胞外域，(2)第三跨膜域，和(3)第三胞内结构域。

在某些实施方式中，所述第三胞外域与所述第二胞外域相同或不同。

在某些实施方式中，所述第三跨膜域与所述第一跨膜域和/或所述第二跨膜域相同或不同。

在某些实施方式中，述第三胞内结构域与所述第一胞内结构域和/或第二胞内结构域相同或不同。

在某些实施方式中，所述的改造的免疫细胞的主要组织相容性复合体(MHC)的表达和/或活性下调。

在某些实施方式中，所述MHC复合体包括B2M。

在某些实施方式中，所述的改造的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)和/或嵌合自身抗体受体(CAAR)。

另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的改造的免疫细胞和药学上可接受的佐剂。

在某些实施方式中，所述的药物组合物包括抗体。

在某些实施方式中，所述抗体能够识别和/或结合所述CD3抗体受体复合物。

在某些实施方式中，所述抗体包括双特异性抗体。

在某些实施方式中，所述双特异性抗体源自所述的免疫细胞。

在某些实施方式中，所述双特异性抗体能够识别和/或结合靶细胞表面的受体。

在某些实施方式中，所述靶细胞为肿瘤细胞。

在某些实施方式中，所述靶细胞表面的受体选自下组中的一种：CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲受体(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。

另一方面，本申请提供了核酸分子，其编码所述的改造的免疫细胞中的CD3抗体受体复合物。

另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的核酸分子。

在某些实施方式中，所述载体为病毒载体。

在某些实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的核酸分子和/或所述的载体。

另一方面，本申请提供了所述的改造的免疫细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤选自以下组：淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。

另一方面，本申请提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述的改造的免疫细胞、所述的药物组合物。

在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤选自以下组：淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是本申请所述改造的免疫细胞联合双特异性抗体杀伤靶细胞示意图。

图2显示的是本申请所述改造的免疫细胞表达CD3抗体受体复合物。

图3显示的是CD3抗体受体复合物可以在TCR KO的人原代T细胞中被CD3抗体UCHT1识别。

图4显示的是CD3抗体受体复合物可以在TCR KO的人原代T细胞中被CD3抗体HIT3a识别。

图5显示的是CD3抗体受体复合物在TCR KO的人原代T细胞中不能被CD3抗体SP34-2识别

图6显示的是CD3抗体受体复合物可以在TCR KO的人原代T细胞中被CD3抗体OKT3识别。

图7显示的是本申请所述的改造的免疫细胞被CD3抗体激活表达细胞激活标签CD137。

图8显示的是本申请所述的改造的免疫细胞被抗CD3抗CD19双特异性抗体介导的肿瘤细胞激活。

图9显示的是本申请所述的改造的免疫细胞通过抗CD3抗CD19双特异性抗体介导杀伤肿瘤细胞。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“CD3抗体”通常是指能够特异性识别CD3亚基(例如，CD3epsilon、CD3 gamma、CD3 delta，或上述的复合物)的抗体，该抗体可以为只能够识别CD3的单克隆抗体，或者是可以同时识别CD3和其他靶点的多靶点抗体。

在本申请中，术语“CD3抗体受体复合物”通常是指能够被CD3抗体识别的受体，其可以至少包含2种(例如，3种)CD3亚基(例如，CD3 epsilon和CD3 delta，或CD3epsilon和CD3 gamma)。CD3抗体受体复合物由至少2条(例如，3条、4条、5条、6条或更多条)CD3重组蛋白组成，对于所述CD3重组蛋白可包含CD3亚基(例如，CD3epsilon、CD3 gamma和/或CD3delta)的胞外域、跨膜域和胞内结构域。CD3 epsilon和CD3 gamma或者CD3 delta胞外域结合后的构象接近于CD3 epsilon异二聚体在TCR复合物中的天然构象，包括大多数CD3抗体如UCHT1，OKT3等识别的表位。单独CD3 epsilon胞外域形成的构象不包括大多数CD3抗体克隆的结合表位。

在本申请中，术语“第一CD3重组蛋白”通常是指包含源自CD3(例如，CD3epsilon)的胞外域、跨膜域和胞内结构域的重组蛋白。所述CD3抗体受体复合物可包含1条或多条(例如，2条、3条、4条或更多条)第一CD3重组蛋白。

在本申请中，术语“第一胞外域”通常是指第一CD3重组蛋白的胞外域部分，所述第一胞外域可包含源自CD3 epsilon结构域的胞外域。

在本申请中，术语“第二CD3重组蛋白”通常是指包含源自CD3(例如，CD3 delta和或CD3 gamma)的胞外域、跨膜域和胞内结构域的重组蛋白。所述CD3抗体受体复合物可包含1条或多条(例如，2条、3条、4条或更多条)第二CD3重组蛋白。

在本申请中，术语“第二胞外域”通常是指第二CD3重组蛋白的胞外域部分，所述第二胞外域可包含源自CD3 delta和或CD3gamma结构域的胞外域。

在本申请中，术语“第三CD3重组蛋白”通常是指包含源自CD3(例如，CD3 delta和或CD3 epsilon)的胞外域、跨膜域和胞内结构域的重组蛋白。所述CD3抗体受体复合物可包含1条或多条(例如，2条、3条、4条或更多条)第三CD3重组蛋白。

在本申请中，术语“第三胞外域”通常是指第三CD3重组蛋白的胞外域部分，所述第三胞外域可包含源自CD3 delta和或CD3 epsilon结构域的胞外域。所述第三胞外域可以与所述第二胞外域源自相同或不同的CD3亚基(例如，CD3 delta和或CD3 gamma)。

在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体(例如，dAb)，单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本申请所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

在本申请中，术语“跨膜域”通常是指细胞表面蛋白中一段跨越细胞膜的序列，其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜域可以与细胞内信号转导结构域相连接，起着传递信号的作用在本申请中，跨膜域可以源自任意的I型、II型或III型跨膜蛋白。在本申请中，跨膜域可不包含源自CD3(例如，CD3 epsilon、CD3 gamma和/或CD3 delta)的跨膜蛋白。

在本申请中，术语“免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)”通常是指是一个由十多个氨基酸构成的保守序列，常出现在免疫系统某些细胞的跨膜蛋白的胞内区。TAM是免疫细胞的重要转导信号。因此，他们常出现在的重要的细胞信号分子的胞内区，如T细胞受体复合物的CD3和ζ链，B细胞受体复合物中CD79α和β链，与某些Fc受体。当这些受体分子与他们的配体发生相互作用时，胞内ITAM上的酪氨酸残基会磷酸化，磷酸化的ITAM可与带有SH2结构域的包内游离蛋白结合，使免疫细胞信号传送到下游的信号分子。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。在本申请中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如CD70)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimeric antigenreceptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,JensenMC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr OpinImmunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Designand development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing Tcells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。

在本申请中，术语“嵌合自身抗体受体(CAAR)”通常是指包含自身抗原、能够被自身抗体识别的蛋白，英文名称为chimeric autoantibody receptors。CAAR可以指导经遗传修饰表达CAAR的免疫细胞攻击表达能够识别该抗原的抗体的B细胞。

在本申请中，术语“双特异性抗体”通常是指在单个抗体分子内具有两种不同抗原的结合位点的抗体。例如，其中一种抗原可以是CD3。

在本申请中，术语“肽段”通常是指一段至少由两个(例如，四个、五个、六个或更多各)氨基酸构成的多肽。其可包括任何具有氨基功能性和酸功能性并且包含天然存在的氨基酸聚合物在内的全部分子，包括天然氨基酸和人工氨基酸。

在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。

在本申请中，术语“铰链区”通常是指胞外域(例如，CD3胞外域)和跨膜区之间的连接区。

在本申请中，术语“信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，信号传导结构域为用于指导蛋白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。在某些情形中，信号传导结构域可以源自CD3ζ。CD3ζ可以与T细胞受体亚基和CD3-gamma,-delta,和-epsilon形成T细胞受体-CD3复合体。CD3ζ含有三个ITAM基序，ITAM序列介导TCR的胞内信号激活。ζ链是一种受体激活的蛋白酪氨酸激酶底物，当TCR受体与多肽MHC复合物结合后，ζ链可以很快发生酪氨酸磷酸化，参与淋巴细胞活化信号的转导。因此CD3ζ在抗原识别和TCR信号转导中起着关键作用。

在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。

在本申请中，术语“免疫细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括但不限于T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。该术语还包括工程化的免疫细胞，如通过将DNA或RNA形式的外源遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞。

在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。载体可涵盖除转基因插入序列和主链以外的额外特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体具体地讲用于在靶细胞中表达转基因，且通常具有控制序列。本申请所述的载体可以是表达载体，可包括病毒载体(慢病毒载体和/或逆转录病毒载体)、噬菌体载体、噬菌粒、粘粒、cosmid、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)和/或质粒。

在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。

在本申请中，术语“主要组织相容性复合体(MHC)”通常是指位于细胞表面的帮助免疫系统识别异物的一系列的蛋白质，MHC主要包含I类MHC分子和II类MHC分子。I类MHC分子可以横跨生物体几乎所有细胞的膜，而II类分子则通常存在于免疫细胞上。其中I类MHC分子也称为I类主要组织相容复合体，由非共价键连接的两条肽链组成的异源二聚体糖蛋白；其中一条称为重链，结构呈多态性，另一条为轻链或称为β2微球蛋白(B2M)。功能上，I类MHC分子会呈递胞内所降解的非自身蛋白的多肽，从而激活免疫系统。人类的I类MHC分子分为经典的HLA分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和非经典的HLA分子(HLA-E、HLA-G、HLA-F)。在本申请中，所述的改造的免疫细胞可以不表达有活性的MHC，所述“不表达有活性的MHC”可包括表达的MHC失去激活免疫系统的活性和/或细胞表面缺失I类MHC分子(例如，缺失HLA-A/B/C/E/F/G)。在某些情形中，可以通过编辑B2M或相应的重链基因来使细胞表面缺失I类MHC分子。

在本申请中，术语“B2M”通常是指β-2微球蛋白，通常是指I类MHC分子的轻链，因此是主要组织相容性复合体(MHC)不可缺少的部分。在人类基因组中，B2M被位于15号染色体上的b2m基因编码，而其他MHC基因在6号染色体上以基因簇的形式存在。人类的B2M蛋白有119个氨基酸(见UniProt数据库编码P61769)。在缺乏β-2微球蛋白的小鼠模型中可以说明，B2M对I类MHC分子在细胞表面的呈递、多肽结合槽的稳定性是必须的。I类MHC分子存在于人体所有的有核细胞表面，MHC的错配会引起免疫排斥，导致移植物的破坏，而通过敲除Β2Μ基因来去除细胞表面的I类MHC分子可以防止错配的发生。

在本申请中，术语“CD3”通常是指CD3蛋白质多亚基复合体，CD3蛋白质多亚基复合体由6个不同的多肽链(亚基)构成。在哺乳动物中，CD3的多肽链可包含一条CD3gamma(γ)链，一条CD3 gamma(δ)链，两条CD3 epsilon(ε)链和两条CD3 zeta(ζ)链。

在本申请中，术语“CD3”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”和未加工的CD3蛋白质以及源自细胞中加工的任何形式的蛋白质或一种或多种CD3链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。

同样的，本申请的术语“CD3 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD3 gamma”和/或“CD3zeta”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。“CD3 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD3 gamma”和/或“CD3 zeta”分别涵盖“全长”和未加工的CD3 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD3 gamma”和/或“CD3 zeta”蛋白质以及源自细胞中加工的任何形式的CD3链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3链的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。例如，示例性的CD3delta的氨基酸序列可参见UniProt数据库登录号P04234，示例性的CD3epsilon的氨基酸序列可参见UniProt数据库登录号P07766，和示例性的CD3 gamma的氨基酸序列可参见UniProt数据库登录号P09693。

在本申请中，术语“T细胞受体(TCR)”通常是指参与T细胞识别抗原后激活的跨膜蛋白复合物。TCR是由两条不同的蛋白亚基形成的异源二聚体。在人类体内，有95％的T细胞表达一条alpha(α)链和一条beta(β)链。剩余的5％表达gamma(γ)和delta(δ)链。TCR分子的每条链可包含两个膜外结构域：可变区和恒定区。可变区可结合多肽/主要组织相容性复合物，α链和β链的可变区都含有三个互补决定区(CDRs)，负责抗原/MHC复合物的识别。恒定区靠近细胞膜，与跨膜区连接。TCR两个异源亚基胞外的恒定结构域都包含短的结合序列，该序列内有半胱氨酸残基。半胱氨酸残基之间形成二硫键从而使两个异源TCR亚基结合在一起。TCR跨膜域含有带正电的氨基酸，负责与CD3分子结合。TCR的胞内区很短，没有活性结构域。

TCR能识别与MHC分子结合的经过处理的多肽片段，由于识别需要MHC分子的呈递，也称为MHC限制性。当供体和受体的MHC分子不同时，TCR能够识别MHC的不同，并导致T细胞的激活和扩增，可能引起移植物抗宿主疾病(GvHD)。敲除TRAC基因可以去除TCRα链的表达，从而可以将TCR复合物从T细胞表面除去，因此能够防止TCR识别同种异体抗原而引起的移植物抗宿主疾病。

CD3多亚基复合体和TCR可以过非共价键形成功能性的复合体，称为TCR-CD3复合体。在形成TCR-CD3复合体的过程中，CD3 epsilon分子分别和CD3 gamma和CD3 delta形成异源二聚体，CD3 zeta与自身形成同源二聚体。一个TCR-CD3复合体包括一个CD epsilon:delta异源二聚体,一个CD epsilon:gamma异源二聚体和一个CD zeta:zeta同源二聚体和一个TCR alpha:beta异源二聚体。因此，这四种二聚体在一个TCR-CD3复合体中呈1:1:1:1的关系。CD3分子的跨膜区因为含有天冬氨酸残基而带有负电，从而使CD3可以与跨膜区带正电的一对TCR亚基结合。CD3 gamma、CD3 delta和CD3 epsilon分子是非常相关的免疫球蛋白超家族细胞膜蛋白，都包含单个胞外免疫球蛋白结构域，而CD3 zeta的胞外区非常短。CD3 gamma、CD3 delta和CD3 epsilon分子的胞内区都含有单个的保守区免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。CD3 zeta链含有三个ITAM基序。单个TCR-CD3复合物共含有10个ITAM基序，这些ITAM基序决定了TCR激活的程度。

在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。

在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。

除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。

术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。

在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。

在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。

通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。

用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。

在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

本申请开发了一种可调控的细胞疗法，该疗法充分利用了双特异性抗体疗法和细胞疗法的优势，为一种双特异性抗体疗法和细胞疗法的联合疗法。本申请使用的T细胞为表达一种CD3抗体受体并且经过基因敲除的通用型T细胞。CD3抗体受体由两种重组CD3蛋白分子构成。该T细胞表达一种可以被双特异性抗体识别的CD3抗体受体，相对于类似的嵌合抗体受体疗法的不同之处在于，本申请CD3抗体受体可以被双特异性抗体识别，并且表达不依赖于TCR复合物，可以独立直接表达于T细胞表面。

本申请提供了如下技术方案：

1.一种改造的淋巴细胞，该淋巴细胞缺失TCR分子，该淋巴细胞表达CD3抗体受体复合物，该CD3抗体受体复合物包含至少两种CD3重组蛋白；其中第一种CD3重组蛋白包含：

a.包含CD3 epsilon结构域的胞外域；

b.跨膜域；

c.胞内结构域；和

其中第二种CD3重组蛋白包含：

d.包含CD3 delta和/或CD3 gamma结构域的胞外域；

e.跨膜域；

f.胞内结构域；

其中，胞内结构域由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成，或者胞内结构域是至少两个氨基酸的肽段；其中第一种CD3重组蛋白和第二种CD3重组蛋白中的至少一种胞内结构域，由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成。

2.技术方案1所述的淋巴细胞，其中该淋巴细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。

3.技术方案2所述的淋巴细胞，其中该淋巴细胞是T细胞。

4.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中a.胞外域包含SEQ ID No:1所示的CD3epsilon的胞外域，或其变体。

5.技术方案4所述的淋巴细胞，其中a.胞外域为SEQ ID No:1所示的CD3 epsilon的胞外域。

6.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中d.胞外域包含CD3 gamma结构域的胞外域。

7.技术方案6所述的淋巴细胞，其中d.胞外域包含SEQ ID No:2所示的CD3 gamma的胞外域，或其变体。

8.技术方案7所述的淋巴细胞，其中d.胞外域为SEQ ID No:2所示的CD3 gamma的胞外域。

9.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中d.胞外域包含CD3 delta结构域的胞外域，或其变体。

10.技术方案9所述的淋巴细胞，其中d.胞外域包含SEQ ID No:4所示的CD3 delta的胞外域，或其变体。

11.技术方案10所述的淋巴细胞，其中d.胞外域为SEQ ID No:4所示的CD3 delta的胞外域。

12.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中跨膜域b和e包含以下至少一项：CD8α的跨膜域、CD28的跨膜域、4-1BB的跨膜域、CD4的跨膜域、CD27的跨膜域、CD7的跨膜域、PD-1的跨膜域、TRAC的跨膜域和TRBC的跨膜域。

13.技术方案12所述的淋巴细胞，其中CD28的跨膜域包含SEQ ID No:7所示的CD28的跨膜域，或其变体。

14.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中胞内共刺激信号传导结构域包含以下至少一项：CD28、4-1BB、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD27、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT和DAP12中的共刺激信号传导区及其组合组成的共刺激分子。

15.技术方案14所述的淋巴细胞，其中胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ IDNo:8所示的CD28的共刺激信号传导区，或其变体。

16.技术方案14所述的淋巴细胞，其中胞内共刺激信号传导结构域包含4-1BB的共刺激信号传导区，或其变体。

17.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中的胞内信号转导结构域包含以下至少一项：CD3zeta激活区、CD3delta激活区、CD3gamma激活区、FceRIγ激活区、FceRI激活区、immunoglobulin alpha(Iga)激活区、Igbeta激活区、bovine leukemia virus gp30激活区、Ep-stein-Barr virus(EBV)LMP2A激活区、simian immunodeficiencyvirus PBj14Nef激活区、HSKV激活区、DAP-12激活区、至少包含一个ITAM(酪氨酸激活基序)的结构域，及以上结构域组合形成的结构域。

18.技术方案17所述的淋巴细胞，其中的CD3 zeta激活区包含SEQ ID No:9所示的序列，或其变体。

19.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中CD3重组蛋白的胞外域和跨膜区之间还具有铰链区。

20.技术方案19所述的淋巴细胞，其中的铰链区包含以下至少一项：CD8α、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1的铰链区。

21.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中胞内结构域是至少为两个氨基酸的肽段。

22.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中第一种CD3重组蛋白选自下述重组蛋白中的一种：CD3ε胞外域-CD8α铰链区-CD8α跨膜区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3ζ激活区，CD3ε胞外域-CD8α跨膜区-4-1BB共刺激信号传导区-CD3ζ激活区，CD3ε胞外域-CD28铰链区-CD28跨膜区-CD28共刺激信号传导区-CD3ζ激活区，和CD3ε胞外域-CD28跨膜区-CD28共刺激信号传导区-CD3ζ激活区。

23.技术方案22所述的淋巴细胞，其中第一种CD3重组蛋白具有SEQ ID No:10所示的序列，或其变体。

24.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中第二种CD3重组蛋白选自下述重组蛋白中的一种：CD3γ胞外区-CD8α铰链区-CD8α跨膜区-CD3γ共刺激信号传导区，CD3γ胞外区-CD8α跨膜区-CD3γ共刺激信号传导区，CD3γ胞外区-CD28铰链区-CD28跨膜区-CD3γ共刺激信号传导区，和CD3γ胞外区-CD28跨膜区-CD3γ共刺激信号传导区，CD3γ胞外区-CD28铰链区-CD28跨膜区-肽段，其中的肽段可以为至少2个、4个或者至少6个氨基酸的肽段。

25.技术方案24所述的淋巴细胞，其中第二种CD3重组蛋白具有SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的序列，或其变体。

26.前述技术方案1-25任一项所述的淋巴细胞，其中第二种CD3重组蛋白选自下述重组蛋白中的一种：CD3δ胞外区-CD8α铰链区-CD8α跨膜区-CD3δ共刺激信号传导区，CD3δ胞外区-CD8α跨膜区-CD3δ共刺激信号传导区，CD3δ胞外区-CD28铰链区-CD28跨膜区-CD3δ共刺激信号传导区，和CD3δ胞外区-CD28跨膜区-CD3δ共刺激信号传导区。

27.前述技术方案任一项所述的淋巴细胞，该淋巴细胞缺失MHC分子。

28.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中第一种CD3重组蛋白的胞内结构域由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成。

29.前述任一项技术方案所述的淋巴细胞，其中第二种CD3重组蛋白的胞内结构域由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成。

30.前述技术方案任一项所述的淋巴细胞，该CD3抗体受体复合物包含三种CD3重组蛋白，第一种CD3重组蛋白包含：

a.包含CD3 epsilon结构域的胞外域；

b.跨膜域；

c.胞内结构域；和

其中第二种CD3重组蛋白包含：

d.包含CD3 delta结构域的胞外域；

e.跨膜域；

f.胞内结构域；和

其中第三种CD3重组蛋白包含：

g.包含CD3 gamma结构域的胞外域；

h.跨膜域；

i.胞内结构域；

其中，胞内结构域由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成，或者胞内结构域是至少两个氨基酸的肽段；其中三种CD3重组蛋白中的至少一种胞内结构域，由胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域组成。

31.一种药物组合物，包含技术方案1-30任一项所述的淋巴细胞，以及一种双特异性抗体，该抗体能与淋巴细胞表面的CD3抗体受体复合物结合，并能同时与靶细胞表面的受体结合。

32.技术方案31所述的药物组合物，其中该靶细胞的受体选自下述中的一种：CD19、CD20、CD22、CD123、CD33、BCMA、IL13R alpha、PSMA、EGFR、HER2、Mesothelin和Claudin18.2。

33.技术方案31或32所述的药物组合物，其中所述的双特异性抗体能与淋巴细胞表面的CD3抗体受体复合物结合，并能同时与靶细胞表面的CD19受体结合。

34.技术方案31-33任一项所述的药物组合物，其中所述的靶细胞为肿瘤细胞。

35.技术方案31-34任一项所述的药物组合物，其中所述的淋巴细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。

36.技术方案1-24任一项所述的淋巴细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

37.技术方案30所述的应用，其中的药物还包括一种双特异性抗体，该抗体能与淋巴细胞表面的CD3抗体受体复合物结合，并能同时与靶细胞表面的受体结合。

38.一种疾病的治疗方法，该方法包括给受试者体内注入：

c.有效量的技术方案1-30任一项所述的淋巴细胞，和

d.有效量的双特异性抗体，该抗体能与淋巴细胞表面的CD3抗体受体复合物结合，并能同时与靶细胞表面的受体结合。

39.技术方案38所述的方法，其中该靶细胞的受体选自下述中的一种：CD19、CD20、CD22、CD123、CD33、BCMA、IL13R alpha、PSMA、EGFR、HER2、Mesothelin和Claudin18.2。

40.技术方案39所述的方法，其中所述的靶细胞为肿瘤细胞。

本申请提供了一种改造的免疫细胞，其可包含CD3抗体受体复合物，所述CD3抗体受体复合物包含第一CD3重组蛋白和第二CD3重组蛋白。

在本申请中，所述第一CD3重组蛋白可包含(1)第一胞外域，(2)第一跨膜域，和(3)第一胞内结构域；所述第二CD3重组蛋白可包含(1)第二胞外域，(2)第二跨膜域，和(3)第二胞内结构域。

在某些情形中，所述第一胞外域可包含源自CD3 epsilon结构域的胞外域，例如，所述第一胞外域可包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如，所述第一胞外域可包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在某些情形中，所述第二胞外域可包含源自CD3 gamma结构域的胞外域，例如，所述第二胞外域可包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。例如，所述第二胞外域可包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在某些情形中，所述第二胞外域可包含源自CD3 delta结构域的胞外域，例如，所述第二胞外域可包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，所述第二胞外域可包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在本申请中，所述CD3重组蛋白(例如，第一CD3重组蛋白和/或第二CD3重组蛋白)可包含跨膜域(例如，所述第一跨膜域和/或第二跨膜域)。所述跨膜域(例如，所述第一跨膜域和/或第二跨膜域)可以源自任意的I型跨膜蛋白，只要其不是CD3的跨膜域即可。在本申请中，示例性的所述跨膜域(例如，所述第一跨膜域和/或第二跨膜域)可包含但不限于源自下组蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、T细胞受体的ζ链、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154、SLAM、和其他任何不依赖于TCR表达的跨膜域，或者以上跨膜域的突变体。

例如，所述跨膜域(例如，所述第一跨膜域和/或第二跨膜域)可以是源自人CD28的跨膜域。例如，所述第一跨膜域可包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如，所述第一跨膜域可包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在本申请中，所述CD3重组蛋白可包含胞内结构域(例如，第一胞内结构域和/或第二胞内结构域)。在某些情形中，所述胞内结构域(例如，第一胞内结构域和/或第二胞内结构域)可包含胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

在本申请中，所述胞内信号转导结构域可以包含至少有一个ITAM基序的结构域。示例性的信号传导结构域可源自选自下组的信号转导结构域，包括但不限于CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30激活区、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12，及上述的变体。

例如，所述信号转导结构域可以为来自CD3zeta胞内域的信号传导结构域。例如，所述来自CD3zeta胞内域的信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:9所示的信号转导结构域。例如，所述来自CD3zeta胞内域的信号传导结构域可包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

所述CD3抗体受体复合物受到刺激后，可以将激活信号传输到细胞内部。有时候，信号转导结构域的激活并不足以提供足够的活化信号，还需要共刺激结构域提供刺激信号。所述共刺激结构域可以包括但不限于下组：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88中的共刺激信号传导区及其组合组成的共刺激分子。

例如，所述共刺激结构域可以是来自人CD28胞内域的共刺激结构域。例如，所述人CD28胞内域的共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:8所示的共刺激结构域。例如，所述人CD28胞内域的共刺激结构域可包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

例如，所述胞内结构域(例如，第一胞内结构域和/或第二胞内结构域)可包含来自上述人CD28胞内域的共刺激结构域和上述来自CD3zeta胞内域的信号传导结构域。

又例如，所述胞内结构域(例如，第一胞内结构域和/或第二胞内结构域)可包含来自CD3 gamma的胞内结构域。例如，所述CD3 gamma的胞内结构域可包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，所述CD3 gamma的胞内结构域可包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在某些情形中，所述胞内结构域(例如，第一胞内结构域和/或第二胞内结构域)可以包含至少两个(例如，至少四个、至少六个或更多个)氨基酸的肽段。在某些情形中，所述胞内结构域可以为至少两个(例如，至少四个、至少六个或更多个)氨基酸的肽段。例如，所述肽段可包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

在本申请的所述CD3抗体受体复合物中，对于第一CD3重组蛋白和第二CD3重组蛋白，除胞外区以外，其他部分(例如，跨膜域、胞内结构域)可以相同或不同。例如，第一CD3重组蛋白的第一跨膜域和第二CD3重组蛋白的第二跨膜域可以相同或不同，第一CD3重组蛋白的第一胞内结构域和第二CD3重组蛋白的第二胞内结构域可以相同或不同。例如，所述第一胞内结构域的信号转导结构域和第二胞内结构域的信号转导结构域可以相同或不同。例如，所述第一胞内结构域的共刺激结构域和第二胞内结构域的共刺激结构域可以相同或不同。只要所述第一胞内结构域和所述第二胞内结构域中的至少一个(例如，至少两个、三个、四个或更多个)包含共刺激结构域和/或信号转导结构域，或者，只要能够为抗体刺激提供足够的信号转导，从而激活改造的免疫细胞即可。

在某些情形中给，所述胞内结构域可以是来自CD3 gamma和/或CD3delta的胞内结构域，例如，所述胞内结构域可包含如SEQ ID NO:3和5中任一项所示的胞内结构域。或者，所述胞内结构域可包含与SEQ ID NO:3和5中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在本申请的所述CD3抗体受体复合物中，所述第一CD3重组蛋白的第一胞内结构域可以包含共刺激结构域和信号转导结构域，所述第二CD3重组蛋白的第一胞内结构域可以为至少两个(例如，至少四个、至少六个或更多个)氨基酸的肽段。

在本申请的所述CD3抗体受体复合物中，所述第二CD3重组蛋白的第一胞内结构域可以包含共刺激结构域和信号转导结构域，所述第以CD3重组蛋白的第一胞内结构域可以为至少两个(例如，至少四个、至少六个或更多个)氨基酸的肽段。

在本申请中，所述CD3重组蛋白(第一CD3重组蛋白和/或第二CD3重组蛋白)还可包含铰链区。所述铰链区可以在胞外域和跨膜域之间。例如，所述铰链区可以包含源自选自下组任意一种或多种蛋白的铰链区：CD8α、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1。

例如，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:6中任一项所示的氨基酸序列。或者所述铰链区可以包含与SEQ ID NO:6中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

例如，在本申请中，所述第一CD3重组蛋白可源自CD3 epsilon结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区、源自CD28的胞内域和源自CD3 zeta的胞内域。例如，所述第一CD3重组蛋白可包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。或者，所述第一CD3重组蛋白可包含与SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

例如，所述第二CD3重组蛋白可包含源自CD3 gamma结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区和源自CD3 gamma的胞内域。例如，所述第二CD3重组蛋白可包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。或者，所述第二CD3重组蛋白可包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

例如，所述第二CD3重组蛋白可包含源自CD3 gamma结构域的胞外域、源自CD28的跨膜区和所述肽段。例如，所述第二CD3重组蛋白可包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。或者，所述第二CD3重组蛋白可包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。

在本申请中，所述CD3抗体受体复合物还可包含一个或多个(例如，两个、三个、四个或更多个)第一重组蛋白。在本申请中，所述CD3抗体受体复合物也可包含一个或多个(例如，两个、三个、四个或更多个)第二重组蛋白。在某些情形中，本申请中，所述CD3抗体受体复合物还可包含第三重组蛋白，所述第三重组蛋白可包含(1)第三胞外域，所述第三胞外域包含源自选自CD3 gamma结构域或CD3 delta结构域中任意一种的胞外域，(2)第三跨膜域，和(3)第三胞内结构域。所述第三跨膜域可以在上文所述的跨膜域的范围内，并且可以与第一跨膜域和/或第二跨膜域相同或不同。所述第三胞内结构域可以在上文所述的胞内结构域的范围内，并且可以与第一胞内结构域和/或第二胞内结构域相同或不同。只要所述CD3抗体受体复合物中的至少一个(例如，至少两个、三个、四个或更多个)CD3重组蛋白的胞内域包含共刺激结构域和/或信号转导结构域，或者，只要能够为抗体刺激提供足够的信号转导，从而激活改造的免疫细胞即可。

另一方面，本申请提供了一种经修饰的免疫细胞。所述免疫细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4

在某些情形中，所述免疫细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括白细胞。白细胞通常是指一种有核的血细胞，具有活跃的移动能力，可以从血管内迁移到血管外，或从血管外组织迁移到血管内。除了在血液外，白细胞还可以存在于淋巴系统、脾，扁桃腺以及身体的其他组织。在本申请中，所述白细胞可以包括粒细胞(如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、无粒白细胞(如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、吞噬细胞、肥大细胞)。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括淋巴细胞，所述淋巴细胞可以包括在血液、淋巴和淋巴组织中发现的任何单核细胞、非吞噬白细胞，例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括外周血单个核细胞，其可包括在外周血中具有单个核的任何细胞。例如，在本申请中，所述外周血单个核细胞可以包括T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。巨噬细胞是一种可以吞噬和消化细胞碎片、微生物、癌细胞和那些所有缺少正常细胞表面表达的表面标志的其他物质，这个过程叫做吞噬作用。巨噬细胞几乎存在于所有组织中，通过阿米巴运动寻找可能的病原物。它们除了在非专一的天然免疫反应中起重要作用外，还可以通过招募其他免疫细胞类型，如淋巴细胞，帮助启动获得性免疫。

本申请所述的改造的免疫细胞，其不表达T细胞受体(TCR)。所述不表达T细胞受体(TCR)可以包括T细胞受体(TCR)的表达和/或活性下调。所述下调可以包含不表达有活性的TCR，不表达内源性TCR，不表达外源性TCR，不包含TCR结构，包含失活的TCR，和/或缺失TCR。

在某些情形中，所述免疫细胞中的T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性可以下调。在某些情形中，所述下调可包括下调编码所述细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性。在本申请所述改造的免疫细胞中，CD3抗体受体复合物的表达可以不依赖于TCR的表达。

所述免疫细胞中的MHC复合物的表达和/或活性下调。在某些情形中，所述下调可包括下调编码所述细胞MHC复合物的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述细胞MHC复合物蛋白的表达和/或活性。

在某些情形中，所述下调可通过基因敲除(knock out)、基因敲减(knock down)、基因突变、基因缺失、基因沉默或上述的任意组合来使所述免疫细胞的TCR和/或MHC复合物的表达和/或活性下调。

例如，可以向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质来实现下调：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统如RNA腺苷脱氨酶(ADAR)、RNA指导的核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、Mega-TAL核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(Meganuclease)、碱基编辑、CRISPR干扰，和，锌指蛋白(Zinc finger)基因阻遏物和/或转录激活子样效应物(TALE)基因阻遏物介导的转录抑制。

在某些情形中，所述下调可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述核酸分子(例如，编码所述细胞MHC复合物的核酸分子)外显子部分的指导RNA。靶向编码所述B2M的核酸分子的指导RNA可使用现有技术中的指导RNA，WO2019/011118的全文通过引用的方式并入本文。

本申请所述的改造的免疫细胞还可包含嵌合抗原受体(CAR)和/或嵌合自身抗体受体(CAAR)。

本申请提供了制备改造的淋巴细胞的方法，其可包括以下步骤：1.从健康供体中获取外周血T细胞；2.使用负载有CD3和CD28抗体的磁珠激活T细胞；3.T细胞激活后，使用慢病毒将嵌合抗体受体基因转入到T细胞内；4.去除磁珠；5.使用基因编辑技术敲除产生免疫排斥的重要基因TRAC和B2M；6.继续培养并收获细胞。

经过基因编辑而使淋巴细胞中的TRAC和B2M基因失活，能有效降低淋巴细胞在异体细胞治疗中的免疫排斥，并且同时在淋巴细胞中表达两种重组的CD3表面蛋白，这两种共表达的CD3表面蛋白即为CD3抗体受体，能使改造的淋巴细胞结合双特异性抗体。

制备改造的淋巴细胞的方法包括：(i)制备表面缺失I类MHC分子和TCR分子的淋巴细胞；(ii)在淋巴细胞表面表达两种重组的CD3表面蛋白。

另一方面，本申请提供了一种载体，其可用于将编码所述CD3抗体受体复合物的分离的核酸分子转入细胞。在本申请中，所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体中的一种或多种。所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。

核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及增强DNA摄取的试剂。可以使用基于RNA或DNA病毒的系统递送核酸，例如，利用病毒能够靶向体内的特定细胞的性质，将病毒有效加载(payload)运至细胞核中。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。所述分子可以通过BamHI和SalI酶切构建到慢病毒载体上。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述改造的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常是指可与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。

本申请所述药物组合物可以包括抗体。所述抗体可以和所述改造的免疫细胞存在于相同或不同的容器中。所述的抗体可以在所述改造的免疫细胞施用前、施用中或施用后施用。例如，所述抗体可以为双特异性抗体。所述双特异性抗体可以同时结合两个靶点，两个靶点可以在同一个靶蛋白上，也可以是不同的靶蛋白。T细胞衔接器是一种比较特殊的双特异性抗体。T细胞衔接器可以包括两个连接的scFv，一端靶向T细胞表面的CD3，另一端靶向靶细胞(例如，肿瘤细胞)表面的受体，从而介导T细胞杀伤肿瘤细胞。靶细胞表面的受体可以包括但不限于CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲受体(Frizzled)、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。

这种联合疗法的基本原理是双特异性抗体负责寻找到靶点，将T细胞引导到靶细胞，而改造的免疫细胞则负责对靶细胞的强力杀伤。在原代T细胞中，TCR未被敲除，双特异性抗体可以通过自然表达的TCR-CD3复合体介导对照T细胞对靶细胞的杀伤。如图1所示，在通用型CD3抗体受体T细胞中，CD3抗体受体表达于改造的免疫细胞表面。双特异性抗体能够通过CD3抗体受体，同时激活共激活信号和CD3 zeta激活信号，促进肿瘤细胞的杀伤和T细胞的增殖。联合使用的优势是细胞疗法可以和双特异性抗体进行多靶点组合，同时易于调控，使该疗法更加安全。在某些情形中，所述双特异性抗体可源自本申请所述的改造的免疫细胞。例如，所述双特异性抗体可以包括由本申请所述的改造的免疫细胞自身分泌的双特异性抗体。

本申请不仅可以应用于通用型T细胞，还可以应用于没有TCR结构的其他杀伤细胞，如NK细胞，或者吞噬细胞，如巨噬细胞等。目前CAR-T细胞使用后的复发包括靶蛋白阴性复发和靶蛋白阳性复发。靶蛋白阳性复发主要是CAR-T细胞在回输后的衰竭导致的。该疗法可以实现细胞消退后持续使用双特异性抗体，利用嵌合抗体受体T细胞和人体内自身的T细胞压制肿瘤的复发。针对晚期身体状态不好的病人也能通过灵活的调控，在保证安全性基础上实现好的治疗效果，增大了病人的适用范围。

另一方面，本申请还提供了所述的改造的免疫细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。

另一方面，本申请还提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述的改造的免疫细胞、所述的药物组合物。

所述受试者首先可以接受一定的化疗预处理，然后将改造的淋巴细胞与双特异性抗体同时或者先后通过静脉输给受试者。以先输细胞为例，细胞在输入后，再按照不同剂量输入双特异性抗体。如果病人出现副反应则调整双特异性抗体的输入剂量。可以重复输入改造的淋巴细胞和双抗，直到出现缓解或者严重的副反应。本申请的改造的淋巴细胞结合双特异性抗体后能够杀伤癌细胞，如血液癌与实体瘤癌细胞。

在本申请中，所述肿瘤可以包括非实体瘤，可以包括但不局限于白血病、淋巴瘤、和/或多发性骨髓瘤，以及实体肿瘤，包括但不局限于肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、胶质瘤及软组织肉瘤等。

例如，所述肿瘤可以包括淋巴瘤。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1设计CD3抗体受体复合物分子和构建质粒

(1)设计分子

从NCBI网站数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索获取基因序列信息(表1)，设计编码CD3抗体受体复合物的基因CG-UST-1(SEQ ID NO.13)，CG-UST-1包括两部分，为两个CD3重组蛋白基因的串联，第一CD3重组蛋白包含CD3 epsilon胞外域、CD28跨膜区、CD28胞内域和CD3 zeta胞内域(SEQ ID NO:10)。第二CD3重组蛋白包含CD3 gamma胞外域、CD28跨膜区和CD3 gamma胞内域(SEQ ID NO:11)。两个CD3重组蛋白之间通过连接分子T2A基因(SEQ ID NO.16)连接。

将CG-UST-1的编码第二CD3重组蛋白基因的CD3 gamma胞内域替换为编码短肽段的基因，得到CG-UST-2(SEQ ID NO.14)，编码第二CD3重组蛋白(SEQ ID NO:12)。同时设计了CG-UST-1的第一CD3重组蛋白的核酸分子CG-UST-3(SEQ ID NO.15)。为方便检测，在基因序列中加入了Flag标签。

(2)构建质粒

CG-UST-1基因序列由南京金斯瑞公司合成并克隆至pUC57载体(南京金斯瑞)内。在合成基因时，在基因两端加入特异性限制性内切酶酶切位点：BamH1和Sal1。将基因合成的重组质粒使用限制性内切酶BamH1(NEB；R3136S)和Sal1(NEB；R3138S)双酶切，使用琼脂糖凝胶电泳分离基因片段后分别进行胶回收纯化(QIAGEN；28706)。测定回收基因片段的浓度。使用T4 DNA连接酶(NEB；M0202S)将合成的基因序列连接到慢病毒载体(Addgene；货号：12252)的BamH1-Sal1位点。克隆的慢病毒载体称为：pL-CG-UST-1。克隆后对慢病毒载体质粒进行测序验证，重组质粒测序引物为：Lenti-For(TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC；SEQ ID NO:17)和Lenti-Rev(CCTCATAAAGAGACAGCAACCAGG；SEQ ID NO:18)。CG-UST-2和CG-UST-3的质粒构建采用相同的构建流程。构建成的慢病毒载体质粒分别称为：pL-CG-UST-2和pL-CG-UST-3。

实施例2制备慢病毒

(1)提取质粒

将上述构建的慢病毒载体质粒重新转化大肠杆菌。从转化好的平板上挑取单克隆到3ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基的摇菌管中，转速220rpm，摇床振荡培养8h；从活化好的菌液中吸取500μl接种到250ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基中，220rpm，摇床振荡培养12-16h。使用Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit试剂盒(货号：12662)按照试剂盒提供的实验流程进行质粒提取。提取质粒后使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)检测质粒浓度并通过DNA琼脂糖凝胶检测超螺旋质粒含量。

(2)培养293T细胞

将冻存的293T细胞(ATCC)从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入提前加入10ml预热的DMEM完全培养基的15ml离心管中，轻轻吹匀；1000rpm离心3min，吸弃上清；加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹匀后接种到10cm皿中，在37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养；当细胞密度达到80％-90％时，弃培养基，10ml PBS清洗1次；加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入培养箱1-2min(期间需要拿出在显微镜下观察细胞是否变圆)；细胞变圆后加入1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移到15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃上清。根据实验需要，按照1:3或1:5的比例传代，接种到新的10cm皿中，或者进行冻存。

(3)转染293T细胞，收获慢病毒

1)第1天，接种293T细胞：按照约15-16×10

2)第2天，质粒转染：转染前培养基需换成有10％FBS但无双抗的培养基。首先准备质粒复合物：将以下质粒加入到1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific；31985-070)内，加入后混匀。病毒载体质粒：18μg，psPAX2质粒(Addgene；货号：12260)：9μg，pMD2.G质粒(Addgene；货号：12259)：18μg。再准备转染试剂复合物：将100μl Lipofectamine 2000(invitrogen；11668-019)加入到1.5ml Opti-MEM内，加入后混匀，室温静置5min；再将质粒复合物加入到转染试剂复合物中，混匀后静置25min；最后将转染复合物加入到细胞培养基中，轻轻摇匀。

3)第4天，收获病毒：收取细胞上清，2000rpm，离心10min；使用0.45um滤膜过滤上清，滤液转移到专用离心管中，配平；使用超速离心机20000rpm超速离心2-3h；倒掉上清后，使用无血清培养基重悬慢病毒，分装慢病毒后保存在-80℃。按照该流程分别制备含有CG-UST-1、CG-UST-2和CG-UST-3的慢病毒。

实施例3制备通用型表达CD3抗体受体复合物的T细胞

使用单采机分离健康供体外周血的PMBCs(购自妙通生物)。将PBMCs稀释到2×106。按照细胞与磁珠1:3的比例使用CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活T细胞，同时添加IL-2(PeproTech；200-02)。在激活后第3天，将浓缩的慢病毒加入到T细胞培养瓶内，转染T细胞。在T细胞激活后的第5天，使用CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TCR和B2M，构建通用型T细胞。使用的gRNA序列和操作流程参考专利WO2019/011118实施例3进行。

实施例4检测CD3抗体受体在细胞内的表达情况

通过荧光抗体染色和流式细胞术检测CD3抗体受体复合物在细胞内的表达情况，基本步骤如下：分别离心收集一定体积培养的改造的T细胞，使用Flag抗体(BioLegend；637309)和APC-TCR抗体(BioLegend；306718)对细胞进行染色，避光30min孵育，用PBS洗涤一次后使用适量体积PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测CD3抗体受体复合物在T细胞内的表达情况和在TCR阴性细胞中的表达情况。

Flag抗体和APC-TCR抗体的染色结果如图2所示。在未转染的对照组，TCR未敲除时，TCR阳性率为95.09％；TCR敲除后，TCR阳性率为1.95％。说明敲除效率很高。在TCR未敲除的组别，CD3抗体受体复合物的表达效率分别为：CG-UST-1：27.21％、CG-UST-2：25.41％和CG-UST-3：68.88％。在TCR敲除组，TCR阴性的T细胞中，CD3抗体受体复合物的表达效率分别为：CG-UST-1：30.2％、CG-UST-2：25.0％和CG-UST-3：65.6％(图2)。在敲除组，表达效率与对应的未敲除组类似，因此CD3抗体受体复合物都可以以TCR不依赖的形式独立表达于人T细胞。

使用不同的CD3抗体UCHT1(BD Biosciences；555335)、HIT3a(BD Biosciences；561804)、SP34-2(BD Biosciences；552127)和OKT3(BD Biosciences；566686)对表达CD3抗体受体的T细胞染色，并用流式细胞仪进行分析。结果分别如图3-图6所示。结果显示，表达CG-UST-1和CG-UST-2的T细胞可以被常见CD3抗体克隆UCHT1识别。如图3所示，TCR敲除组，在TCR阴性的T细胞中，CG-UST-1和CG-UST-2组分别有22.0％和19.9％的细胞被UCHT1所识别。采用同样的染色和分析方法发现，表达CG-UST-1和CG-UST-2的T细胞可以被CD3抗体HIT3a克隆所识别(见图4)，但是不能被克隆SP34-2识别(见图5)。进一步同时对细胞进行SP34-2和OKT3抗体染色发现，这些细胞可以被OKT3抗体识别(见图6)。但是单独表达包含CD3 epsilon膜外域的CG-UST-3的T细胞不能被常见CD3抗体克隆识别(见图3-图6)。

因此，CD3抗体受体可以以不依赖于TCR的形式表达于TCR敲除的原代T细胞内。共表达CD3 epsilon和CD3 gamma胞外域的CD3抗体受体复合物的T细胞可以被常规CD3抗体识别，其中包括CD3抗体UCHT1、HIT3a和OKT3。

实施例5CD3抗体OKT3激活通用型CD3抗体受体T细胞

(1)包被平板。使用PBS稀释OKT3抗体，稀释到0.25μg/ml。将稀释的抗体按照100μl每孔加入到96孔板中，37℃孵育3小时。孵育完成后，使用1×PBS清洗平板，去除PBS。

(2)激活T细胞。将不同组别的T细胞密度调整为1×10

(3)检测T细胞的激活。细胞孵育完成后，取一定体积的细胞，使用CD137荧光抗体(BD Biosciences；555956)和TCR抗体(Biolegend；306718)进行细胞染色，使用流式细胞术检测TCR敲除T细胞中激活标签CD137蛋白的表达情况。在表达CD3抗体受体CG-UST-1和CG-UST-2的T细胞中，TCR阴性切CD137阳性的细胞分别为7.01％和4.05％，见图7。说明包被的CD3抗体可以激活通用型CD3抗体受体T细胞。

(4)检测细胞因子分泌。取上述细胞的上清，转移到新的96孔板，使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific；货号88-7316)检测T细胞IFN-γ细胞因子的分泌情况。平板制备和上清细胞因子的检测按照试剂盒提供的流程进行。

结果发现，OKT3抗体分别刺激表达CG-UST-1和CG-UST-2的通用型抗体受体T细胞分泌341.28和248.76pg/ml的IFN-γ，分泌情况见表1。因此，包被的CD3抗体可以刺激表达CD3抗体受体复合物CG-UST-1和CG-UST-2的通用型T细胞分泌细胞因子IFN-γ。

表1.OKT3抗体刺激通用型CD3抗体受体T细胞分泌细胞因子IFN-γ(pg/ml)

实施例6通用型CD3抗体受体复合物T细胞联合抗CD3抗CD19双特异性抗体杀伤肿瘤细胞

抗CD3抗CD19双特异性抗体购自Invivogen(货号：bimab-hcd19cd3)。该双抗可以同时结合CD3 epsilon和CD19，介导T细胞杀伤表达CD19的靶细胞。该双抗使用的CD3抗体克隆号为L2K-07。

(1)细胞共培养。

首先进行细胞共培养。步骤如下：将不同组别的T细胞浓度调整至1×10

(2)CD137表达检测。

取一定体积的细胞，使用CD19抗体(eBioscience，11-0199-42)、CD137荧光抗体和TCR抗体进行细胞染色，使用流式细胞术检测。CD19阴性的细胞即为T细胞。通过检测细胞膜激活标签CD137，发现添加双抗的Raji细胞可以激活表达CD3抗体受体CG-UST-1和CG-UST-2的通用型T细胞，见图8。在TCR阴性的T细胞中，两者的CD137阳性率分别为7.15％和6.47％。

(3)细胞因子分泌检测。

孵育完成后取上清，如实施例5，进行ELISA实验。结果显示抗CD3抗CD19双特异性抗体可以介导通用型CD3抗体受体T细胞分泌细胞因子IFN-γ，见表2。在TCR敲除的情况下，双抗联合肿瘤细胞分别刺激表达CG-UST-1和CG-UST-2的通用型抗体受体T细胞分泌287.639和286.512pg/ml的IFN-γ。

表2.双抗介导肿瘤细胞刺激通用型CD3嵌合抗体受体T细胞分泌细胞因子IFN-γ(pg/ml)

(4)CD107a表达检测。

1)取96孔板，每孔加T细胞和靶细胞各2×10

2)将样品离心去除培养基，使用无血清培养基洗细胞一次，1600rpm离心6分钟。弃上清，重悬细胞，重悬体积100μl。每管加入适量CD3抗体UCHT1，4℃避光孵育30分钟；

3)每管用PBS清洗细胞1次，1600rpm离心5分钟。仔细吸去上清；

4)加入适量PBS重悬细胞，流式细胞仪检测CD107a表达量。

结果显示表达CG-UST-1和CG-UST-2的通用型抗体受体T细胞可以被UCHT1识别，同时抗CD3抗CD19双特异性抗体可以介导通用型抗体受体T细胞释放杀伤颗粒(见图9)。在经过双抗和肿瘤细胞刺激后，表达CG-UST-1和CG-UST-2的通用型CD3抗体受体T细胞分别有9.49％和10.75％的细胞表达CD107a。因此，通用型CD3抗体受体T细胞可以和双特异性抗体联合使用杀伤肿瘤细胞。

序列表

<110> 苏州克睿基因生物科技有限公司

<120> 一种表达CD3抗体受体复合物的免疫细胞及其用途

<130> 0141-PA-009CN

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val

1 5 10 15

Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly

20 25 30

Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu

35 40 45

Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu

50 55 60

Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val

85 90 95

Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp

100

<210> 2

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu

1 5 10 15

Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr

20 25 30

Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys

35 40 45

Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln

50 55 60

Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile Ser

85 90

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp

20 25 30

Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Arg Asn

35 40 45

<210> 4

<211> 84

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys

1 5 10 15

Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser

20 25 30

Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly

35 40 45

Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr

50 55 60

Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro

65 70 75 80

Ala Thr Val Ala

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu

1 5 10 15

Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

35 40 45

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

20 25 30

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35 40

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 8

<211> 41

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 10

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 第一CD3重组蛋白（CD3 epsilon胞外域+CD28跨膜区+CD28胞内域+CD3 zeta胞内域）

<400> 10

Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val

1 5 10 15

Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly

20 25 30

Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu

35 40 45

Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu

50 55 60

Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly

65 70 75 80

Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val

85 90 95

Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

100 105 110

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

115 120 125

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

130 135 140

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

145 150 155 160

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe

165 170 175

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

180 185 190

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

195 200 205

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

210 215 220

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

225 230 235 240

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

245 250 255

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

260 265 270

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

275 280

<210> 11

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 第二CD3重组蛋白1（CD3 gamma胞外域+CD28跨膜区+CD3 gamma胞内域）

<400> 11

Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu

1 5 10 15

Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr

20 25 30

Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys

35 40 45

Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln

50 55 60

Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile Ser Phe Trp

85 90 95

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

100 105 110

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

115 120 125

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr

130 135 140

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

145 150 155 160

Asn Gln Leu Arg Arg Asn

165

<210> 12

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 第二CD3重组蛋白2（CD3 gamma胞外域+CD28跨膜区+短肽）

<400> 12

Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu

1 5 10 15

Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr

20 25 30

Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys

35 40 45

Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln

50 55 60

Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile Ser Phe Trp

85 90 95

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

100 105 110

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

115 120 125

Ser

<210> 13

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CG-UST-1

<400> 13

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatggta atgaagaaat gggtggtatt acacagacac catataaagt ctccatctct 120

ggaaccacag taatattgac atgccctcag tatcctggat ctgaaatact atggcaacac 180

aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac 240

ctgtcactga aggaattttc agaattggag caaagtggtt attatgtctg ctaccccaga 300

ggaagcaaac cagaagatgc gaacttttat ctctacctga gggcaagagt gtgtgagaac 360

tgcatggaga tggatttttg ggtgctggtg gtggttgggg gagtcctggc ttgctatagc 420

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 480

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 540

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 600

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 660

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 720

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 780

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 840

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 900

gccctgcccc ctcgcggcag cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 960

gaggagaatc ccggccctag gatgcttctc ctggtgacaa gccttctgct ctgtgagtta 1020

ccacacccag cattcctcct gatcccaggc ggcagcgact acaaagacga tgacgacaag 1080

ggtggctccc agtcaatcaa aggaaaccac ttggttaagg tgtatgacta tcaagaagat 1140

ggttcggtac ttctgacttg tgatgcagaa gccaaaaata tcacatggtt taaagatggg 1200

aagatgatcg gcttcctaac tgaagataaa aaaaaatgga atctgggaag taatgccaag 1260

gaccctcgag ggatgtatca gtgtaaagga tcacagaaca agtcaaaacc actccaagtg 1320

tattacagaa tgtgtcagaa ctgcattgaa ctaaatgcag ccaccatatc tttttgggtc 1380

cttgtcgttg tcgggggcgt cttggcgtgt tatagcctcc tcgtcaccgt agcattcatt 1440

atattctggg tgggacagga tggagttcgc cagtcgagag cttcagacaa gcagactctg 1500

ttgcccaatg accagctcta ccagcccctc aaggatcgag aagatgacca gtacagccac 1560

cttcaaggaa accagttgag gaggaattga 1590

<210> 14

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CG-UST-2

<400> 14

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatggta atgaagaaat gggtggtatt acacagacac catataaagt ctccatctct 120

ggaaccacag taatattgac atgccctcag tatcctggat ctgaaatact atggcaacac 180

aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac 240

ctgtcactga aggaattttc agaattggag caaagtggtt attatgtctg ctaccccaga 300

ggaagcaaac cagaagatgc gaacttttat ctctacctga gggcaagagt gtgtgagaac 360

tgcatggaga tggatttttg ggtgctggtg gtggttgggg gagtcctggc ttgctatagc 420

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 480

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 540

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 600

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 660

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 720

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 780

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 840

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 900

gccctgcccc ctcgcggcag cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 960

gaggagaatc ccggccctag gatgcttctc ctggtgacaa gccttctgct ctgtgagtta 1020

ccacacccag cattcctcct gatcccaggc ggcagcgact acaaagacga tgacgacaag 1080

ggtggctccc agtcaatcaa aggaaaccac ttggttaagg tgtatgacta tcaagaagat 1140

ggttcggtac ttctgacttg tgatgcagaa gccaaaaata tcacatggtt taaagatggg 1200

aagatgatcg gcttcctaac tgaagataaa aaaaaatgga atctgggaag taatgccaag 1260

gaccctcgag ggatgtatca gtgtaaagga tcacagaaca agtcaaaacc actccaagtg 1320

tattacagaa tgtgtcagaa ctgcattgaa ctaaatgcag ccaccatatc tttttgggtc 1380

cttgtcgttg tcgggggcgt cttggcgtgt tatagcctcc tcgtcaccgt agcattcatt 1440

atattctggg tgggacagga tggagttcgc cagtcgtga 1479

<210> 15

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CG-UST-3

<400> 15

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggcggca gcgactacaa agacgatgac gacaagggtg gctccgatgg taatgaagaa 120

atgggtggta ttacacagac accatataaa gtctccatct ctggaaccac agtaatattg 180

acatgccctc agtatcctgg atctgaaata ctatggcaac acaatgataa aaacataggc 240

ggtgatgagg atgataaaaa cataggcagt gatgaggatc acctgtcact gaaggaattt 300

tcagaattgg agcaaagtgg ttattatgtc tgctacccca gaggaagcaa accagaagat 360

gcgaactttt atctctacct gagggcaaga gtgtgtgaga actgcatgga gatggatttt 420

tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 480

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 540

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 600

gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 660

cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 720

gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 780

cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 840

attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 900

agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctga 960

<210> 16

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> T2A

<400> 16

ggcagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cctagg 66

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Lenti-For

<400> 17

tcaagcctca gacagtggtt c 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Lenti-Rev

<400> 18

cctcataaag agacagcaac cagg 24

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 短肽

<400> 19

Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser

1 5