一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物、试剂盒及方法，涉及分子标记技术领域和作物遗传育种技术领域，其包括四组引物，每组引物均包括正向引物和反向引物，四组引物的序列如SEQ ID NO:1～8所示；试剂盒包括上述引物、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶；筛选方法包括：提取待检测水稻种质的基因组总DNA，以其为模板，使用上述引物或试剂盒进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物电泳，在琼脂糖凝胶成像系统中进行拍照和分析。本发明的有益效果是通过四组引物就能够实现分蘖早生快发水稻种质的筛选，准确，不受外界干扰，并且采用试剂盒通过1次PCR扩增即可完成4个分子标记的检测，具有简单和高效的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域和作物遗传育种技术领域，具体涉及一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物、试剂盒及方法。

背景技术

水稻早生快发是指水稻群体前期早分蘖、快分蘖，尽可能早地达到理论有效分蘖数，从而提高成穗率、稻穗整齐度，最终实现水稻稳产、高产。因此，筛选分蘖早生快发的水稻种质对于选育稳产、高产水稻品种具有重要意义。

水稻分蘖早生快发性状是多基因调控的数量性状，但容易受到水稻的种植密度、肥水管理和当地的气候条件等因素的影响。首先，育种工作者在田间筛选分蘖早生快发水稻种质的过程中，容易受到水稻种植地点气候条件、土壤条件、栽培管理措施的干扰，从而均可能造成性状鉴定结果失真。其次，观察或调查水稻分蘖早生快发性状需要在水稻进入分蘖期时定点、持续观察和调查水稻的分蘖动态，工作量大、持续时间长，需要消耗大量的人力资源。最后，由于不同研究单位所处区域气候条件、土壤条件、栽培管理措施的差异，以及不同研究人员的评价标准不同，从而造成不同研究单位鉴定结果之间缺乏可比性。

因此，提高水稻分蘖早生快发性鉴定结果的准确性、可靠性和鉴定结果之间的可比性，对提高水稻分蘖早生快发性状的育种成效、降低由于鉴定过程中的资源消耗以及减少由于不同研究单位重复鉴定而造成的资源浪费具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物、试剂盒及方法。

本发明的技术解决方案如下：

本发明第一方面提供一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物，其包括引物1、引物2、引物3以及引物4这四组引物，四组引物均包括正向引物和反向引物，四组引物的序列分别为：

SEQ ID No.1F：5′-TGCAATGACATGCCTGAAGT-3′；

SEQ ID No.1R：5′-CTGGCAAGACGCAACTAACA-3′；

SEQ ID No.2F：5′-ACTCCCTCGTCTCTAGAGTTCTCC-3′；

SEQ ID No.2R：5′-GTTGGGAGTCTATCCCATCG-3′；

SEQ ID No.3F：5′-CACCAGCTGTTGCTTCCATAAGTACC-3′；

SEQ ID No.3R：5′-GTCGACGTCCACGATGACTACC-3′；

SEQ ID No.4F：5′-TAGCGATTGGATGGAGGCTGAGG-3′；

SEQ ID No.4R：5′-GGTCGCCTCGCCATTAGTTACG-3′。

本发明第二方面提供一种用于检测分蘖早生快发性状水稻种质的试剂盒，包括上述的引物。

作为优选，正向引物1、正向引物2、正向引物3以及正向引物4的质量比为3:2:1:1，反向引物1、反向引物2、反向引物3以及反向引物4的质量比为3:2:1:1。

作为优选，试剂盒还包括PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶。

作为优选，PCR反应缓冲液的体积为12.5ul，Taq DNA聚合酶3U。

作为优选，四组引物的正向引物的总体积为3ul、总质量为150ng，四组引物的反向引物的总体积为3ul、总质量为150ng。

作为优选，还包括DNA Marker，DNA Marker经电泳后呈现大小分别为301bp、244bp、156bp和123bp的条带。

本发明第三方面提供一种检测分蘖早生快发性状水稻种质的方法，其特征在于，包括使用上述的引物或者上述的试剂盒进行检测。

作为优选，所述方法包括：

S1、提取待检测水稻种质的基因组总DNA；

S2、以提取的所述基因组总DNA为DNA模板，使用上述的引物或上述的试剂盒与所述DNA模板进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

S3、将所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳；

S4、电泳结束后，在琼脂糖凝胶成像系统中进行拍照和分析。

优选地，步骤S2中，PCR扩增反应包括：取PCR Mastermix缓冲液12.5ul、2ul DNA模板5.0ng、3ul正向混合引物150ng、3ul反向混合引物150ng、双蒸水4.5ul，配制成25ul反应体系，其中，正向混合引物中正向引物1、正向引物2、正向引物3以及正向引物4的质量比为3:2:1:1，反向混合引物中反向引物1、反向引物2、反向引物3以及反向引物4的质量比为3:2:1:1；反应程序为95℃预变性3分钟、95℃变性15秒、60℃退火20秒、72℃延伸30秒，进行35个循环，72℃保温5分钟。

优选地，步骤S3中，将所述PCR扩增产物在浓度为3％的琼脂糖凝胶中电泳25分钟。

优选地，步骤S4中，将凝胶照片中待检测水稻种质的电泳条带与DNA Marker的条带进行比较，待检测水稻种质呈现与DNA Marker一致的电泳条带数量越多，则判定被检测的水稻种质的分蘖早生快发性越强，待检测水稻种质呈现与DNA Marker一致的条带数量越少，则判定被检测水稻种质的分蘖早生快发性越弱本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明通过四组引物就能够对分蘖早生快发水稻种质的筛选，具有准确和不受外界干扰的优点。

本发明的试剂盒用一个PCR扩增反应就能够完成四个SSR分子标记的扩增和检测，检测方法简单、快速和高效，且结果可靠。

本发明的筛选方法不受季节、环境和时间的限制，筛选结果可靠，对提高水稻分蘖早生快发性状的育种成效、降低由于鉴定过程中的资源消耗以及减少由于不同研究单位重复鉴定而造成的资源浪费具有重要意义。

附图说明

图1为本发明优选实施例中试剂盒包含分蘖早生快发性强水稻种质基因组扩增产物大小一致的特异DNA Marker的琼脂糖电泳图；

图2为采用本发明优选实施例中的筛选方法对待检测水稻进行检测得到的琼脂糖电泳图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

本实施例提供一组关联水稻分蘖早生快发性状的4个SSR分子标记以及与4个SSR分子标记对应的四组引物，这四组引物分别为引物1、引物2、引物3以及引物4，四组引物均包括正向引物和反向引物，四组引物的正向引物与反向引物的核苷酸序列如表1 所示：

表1

先提取分蘖早生快发的水稻种质基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR 扩增，产物大小依次为301bp、244bp、156bp和123bp；然后提取分蘖早生快发性弱的水稻种质基因组DNA，利用所述SSR分子标记的正向混合引物与反向混合引物进行 PCR扩增，则扩增出的条带大小与分子标记的条带大小不一致。

由此可知，水稻种质分蘖早生快发性状的强弱与携带上述SSR分子标记的数量成正比，即若某个水稻种质基因组序列中携带上述4个SSR分子标记，则其分蘖早生快发性强；若携带上述4个中的2个或3个SSR分子标记，则其分蘖早生快发性中等；若携带上述4个中的0个或1个SSR分子标记、则其分蘖早生快发性弱。

本实施例还提供了一种筛选分蘖早生快发水稻种质的试剂盒，包括4个SSR分子标记的正向混合引物和反向混合引物以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶等试剂，具体地，反应体系中：PCR Mastermix缓冲液12.5ul，2ul DNA模板5.0ng，Taq DNA 聚合酶3U，3ul正向混合引物150ng，3ul反向混合引物150ng，双蒸水4.5ul，配制成 25ul反应体系。其中，正向混合引物中正向引物1、正向引物2、正向引物3以及正向引物4之间的质量比为3:2:1:1，反向混合引物中反向引物1、反向引物2、反向引物3 以及反向引物4的之间的质量比为3:2:1:1。

所述试剂盒还包括了与上述4个SSR分子标记的PCR扩增产物大小一致的DNAMarker，DNA Marker经琼脂糖电泳后呈现大小为301bp、244bp、156bp和123bp的条带，参见附图1，其中，泳道1为商业购买的DNA Marker，泳道2为本实施例中试剂盒的DNA Marker。

本实施例还提供了一种筛选分蘖早生快发水稻种质的方法，包括以下步骤：

S1、从武运粳24/T461//武运粳24的回交重组自交系中随机选取15个株系作为本实施例待检测的水稻种质材料，分别标号WTL001、WTL023、WTL047、WTL051、 WTL077、WTL103、WTL106、WTL143、WTL176、WTL221、WTL262、WTL279、 WTL303、WTL318和WTL327，将上述15个株系的水稻种质通过浸种催芽生长至1叶 1心后，分别剪切每份水稻种质的幼叶0.5克、采用CTAB法提取基因组总DNA，基因组总DNA通过琼脂糖电泳检测其提取完整性、采用分光光度计测定所提总DNA的浓度；另外，将上述15个株系分别挑选均匀一致、催芽整齐的种子，在江西南昌2019年于4月15日、2020年于5月21日采用按穴单粒点播的方式直播种植，株行距16.7×23.3 厘米，按照常规栽培管理措施进行管理，上述15个株系从播种至出现第1个分蘖的天数和达到第15个分蘖的天数见表2。

S2、以提取的基因组总DNA为DNA模板，使用上述试剂盒与5.0ng的DNA模板进行PCR扩增反应，反应程序为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火20 秒，72℃延伸30秒，35个循环，72℃保温5分钟，得到PCR扩增产物；

S3、取上述PCR扩增产物4ul点样于浓度为3％的琼脂糖凝胶的上样孔内，并将试剂盒中的DNA Marker点样于浓度为3％的琼脂糖凝胶的上样孔内，打开电泳仪电源，以5V/cm的电压电泳25分钟后停止电泳；

S4、电泳结束后，在琼脂糖凝胶成像系统中进行拍照，得到凝胶照片，将凝胶照片中待检测水稻种质的电泳条带与DNA Marker的条带进行比较分析。

表2

检测结果如图2所示，其中，泳道1和泳道18为商业购买的DNA Marker，泳道2 为本发明试剂盒的DNA Marker，泳道3-6依次为水稻回交重组自交系中分蘖早生快发性强的稳定株系WTL001、WTL023、WTL103和WTL327，泳道7-13依次为水稻回交重组自交系中分蘖早生快发性中等的稳定株系WTL047、WTL077、WTL106、WTL143、 WTL221、WTL279和WTL318，泳道14-17依次为水稻回交重组自交系中分蘖早生快发性弱的稳定株系WTL051、WTL176、WTL262和WTL303。

由图2可以看出，泳道3-6均包括301bp、244bp、156bp和123bp这4个条带，即WTL001、WTL023、WTL103和WTL327这4个株系的基因组均携带了4个SSR分子标记。泳道7包括301bp、156bp和123bp这3个条带，泳道8包括244bp和123bp这2 个条带，泳道9包括156bp和123bp这2个条带，泳道10包括301bp和244bp这2个条带，泳道11包括301bp和156bp这2个条带，泳道12包括244bp和156bp这2个条带，泳道13包括301bp和123bp这2个条带，即WTL047、WTL077、WTL106、WTL143、 WTL221、WTL279和WTL318这7个株系携带了4个SSR分子标记中的2个或3个。泳道14包括156bp这个条带，泳道15～17不包括上述条带，即WTL051、WTL176、WTL262和WTL303这4个株系的基因组携带了4个SSR分子标记中的0个或1个。因此，根据上述检测结果可知，WTL001、WTL023、WTL103和WTL327这4个株系为分蘖早生快发性强的水稻种质，WTL047、WTL077、WTL106、WTL143、WTL221、 WTL279和WTL318这7个株系为分蘖早生快发性中等的水稻种质，WTL051、WTL176、 WTL262和WTL303这4个株系为分蘖早生快发性弱的水稻种质。

将图2中的检测结果与表2中各株系的分蘖早生快发性种质进行对比可以看出，本实施例的方法检测的结果与表2中各株系的分蘖早生快发性种质的结果一致，由此可以看出，本实施例中的方法检测准确，可以用来检测筛选水稻分蘖早生快发性种质。另外，通过上述检测结果也进一步验证了水稻株系分蘖早生快发性的强弱与携带上述4个SSR 分子标记的数量呈正比。

因此，本实施例的试剂盒用一个PCR扩增反应就能够完成四个SSR分子标记的扩增和检测，检测方法简单、快速，结果可靠，采用该试剂盒对分蘖早生快发性状水稻种质进行筛选的方法不受季节、环境和时间的限制，筛选结果可靠，对提高水稻分蘖早生快发性状的育种成效、降低由于鉴定过程中的资源消耗以及减少由于不同研究单位重复鉴定而造成的资源浪费具有重要意义。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西农业大学

<120> 一种筛选分蘖早生快发水稻种质的引物、试剂盒及方法

<130> 江西农业大学

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列1(Artificial Sequence1)

<400> 1

tgcaatgaca tgcctgaagt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列2(Artificial Sequence2)

<400> 2

ctggcaagac gcaactaaca 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列3(Artificial Sequence3)

<400> 3

actccctcgt ctctagagtt ctcc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列4(Artificial Sequence4)

<400> 4

gttgggagtc tatcccatcg 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列5(Artificial Sequence5)

<400> 5

caccagctgt tgcttccata agtacc 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列6(Artificial Sequence6)

<400> 6

gtcgacgtcc acgatgacta cc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列7(Artificial Sequence7)

<400> 7

tagcgattgg atggaggctg agg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列8(Artificial Sequence8)

<400> 8

ggtcgcctcg ccattagtta cg 22