一种2019新型冠状病毒微小RNA及其在作为病毒感染诊断标志物中的应用

摘要

本发明公开一种2019新型冠状病毒微小RNA及其在作为病毒感染诊断标志物中的应用，该2019‑nCoV微小RNA为svRNA1和svRNA2中的至少一种，所述的svRNA1包含2段剪接异构体svRNA1‑isoform‑1和svRNA1‑isoform‑2。同时提供该2019‑nCoV微小RNA对应的检测引物和具体检测方法，据此2019‑nCoV微小RNA设计并制备诊断试剂盒，可以极其灵敏与特异地将2019‑nCoV感染者与正常人群区分出来，从而大大提高普查、筛查的精确度与可及性，完善并强化2019‑nCoV的防控，为恢复生产提供科学保障，并为人类针对2019‑nCoV感染的RNA干扰疗法提供潜在的核酸药物序列信息。

说明书

技术领域

本发明属于病毒RNA组学及医学领域，涉及一种2019新型冠状病毒微小RNA及其在作为病毒感染诊断标志物中的应用。

背景技术

2019新型冠状病毒，2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可导致感冒、中东呼吸综合征(Middle East RespiratorySyndrome，MERS)和严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)等症候轻重不一的人类流行性疾病。2019新型冠状病毒(以下简称2019-nCoV)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。2019-nCoV感染者常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。2019-nCoV自2019年始，已在世界范围内，引发严重的公共卫生问题。目前，人类对于2019-nCoV所致疾病尚缺乏特异治疗方法，诸多药物及临床干预手段，尚处于临床试验阶段。针对2019-nCoV的疫苗，正处于临床研发及试验阶段，因此人类现阶段缺乏主动预防该病毒感染及传播的有效手段。通过对人群或高危人群，进行精准的普查、筛查，识别出2019-nCoV感染者尤其是无症状感染者，并对其进行隔离、治疗及随访，以阻断病毒潜在的传播链条，是目前唯一行之有效的针对2019-nCoV的防控手段。

small RNA,亦即微小RNA，是一类进化保守、长度在18-25个核苷酸序列的短非编码RNA分子，现已发现其可通过多种调控方式，广泛参与各项生命活动进程，如：转录后水平的负性调控，通过与目标RNA结合，促进RNA的降解或者抑制RNA的翻译，此种调控方式在病毒、单细胞及高等生物细胞中广泛存在；近年来，已发现在真核细胞中，微小RNA可被Ago2蛋白绑定从而入核，通过与基因启动子结合，促进基因的表达，即存在转录水平的正性调控。微小RNA在进化中存在显著的保守性，同时，在细胞、人类体液中可极稳定存在，不似长RNA单链易被降解，因此具有作为诊断标志物的优势潜能。现阶段，针对2019-nCoV的核酸RT-PCR检测，主要针对2019-nCoV的编码区RNA。2019-nCoV属于单链RNA病毒，目前人类对2019-nCoV基因组在人体不同组织细胞中的复制、剪接、降解等特征尚未完全认知与阐明，因此，针对2019-nCoV的编码区RNA展开的核酸RT-PCR检测手段，由于病毒编码区RNA在不同人体细胞内受到RNA加工而必然带来的诸多不确定性影响因素，以及长片段单链RNA本身易于降解与极不稳定的天然属性，在理论上大大限制了2019-nCoV的编码区长RNA序列作为感染诊断标志物的潜能。

如前所述，由于微小RNA自身具备的进化保守性与极不易降解的生物稳定性，具备了作为诊断标志物的优势潜能。因此，筛选可作为2019-nCoV病毒感染诊断标志物的2019-nCoV微小RNA，对2019-nCoV病毒感染进行精准的普查、筛查和治疗具有重要意义。本发明发现了2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体可作为病毒感染的高效诊断标志物，根据此组2019-nCoV微小RNA设计并制备诊断试剂盒，可以极其灵敏与特异地将2019-nCoV感染者与正常人群区分出来，从而大大提高普查、筛查的精确度与可及性，完善并强化2019-nCoV的防控，为恢复生产提供科学保障，并为人类针对2019-nCoV感染的RNA干扰疗法提供潜在的核酸药物序列信息。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2019-nCoV微小RNA及其在作为病毒感染的诊断标志物中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述2019-nCoV微小RNA的检测引物及其在制备2019-nCoV诊断试剂中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种2019-nCoV病毒感染治疗试剂，本发明的2019-nCoV微小RNA为人类针对2019-nCoV感染的RNA干扰疗法提供潜在的核酸药物序列信息。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种2019-nCoV微小RNA(small viral RNA，svRNA)，该2019-nCoV微小RNA为svRNA1和svRNA2中的至少一种，其中所述的svRNA1存在2段剪接异构体(isoform)svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2；各微小RNA的序列如下所示：

svRNA1-isoform-1：AAAGAUCUCAGUCCAAGAUGGU；

svRNA1-isoform-2：AAAGAUCUCAGUCCAAGAUG；

svRNA2：AGGAACUGGGCCAGAAGCUGGA。

作为一种优选技术方案，该2019-nCoV微小RNA为svRNA1和svRNA2的组合或svRNA1。

上述2019-nCoV微小RNA的检测引物，为(1)～(3)中至少一组所述的引物：

(1)针对svRNA1-isoform-1的检测引物序列包括：逆转录茎环引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCATCT-3’，PCR正向引物1：5'-AAGATCTCAGTCCAAGAT-3'，PCR正向引物2：5'-AAGATCTCAGTCCAAGA-3'，PCR通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；

(2)针对svRNA1-isoform-2的检测引物序列包括：逆转录茎环引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATCTTG-3’，PCR正向引物1：5'-AAGATCTCAGTCCAAGA-3'，PCR正向引物2：5'-AAGATCTCAGTCCAAG-3'，PCR通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；

(3)针对svRNA2的检测引物序列包括：逆转录茎环引物:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAGCT-3'，PCR正向引物：5'-GGAACTGGGCCAGAAG-3'，PCR通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

上述的2019-nCoV微小RNA在作为2019-nCoV病毒感染诊断标志物中的应用。

一种2019-nCoV病毒感染诊断试剂，它包括上述2019-nCoV微小RNA的检测引物。

上述的2019-nCoV病毒感染诊断试剂，优选的，其所述2019-nCoV微小RNA的检测引物为上述(1)～(3)中至少一组所述的引物。作为一种进一步优选的技术方案该2019-nCoV病毒感染诊断试剂可以制成试剂盒，该试剂盒中除含有上述2019-nCoV微小RNA的检测引物外，还可以包含PCR技术常用的试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。本发明所涉及的与2019-nCoV病毒感染诊断相关的微小RNA标志物的序列、逆转录茎环引物序列及对应PCR正向引物序列均需要本领域技术人员付出创造性劳动才能获得，该试剂盒可用于精准诊断2019-nCoV病毒感染者。

一种2019-nCoV病毒感染治疗试剂，该治疗试剂通过干扰疗法为2019-nCoV病毒感染者提供治疗，所述干扰疗法的RNA核酸药物序列信息为如上述的2019-nCoV微小RNA或/和其反向互补序列。

上述的2019-nCoV微小RNA在制备2019-nCoV病毒感染诊断试剂或治疗试剂中的应用。

上述的检测引物在制备2019-nCoV病毒感染诊断试剂中的应用。

上述的2019-nCoV微小RNA或上述的检测引物在2019-nCoV病毒感染诊断中的应用。

上述的2019-nCoV微小RNA在2019-nCoV病毒感染治疗中的应用。

上述的2019-nCoV微小RNA及其反向互补序列可为2019-nCoV病毒感染者未来RNA干扰疗法提供核酸药物序列信息：

2019-nCoV病毒属于正链RNA病毒，截至目前人类尚缺乏根除此病毒基因组的有效药物，虽然现阶段提出的病毒RNA聚合酶抑制剂、病毒蛋白水解酶抑制剂可在一定程度上抑制病毒的复制，将人体中的病毒载量压制在较低的丰度范围，但仍旧无法彻底将此病毒从人体细胞中清除，因此，核酸检测阴性后又复阳者屡有报道，提示2019-nCoV病毒在人体内存在潜伏感染状态的可能；现有的以免疫相关受体或炎症介质为靶点的单克隆抗体药物，主要是抑制人类自身因感染病毒而产生的过激性免疫紊乱，最近的干细胞疗法，其原理亦是抑制机体过激的炎症风暴，且上述药物尚处于临床试验的不同阶段，未全面进入临床；故目前人类尚无高效的直接将此病毒从机体内清除的疗法。

RNA干扰疗法，是人类现阶段最有望可彻底清除机体内病毒的一种治疗方法，其通过RNA干扰机制，利用核酸给药递送系统，以短RNA核酸序列作为治疗药物，该种药物进入人体细胞中可与病毒基因组结合，致使病毒基因组降解，从而达到清除病毒的目的。本发明上述2019-nCoV微小RNA感染诊断标志物，其本质即为2019-nCoV在人体细胞中形成的微小RNA分子序列，因此该序列及其反向互补序列，可为未来人类针对2019-nCoV病毒感染进行的RNA干扰疗法，提供潜在的短RNA核酸药物序列信息，该信息具体为：

(1)svRNA1-isoform-1及其对应反向互补序列(AAAGAUCUCAGUCCAAGAUGGU)、(ACCAUCUUGGACUGAGAUCUUU)；

(2)svRNA1-isoform-2及其对应反向互补序列(AAAGAUCUCAGUCCAAGAUG)、(CAUCUUGGACUGAGAUCUUU)；

(3)svRNA2及其对应反向互补序列(AGGAACUGGGCCAGAAGCUGGA)、(UCCAGCUUCUGGCCCAGUUCCU)。

具体地说，本发明的技术方案采用以下步骤获得：

(1)目前人类研究已发现2019-nCoV与SARS-CoV基因组同源性达85％以上，在2019-nCoV与SARS-CoV基因组高度同源的基础上，将SARS-CoV在人呼吸道上皮细胞中产生的高丰度微小RNA序列与2019-nCoV基因组进行BLAST(生物大分子序列比对搜索工具)分析，发现2019-nCoV基因组中有6种序列与上述SARS-CoV微小RNA序列之间，存在高度的同源保守性，将此6种2019-nCoV序列视作为2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中可能形成的潜在微小RNA序列，见附表1；

(2)运用polyA加尾法实时荧光定量PCR联合PCR扩增产物测序，对2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本进行检测并鉴定，从上述6种2019-nCoV潜在微小RNA序列中，发现并证明其中有2种微小RNA序列在实际病毒感染核酸样本中真实存在，即此2种微小RNA序列是由2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中产生，且该2种微小RNA序列位置在2019-nCoV基因组中仅相隔13个核苷酸，其前体序列可形成微小RNA剪接、加工及成熟所需要具备的发卡结构，最终确定该2种微小RNA序列为2019-nCoV微小RNA，见附图2；

(3)在成功发现上述2019-nCoV微小RNA的基础上，针对此2种2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体，运用茎环法实时荧光定量PCR，继续在2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本及正常人咽拭子核酸样本中进行检测与分析，运用ROC曲线评价此组2019-nCoV微小RNA作为病毒感染诊断标志物的效能，见附图3；

(4)鉴于目前人类尚缺乏高效的直接将2019-nCoV从人体中清除的疗法，而RNA干扰疗法是人类最有前景在未来有望可以清除病毒的一种治疗方法，上述2019-nCoV微小RNA，其本质即为短RNA核酸序列分子，该序列及其反向互补序列，可为未来人类针对2019-nCoV病毒感染进行的RNA干扰疗法，提供潜在的短RNA核酸药物序列信息。

具体来说本研究的实验方法主要包括以下几个部分：

(1)研究样本选择：2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本、正常人咽拭子核酸样本；

(2)运用BLAST分析，提出6种2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中可能形成的潜在微小RNA序列；

(3)运用polyA加尾法实时荧光定量PCR联合PCR扩增产物测序，发现并证明上述6种微小RNA序列中有2种在实际病毒感染核酸样本中真实存在，并结合微小RNA剪接、加工及成熟所需要具备的前体发卡结构，确定该2种微小RNA序列为2019-nCoV微小RNA；

(4)针对此2种2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体，运用茎环法实时荧光定量PCR，继续在2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本及正常人咽拭子核酸样本中进行检测与分析，运用ROC曲线评价此组2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体，作为病毒感染诊断标志物的效能；

(5)该组2019-nCoV微小RNA诊断标志物的序列及其反向互补序列，可为未来人类针对2019-nCoV病毒感染进行的RNA干扰疗法，提供潜在的短RNA核酸药物序列信息。

本发明的有益效果：

(1)发现了2019-nCoV微小RNA(small viral RNA，svRNA)，该2019-nCoV微小RNA为下述2种核酸分子中的至少一种，分别为svRNA1和svRNA2。其中，svRNA1存在2段剪接异构体(isoform)，分别为svRNA1-isoform-1、svRNA1-isoform-2；其对应具体序列如下：

①svRNA1-isoform-1(AAAGAUCUCAGUCCAAGAUGGU)；

②svRNA1-isoform-2(AAAGAUCUCAGUCCAAGAUG)；

③svRNA2(AGGAACUGGGCCAGAAGCUGGA)。

(2)发现此2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体可作为病毒感染的高效诊断标志物，相较于依据2019-nCoV的编码区RNA或病毒长片段RNA展开的核酸RT-PCR检测手段，2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体，作为新型的感染诊断标志物，具有以下优点：一、因其序列生物保守性强，从而不易受病毒进化、变异的影响；二、因其生物稳定性好、不易降解，极低丰度亦可被灵敏检测，因此对样本的采集与制备，要求简单、快捷。

(3)针对该组2019-nCoV微小RNA诊断标记物(同种微小RNA及其剪接异构体)设计检测引物，联合PCR技术常用的试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品，可用于制作2019-nCoV病毒感染诊断试剂盒。

(4)鉴于目前人类尚缺乏高效的直接将2019-nCoV从人体中清除的疗法，而RNA干扰疗法是人类最有前景在未来有望可以清除病毒的一种治疗方法，上述2019-nCoV微小RNA诊断标志物，其本质即为短RNA核酸序列，该序列及其反向互补序列，可为未来人类针对2019-nCoV病毒感染进行的RNA干扰疗法，提供潜在的短RNA核酸药物序列信息。

总之，这类分子标志物的开发、利用，将为2019-nCoV感染诊断以及进一步治疗提供新的方向。

附图说明

图1：研发流程图。

图2：一种2019-nCoV微小RNA的发现及确立；

其中，(A)5例2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本，采用PolyA加尾法实时荧光定量PCR获得的扩增曲线及熔解曲线。其中，svRNA1熔解曲线的峰值低于svRNA2，且峰值更为均一，这与svRNA1中的GC含量(40％-42.8％)显著低于svRNA2中的GC含量(59.1％)有关；(B)5例2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本,PolyA加尾法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，结果显示，在5例病毒感染样本中，svRNA1及其剪接异构体均可被检出，检出率达100％，而svRNA2在1例样本中被检出，检出率为20％；这证明svRNA1与svRNA2是由2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中产生，且svRNA1及其剪接异构体的诊断潜可能优于svRNA2；(C)svRNA1与svRNA2在2019-nCoV基因组中仅相隔13个核苷酸，通过RNA fold分析显示，其前体序列可形成稳定的发卡结构，这从微小RNA剪接、加工及成熟所需要具备的前体二级结构层面，进一步证明svRNA1与svRNA2是由2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中产生的2种微小RNA。

图3：2019-nCoV微小RNA作为病毒感染诊断标志物的效能分析；

其中，(A)鉴于微小RNA的多态性主要源于3'端，通过设计不同的茎环逆转录引物及正向PCR引物，分别针对svRNA1-isoform-1、svRNA1-isoform-2及svRNA2，在2019-nCoV感染者及正常人咽拭子核酸样本中进行抽样检测并筛选，最终确定3段特异性茎环逆转录引物联合4段正向PCR引物，可在病毒感染核酸样本中检出2019-nCoV微小RNA扩增曲线，而在正常人核酸样本中未检出扩增曲线，对应代表性扩增曲线和熔解曲线如图所示；(B)在25例2019-nCoV感染者及25例正常人咽拭子核酸样本中，运用上述特异性茎环逆转录引物及对应的正向PCR引物进行检测并建立诊断积分系统，运用ROC曲线分析此2种2019-nCoV微小RNA单独或联合的诊断效能，结果显示svRNA1单独(包括svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2)对2019-nCoV感染诊断的ROC曲线下面积(Area Under roc Curve，AUC)为：0.915(95％CI：0.832–0.998)；svRNA2单独对2019-nCoV感染诊断的ROC曲线下面积(AreaUnder roc Curve，AUC)为：0.680(95％CI：0.531–0.829)；svRNA1联合svRNA2对2019-nCoV感染诊断的ROC曲线下面积(Area Under roc Curve，AUC)为：0.975(95％CI：0.931–0.999)，证明svRNA1联合svRNA2表现出最优的诊断效能，svRNA1单独(包括svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2)的诊断效能与svRNA1联合svRNA2的诊断效能相当。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

发明人于2020年3月至6月，分别从江苏省疾控中心收集了30例2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本、从江苏省人民医院收集了25例正常人咽拭子核酸样本。

参照研发流程图(附图1)，按如下三步进行：

第一步，在2019-nCoV与SARS-CoV基因组高度同源的基础上，将SARS-CoV在人呼吸道上皮细胞中产生的高丰度微小RNA序列与2019-nCoV基因组进行BLAST(生物大分子序列比对搜索工具)分析，发现2019-nCoV基因组中有6种序列与上述SARS-CoV微小RNA序列之间，存在高度的同源保守性，将此6种2019-nCoV序列，视作为2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中可能形成的潜在微小RNA序列，见附表1。

表1：6种2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中可能形成的潜在微小RNA序列

第二步，运用PolyA加尾法实时荧光定量PCR联合PCR扩增产物测序，对5例病毒感染核酸样本进行检测并鉴定，从上述6种2019-nCoV潜在微小RNA序列中，发现并证明其中有2种微小RNA序列在实际病毒感染核酸样本中真实存在，即此2种微小RNA序列是由2019-nCoV在人呼吸道上皮细胞中产生，且该2种微小RNA序列位置在2019-nCoV基因组中仅相隔13个核苷酸，其前体序列可形成微小RNA剪接、加工及成熟所需要具备的发卡结构，最终确定该2种微小RNA序列为2019-nCoV微小RNA，见附图2；具体步骤为：

(1)核酸样本提取：选用Invitrogen公司Trizol法提取RNA，并最后用20μL DEPC水进行溶解。

(2)cDNA的制备：

①PolyA加尾反应体系(冰上配制)

②PolyA加尾反应程序

③PolyA加尾产物逆转录反应体系(冰上配制)

④逆转录反应程序

(3)实时荧光定量PCR：

①实时荧光定量PCR反应体系(冰上配制)

②正向引物序列

③实时荧光定量PCR反应程序

(4)PCR扩增产物测序，测序所用引物为正向引物及通用反向引物。

(5)微小RNA前体序列发卡二级结构分析及确认。

第三步，在成功发现上述2019-nCoV微小RNA的基础上，针对此2种2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体，运用茎环法实时荧光定量PCR，继续在剩余25例2019-nCoV感染者咽拭子核酸样本及25例正常人咽拭子核酸样本中进行检测与分析，运用ROC曲线评价此组2019-nCoV微小RNA作为病毒感染诊断标志物的效能，见附图3；具体步骤为：

(1)核酸样本提取：选用Invitrogen公司Trizol法提取RNA，并最后用20μL DEPC水进行溶解。

(2)cDNA的制备：

①逆转录反应体系(冰上配制)

②特异茎环逆转录引物序列

③逆转录反应程序

(3)实时荧光定量PCR：

①实时荧光定量PCR反应体系(冰上配制)

②正向引物序列

PCR通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

③实时荧光定量PCR反应程序

(4)建立诊断积分系统，运用ROC曲线评价上述2019-nCoV微小RNA及其剪接异构体作为病毒感染诊断标志物的效能，并提出诊断积分Cut-off值。

数据分析：

(1)诊断评分系统的建立：如前所述，针对svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2，各制备1段特异性茎环逆转录引物、2段正向PCR引物及1段通用反向引物；针对svRNA2，制备1段特异性茎环逆转录引物、1段正向PCR引物及1段通用反向引物；在此基础上，按以下标准，建立诊断积分系统：

最低0分，最高5分

(2)2019-nCoV微小RNA诊断效能评价及诊断积分Cut-off值的确立：

在25例2019-nCoV感染者及25例正常人咽拭子核酸样本中，运用上述特异性茎环逆转录引物及对应的正向PCR引物进行检测，并根据上述诊断积分系统，获得每例样本的诊断积分，然后运用ROC曲线分析2种2019-nCoV微小RNA单独或联合的诊断效能，结果显示，svRNA1联合svRNA2表现出最优的诊断效能，svRNA1单独(包括svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2)的诊断效能与svRNA1联合svRNA2的诊断效能相当，如图3所示，同时，根据正确指数即约登指数(Youden’s index)的最大值，得出svRNA1联合svRNA2诊断积分的Cut-off值为3分，该Cut-off值对应的灵敏度为70％，特异度为98％；svRNA1单独(包括svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2)诊断积分的Cut-off值为2分，该Cut-off值对应的灵敏度为80％，特异度为82％。

2019-nCoV病毒感染诊断试剂盒，该试剂盒中含有svRNA1-isoform-1和svRNA1-isoform-2的检测引物，或者svRNA2的检测引物，或者svRNA1-isoform-1、svRNA1-isoform-2和svRNA2的检测引物，包括对应的逆转录茎环引物、PCR正向引物和PCR通用反向引物。该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。本发明所涉及的与2019-nCoV病毒感染诊断相关的微小RNA标志物的序列、逆转录茎环引物序列及对应PCR正向引物序列均为本领域技术人员的创造性劳动，该试剂盒可用于精准诊断2019-nCoV病毒感染者。