包含核壳结构的微粒作为活性成分的用于增加生长因子基因表达的组合物

摘要

本公开涉及用于增加生长因子基因表达的组合物，其包含核壳结构的微粒作为活性成分。当与基因一起在体内施用时，根据本公开的用于增加生长因子基因表达的组合物可以使共同施用的基因的表达增加至少30％或高于30％。特别地，当与适用于本发明的选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人HGF的变体基因和其突变基因的至少一种基因，或与适用于本发明的选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人IGF‑1的变体基因及其突变基因的至少一种基因一起施用时，所述组合物可以使基因的表达增加至少30％或高于30％。当与基因治疗剂一起施用时，即使使用少量的基因，组合物也可以实现治疗效果，因此所述组合物是有用的。

说明书

技术领域

本公开涉及用于增加生长因子基因表达的组合物，其包含核壳结构的微粒作为活性成分。

背景技术

人肝细胞生长因子(HGF)由中胚层衍生的细胞分泌，并根据靶细胞和环境发挥不同的功能(Stella，M.C.和Comoglio，P.M.，The International Journal of Biochemistry& Cell Biology，31：1357-1362(1999))。其功能包括：1)通过促进上皮细胞的分裂和运动并增强其基质侵袭能力来诱导上皮细胞形成肾小管结构；2)在体外和体内通过内皮细胞刺激血管化；3)由于其抗凋亡活性而使肝和肾再生；4)胚胎发育过程中肾、卵巢和睾丸的器官发生；5)通过调节破骨细胞和成骨细胞的功能来控制骨发生；6)促进红细胞生成祖细胞的生长和分化；和7)神经元的轴突萌生。基于这些不同的功能，可以将肝细胞生长因子开发为各种疾病例如缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的治疗剂。

人胰岛素样生长因子1(IGF1)是由70个氨基酸组成的多肽激素，其具有胰岛素样活性和有丝分裂促进活性。这种激素可促进肌肉骨骼系统、肝脏、肾脏、肠、神经系统、心脏、肺等各种组织的细胞生长。

如本领域技术人员众所周知的，IGF1的已知和潜在用途是多种多样且广泛的。例如，已经有许多关于使用IGF1作为治疗神经退行性症状的潜在治疗剂的报道。例如，参考Kanje等人，Brain Res.，486：396-398(1989)；Hantai等人，J.Neurol.Sci.，129：122-126(1995)；Contreras等人，Pharmac.Exp.Therap.，274：1443-1499(1995)；Di Giulio等人，Society for Neuroscience，22：1960(1996)；Di Giulio等人，Society forNeuroscience，23：894(1997)；Hsu等人，Biochem.Mol.Med.，60(2)：142-148(1997)；Gorio等人，Neuroscience，82：1029-1037(1998)。IGF1疗法针对多种神经系统症状，例如ALS、卒中、癫痫、帕金森病、阿尔茨海默病、急性创伤、衰老、其他与疾病或损伤相关的病症等。例如，参考美国专利第5093137号、第5652214号和第5703045号；以及国际专利公开第1990-001483号和第1993-002695号。

在许多公开的文献中陈述了IGF1疗法用于各种其他症状的用途。例如，参见Schalch等人，″Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-likegrowth factor I(rhIGF-I)in type II diabetes mellitus″.Modem Concepts ofInsulin-Like Growth Factors，Spencer，ed.，New York：Elsevier SciencePubl.Co.pp.705-714(1991)；Clemmons和Underwood，J.Clin.Endocrinol.Metab.，79(1)：4-6(1994)；和Langford等人，Eur.J.Clin.Invest.，23(9)：503-516(1993)(例如，提到了胰岛素抵抗和糖尿病)；O′shea等人，Am.J.Physiol.，264：F917-F922(1993)(例如，提到了肾功能下降)。另外，参考US专利第7258864号(例如，提到了身材矮小症)；US专利第5110604号和第5427778号(例如，提到了伤口愈合)；US专利第5126324号(例如，提到了心脏疾病和发育迟缓)；US专利第5368858号(例如，提到了软骨缺损或损伤)；US专利第5543441号和第5550188号(例如，提到了组织增大)；US专利第5686425号(例如，提到了疤痕组织、局部肌肉功能障碍和尿失禁)；和US专利第5656598号(例如，提到了骨骼生长)。另外，参考国际专利公开第1991-012018号(例如，提到了肠道功能紊乱)；国际专利公开第1992-009301号和国际专利公开第1992-014480号(例如，提到了伤口愈合)；国际专利公开第1993-008828号(例如，提到了缺血、缺氧或神经退行性神经损伤)；国际专利公开第1994-016722号(例如，提到了胰岛素抵抗)；国际专利公开第1996-002565号(例如，提到了IGF/IGFBP复合物用于促进骨骼形成和调节骨骼重塑)；US专利公开第2003-0100505号(例如，提到了骨质疏松症)；和US专利公开第2005-0043240号(例如，提到了肥胖症)。

本公开的发明人已经研究开发了即使使用少量基因也能够实现治疗效果的基因治疗剂。在这情况下，发明人已经确定，当将组成为卤代烃和/或卤化硫作为核且脂质成分作为外壳的核壳结构微粒与HGF、IGF1等的基因一起在体内施用时，生长因子基因的表达显著增加，从而完成了本公开。

相关技术的参考

专利文献

(专利文献001)KR 10-0562824 B。

发明内容

技术问题

本公开旨在提供用于增加生长因子基因表达的组合物，其包含核壳结构的微粒作为活性成分。

本公开还旨在提供用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的药物组合物，其包含上述组合物。

本公开还旨在提供用于预防或治疗通过结合至IGF1受体介导的症状或疾病的药物组合物，其包含上述组合物。

技术方案

本公开提供了用于增加生长因子基因表达的组合物，其包含核壳结构的微粒作为活性成分，其中核是作为生物相容性气体的卤代烃、卤化硫或其混合物，壳是脂质或其衍生物，生长因子基因是选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因或选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因。

在本公开的示例性实施方案中，生物相容性气体可以选自六氟化硫、八氟丙烷、溴氯二氟甲烷、一氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷及其混合物。

在本公开的一个示例性实施方案中，卤代烃可以是全氟烃。

在本公开的一个示例性实施方案中，全氟烃可以是全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟丙烯、全氟丁烯、全氟丁二烯、全氟丁-2-烯、全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟甲基环己烷、全氟甲基环己烷、全氟甲基环己烷或其混合物。

在本公开的一个示例性实施方案中，脂质可以是选自单脂、磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇和阳离子脂质中的一种或多于一种。

在本公开的一个示例性实施方案中，磷脂可以选自磷脂酰胆碱衍生物、磷脂酰乙醇胺衍生物、磷脂酰丝氨酸衍生物、二乙酰化磷脂、L-α-二油醇磷脂酰乙醇胺、二油精、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、聚乙二醇化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂和氢化磷脂。

在本公开的一个示例性实施方案中，甘油糖脂可以选自磺氧基核糖基甘油酯、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯和糖基二甘油酯。

在本公开的一个示例性实施方案中，鞘糖脂可以是半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂或神经节苷脂。

在本公开的一个示例性实施方案中，阳离子脂质可以选自1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(2，3-二油基氧基丙-1-基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙三氟乙酸铵(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)、1，2-二油酰基氧基丙基-3-二乙基羟乙基溴化铵(DORIE)和3β-[N-(N′N′-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)。

在本公开的一个示例性实施方案中，人肝细胞生长因子的变体基因可以由选自SEQ IDS NO 3至6的碱基序列的任何一种组成。

在本公开的一个示例性实施方案中，组合物可以使生长因子基因的表达增加30％或大于30％。

本公开还提供了用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的药物组合物，其包含上述组合物和选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因。

在用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的药物组合物中，人肝细胞生长因子基因可以由SEQ ID NO 2的碱基序列组成并且人肝细胞生长因子的变体基因可以由选自SEQ IDS NO 3至6的碱基序列的任何一种组成。

本公开还提供了用于预防或治疗通过与IGF1受体结合介导的症状或疾病的药物组合物，其包含上述组合物和选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因。

在用于预防或治疗通过结合至IGF1受体介导的症状或疾病的药物组合物中，人胰岛素样生长因子1基因可以由SEQ ID NO 7的碱基序列组成。

在本公开的一个示例性实施方案中，症状或疾病可以选自身材矮小症、肥胖症、体重减轻、恶病质、厌食、神经退行性病症、与纤维化有关的病症、软骨症、骨病、炎性病症、肠道病症、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、Rabson-Mendenhall综合征、视网膜病变、肢端肥大症、纤维肌增生和心脏疾病。

在本公开的一个示例性实施方案中，需要治疗身材矮小症的对象可以是患有胰岛素样生长因子1缺乏症(IGFD)的儿童，并且组合物可以有效地治疗儿童中的IGFD。

有益效果

当与基因(例如编码该基因的多核苷酸或包含该基因的载体)一起在体内施用时，本公开的用于增加生长因子的基因表达的组合物可以使生长因子的基因表达增加至少30％或大于30％。

特别地，当与适用于本公开的选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因的至少一种基因或选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的亚型基因及其变体基因的至少一种基因一起施用时，组合物可以使生长因子的基因表达增加至少30％。

当与基因治疗剂一起施用时，即使具有非常少量的基因，组合物也可以实现治疗效果，因此是有用的。

附图说明

图1示出了根据本公开的一个示例性实施方案的pGP载体的酶切图。

图2比较了根据施用pGP-HGF(仅基因)、对照组的药物组合物(HGF-JetPEI)和根据实施例1的药物组合物(HGF-MP1、HGF-MP2和HGF-MP3)的小鼠中的HGF蛋白的表达水平。

图3比较了根据施用pGP-HGFX7(仅基因)、对照组的药物组合物(HGFX7-JetPEI)和根据实施例2的药物组合物(HGFX7-MP1和HGFX7-MP2)的小鼠中的HGF蛋白的表达水平。

图4比较了根据施用pGP-IGF1(仅基因)、对照组的药物组合物(IGF1-JetPEI)和根据实施例3的药物组合物(IGF1-MP1、IGF1-MP2和IGF1-MP3)的小鼠中的IGF1蛋白的表达水平。

图5比较了根据施用pGP-VEGF(仅基因)、对照组的药物组合物(VEGF-JetPEI)和根据对比例1的药物组合物(VEGF-MP1和VEGF-MP2)的小鼠中的VEGF蛋白的表达水平。

图6比较了根据施用pGP-FGF1(仅基因)和根据对比例2的药物组合物(FGF1-MP1和FGF1-MP2)的小鼠中FGF1蛋白的表达水平。

图7比较了根据施用pGP-FGF4(仅基因)和根据对比例3的药物组合物(FGF4-MP1和FGF4-MP2)的小鼠中FGF4蛋白的表达水平。

图8比较了根据施用pGP-PDGF-B(仅基因)和根据对比例4的药物组合物(PDGF-B-MP1和PDGF-B-MP2)的小鼠中PDGF-B蛋白的表达水平。

图9显示了在将本公开的实施例2的组合物(HGFX7-MP2)施用至糖尿病诱发的大鼠周围神经病模型2周后，PWT值显著增加。

图10显示了在将实施例1的组合物(HGF-MP2)施用至慢性收缩性损伤诱发的大鼠神经病模型2周后，PWT值显著增加。

最佳实施方式

在下文中，更详细地描述本公开内容。

在一方面，本公开提供了用于增加生长因子基因表达的组合物，其包含核壳结构的微粒作为活性成分，其中核是作为生物相容性气体的卤代烃、卤化硫或其混合物，壳是脂质或其衍生物，生长因子基因是选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因或选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因。

核

在本公开中，“核”可以由卤代烃、卤化硫或其混合物作为生物相容性气体组成。

生物相容性气体可以是六氟化硫、八氟丙烷、溴氯二氟甲烷、一氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷或其混合物。

具体地，卤代烃可以是全氟烃。

全氟烃可以是全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟丙烯、全氟丁烯、全氟丁二烯、全氟丁-2-烯、全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟甲基环己烷、全氟甲基环己烷、全氟甲基环己烷或其混合物。

具体地，本公开的生物相容性气体可以是六氟化硫或全氟丁烷。

壳

在本公开中，“壳”可以由脂质或其衍生物组成。

脂质可以是选自单脂、磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、胆固醇和阳离子脂质中的一种或多于一种。具体而言，其可以是磷脂。

磷脂可以是磷脂酰胆碱衍生物、磷脂酰乙醇胺衍生物、磷脂酰丝氨酸衍生物、二乙酰化磷脂、L-α-二油基磷脂酰乙醇胺、二油精、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、聚乙二醇化磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化磷脂等。

甘油糖脂可以是磺氧基核糖基甘油酯、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等。

鞘糖脂可以是半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂等。

并且，阳离子脂质可以是1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(2，3-二油基氧基丙-1-基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙三氟乙酸铵(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)、1，2-二油酰基氧基丙基-3-二乙基羟乙基溴化铵(DORIE)、3β-[N-(N′N′-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。

微粒

本公开的微粒通过包围核气体的壳而稳定。壳阻止了气体向附近液体的扩散，并防止了微粒之间的融合。

当在体内施用时，微粒保持其形状，直到其到达靶细胞或组织，并在靶细胞或组织附近被破坏释放出气体。释放的气体可引起靶细胞的细胞膜变化，并可促进生长因子基因通过气体的喷射力进入靶细胞的细胞质环境。

微粒的平均直径可以为1μm至10μm，特别是2μm至8μm，更特别是2μm至4μm。

用于增加基因表达的组合物

近年来，对以气体为核的核壳微粒进行了许多研究。在先前的研究中，除非与微粒一起超声辐照，否则无法达到增加基因表达的效果。

具体而言，Sang-Chol Lee等人，Korean Circulation J 2006；36：32-38；″Enhancement of Gene Delivery into Mouse Skeletal Muscle with MicrobubbleDestruction by Low-Frequency Ultrasound″公开了当仅注射荧光素酶基因-微粒混合物而不进行超声辐照时无法实现增加基因表达的效果。

ZP Shen等人，Gene Therapy(2008)15，1147-1155；″Ultrasound withmicrobubbles enhances gene expression of plasmid DNA in the liver viaintraportal delivery″也公开了当仅注射荧光素酶基因-微粒混合物而不进行超声辐照时无法实现增加基因表达的效果。

另外，Xingsheng Li等人，J Ultrasound Med 2008；27：453-460；″ExperimentalResearch on Therapeutic Angiogenesis Induced by Hepatocyte Growth FactorDirected by Ultrasound-Targeted Microbubble Destruction in Rats″公开了当仅注射HGF基因-脂质体微粒混合物而不进行超声辐照时无法达到增加基因表达的效果。

然而，本公开的发明人已经发现，在研究微粒的使用期间，当基因与根据本公开的微粒一起注射时，即使在无超声辐照的情况下，HGF或IGF1基因的表达水平也显著增加，并且完成了本公开。同时，如在测试实施例中具体描述的，用除HGF或IGF1以外的生长因子基因的微粒不能实现增加基因表达的效果。

当与基因一起体内施用时，根据本公开的用于增加生长因子基因表达的组合物可以使生长因子的基因表达水平增加至少30％。

特别地，当与适用于本公开的选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因的至少一种基因或选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的亚型基因及其变体基因的至少一种基因一起施用时，组合物可以使基因的表达增加至少30％，特别是40％或大于40％，更特别是50％或大于50％，最特别是100％或大于100％。

在下述实施例中，证实了当与HGF、HGFX7或IGF1基因一起施用至小鼠时，用于增加本公开的基因表达的组合物显著增加了HGF、HGFX7或IGF1基因的表达水平。更具体地说，HGF、HGFX7和IGF1的表达水平分别增加了45％或大于45％、120％或大于120％和35％或大于35％。同时，发现即使将VEGF、FGF1、FGF4或PDGF-B与本公开的用于增加基因表达的组合物一起施用时，VEGF、FGF1、FGF4或PDGF-B的表达水平也没有显著增加。具体地，相较而言，VEGF、FGF4和PDGF-B的表达水平仅分别增加最高16％、最高14％和最高4％，FGF1的表达水平则降低了40％或大于40％。

也就是说，似乎本公开的用于增加基因表达的组合物仅在与生长因子基因中选自人肝细胞生长因子(HGF)、其亚型及其变体的一种或多于一种基因或选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)、其亚型及其变体的一种或多于一种基因一起施用时才有效地特异性地增加基因的表达水平。

组合物还可以包含药物佐剂，例如稳定剂、缓冲剂、控制渗透压的盐、赋形剂、防腐剂等或其他治疗上有用的物质，并且可以根据常见方法制备成用于口服或肠胃外施用，特别是用于肠胃外施用的各种制剂。具体地，用于肠胃外施用的制剂通常可以是等渗水溶液或悬浮液形式的注射制剂。或者，可将组合物制成粉末，然后在施用前立即悬浮在溶剂中。

在本公开的用于增加基因表达的组合物中，虽然没有特别限制，但微粒的含量可以为0.5μL/mL至2000μL/mL，特别是1μL/mL至1000μL/mL或5μL/mL至2000μg/mL，特别是10μL/mL至1000μg/mL。

如果微粒的含量在上述范围之外，则不能实现所需的效果。

具体地，可以将组合物与基因混合施用以实现更好的效果。

基因

当与以下基因一起施用时，根据本公开的用于增加基因表达的组合物可以进一步增加基因的表达和效率。

人肝细胞生长因子基因可以由SEQ ID NO 2的碱基序列组成。人肝细胞生长因子可以以基因治疗剂的形式或蛋白质治疗剂的形式开发。

在本公开中，“人肝细胞生长因子的亚型”是指具有与动物中天然存在的HGF氨基酸序列(包括所有等位基因变体)至少80％同一性的氨基酸序列的HGF多肽。例如，HGF亚型包括正常形式或野生型的HGF，以及HGF的各种变体(例如剪接变体或缺失变体)。

在本公开中，“人肝细胞生长因子的变体基因”可以是能够表达HGF的两个变体(HGF和dHGF)的杂合HGF基因(参见韩国专利注册第10-0562824号)。具体地，“杂合HGF基因”是指同时表达两种类型的变体HGF和dHGF(HGF的缺失变体)的杂合HGF基因(SEQ ID NO 3至5)，其具有插入在HGF cDNA的外显子4和外显子5之间的人HGF基因的内含子4或其片段序列，并具有高基因表达效率。

根据本公开的基因治疗剂策略，就治疗效果而言，使用编码两种或多于两种类型的HGF变体的一种或多于一种核苷酸序列可能是优选的。可以作为单独的多核苷酸或另外的多核苷酸提供编码两种或多于两种类型的HGF变体的核苷酸序列。

另外，在本公开中，“人肝细胞生长因子的变体基因”可以是HGFX6(SEQ ID NO 3)(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

另外，在本公开中，“人肝细胞生长因子的变体基因”可以是HGFX7(SEQ ID NO 4)(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

另外，在本公开中，“人肝细胞生长因子的变体基因”可以是HGFX8(SEQ ID NO 5)(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

另外，在本公开中，“人肝细胞生长因子的变体基因”可以是HGF(dHGF)的缺失变体(SEQ ID NO 6)(参见韩国专利注册第10-0562824号)。在本公开中使用的术语“dHGF”是指通过在动物特别是在哺乳动物中选择性剪接HGF基因而产生的HGF蛋白的缺失变体。更具体地，它是指由723个氨基酸组成的人HGF，其中在全长HGF序列(728氨基酸)中，α链的第一个三环结构域中缺失了5个氨基酸(F、L、P、S和S)。

人胰岛素样生长因子基因，特别是人胰岛素样生长因子1(IGF1)可以由SEQ ID NO7的碱基序列组成。人胰岛素样生长因子可以以蛋白治疗剂的形式或基因治疗剂的形式开发。

IGF1主要由人生长激素(hGH)刺激而由肝脏分泌。人体的几乎所有细胞，特别是肌肉、软骨、骨骼、肝脏、肾脏、神经、皮肤和肺中的细胞都受到IGF1的影响。除了胰岛素样作用，IGF1还可以调节细胞生长。

本公开中使用的术语“IGF1亚型(变体)”是指具有与动物中天然存在的IGF1氨基酸序列(包括所有等位基因变体)至少80％同一性的氨基酸序列的IGF1多肽。例如，IGF1亚型包括所有正常形式或野生型的IGF1，以及IGF1的各种变体(例如剪接变体、缺失变体或置换变体)。

IGF1亚型的具体实例包括IGF1 Ea、IGF1 Eb、IGF1 Ec等。

在本公开中，“IGF1变体”可以是IGF1的缺失变体(dIGF1)或在特定位置具有氨基酸置换的IGF1变体。在本公开中使用的术语“dIGF1”是指通过在动物特别是在哺乳动物中选择性剪接IGF1基因而产生的IGF1蛋白的缺失变体。作为IGF1置换变体的一个具体实例，“IGF1变体”可以是其中第42位的氨基酸甘氨酸被丝氨酸置换的多肽。作为另一个具体实例，“IGF1变体”可以是在IGF1蛋白的氨基酸G1、P2、E3、R36、R37、K68、S69和/或A70中具有突变的多肽。

质粒

当与包括编码基因的单链多核苷酸的质粒一起施用时，根据本公开的用于增加基因表达的组合物可以进一步增加基因的表达和效率。

在本公开中，术语“质粒”通常是指与载体可操作地连接使得外源基因可以在宿主细胞中表达的环状DNA分子。然而，质粒可被用作被特异性限制性内切酶切割并通过基因重组引入新靶基因的载体。因此，术语质粒和载体在本公开中可互换使用，即使不区分术语，基因工程领域的普通技术人员根据上下文也会充分理解。

在本公开中，术语“载体”是指能够稳定地将外源基因转运到宿主细胞中的DNA分子。作为有用的载体，它必须是可复制的，具有进入宿主细胞的方式，并配备有检测其存在的方式。

表达

当与包括编码基因的单链多核苷酸的表达载体一起施用时，根据本公开的用于增加基因表达的组合物可以进一步增加基因的表达和效率。

在本公开中，术语“表达”是指基因在细胞中的产生。

在本公开中，术语“表达载体”是指能够在合适的宿主中表达靶基因的载体，并且是指包括为了表达基因插入物可操作地连接了必需调控元件的基因构建体。

在本公开中，术语“可操作地连接”是指将核酸表达调节序列和编码靶基因的多核苷酸功能性连接以执行一般功能。例如，启动子和编码基因的多核苷酸可以可操作地连接以影响多核苷酸的表达。可以使用本领域众所周知的遗传重组技术来实现与重组载体的可操作的连接，并且可以使用本领域通常已知的酶来实现位点特异性的DNA切割和连接。

尽管不限于此，但是可以使用质粒、载体或病毒载体来制备本公开的表达载体。合适的表达载体可以包括表达调节元件、例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸信号、增强子等，并且可以根据目的进行各种制备。载体的启动子可以是组成型的或可诱导的。由于质粒是目前最常用的载体形式，因此有时术语“质粒”和“载体”在本公开中可互换使用。为了本公开的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体具有的结构包括(a)复制起点，用于根据宿主细胞有效复制出数个至上百个的质粒载体；以及(b)限制性内切酶位点，可将外源DNA片段插入该位点。即使不存在适当的限制性内切酶位点，也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头轻松连接载体和外源DNA。

用于过表达根据本公开的基因的载体可以是本领域已知的表达载体。可以在本公开中使用的框架载体可以选自pCDNA3.1、pGP、pEF、pVAX、pUDK、pCK、pQE40、pT7、pET/Rb、pET28a、pET-22b(+)和pGEX，尽管不特别限于此。具体而言，就效果而言，优选使用选自pGP、pCK、pUDK和pVAX的载体。

在一个具体的示例性实施方案中，本公开的表达载体可以是包括具有图1的切割图的pGP载体的表达载体。

药物组合物

在另一个方面，本公开还提供了用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的药物组合物，其包含上述用于增加基因表达的组合物，所述基因为人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子的亚型基因及其变体基因。由于即使使用少量的人肝细胞生长因子(HGF)、人肝细胞生长因子的亚型基因或其变体基因，基因的表达也会增加，因此用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的药物组合物显示出优异的治疗效果，可有效地用于预防或治疗缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病。

人肝细胞生长因子基因可以由SEQ ID NO 2的碱基序列组成并且人肝细胞生长因子的变体基因可以由选自SEQ IDS NO 3至6的碱基序列的任何一种组成。

“缺血性疾病”可以选自缺血性脑血管疾病、缺血性心脏病、缺血性心肌梗死、糖尿病性心血管疾病、缺血性心力衰竭、缺血性血管疾病、阻塞性动脉硬化、心肌肥大、缺血性视网膜病变、缺血性肢体疾病、缺血性结肠炎、缺血性急性肾衰竭、缺血性肺病、缺血性脑卒中、缺血性坏死、脑创伤、阿尔茨海默病、帕金森病、新生儿缺氧、青光眼和糖尿病周围神经病。

“神经疾病”可以是中枢神经系统疾病，其选自肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脊髓小脑变性、脊髓损伤、脑梗死、脑缺血和多发性硬化症。

“肾脏疾病”可以是急性肾衰竭或慢性肾衰竭。

“肝脏疾病”可能是肝缺血、脂肪肝、肝炎、肝癌、肝纤维化或肝硬化。

在另一方面，本公开提供了用于预防或治疗通过与IGF1受体结合介导的症状或疾病的药物组合物，其包含用于增加上述基因和选自人胰岛素样生长因子1(IGF1)基因、人胰岛素样生长因子1的变体基因及其变体基因的一种或多于一种基因的表达的组合物。由于即使使用少量的人胰岛素样生长因子1基因，基因的表达也会增加，因此用于预防或治疗通过与IGF1受体结合介导的症状或疾病的药物组合物表现出优异的治疗效果，可有效地用于预防或治疗通过结合至IGF1受体介导的症状或疾病。

人胰岛素样生长因子1基因可以由SEQ ID NO 7的碱基序列组成。

在本公开的药物组合物中，可以以1∶0.5至30(重量/体积)的体积比包含用于增加基因和生长因子基因的表达的组合物。

症状或疾病可以选自身材矮小症、肥胖症、体重减轻、恶病质、厌食、退行性病症、与纤维化有关的病症、软骨症、骨病、炎性病症、肠道病症、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、Rabson-Mendenhall综合征、视网膜病变、肢端肥大症、纤维肌增生和心脏疾病。

特别地，需要治疗身材矮小症的对象可以是患有胰岛素样生长因子1缺乏症(IGFD)的儿童，并且本公开的药物组合物可以有效地治疗儿童的IGFD。

本公开的药物组合物可以用于基因治疗。

本公开的药物组合物可以被制备成用于治疗目的的药物制剂。

药物载体和赋形剂以及合适的药物制剂是本领域已知的(例如，″PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins″，Frokjaer等人，Taylor &Francis(2000)或″Handbook of Pharmaceutical Excipients″，3rd edition，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。特别地，本公开的药物组合物可以配制成冻干形式或稳定的液体形式。本公开内容的组合物可以通过本领域已知的各种方法冷冻干燥。通过添加一种或多于一种药学上可接受的稀释剂例如注射用无菌水或无菌生理盐水来复溶冻干制剂。

组合物的制剂通过任何药学上合适的施用方式递送给对象。各种已知的递送系统可用于通过任何方便的途径递送组合物。本公开的组合物主要是全身施用的。对于全身给药，本公开的组合物根据常规方法配制成用于肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或透皮)递送或肠内(例如口服、阴道或直肠)递送。最优选的施用途径是静脉内和肌内途径。这些制剂可以通过输注连续施用或通过团注施用。一些制剂包括缓释系统。

本公开的组合物以治疗有效剂量施用给患者，所述剂量是足以产生所需效果，预防或减轻所治疗的病症或适应症的严重性或扩散的剂量，而没有达到产生无法忍受的不利影响的剂量。确切剂量取决于许多因素，例如适应症、制剂、施用方式等，并且必须通过临床前和临床试验针对每种适应症进行确定。

本公开的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂组合施用。这些试剂可以作为同一药物的一部分掺入。

本公开还涉及用于治疗患有缺血性疾病、神经疾病、肾脏疾病或肝脏疾病的对象或患有通过结合IGF1受体介导的症状或疾病的对象的方法。该治疗方法可以包括将有效量的本公开的药物组合物施用于对象的步骤。

根据本公开的一个示例性实施方案，本公开的HGF、IGF1等基因可以以10ng至100mg的剂量施用。当施用HGF、IGF1或编码其的多核苷酸重复多于一次时，每次施用的施用剂量可以相同或不同。

在下文中，通过具体实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例仅用于更详细地说明本公开，并且对于本领域的普通技术人员明显是，本公开的范围不受这些实施例的限制。

实施例

材料准备

由Genscript(美国)合成了由SEQ ID NO 2表示的人肝细胞生长因子(HGF)基因(参见NCBI碱基序列NM_000601.6)。

由Genscript(美国)合成了由SEQ ID NO 3表示的人肝细胞生长因子的变体基因，HGFX6(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

由Genscript(美国)合成了由SEQ ID NO 4表示的人肝细胞生长因子的变体基因，HGFX7(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

由Genscript(美国)合成了由SEQ ID NO 5表示的人肝细胞生长因子的变体基因，HGFX8(韩国专利注册第10-0562824号)。

由Genscript(美国)合成了由SEQ ID NO 6表示的人肝细胞生长因子的变体基因，dHGF(参见韩国专利注册第10-0562824号)。

由Bionics(Korea)合成由SEQ ID NO 7表示的人胰岛素样生长因子1基因，IGF1(参见NCBI碱基序列NM_001111283.2)。

由Bionics(韩国)合成由SEQ ID NO 8表示的人血管内皮生长因子基因(参见GenBank碱基序列AB021221.1；VEGF

由Bionics(韩国)合成由SEQ ID NO 9表示的人成纤维细胞生长因子1基因，FGF1(参见GenBank碱基序列X65778.1)。

由Bionics(Korea)合成由SEQ ID NO 10表示的人成纤维细胞生长因子4基因，FGF4(参见GenBank碱基序列M17446.1)。

由Bionics(韩国)合成由SEQ ID NO 11表示的人血小板源生长因子B基因，PDGF-B(参见GenBank碱基序列X02811.1)。

在参考Lee等人(Lee Y等人，Improved expression of vascular endothelialgrowth factor by naked DNA in mouse skeletal muscles：implication for genetherapy of ischemic diseases.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000；272(1)：230-235)的文献合成pCK质粒后，使用表1的引物1和引物2，以文献中描述的相同方式进行PCR。使获得的片段与EcoRI酶在37℃下反应1小时后，使用Expin Gel SV(GeneAll，Korea)试剂盒纯化DNA。然后，在使用T4连接酶进行连接30分钟后，将DNA与大肠杆菌一起孵育过夜。第二天，通过mini-prep从菌落中分离出DNA后，获得了SEQ ID NO 1所示的pGP质粒。图1示出了根据本公开的一个示例性实施方案的pGP载体的酶切图。

[表1]

制备例

将以上制备的每个基因和每个pGP质粒用NheI和NotI酶切割1小时，并通过在琼脂糖凝胶上进行电泳来分离片段。使用T4连接酶将分离的片段连接30分钟，然后与大肠杆菌一起孵育过夜。第二天，通过mini-prep从菌落中分离DNA，然后用NheI和NotI消化。在存在卡那霉素的情况下，将克隆的DNA与用限制性酶消化的大肠杆菌上清液在4L烧瓶中孵育过夜。将使用Endofree Giga制备试剂盒(美国Qiagen)制备的质粒DNA用于动物实验。制备的质粒DNA总结在表2中。

[表2]

实施例

从Bracco Imaging Korea购买了参考号为621400210的核壳结构微粒(MP1)，其平均直径约为2.5μm，由六氟化硫为核和脂质为壳组成。另外，从GE Healthcare Korea购买了参考号为646300210的核壳结构微粒(MP2)，其平均直径为约2.4μm至3.6μm，由全氟丁烷为核和包含脂质和表面活性剂的壳组成。另外，从Bookyung SM购买了参考号为662900020的核壳结构微粒(MP3)，其平均直径为约1.1μm至3.3μm，由全氟丁烷为核和包含脂质和表面活性剂的壳组成。

根据制造商的说明书，通过将225μg的微粒MP1与2mL的生理盐水混合来制备混悬剂(用于增加基因表达的组合物)，并且根据制造商手册，通过将16μL的MP2与2mL注射用水混合制备混悬剂(用于增加基因表达的组合物)。此外，根据制造商的手册，通过剧烈摇晃微粒MP3与生理盐水(150μL/mL)的溶液混合45秒来制备混悬剂(用于增加基因表达的组合物)。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1、MP2和MP3)分别与上述制备的pGP-HGF(70μg/35μL)混合来制备药物组合物HGF-MP1、HGF-MP2和HGF-MP3。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1和MP2)分别与上述制备的pGP-HGFX7(70μg/35μL)混合来制备药物组合物HGFX7-MP1和HGFX7-MP2。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1、MP2和MP3)分别与上述制备的pGP-IGF1(70μg/35μL)混合来制备药物组合物IGF1-MP1、IGF1-MP2和IGF1-MP3。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1和MP2)分别与上述制备的pGP-VEGF(70μg/35μL)混合来制备药物组合物VEGF-MP1和VEGF-MP2。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1和MP2)分别与上述制备的pGP-FGF1(70μg/35μL)混合来制备药物组合物FGF1-MP1和FGF1-MP2。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1和MP2)分别与上述制备的pGP-FGF4(70μg/35μL)混合来制备药物组合物FGF4-MP1和FGF4-MP2。

以与实施例1相同的方式制备用于增加基因表达的组合物。

通过将15μL用于增加基因表达的组合物(MP1和MP2)分别与上述制备的pGP-PDGF-B(70μg/35μL)混合来制备药物组合物PDGF-B-MP1和PDGF-B-MP2。

根据制造商的手册，在体内通过将128μL JetPEI(美国，Polyplus)与2mL的5％葡萄糖混合制备混悬剂(对应于用于增加基因表达的组合物)。

通过将15μL用于增加基因的表达的组合物与DNA(70μg/35μL)混合来制备药物组合物HGF-JetPEI、HGFX7-JetPEI、IGF1-JetPEI和VEGF-JetPEI。

测试实施例

将根据对照组、实施例和对比例的每种药物组合物以75μg/50μL/腿注射到Balb/c小鼠(Samtako Bio)的下小腿肌肉中。

施用后第7天，处死小鼠并切下注射区域的肌肉。然后，使用液氮和蛋白质提取试剂盒(Cell Biolabs，美国)研磨切除的肌肉后，分离出总蛋白质。使用DC蛋白质测定试剂盒(美国Bio-Rad实验室)测量分离的总蛋白质的量。

为了测量HGF蛋白，使用ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图2和图3所示。

为了测量IGF1蛋白，使用IGF1 ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图4所示。

从图2至图4可以看出，与对照组的组合物相比，施用根据本发明的药物组合物(实施例1至实施例3)使HGF或IGF1基因具有统计学上显著高的表达水平。

为了测量VEGF蛋白，使用VEGF ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图5所示。

为了测量FGF1蛋白，使用FGF1 ELISA试剂盒(Abcam，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图6所示。

为了测量FGF4蛋白，使用FGF4 ELISA试剂盒(Abcam，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图7所示。

为了测量PDGF-B蛋白，使用PDGF-B ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)测量对于相同量的蛋白的每个基因的表达水平。结果如图8所示。

从图5至图8中可以看出，与对照组的组合物相比，施用对比例1至对比例4的组合物没有使表达水平显著增加。

这些结果证实，根据本公开的实施例1至3的组合物可以显著增加HGF或IGF1基因的表达水平。

糖尿病周围神经病(DPN)是缺血性疾病和神经疾病的复合疾病，是由糖尿病诱导的血糖升高和微血管损伤诱导的周围神经损伤诱导，并伴有临床疼痛。链脲霉素诱导的糖尿病周围神经病被用作代表动物模型。

在从Samtako Bio购买的6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中，通过静脉注射70mg/kg链脲霉素(STZ)诱发1型糖尿病。注射STZ后1周，选择非空腹血糖水平为300mg/dL或高于300mg/dL的对象。对于每个对象，通过手动Von Frey测试测量缩爪阈值(PWT)，以评估疼痛程度。选择诱发疼痛的对象(PWT值为4.0或低于4.0)，并分成两组，每组5只大鼠。

对于对照组，分别以200μg/200μL向两侧的小腿肌肉中施用400μg的pGP-HGFX7DNA。对于测试组，在两侧的小腿肌肉中施用相同量(400μg)的实施例2的HGFX7-MP2。

在施用2周后测量PWT作为疼痛程度。结果，证实了与对照组相比，在施用实施例2的HGFX7-MP2的组中，PWT值在统计学上显著增加(参见图9)。

神经性疼痛被称为由神经系统异常诱导的慢性神经系统疾病，并且由于对疼痛的敏感性增加，可能在临床上与痛觉超敏等相关。坐骨神经结扎引起的慢性压迫性损伤被用作慢性神经性疼痛的代表性动物模型。

通过吸入异氟烷、二氧化氮和氧气的混合物麻醉从Orient Bio购买的5周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，并通过切开左股骨区域暴露坐骨神经。将裸露的坐骨神经用三股4-0肠线缝合，间距为1.0mm至1.5mm，松散结扎，然后缝合。手术1周后，通过人工Von Frey试验测定缩爪阈值(PWT)，选择诱发疼痛的对象(PWT值为4.0或低于4.0)，分为两组，每组5只大鼠。

对于对照组，以150μg/250μL将1mg的pGP-HGF DNA施用于左股骨肌肉的四个区域。对于测试组，将与实施例1相同量(1mg)的HGF-MP2以250μg/250μL施用于与对照组相同的区域。

在施用2周后测量PWT作为疼痛程度。结果，证实了与对照组相比，在施用实施例1的HGF-MP2的组中，PWT值在统计学上显著增加，这意味着感知疼痛所需的刺激幅度显著增加(参见图10)。

通过这些结果，证实了本公开的组合物可以通过显著增加基因的表达水平来增强基因在几种疾病模型中的功效。

具体而言，在测试实施例2中，将本公开用于增加基因表达的组合物与HGFX7一起施用于诱导糖尿病性神经病的大鼠模型，并在2周后测量PWT值，结果确认了与对照组相比，PWT值增加了约80％。

另外，在测试实施例3中，将本公开用于增加基因表达的组合物与HGF一起施用给诱导神经性疼痛的大鼠模型中，然后在2周后测量PWT值，证实了与对照组相比，PWT值增加了40％或大于40％。

PWT值的增加意味着感知疼痛所需的刺激幅度显著增加，即疼痛得到缓解。诱导糖尿病性神经疾病或诱导神经性疼痛的大鼠模型中，缓解疼痛的效果的原因似乎是本公开用于增加基因表达的组合物使HGF或HGFX7的表达增加。

也就是说，通过上述测试实施例，证实了包含本公开用于增加基因表达的组合物和选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子亚型基因及其变体基因的一种或多于一种基因的药物组合物在诱导神经性疼痛的大鼠模型和诱导糖尿病性神经疾病的大鼠模型中均有效缓解疼痛。因此，认为药物组合物，其包含本公开用于增加基因表达的组合物和选自人肝细胞生长因子(HGF)基因、人肝细胞生长因子亚型基因和其变体基因作为活性成分可用于预防、改善或治疗各种神经疾病，例如糖尿病性神经疾病、神经性疼痛等。

尽管利用上述特定示例性实施例示出了本公开，但是在不脱离本公开的主题和范围的情况下，可以对其进行各种修改或改变。另外，在本公开的主题内的这种修改或改变被包括在所附权利要求的范围内。