一种核酸解离液及其在核酸提取中的应用

摘要

本发明公开了一种核酸解离液及其在核酸提取中的应用。本发明提供的核酸解离液由异硫氰酸胍、水饱和酚、醇类还原剂和8‑羟基喹啉组成，其中，异硫氰酸胍的浓度为0.4mol/L‑2mol/L，水饱和酚的浓度为10%‑50%，醇类还原剂的浓度为0.07%‑0.35%，8‑羟基喹啉的浓度为0.02%‑0.1%，解离液的PH值为5.0‑10.0。本发明还提供了核酸解离液在核酸提取中的应用，采用葡聚糖凝胶吸附柱进行处理，对核酸没有影响。本发明能实现1分钟内完成核酸的提取和纯化，其解离提取的核酸可直接用于PCR反应，解离后的核酸在3分钟到1周时间内可保持其的完整性。这种核酸提取方法对设备要求低。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，更具体的涉及一种核酸解离液及其在核酸提取中的应用。

背景技术

实现核酸的快速提取是缩短临床核酸诊断时间的关键步骤之一，特别是在疫情爆发期间，核酸的快速诊断对疫情的防控极为重要。核酸样本提取分为蛋白与核酸解离及核酸提取两个部分。

蛋白与核酸解离一般采取化学解离法、酶解离法等。细胞或者病毒的核酸提取大多采用化学解离法。经典的蛋白与核酸解离解离液是Trizol，可快速裂解细胞，解离蛋白与核酸，并保持RNA的完整性；其组分中含有大量的盐离子，所以在RNA提取过程中通常采用沉淀离心法，单样本的核酸提取耗时约30min。

核酸的提取方法一般采用沉淀、层析、密度梯度离心、电泳、物理吸附等方法，如用Trizol提取，则多采用沉淀离心法进行提取。目前核酸提取多采用吸附法，如树脂吸附柱法或磁珠吸附法，其提取步骤分为洗涤和洗脱两部分，共耗时15-30min。

葡聚糖凝胶是一种常用的脱盐材料，通常应用于蛋白纯化领域。

葡聚糖凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，随着洗脱液通过凝胶柱时，颗粒接近或大于凝胶网孔的分子，因不能进入凝胶网孔中，在重力作用下它们沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，因受到的阻滞作用小，移动速率快，先被洗出层析柱；而小于凝胶网孔的分子可通过凝胶网孔渗入颗粒内部，它们被洗脱时不断地从一个网孔穿到另一个网孔，逐层扩散，阻滞作用大，移动速度慢，因而后出层析柱。若分子介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。根据各分子流出层析柱的时间，从而将混合物中的不同组分分离开来。凝胶柱是其在小量蛋白（30-100ul）纯化时应用的便捷装置。

葡聚糖凝胶根据其溶胀系数，分为10、15、25、50、75、100等；其中溶胀系数为25的为较常用，表明其10克干粉具备可吸收25ml水的能力。

总体来说，目前的核酸提取与纯化大多采用树脂吸附法或磁珠吸附法，需配备高速离心机或自动核酸提取仪，总耗时较长，大约在15-30分钟。没有用凝胶柱进行核酸提取与纯化，且在短时间内完成核酸提取与纯化。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种核酸解离液，并详述其在核酸提取中的应用，该解离液结合本发明的提取方法可实现在一分钟内有效完成核酸的提取，并能确保后续PCR反应的正常进行。

本发明的解决方案如下：

本发明提供了一种核酸解离液，所述解离液由异硫氰酸胍、水饱和酚、醇类还原剂和8-羟基喹啉组成，所述解离液中的各组分及其浓度和pH值如下：异硫氰酸胍：摩尔浓度为0.4mol/L-2mol/L；水饱和酚：质量百分比浓度为10%-50%；醇类还原剂：质量百分比浓度为0.07%-0.35%；8-羟基喹啉：质量百分比浓度为0.02%-0.1%；所述解离液的PH值为5.0-10.0。

优选的，所述醇类还原剂为2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。

本发明还提供了上述核酸解离液在核酸提取中的应用。

优选的，所述核酸提取采用了葡聚糖凝胶填充的凝胶柱。凝胶吸附柱吸附解离液中的各种阴阳离子以及PCR反应的抑制物，核酸解离液处理的样本经凝胶柱吸附离子和各种PCR反应抑制物后可直接用于PCR反应。

更优的，所述葡聚糖凝胶的溶胀系数为25。

本发明的应用方法包括如下步骤：

（1）采集咽拭子，将采集后的咽拭子浸于所述解离液中，充分混合，作为解离后样本；

（2）将所述凝胶柱离心，在所述凝胶柱中加入所述解离后样本，离心，所得到的滤液即为提取后的核酸。

本发明的有益效果：本发明的解离液与凝胶柱联合应用，具有如下有益效果：

（1）快速裂解细胞，可有效解离临床采集的咽拭子和痰液样本中与蛋白结合的核酸，实现1分钟内完成核酸提取，其解离提取的核酸可直接用于PCR反应，大幅度缩短PCR核酸诊断整个操作时间；

（2）可长时间保持核酸的完整性：本发明的解离液还能够对解离后的核酸起保护作用，在从样品取样、运输到实验室提取核酸，短到三分钟、长至一周的时间内，均可保持核酸的完整性；

（3）不需配备昂贵的设备，只需一台掌上离心机即可。

附图说明

图1为用实施例2中的解离液、提取方法和Trizol传统核酸提取法对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图；

图2为用实施例2中的解离液、提取方法和Trizol联合凝胶柱核酸提取方法对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图；

图3为Trizol传统核酸提取法和Trizol传统核酸提取法提取的核酸过凝胶柱对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅做示例说明。其中使用的试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要，选择其他相应试剂以实现本发明的目的。

实施例1：本发明解离液配方组成在核酸提取中应用的一个优选实施例

本实施例的核酸解离液由异硫氰酸胍、水饱和酚、2-巯基乙醇和8-羟基喹啉组成，所述解离液中的各组分及其浓度和PH值如表1所示：

表1.实施例1中的解离液配方组成

核酸提取方法所需的主要材料：凝胶柱，7.4mm滤片，葡聚糖凝胶G25，2mM Tris PH9.0缓冲液。

将上述核酸解离液对临床咽拭子进行解离提取的方法如下：

将临床采集的咽拭子浸入本实施例中的解离液中，充分混匀后即为解离后样本。凝胶柱用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，去除凝胶柱中的2mM Tris PH9.0缓冲液，在所述凝胶柱中加入50µl解离后样本，再用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，所得到的滤液即为提取后的核酸，该核酸可直接用于PCR扩增。

实施例2：本发明解离液配方组成在核酸提取中应用的第二个优选实施例

本实施例的核酸解离液由异硫氰酸胍、水饱和酚、2-巯基乙醇和8-羟基喹啉组成，所述解离液中的各组分及其浓度和PH值如表2所示：

表2.实施例2中的解离液配方组成

核酸提取方法所需的主要材料：凝胶柱，7.4mm滤片，葡聚糖凝胶G25，2mM TrisPH9.0缓冲液。

将上述核酸解离液对临床咽拭子进行解离提取的方法如下：

将临床采集的咽拭子浸入本实施例中的解离液中，充分混匀后即为解离后样本。凝胶柱用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，去除凝胶柱中的2mM Tris PH9.0缓冲液，在所述凝胶柱中加入50µl解离后样本，再用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，所得到的滤液即为提取后的核酸，该核酸可直接用于PCR扩增。

实施例3：本发明解离液配方组成在核酸提取中应用的第三个优选实施例

本实施例的核酸解离液由异硫氰酸胍、水饱和酚、2-巯基乙醇和8-羟基喹啉组成，所述解离液中的各组分及其浓度和PH值如表3所示：

表3.实施例3中的解离液配方组成

核酸提取方法所需的主要材料：凝胶柱，7.4mm滤片，葡聚糖凝胶G25，2mM TrisPH9.0缓冲液。

将上述核酸解离液对临床咽拭子进行解离提取的方法如下：

将临床采集的咽拭子浸入本实施例中的解离液中，充分混匀后即为解离后样本。凝胶柱用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，去除凝胶柱中的2mM Tris PH9.0缓冲液，在所述凝胶柱中加入50µl解离后样本，再用掌上离心机（转速4000-6000转/分）离心3秒，所得到的滤液即为提取后的核酸，该核酸可直接用于PCR扩增。

实施例4：本发明的核酸解离提取方法与磁珠核酸提取方法的对比试验

将临床采集的3份咽拭子，用生理盐水保存，作为对比实验和本实施例的检测样本。分别标记为样本1，样本2，样本3。对样本1、样本2、样本3分别用对比试验方法和本发明的方法进行核酸提取。具体操作如下：

对比实验的方法：用汇研科创生物科技有限公司HY-112A核酸提取试剂联合其公司全自动核酸自动提取仪进行核酸提取。操作步骤如下：（1）取出一块96深孔板，在第一孔加入第一孔试剂400µl，封盖剂250µl；（2）在第二孔加入第二孔试剂600µl；（3）在第三孔加入第三孔试剂620µl；（4）在第四孔加入第四孔试剂620µl；（5）在第六孔加入第六孔试剂500µl；（6）向第一孔穿过封盖剂加入咽拭子样本100µl和20ul HY-112A结合液，吸放混匀5-8次；（7）将96深孔板放置在核酸自动提取仪试剂托盘上，安装好磁棒套，盖上仪器盖子；（8） 点击“HY-112A”程序进行全自动核酸提取；（9）程序运行结束后，将96深孔板取出，第六孔中的液体即为提取的核酸。

本实施例的方法：取咽拭子样本10µl，加入实施例1中的解离液40µl，震荡混匀后即为解离后样本。用实施例1中的凝胶柱提取方法对解离后的样本进行核酸提取。

针对两个靶基因：靶基因1和2，用相同的PCR反应液进行扩增检测。比较两种方法提取的核酸扩增后的CT值，结果如表4所示：

表4.用实施例1中的解离液及提取方法与磁珠核酸提取方法进行对比试验所得到的的CT值

由表4的结果可知，使用本发明实施例1中的解离液及核酸提取的方法所提取得到的核酸与磁珠提取法提取得到的核酸，进行PCR核酸扩增反应检测，两者的检测的CT值基本一致。

由此说明，本发明实施例1中的解离液及核酸提取方法与常规的核酸磁珠提取方法所得到的提取的核酸的效果一致；且本发明核酸提取方法只需在1分钟内即可完成，仪器只需掌上离心机一台，不需其他大型设备；但常规的核酸磁珠提取方法需要耗时30分钟。

实施例5：本发明核酸解离液联合凝胶柱的核酸提取法、Trizol传统核酸提取法、Trizol传统核酸提取法提取的核酸过凝胶柱与Trizol联合凝胶柱核酸提取法四种方法的对比实验

将临床采集的3份咽拭子，用生理盐水保存，作为对比实验和本实施例的检测样本。分别标记为样本1，样本2，样本3。对样本1、样本2、样本3分别用对比试验方法和本发明的方法进行核酸提取。具体操作如下：

对比实验的方法一：Trizol传统核酸提取法

操作步骤如下：取咽拭子样本100µl，加入Trizol 400µl，震荡混匀；再加入100µl氯仿，震荡混匀；12000rpm离心5min。取上清液至一新EP管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，12000rpm离心10min。去除上清液，加入1ml 75%乙醇，上下颠倒数次，12000rpm离心5min。去除上清液，加入500µl DEPC水溶解核酸沉淀。

对比实验的方法二：Trizol传统核酸提取法提取的核酸过凝胶柱

操作步骤如下：取本实施例中对比实验的方法一提取的核酸50ul，用实施例2中的凝胶柱对Trizol传统核酸提取方法提取的核酸进行纯化。

对比实验的方法三：Trizol联合凝胶柱核酸提取法

操作步骤如下：取咽拭子样本10µl，加入Trizol 40µl，震荡混匀后即为解离后样本。用实施例2中的凝胶柱提取方法对Trizol解离后的样本进行核酸提取。

本实施例的方法：取咽拭子样本10µl，加入实施例2中的解离液40µl，震荡混匀后即为解离后样本。用实施例2中的凝胶柱提取方法对解离后的样本进行核酸提取。

用相同的PCR反应液对同一靶基因进行扩增检测。比较四种方法提取和纯化的核酸扩增后的CT值，结果如表5所示：

表5.用实施例2中的解离液、提取方法与Trizol传统核酸提取法、Trizol传统核酸提取法提取的核酸过凝胶柱及Trizol 联合凝胶柱核酸提取方法进行对比试验所得到的CT值

图1为用实施例2中的解离液、提取方法和Trizol传统核酸提取法对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图；图2为用实施例2中的解离液、提取方法和Trizol联合凝胶柱核酸提取方法对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图；图3为Trizol传统核酸提取法和Trizol传统核酸提取法提取的核酸过凝胶柱对比检测样本1中的靶基因的扩增曲线图。

由表5和图1的结果可知，使用本发明实施例2中的解离液及核酸提取的方法所提取得到的核酸与Trizol传统核酸提取法得到的核酸，进行PCR核酸扩增反应检测，扩增所得到的CT值基本一致，但前者扩增的荧光值稍微偏低，原因是本方法所得到的核酸含有一定量的蛋白，对PCR反应的荧光值有些影响，但并不影响其CT值，所以对临床核酸检测结果的判读无影响。

由表5和图2的结果可知，使用本发明实施例2中的解离液及核酸提取的方法所提取得到的核酸与Trizol联合凝胶柱所得到的核酸，进行PCR核酸扩增反应检测，后者所得到的核酸扩增的CT值比前者得到的核酸的CT值大2-3，原因是因为Trizol中含有大量的盐离子，用凝胶柱纯化时，不能去除全部的盐离子，离心所得的滤液中仍有大量的盐离子，从而抑制了PCR扩增反应。所以Trizol解离的样本不适合用凝胶柱一次纯化，可能需要多次纯化才能去除解离后样本中的盐离子。

由表5和图3的结果可知，使用本发明实施例2中的凝胶柱对Trizol传统核酸提取法提取的核酸进行纯化，相对于Trizol传统核酸提取法提取的核酸，进行PCR核酸扩增反应检测，前者经凝胶柱纯化的核酸扩增的CT值较后者小1-2，原因是因为Trizol传统核酸提取法提取的核酸仍含有一些未知的PCR抑制物，从而抑制了PCR反应。经凝胶柱纯化后，则去除了某些未知的PCR抑制物，使核酸纯度更高，抑制物更少，从而使PCR扩增反应更充分。由此可以看出，凝胶柱可对trizol传统核酸提取法提取的核酸进一步纯化。

实施例六：凝胶柱联合其他裂解液的应用。

本实施例以一步法碱裂解液为例。

将临床采集的3份咽拭子，用生理盐水保存，作为对比实验和本实施例的检测样本。分别标记为样本1，样本2，样本3。对样本1、样本2、样本3分别用对比实验方法和用凝胶柱对对比实验提取的核酸进行纯化的方法进行对比实验。具体操作如下：

对比实验的方法：

取咽拭子样本100µl，加入一步法碱裂解液300µl，震荡混匀后即为样本核酸。

本实施例的方法：

取本实施例对比实验的样本核酸50µl，用实施例2中的凝胶柱对一步碱裂解法提取的核酸进行纯化。

用相同的PCR反应液对同一靶基因进行扩增检测。比较两种方法提取和纯化的核酸扩增后的CT值，结果如表6所示：

表6 .用一步碱裂解法提取的核酸及用凝胶柱对一步碱裂解法提取的核酸进行纯化所得到的核酸进行对比实验所得到的CT值

由表6结果可知，用凝胶柱对一步碱裂解法提取的核酸进行纯化后，其CT值比一步碱裂解法提取的核酸小3-4。是因为凝胶柱去除了一步碱裂解法提取的核酸中的PCR抑制物，从而降低了其对PCR的扩增反应。

由此可知，凝胶柱可去除一步碱裂解法提取的核酸中的某些未知的PCR抑制物，对核酸进行进一步的纯化。以此类推，凝胶柱也可对其他核酸提取方法提取的核酸进行进一步的纯化。

综上可知，本发明的解离液、核酸提取方法与磁珠核酸提取法或Trizol传统核酸提取法所得到的核酸，PCR扩增反应CT值基本一致。且本发明核酸提取方法只需在1分钟内即可完成，而另外两种方法则需约30分钟完成。另外，本发明核酸提取方法只需掌上离心机一台，不需配备高速离心机或核酸提取仪，有效节约了实验场地和仪器费用。

此外，用凝胶柱还可对其它方法提取的核酸进一步纯化，去除某些未知的PCR抑制物。以及其他裂解液裂解的样本也可用凝胶柱进行核酸提取与纯化。不同裂解液，凝胶柱纯化次数可能不同。