用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法

摘要

本发明一般地涉及使用可活化抗体检测受试者或生物样品中的蛋白酶活性的组合物和方法以及这些组合物和方法在多种诊断指征中的用途。

说明书

本申请是申请日为2014年1月3日，申请号为201480011969.7，发明名称为“用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2013年1月4日提交的美国临时申请号61/749,220、2013年1月4日提交的美国临时申请号61/749,212、2013年1月7日提交的美国临时申请号61/749,529、2013年1月7日提交的美国临时申请号61/749,486、2013年1月23日提交的美国临时申请号61/755,810、2013年2月11日提交的美国临时申请号61/763,237、2013年6月4日提交的美国临时申请号61/830,940、和2013年10月30日提交的美国临时申请号61/897,659的权益，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及使用可活化抗体检测受试者或生物样品中的蛋白酶活性的组合物和方法以及这些组合物和方法在多种诊断指征中的用途。

背景技术

异常的蛋白酶活性已经涉入不同的病症。因此，需要可以可靠地检测生物样品中的特定蛋白酶活性的方法。

发明内容

本发明提供了使用可活化抗体检测生物样品中的特定蛋白酶活性的方法和组合物。这些组合物和方法可以用在多种诊断指征中，例如，体内、体外、原位或先体外后体内(

本文描述的组合物和方法提供了通过使用蛋白酶活化的抗体技术而能够检测受试者或生物样品（例如，细胞或组织样品）中的特定蛋白酶活性的有效新技术。可活化抗体的成像代表表征受试者和生物样品中的蛋白酶活性的独特方案。该技术能够验证表达蛋白酶的细胞和组织中的可活化抗体的蛋白水解性活化和活化的抗体向靶标的结合，所述蛋白酶能够切割所述可活化抗体。结果允许确定细胞或组织是否具有足以活化可活化抗体的特异性和浓度的蛋白酶活性，所述抗体结合该细胞或组织中的期望靶标。

本公开内容的可活化抗体含有阻断所述抗体的抗原结合位点的掩蔽部分。所述掩蔽部分经由含有蛋白酶底物的接头（在本文中被称作可切割部分(CM)）与所述抗体连接。通过选择被特异性蛋白酶切割的CM，已经开发了一系列可活化抗体，其用于筛选具有不同特异性的蛋白酶的活性。已经将本文中公开的组合物和方法应用于携带异种移植肿瘤的小鼠的体内和先体外后体内筛选以及应用于人患者肿瘤组织的原位筛选，从而揭示蛋白水解活性的存在。蛋白酶抑制剂会抑制肿瘤组织中的这种活性。本文中公开的组合物和方法支持可活化抗体作为用于治疗以异常的（通常增加的）蛋白酶活性为特征的疾病的治疗剂的用途。本文中公开的组合物和方法也可用于鉴别或以其它方式细化（例如，分级）适合于用本公开内容的可活化抗体进行治疗的患者群体。在某些实施方案中，对于活化的抗体所结合的靶标和切割被试验的可活化抗体的可切割部分(CM)中的底物的蛋白酶而言，受试者为试验阳性的。将这样的患者鉴别为使用这样的可活化抗体（其包含这样的CM）的治疗的合适候选人，因为所述靶标和蛋白酶共定位在组织中，由此实现抗体的活化和结合。在某些实施方案中，给受试者施用这样的可活化抗体作为疗法，所述受试者使用这样的可活化抗体试验为所述靶标和蛋白酶阳性的。

本发明提供了使用结合多种诊断和/或预防指征中的靶标的可活化抗体的方法、以及用在这些方法中的试剂盒。所述靶标是例如在表1中列出的靶标中的任一种或它们的任意组合。例如，本发明提供了通过如下检测切割试剂和靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，和(ii)测量所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的水平，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品中。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

这样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割试剂切割的可切割部分(CM)和特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。在某些实施方案中，处于未切割的(即，未活化的)状态的可活化抗体包含如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在某些实施方案中，所述MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体的MM会干扰AB与靶标的特异性结合，且其中处于切割的(即，活化的)状态的可活化抗体的MM不会干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在某些实施方案中，所述可活化抗体是缀合的可活化抗体，即

本发明还提供了试剂盒，其用在检测切割试剂和目标靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法中，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的、本文描述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体、以及用于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了通过如下检测切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)在有所述靶标存在下，使受试者或生物样品与可活化抗体接触，和(ii)测量所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的水平，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品。这样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割试剂切割的可切割部分(CM)和特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。在某些实施方案中，处于未切割的(即，未活化的)状态的可活化抗体包含如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在某些实施方案中，所述MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体的MM会干扰AB与靶标的特异性结合，且其中处于切割的(即，活化的)状态的可活化抗体的MM不会干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在某些实施方案中，所述可活化抗体是缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述可活化抗体没有缀合至试剂。在某些实施方案中，所述可检测标记与所述掩蔽部分连接。在某些实施方案中，所述可检测标记连接至蛋白酶切割位点的N-端的可切割部分。在某些实施方案中，AB的单个抗原结合位点被掩蔽。在某些其中本公开内容的抗体具有至少2个抗原结合位点的实施方案中，至少一个抗原结合位点被掩蔽，且至少一个抗原结合位点没有被掩蔽。在某些实施方案中，所有抗原结合位点被掩蔽。在某些实施方案中，所述测量步骤包括使用包含可检测标记的第二试剂。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了试剂盒，其用在检测切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法中，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的、本文描述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体、以及用于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中所述可活化抗体包括位于所述可活化抗体的一部分上的可检测标记，所述部分在CM的切割以后被释放，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明提供了通过如下检测切割试剂和靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包括位于所述可活化抗体的一部分上的可检测标记，所述部分在CM的切割以后被释放，和(ii)测量所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的水平，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的降低的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。降低的可检测标记水平是例如约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%和/或约100%的下降。这样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割试剂切割的可切割部分(CM)和特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。在某些实施方案中，处于未切割的(即，未活化的)状态的可活化抗体包含如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在某些实施方案中，所述MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体的MM会干扰AB与靶标的特异性结合，且其中处于切割的(即，活化的)状态的可活化抗体的MM不会干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在某些实施方案中，所述可活化抗体是缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述可活化抗体没有缀合至试剂。在某些实施方案中，所述可活化抗体包含可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记位于AB上。在某些实施方案中，使用特异性地结合活化的抗体的第二试剂完成测量受试者或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在某些实施方案中，所述第二试剂是包含可检测标记的抗体。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了试剂盒，其用在检测切割试剂和目标靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法中，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的、本文描述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体、以及用于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的降低的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。降低的可检测标记水平是例如约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%和/或约100%的下降。

本发明还提供了通过如下检测切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中所述可活化抗体包括位于所述可活化抗体的一部分上的可检测标记，所述部分在CM的切割以后被释放；和(ii)测量所述受试者或生物样品中的可检测标记的水平，其中所述受试者或生物样品中的可检测标记的可检测水平指示，所述切割试剂不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中可检测标记的降低的可检测水平指示，所述切割试剂存在于所述受试者或生物样品中。降低的可检测标记水平是例如约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%和/或约100%的下降。这样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割试剂切割的可切割部分(CM)和特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。在某些实施方案中，处于未切割的(即，未活化的)状态的可活化抗体包含如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在某些实施方案中，所述MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体的MM会干扰AB与靶标的特异性结合，且其中处于切割的(即，活化的)状态的可活化抗体的MM不会干扰或竞争AB与靶标的特异性结合。在某些实施方案中，所述可活化抗体是缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述可活化抗体没有缀合至试剂。在某些实施方案中，所述可活化抗体包含可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记位于AB上。在某些实施方案中，使用特异性地结合活化的抗体的第二试剂完成测量受试者或样品中的可活化抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在某些实施方案中，所述第二试剂是包含可检测标记的抗体。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了试剂盒，其用在检测目标切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法中，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的、本文描述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体、以及用于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中所述可活化抗体包括位于所述可活化抗体的一部分上的可检测标记，所述部分在CM的切割以后被释放，其中所述受试者或生物样品中的可检测标记的可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中可检测标记的降低的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。降低的可检测标记水平是例如约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%和/或约100%的下降。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述靶标选自在表1中列出的靶标的组。在某些实施方案中，所述AB是或衍生自选自在表2中列出的抗体的组的抗体。在某些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')

在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可活化抗体包括可检测标记。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可检测标记包括显像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述显像剂包含放射性同位素。在这些方法的某些实施方案中，所述放射性同位素是铟或锝。在这些方法的某些实施方案中，所述放射性同位素是或衍生自碘。在这些方法的某些实施方案中，所述放射性同位素是

在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可检测标记缀合至所述可活化抗体的至少一部分。例如，在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可检测标记缀合至AB。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可检测标记至少缀合至MM。在其中所述可检测标记至少缀合至MM的这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述缀合至MM的可检测标记是生物素。这样的构建体可用于多种成像技术，作为非限制性实例，包括磁共振(MR)成像。在这些实施方案中，在MR成像之前，将具有生物素化的MM的可活化抗体与抗生物素蛋白和/或抗生蛋白链菌素包被的磁性纳米颗粒一起施用给受试者。在某些实施方案中，用抗-生物素抗体包被所述磁性纳米颗粒。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，同时施用所述具有生物素化的MM的可活化抗体和所述包被的磁性纳米颗粒。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，依次施用所述具有生物素化的MM的可活化抗体和所述包被的磁性纳米颗粒。这些试剂盒和方法可用于监测可活化抗体的活化。

在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、劳动动物或动物园动物。在某些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。

在这些方法的某些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是先体外后体内方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是体外方法。

在所述方法和/或试剂盒的某些实施方案中，使用所述方法和/或试剂盒来鉴别或以其它方式细化（例如，分级）适合于用本公开内容的可活化抗体治疗的患者群体。例如，在本文提供的任意方法中，将靶标和蛋白酶试验阳性的患者鉴别为用包含这样的CM的这样的可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在这些方法所试验的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物。同样地，在本文提供的任意方法中，可能将靶标和蛋白酶中的任一种或两种试验阴性的患者鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人，所述蛋白酶在使用这些方法试验的可活化抗体中的CM中切割底物。在某些实施方案中，可以用其它可活化抗体试验这样的患者，直到鉴别出用于治疗的合适的可活化抗体(例如，包含CM的可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。

本发明还提供了试剂盒，其用在鉴别或以其它方式细分患者群体的方法中，其中所述试剂盒至少包括(i)用于接触受试者或生物样品的、本文描述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，(ii)用于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中所述样品中活化的可活化抗体的可检测水平指示，所述样品就靶标和切割试剂的存在而言是阳性的，所述切割试剂在可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物，和(iii)用于鉴别和选择一个或多个就所述靶标和所述切割试剂的存在而言试验阳性的受试者的装置，由此鉴别或细化患者群体。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括关于将治疗有效量的本文描述的这样的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用给一个或多个受试者的说明书，所述受试者是在就所述靶标和所述切割试剂的存在而言试验阳性的患者群体中。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括关于将治疗有效量的本文描述的这样的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用给一个或多个受试者的说明书，所述受试者是在就所述靶标和所述切割试剂二者的存在而言没有试验阳性的患者群体中。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括关于将治疗有效量的本文描述的另一种抗-靶标治疗剂施用给一个或多个受试者的说明书，所述受试者是在就所述靶标和所述切割试剂二者的存在而言没有试验阳性的患者群体中。在某些实施方案中，所述可活化抗体包含可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记包含显像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、放射性同位素、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在某些实施方案中，所述病症是癌症。在某些实施方案中，所述病症是自身免疫疾病和/或炎症性病症。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

在这些方法的某些实施方案中，所述靶标选自在表1中列出的靶标的组。在某些实施方案中，所述AB是或衍生自选自在表2中列出的抗体的组的抗体。在某些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')

在这些方法的某些实施方案中，所述切割试剂是与受试者或生物样品中的靶标共定位的蛋白酶，且所述CM是作为蛋白酶底物起作用的多肽，其中当所述可活化抗体暴露于所述蛋白酶时所述蛋白酶切割可活化抗体中的CM。在某些实施方案中，所述CM是蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自在表3中列出的蛋白酶的组。在这些方法的某些实施方案中，所述CM是长度为至多15个氨基酸的多肽。在这些方法的某些实施方案中，所述CM偶联至AB的N-端。在这些方法的某些实施方案中，所述CM偶联至AB的C-端。在这些方法的某些实施方案中，所述CM偶联至AB的可变轻(VL)链的N-端。在这些方法的某些实施方案中，所述CM偶联至AB的可变重(VH)链的N-端。

在这些方法的某些实施方案中，所述切割试剂是酶。在这些方法的某些实施方案中，所述切割试剂是还原剂。在这些方法的某些实施方案中，所述切割试剂是光解。

在这些方法的某些实施方案中，所述切割试剂是酶，且所述CM是所述酶的底物。在这些方法的某些实施方案中，所述酶是本文中公开的蛋白酶。在这些方法的某些实施方案中，所述蛋白酶是本文中公开的蛋白酶之一。在这些方法的某些实施方案中，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在某些实施方案中，所述酶包含uPA。在某些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在某些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。在某些实施方案中，所述酶包含基质金属蛋白酶(MMP)。在某些实施方案中，所述MMP选自MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在某些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达所述靶标的组织中不具有活性或具有显著更低的活性。在某些实施方案中，所述蛋白酶在健康的（例如，未患病的）组织中不具有活性或具有显著更低的活性。

本发明还提供了在多种诊断指征中使用缀合的可活化抗体(在本文中也被称作可活化抗体缀合物)的方法。例如，本发明提供了通过如下检测切割试剂和目标靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体和/或缀合的可活化抗体接触，和(ii)测量受试者或生物样品中的抗体和/或缀合的可活化抗体的水平，其中所述受试者或生物样品中活化的抗体和/或缀合的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的活化的抗体和/或缀合的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂、所述靶标或所述切割试剂和所述靶标二者都不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了通过如下检测切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)在有所述靶标存在下，使受试者或生物样品与可活化抗体和/或缀合的可活化抗体接触，和(ii)测量所述受试者或生物样品中的活化的抗体和/或缀合的可活化抗体的水平，其中所述受试者或生物样品中活化的抗体和/或缀合的可活化抗体的可检测水平指示，所述切割试剂存在于所述受试者或生物样品中，且其中所述受试者或生物样品中的抗体和/或缀合的可活化抗体的不可检测水平指示，所述切割试剂不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了通过如下检测切割试剂在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体和/或缀合的可活化抗体接触；和(ii)测量所述受试者或生物样品中的可检测标记的水平，其中所述受试者或生物样品中的可检测标记的可检测水平指示，所述切割试剂不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中的可检测标记的不可检测水平指示，所述切割试剂存在于所述受试者或生物样品中。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

本发明还提供了通过如下检测切割试剂和靶标在受试者或样品中的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体和/或缀合的可活化抗体接触；和(ii)测量所述受试者或生物样品中的可检测标记的水平，其中所述受试者或生物样品中的可检测标记的可检测水平指示，所述切割试剂和/或靶标不存在和/或不足够以可检测水平存在于所述受试者或生物样品，且其中所述受试者或生物样品中可检测标记的降低的可检测水平指示，所述切割试剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。降低的可检测标记水平是例如约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%和/或约100%的下降。在某些实施方案中，所述生物样品包含超过一个组织类型。在某些实施方案中，所述生物样品是组织微阵列。在某些实施方案中，所述生物样品是冷冻的组织微阵列。

在这些方法的某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括选自以下的可检测标记：显像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子和基于配体的标记。在这些方法的某些实施方案中，所述显像剂包含放射性同位素。在这些方法的某些实施方案中，所述放射性同位素是铟或锝。在这些方法的某些实施方案中，所述造影剂包含氧化碘、氧化钆或氧化铁。在这些方法的某些实施方案中，所述酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法的某些实施方案中，所述荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、经修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2 (RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法的某些实施方案中，所述发光标记包含N- methylacrydium衍生物。在这些方法的某些实施方案中，所述标记包含Alexa Fluor

在这些方法的某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在这些方法的某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、劳动动物或动物园动物。在某些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。

在这些方法的某些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是先体外后体内方法。在这些方法的某些实施方案中，所述方法是体外方法。

在所述方法的某些实施方案中，使用所述方法鉴别或以其它方式细化适合于用本公开内容的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体治疗的患者群体。例如，将靶标和蛋白酶二者试验阳性的患者鉴别为用包含这样的CM的这样的抗体和/或这样的缀合的可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在这些方法所试验的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物。同样地，可能将靶标和蛋白酶中的任一种或两种试验阴性的患者鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人，所述蛋白酶在使用这些方法试验的可活化抗体中的CM中切割底物。在某些实施方案中，这样的患者可以用其它抗体和/或缀合的可活化抗体试验，直到鉴别出治疗的合适的抗体和/或缀合的可活化抗体(例如，包含CM的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。

在某些实施方案中，所述可活化抗体结合处于活化状态的靶标，且包括(i)特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)；(ii)与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶的底物起作用的多肽；和(iii)掩蔽部分(MM)，其抑制处于未切割状态的可活化抗体的AB与靶标的结合，其中所述MM经由CM偶联至AB。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括在MM和CM之间的连接肽。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括在CM和AB之间的连接肽。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在某些实施方案中，所述2个连接肽不需要彼此相同。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，结合靶标的抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段(AB)特异性地结合选自表1所示的那些的靶标。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段(AB)是或衍生自选自表2所示的那些的抗体。

在某些实施方案中，所述AB具有就与靶标的结合而言约100 nM或更小的平衡解离常数。

在某些实施方案中，所述MM就与AB的结合而言的平衡解离常数大于AB与靶标的平衡解离常数。在某些实施方案中，所述MM就与AB的结合而言的平衡解离常数不超过AB与靶标的平衡解离常数。在某些实施方案中，所述MM不会干扰或竞争处于被切割状态的可活化抗体的AB与靶标的结合。

在某些实施方案中，所述MM是长度为约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。

在某些实施方案中，所述MM多肽序列不同于靶标的序列，且所述MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不超过50%同一性。

在某些实施方案中，所述MM不包括与所述靶标的超过25%氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，所述MM不包括与所述靶标的超过10%氨基酸序列同一性。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少20倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少40倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少50倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少100倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少200倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM的偶联会减小AB的结合靶标的能力，使得AB当与MM偶联时对靶标的解离常数(K

在某些实施方案中，所述MM包括氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 12)。

在某些实施方案中，当使用靶标置换测定（例如，在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定）在体外测定时，在有所述靶标存在下，与当CM被切割时相比，当CM是未切割的时，所述MM会使AB的结合靶标的能力减小至少90%。

在某些实施方案中，所述蛋白酶与所述靶标共定位在组织中，且当所述可活化抗体暴露于所述蛋白酶时所述蛋白酶切割所述可活化抗体中的CM。在某些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达所述靶标的组织中不具有活性或具有显著更低的活性。在某些实施方案中，所述蛋白酶在健康的（例如，未患病的）组织中不具有活性或具有显著更低的活性。

在某些实施方案中，所述CM是长度为至多15个氨基酸的多肽。

在某些实施方案中，所述CM是蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自uPA (尿激酶纤溶酶原激活物)、豆荚蛋白和MT-SP1 (matriptase)。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含uPA。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含豆荚蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含MT-SP1。

在某些实施方案中，所述CM是至少2种蛋白酶的底物。在某些实施方案中，每种蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是至少2种蛋白酶的底物，其中所述蛋白酶之一选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1，且另一种蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的至少2种蛋白酶的底物。

在某些实施方案中，所述CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 14)。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体至少包括第一个CM和第二个CM。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个是作为蛋白酶的底物起作用的多肽，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 14)。在某些实施方案中，所述第一个CM被靶组织中选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的第一种切割试剂切割，且所述第二个CM被靶组织中的第二种切割试剂切割。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的相同酶，且所述第一个CM和所述第二个CM是所述酶的不同底物。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是不同的酶。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂共定位在靶组织中。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM被靶组织中的至少一种切割试剂切割。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体至少包括第一个CM和第二个CM。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个是作为蛋白酶的底物起作用的多肽，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 14)。在某些实施方案中，所述第一个CM被靶组织中选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的第一种切割试剂切割，且所述第二个CM被靶组织中的第二种切割试剂切割。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的相同酶，且所述第一个CM和所述第二个CM是所述酶的不同底物。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是不同的酶。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂共定位在靶组织中。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM被靶组织中的至少一种切割试剂切割。

在某些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自以下的氨基酸序列：(GS)

在某些实施方案中，所述可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在某些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在某些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在某些实施方案中，所述试剂是选自在表4中列出的组的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是多拉司他汀。在某些实施方案中，所述试剂是耳他汀或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是耳他汀E或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是单甲基耳他汀E (MMAE)。在某些实施方案中，所述试剂是美坦辛类或美坦辛类衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在某些实施方案中，所述试剂是多卡米星或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是卡奇霉素或其衍生物。

在某些实施方案中，所述试剂经由接头缀合至AB。在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在某些实施方案中，所述接头选自在表5和6中所示的接头。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还包括信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述间隔物在没有信号肽存在下缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述间隔物直接连接至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的MM。在某些实施方案中，所述间隔物至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 11)。在某些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 11)的间隔物，所述间隔物直接连接至本文中公开的MM序列，且具有间隔物-MM-CM-AB的从N-端至C-端的结构排列。在某些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括间隔物，所述间隔物直接连接至本文中公开的MM序列，且具有间隔物-MM-CM-AB的从N-端至C-端的结构排列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体包括间隔物，其中所述间隔物直接连接至MM，且具有AB-CM-MM-间隔物的从N-端至C-端的结构排列。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是单特异性的。在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是多特异性的，例如，作为非限制性实例，双特异性的或三功能的。在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为促双特异性的T细胞衔接子(pro-Bispecific T Cell Engager，BITE)分子的一部分。在某些实施方案中，所述可活化抗体被配制为促嵌合的抗原受体(pro-ChimericAntigen Receptor，CAR)修饰的T细胞或其它经工程改造的受体的一部分。

在某些实施方案中，所述靶标选自在表1中列出的靶标的组。在某些实施方案中，所述AB是或衍生自选自在表2中列出的抗体的组的抗体。在某些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')

在某些实施方案中，使用方法或试剂盒鉴别或以其它方式细化适合于用本公开内容的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体治疗的患者群体，然后通过将所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用给有此需要的受试者进行治疗。例如，将靶标和蛋白酶二者试验阳性的患者鉴别为用包含这样的CM的这样的抗体和/或这样的缀合的可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在在这些方法中试验的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物，然后给患者施用治疗有效量的试验的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。同样地，可能将靶标和蛋白酶中的任一种或两种试验阴性的患者鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人，所述蛋白酶在使用这些方法试验的可活化抗体中的CM中切割底物。在某些实施方案中，可以用其它抗体和/或缀合的可活化抗体试验这样的患者，直到鉴别出用于治疗的合适的抗体和/或缀合的可活化抗体(例如，包含CM的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。在某些实施方案中，然后给患者施用治疗有效量的所述患者试验为阳性的可活化抗体和/或缀合物。

在某些实施方案中，所述可活化抗体结合处于活化状态的靶标，且包括(i)特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)；(ii)与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶的底物起作用的多肽；和(iii)掩蔽部分(MM)，其抑制处于未切割状态的可活化抗体的AB与靶标的结合，其中所述MM经由CM偶联至AB。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括在MM和CM之间的连接肽。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括在CM和AB之间的连接肽。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在某些实施方案中，所述2个连接肽不需要彼此相同。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段(AB)特异性地结合选自表1所示的那些的靶标。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段(AB)是或衍生自选自表2所示的那些的抗体。

在某些实施方案中，所述AB具有就与靶标的结合而言约100 nM或更小的平衡解离常数。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括特异性地结合所述靶标的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，结合靶标的抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')

在某些实施方案中，所述MM就与AB的结合而言的平衡解离常数大于AB与靶标的平衡解离常数。在某些实施方案中，所述MM就与AB的结合而言的平衡解离常数不超过AB与靶标的平衡解离常数。在某些实施方案中，所述MM不会干扰或竞争处于被切割状态的可活化抗体的AB与靶标的结合。

在某些实施方案中，所述MM是长度为约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。

在某些实施方案中，所述MM多肽序列不同于靶标的序列，且所述MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不超过50%同一性。

在某些实施方案中，所述MM不包括与所述靶标的超过25%氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，所述MM不包括与所述靶标的超过10%氨基酸序列同一性。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少20倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少40倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少50倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少100倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM位于可活化抗体和/或缀合的可活化抗体中，以致于在未切割状态，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与靶标的结合减小至其发生的平衡解离常数比与靶标结合的未修饰的AB的平衡解离常数大至少200倍，而处于被切割状态的可活化抗体的AB结合靶标。

在某些实施方案中，所述MM的偶联会减小AB的结合靶标的能力，使得AB当与MM偶联时对靶标的解离常数(K

在某些实施方案中，当使用靶标置换测定（例如，在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定）在体外测定时，在有所述靶标存在下，与当CM被切割时相比，当CM是未切割的时，所述MM会使AB的结合靶标的能力减小至少90%。

在某些实施方案中，所述蛋白酶与所述靶标共定位在组织中，且当所述可活化抗体暴露于所述蛋白酶时所述蛋白酶切割所述可活化抗体中的CM。在某些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达所述靶标的组织中不具有活性或具有显著更低的活性。在某些实施方案中，所述蛋白酶在健康的（例如，未患病的）组织中不具有活性或具有显著更低的活性。

在某些实施方案中，所述CM是长度为至多15个氨基酸的多肽。

在某些实施方案中，所述CM是蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自uPA (尿激酶纤溶酶原激活物)、豆荚蛋白和MT-SP1 (matriptase)。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含uPA。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含豆荚蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白酶包含MT-SP1。

在某些实施方案中，所述CM是至少2种蛋白酶的底物。在某些实施方案中，每种蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是至少2种蛋白酶的底物，其中所述蛋白酶之一选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1，且另一种蛋白酶选自表3中所示的那些。在某些实施方案中，所述CM是至少2种蛋白酶的底物，所述蛋白酶选自：uPA、豆荚蛋白和MT-SP1。

在某些实施方案中，所述CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 14)。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体至少包括第一个CM和第二个CM。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个是作为蛋白酶的底物起作用的多肽，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM中的至少一个包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 14)。在某些实施方案中，所述第一个CM被靶组织中选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的第一种切割试剂切割，且所述第二个CM被靶组织中的第二种切割试剂切割。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的相同酶，且所述第一个CM和所述第二个CM是所述酶的不同底物。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂是不同的酶。在某些实施方案中，所述第一种切割试剂和所述第二种切割试剂共定位在靶组织中。在某些实施方案中，所述第一个CM和所述第二个CM被靶组织中的至少一种切割试剂切割。

在某些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自以下的氨基酸序列：(GS)

在某些实施方案中，所述可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在某些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在某些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在某些实施方案中，所述试剂是选自在表4中列出的组的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是多拉司他汀。在某些实施方案中，所述试剂是耳他汀或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是耳他汀E或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是单甲基耳他汀E (MMAE)。在某些实施方案中，所述试剂是美坦辛类或美坦辛类衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在某些实施方案中，所述试剂是多卡米星或其衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是卡奇霉素或其衍生物。

在某些实施方案中，所述试剂经由接头缀合至AB。在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在某些实施方案中，所述接头选自在表5和6中所示的接头。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还包括信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述间隔物在没有信号肽存在下缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述间隔物直接连接至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的MM。在某些实施方案中，所述间隔物至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 11)。在某些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 11)的间隔物，所述间隔物直接连接至本文中公开的MM序列，具有间隔物-MM-CM-AB的从N-端至C-端的结构排列。在某些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括间隔物，所述间隔物直接连接至本文中公开的MM序列，具有间隔物-MM-CM-AB的从N-端至C-端的结构排列。在某些实施方案中，处于未切割状态的可活化抗体包括间隔物，其中所述间隔物直接连接至MM，且具有AB-CM-MM-间隔物的从N-端至C-端的结构排列。

在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是单特异性的。在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是多特异性的，例如，作为非限制性实例，双特异性的或三功能的。在某些实施方案中，所述可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为促双特异性的T细胞衔接子(BITE)分子的一部分。在某些实施方案中，所述可活化抗体被配制为促嵌合的抗原受体(CAR)修饰的T细胞或其它经工程改造的受体的一部分。

在某些实施方案中，所述靶标选自在表1中列出的靶标的组。在某些实施方案中，所述AB是或衍生自选自在表2中列出的抗体的组的抗体。在某些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')

本发明还提供了试剂盒和/或方法，其使用构建体（在本文中被称作“半可活化抗体”）检测可活化抗体的活化和活化的可活化抗体与目标靶标的结合，其中所述可活化抗体包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域没有被掩蔽，且所述第二抗原结合结构域被掩蔽且含有标记的接头，所述接头包括蛋白酶可切割的序列。在这些半可活化抗体中，未掩蔽的臂结合组织靶标，例如，组织受体，由此将所述半可活化抗体锚定至组织。如果所述蛋白酶存在于组织中且切割标记的接头，所述掩蔽物和/或标记将从半可活化抗体解离，且标记信号(例如，荧光)将下降。如果所述蛋白酶不以可检测水平存在于组织中，标记信号(例如，荧光)的水平将保持不变或相对不变。

在某些实施方案中，将所述半可活化抗体标记，且所述标记用作在组织上结合的材料的量的共登记（co-register）。

在某些实施方案中，使用标记的或未标记的半可活化抗体，其中所述第一抗原结合结构域没有被掩蔽，且所述第二抗原结合结构域被掩蔽且含有接头，所述接头包括被包含在荧光团-猝灭剂对中的蛋白酶可切割物。在这些半可活化抗体中，未掩蔽的臂结合组织靶标，例如，组织受体，由此将所述半可活化抗体锚定至组织。如果所述蛋白酶存在于组织中且切割标记的接头，所述猝灭剂和/或标记将解离，且所述标记信号(例如，荧光)将增加。如果所述蛋白酶不以可检测水平存在于组织中，标记信号(例如，荧光)的水平将保持不变或相对不变。

本发明还提供了试剂盒和/或方法，其用于监测可活化抗体的活化，用于监测可活化抗体的分布，和/或用于监测可活化抗体在受试者中的积累。在这些方法中，所述可活化抗体缀合至多种可检测的标志物中的任一种，且使用对应的仪器或其它分析装置检测所述标志物。在这些方法和/或试剂盒的某些实施方案中，所述可活化抗体缀合至标记，例如，作为非限制性实例，生物素、荧光标记、PET/SPECT示踪剂、光声试剂和/或MRI造影剂。本文描述了这样的标记的合适实例。然后使用多种方法中的任一种，作为非限制性实例，包括蛋白质印迹分析、组织学、免疫荧光(IF)、免疫组织化学(IHC)和/或体内和/或外科手术中的成像方法，检测这些标记。

本发明还提供了试剂盒和/或方法，其用于通过体内成像用“冷的”预处理步骤在肿瘤模型中评价可活化抗体的活化和活化的可活化抗体的结合。这些方法是有利的，因为它们能够在体内评价(i)肿瘤或患病组织中的蛋白酶活性；(ii)底物的可切割性和特异性；(iii)可活化抗体的活化和结合；和(iv)标记过程不会损害的不同底物的对比。

在这些试剂盒和/或方法中，如下进行可活化抗体活化和结合的间接测量：用“冷的”未标记的可活化抗体预处理小鼠，随后施用标记的抗体。在仅用标记的抗体处理的小鼠(即，没有“冷的”预处理)和用“冷的”可活化抗体处理的小鼠之间的荧光强度或任意其它成像模态（例如，PET、MRI等）的差异指示被活化的可活化抗体占据的受体的量，在本文中也被称作被占据的受体的水平。通过用“冷的”抗体预处理肿瘤模型（例如，小鼠）从而导致完全受体占据，设定信号的基线。另外，该对照能够证实由于增强的渗透性和保留(EnhancedPermeability and Retention，EPR)效应潜在地捕获的被标记的材料的信号。

本发明还提供了将组织样品（诸如得自多发性骨髓瘤患者的骨髓活组织检查样品）切片的方法。在某些实施方案中，所述组织样品是结合支持物基质的任何冷冻的组织。在某些实施方案中，所述组织样品是脂肪组织或软组织，诸如乳腺癌或淋巴结样品。在某些实施方案中，所述组织得自实体瘤。在某些实施方案中，所述组织样品是多发性骨髓瘤样品。在某些实施方案中，所述组织样品是得自多发性骨髓瘤患者的骨髓活组织检查样品。在某些实施方案中，将得自患者的组织样品切片后进行染色。在某些实施方案中，将得自多发性骨髓瘤患者的组织样品切片后进行染色。在某些实施方案中，将得自多发性骨髓瘤患者的骨髓活组织检查样品切片后进行染色。在这些方法中，将组织样品冷冻，在某些实施方案中冷冻到至少-30℃。在某些实施方案中，然后将所述冷冻的组织样品附着至卡盘。将所述卡盘放在卡盘夹具中以后，将与冷冻切片过程相容（miscible）的支持物基质（例如，塑料或粘合材料，例如，胶带）施加于所述块的面。在某些实施方案中，然后操作所述支持物基质，例如，使用塑料滚筒或其它这样的设备，以确保均匀粘附。当将支持物基质的边缘保持就位时，将所述块缓慢地下降至刀片，并制作切片。可以在任意合适的宽度将组织切片，例如，在小于1微米(um)，在1微米，在2微米，在3微米，在4微米，在5微米，在6微米，在7微米，在8微米，在9微米，在10微米或在大于10微米。在某些实施方案中，使用碳化钨刀，例如，16 cm碳化钨刀，将组织切片。将组织切片保持在支持物基质上并保持冷冻。在某些实施方案中，将附着于支持物基质的组织切片在支持物基质上直接染色，从而消除对组织转移（其可能导致损伤）的需求。

附图说明

图1是本公开内容的方法（即，本公开内容的可活化抗体的原位成像）的示意图：1.放置在载玻片上的组织切片。2. 所述载玻片用含有标记的可活化抗体的溶液覆盖并温育。3.充分洗涤后，使可活化抗体的结合显影。

图2A和2B的一系列图像描绘了使用非小细胞肺癌H292异种移植肿瘤组织的可活化抗体原位成像的原理证据。这些插图描绘了非小细胞肺癌H292异种移植肿瘤组织的活化和结合抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的能力。这样的活化会被蛋白水解酶抑制剂或被过量的未标记的(

图3的一系列图像显示了使用本公开内容的原位成像方法，抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5被活化和结合冷冻的人癌症组织的能力。顶行的左图中的组织图像证实，抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5通过抗-EGFR可活化抗体的组织衍生的蛋白水解性裂解而活化，以产生与组织中的EGFR靶标结合的C225v5抗体。通过将商购可得的抗-EGFR抗体暴露于组织，检测组织染色的相同模式，如在顶行的中图中所示。顶行的右图中的图像证实，通过用广谱抑制剂混合液集合（cocktail set）III和50 mM EDTA的1:100稀释液预处理组织，抑制在左图中显示的荧光信号。底行代表DAPI核染色。

图4的一系列图像描绘了三重阴性乳腺癌(TNBC)的肿瘤组织对可活化抗体3954-1204-C225v5 (中图)和3954-LS9-C225v5 (右图)的活化。CM 1204 (氨基酸序列LSGRSDNH,SEQ ID NO: 14)是MT-SP1、uPA和豆荚蛋白的底物；并且已知的可切割部分，在本文中被称作CM LS9 (氨基酸序列SLAPLGLQRR, SEQ ID NO: 251)，是MMP-14的底物。将蛋白酶活性定量为可活化抗体活化和组织结合相对于西妥昔单抗染色效率的百分比(左图)。

图5描绘的一系列图像显示了组织切片对可活化抗体活化的pH依赖性。在pH 6.5(组织蛋白酶B（一种细胞内蛋白酶）的最佳pH)的缓冲液中在H292异种移植肿瘤组织上温育可活化抗体3954-1204-C225v5和3954-LS4-C225v5 (CM LS4 (氨基酸序列RRALAL, SEQ IDNO: 252)是组织蛋白酶B的底物)，导致3954-LS4-C225v5的活化(右下图)，但是没有导致3954-1204-C225v5的显著活化(左下图)。相反，这些可活化抗体在生理pH (pH 7.4)的温育导致3954-1204-C225v5的活化(左上图)，但是没有导致3954-LS4-C225v5的显著活化。

图6的一系列表格描绘了3954-1204-C225v5在广泛的人肿瘤样品中是可活化的。第2列指示如通过商购可得的抗-EGFR抗体所检测的，多种人癌症组织样品的EGFR受体的表达水平。第3列指示如通过抗体A11所检测的，在多种人癌症组织样品中的活性matriptase(MT-SP1)的量。第4和5列代表与西妥昔单抗(Cetux)组织染色（第4列）相比，EGFR可活化抗体的原位活化和结合的评价（第5列）。将测量与组织样品结合的EGFR和A11抗体的量的IHC染色从-至3+进行评分：-，无染色；1+ (

图7的图示描绘了EGFR和A11在人结直肠癌肝转移组织样品中的共定位。

图8的图示描绘了人结直肠癌肝转移组织的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力。

图9的一系列图像显示了原位成像、EGFR IHC和A11 IHC的三重染色。图像的上行证实了在原位成像条件下在单个组织切片上进行的染色，证实了（左到右）：EGFR表达、matriptase (MT-SP1)的活性和西妥昔单抗的结合。图像的下行证实了在单个组织切片上进行的染色，证实了（左到右）：EGFR表达、matriptase (MT-SP1)的活性和抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的原位成像。图9中图像的右列对比了在原位成像条件下西妥昔单抗的结合（上图像）和通过组织衍生的蛋白水解性裂解活化的抗-EGFR可活化抗体的结合（下图像）。如图9的图像左列所示，通过将商购可得的抗-EGFR抗体暴露于组织，检测到组织染色的类似模式。图9图像的中间列显示了matriptase (MT-SP1)活性与EGFR表达的共定位。

图10的一系列图像描绘了如使用原位成像证实的抗-Jagged可活化抗体（在本文中被称作5342-1204-4D11和5342-PLGL-4D11）的被活化和结合BxPC3异种移植肿瘤组织的能力；CM PLGL (氨基酸序列PLGL, SEQ ID NO: 214)是pan-MMP底物。用Alexa Fluor®680标记可活化抗体，以产生经标记的可活化抗体5342-1204-4D11-AF680和5342-PLGL-4D11-AF680。还试验了经标记的抗-Jagged亲本抗体4D11-AF680。将4D11-AF680 (图A)、5342-1204-4D11-AF680 (图B)和5342-PLGL-4D11-AF680 (图C)中的每一种与冷冻的BxPC3异种移植肿瘤组织样品一起温育。图D、E和F代表将4D11-AF680、5342-1204-4D11-AF680和5342-PLGL-4D11-AF680与冷冻的BxPC3异种移植肿瘤组织（用广谱蛋白酶抑制剂混合液预处理过）一起温育以后得到的荧光图像。

图11的一系列图像描绘了如通过人胰腺癌组织的原位成像证实的抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11和5342-PLGL-4D11的活化。将4D11-AF680 (4D11) (第1列，第1行)、5342-1204-4D11-AF680 (1204) (第1列，第2行)和5342-PLGL-4D11-AF680 (PLGL) (第1列，第3行)中的每一种与分离自胰腺癌人患者的冷冻组织样品一起温育。第2、3和4列中的图分别代表将4D11-AF680、5342-1204-4D11-AF680和5342-PLGL-4D11-AF680与以下物质一起温育以后得到的荧光图像：冷冻的胰腺癌患者组织预处理的抗体A11，即特异性地结合MT-SP1蛋白酶（也被称作matriptase）的活性部位的抗体；(第2列)；MMP抑制剂(图11, 第3列)；或广谱蛋白酶抑制剂混合液(第4列)。

图12描绘的一系列图像证实了非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)人组织样品上的抗体C225v5的原位成像和可活化抗体3954-1204-C225v5的活化。

图13A和13B的一系列照片描绘了腹膜内地注射被掩蔽的抗-EGFR抗体构建体（在本文中被称作被掩蔽的抗体3954-NSUB-C225v4）、可活化的抗-EGFR抗体构建体（在本文中被称作3954-1204-C225v4）或西妥昔单抗(

图14的一系列图像描绘了使用非标记的(即，未标记的)可活化抗体和第二试剂进行原位成像的可行性，所述第二试剂包含可检测标记且特异性地结合可活化抗体的AB。

图15的图示描绘了示例性的内化成像方案，其使用与成像试剂缀合的可活化抗体，使得所述可活化抗体被蛋白酶活化，活化的可活化抗体结合靶标并内化，然后在细胞内活化显像剂。

图16的图示描绘了使用与成像试剂缀合的抗体的内化成像方案，其中所述抗体结合靶标并内化，然后在细胞内活化显像剂。

图17的图示描绘了在磁共振成像技术中使用缀合的可活化抗体的一种示例性方法。

图18的图示描绘了在用于监测可活化抗体分布、积累和/或活化的不同成像方法中使用可活化抗体和缀合的可活化抗体的多个实施方案。

图19的一系列图示提供了在本文中提供的半可活化抗体的示意图。图19A和19C描绘了半可活化抗体设计，其中可活化抗体的一个臂含有标记的接头，且另一个臂代表亲本抗体(或针对无所不在地表达的靶标的抗体)的抗原结合位点。图19B描绘了一种半可活化抗体设计，其中可活化抗体的接头含有掩蔽抗体的抗原结合位点的标记试剂。图19D描绘了一种半可活化抗体设计，其中可活化抗体的一个臂含有标记的接头和淬灭的探针(Q)，且另一个臂代表亲本抗体的抗原结合位点。

图20的图示将图1的标准可活化抗体原位成像技术与原位成像方法（在本文中被称作“反向”原位成像）进行了对比。

图21的图描绘了在得自非小细胞肺癌(NSCLC)和乳腺癌(BC)专利肿瘤样品的组织微阵列(TMA)样品中观察到的活化率水平。原位成像染色评分是基于与4D11 (亲本)抗体染色的对比，且如下定义：-，无染色；1+ (即，“+”)，与亲本抗体相比弱染色；2+ (即，“++”)，与亲本抗体相比中等染色；和3+ (即，“+++”)，与亲本抗体类似的染色。

图22和23的图示描绘了在细针抽吸(FNA)样品中的染色，所述样品在有广谱蛋白酶抑制剂(BSPI)存在下接触标记的亲本抗-EGFR抗体(西妥昔单抗-AF680)、标记的抗-EGFR可活化抗体(3954-1204-C225v5-AF680)或标记的抗-EGFR可活化抗体(3954-1204-C225v5-AF680)。得自2位受试者的结果分别显示在图22和23中。

图24A、24B和24C的一系列照片和图描绘了使用受体占据的体内和先体外后体内成像检测到的可活化的抗-Jagged抗体(5342-1204-4D11)积累水平之间的关联。

图25的图描绘了使用受体占据成像估计的抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的活化。

图26的照片描绘了抗-Jagged抗体4D11染色与CD138的共定位，所述CD138是多发性骨髓瘤骨髓活组织检查患者样品(MM00015)中的一种恶性多发性骨髓瘤浆细胞标志物。

图27的照片描绘了在2个多发性骨髓瘤骨髓活组织检查患者样品(MM00015和MM00102)中的抗-Jagged抗体4D11的免疫组织化学分析的结果和可活化的抗-Jagged抗体5342-1204-4D11的原位成像分析的结果。

发明详述

本发明提供了使用可活化抗体检测生物样品中的特定蛋白酶活性的方法和组合物。这些组合物和方法可以用在多种诊断指征中，例如，体内、体外、原位或先体外后体内。

本文中提供的技术能够检测生物样品（诸如细胞培养物或组织切片）中的蛋白水解活性。使用本文描述的技术，可能基于可检测标记(例如，荧光标记)的存在而定量蛋白水解活性。这些技术可与从疾病部位(

蛋白酶是催化肽键的水解性裂解的酶，且可以基于它们的催化机制分成5个不同种类: 丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或苏氨酸蛋白酶(C.Lopez-Otin, Nature Reviews 2007)。蛋白酶涉入众多重要的生理学过程，包括蛋白质转换、血液凝固、伤口愈合、消化、受精、细胞分化和生长、细胞信号传递、免疫应答和细胞凋亡。但是，如果不严格控制的话，蛋白酶可以是非常有害的。这样，不适当的蛋白酶解可以在癌症以及心血管疾病、炎症性疾病、神经变性疾病、细菌性疾病、病毒性疾病和寄生虫病中具有重要作用。因为通过抑制适当的蛋白酶可以阻止过度的蛋白酶解，所以认为蛋白酶是合适的治疗靶标(B. Turk, Nature Rev Drug Disc)。值得注意的是，蛋白酶的活性通过基本机制（包括生物合成的调节、无活性的蛋白酶前体（也被称作前酶或酶原）的活化）和通过抑制剂和辅因子的结合受到严密控制。

几种分子技术可用于鉴别和表征细胞和组织中的蛋白酶。那些技术中的大多数聚焦于mRNA的检测或蛋白酶的蛋白表达；但是，在给出蛋白酶处于它的酶原形式或与抑制它的活性的蛋白酶抑制剂形成复合物的可能性的情况下，这些技术不会提供关于蛋白酶活性的信息。因此，能够实现生物系统和特别是患者样品中的蛋白酶活性检测的试剂的开发，是进一步理解蛋白酶涉入体内稳态和疾病发展的机制以及帮助我们为临床应用设计更好的治疗策略的中心。

酶谱法是通过使用提供底物降解的可视化的试剂来检测功能性蛋白酶的技术。为先体外后体内蛋白酶活性的可视化开发了几类酶谱法技术，其可以细分成2类：凝胶中酶谱法和原位酶谱法(综述参见Vandooren等人, 2013)。组织匀浆物用于凝胶中酶谱法的用途排除了组织上的酶活性的定位，且可能潜在地导致由蛋白酶或抑制剂的相互作用引起的蛋白酶活性的修饰，所述蛋白酶或抑制剂可能已经定位在完整细胞或组织的不同隔室中(Hrabec, 等人, J Cancer Res Clin Oncol 128:197-204, 2002)。相反，原位酶谱法技术是基于多种蛋白酶活性的评估以及它们的定位(Yan和Blomme, 2003)。但是，与其中可以通过分子重量来鉴别蛋白酶的凝胶中酶谱法相比，在原位酶谱法中，数据的解释主要依赖于底物的特异性和选择性。目前用于原位酶谱法的大多数试剂，诸如DQ-胶原或DQ-酪蛋白，是基于许多蛋白酶可以切割的底物，这使得数据的解释是非常推测性的。

本文所述的方法提供了新颖的且有效的技术，其通过使用蛋白酶活化的抗体技术（在本文中被称作可活化抗体成像），能够选择性地检测生物样品（例如，组织样品）中的特定蛋白酶活性。在某些实施方案中，所述方法是可活化抗体体内成像。在某些实施方案中，所述方法是可活化抗体先体外后体内成像。在某些实施方案中，所述方法是可活化抗体原位成像。在某些实施方案中，所述方法是可活化抗体体外成像。这些方法使用可活化抗体，其被设计成掺入不同的蛋白酶特异性的底物以检测和定位组织切片中的特定蛋白酶活性。

通常，本文提供的组合物和方法包括可活化抗体，所述可活化抗体包括特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB偶联至掩蔽部分(MM)，使得MM的偶联会降低抗体或其抗原结合片段的结合靶标的能力。在某些实施方案中，所述MM经由可切割部分(CM)偶联至AB，所述可切割部分(CM)包括蛋白酶（例如，与靶标共定位在受试者的治疗部位处的蛋白酶）的底物。众多研究已经证实了实体瘤中的异常蛋白酶水平的关联，例如，uPA、豆荚蛋白、MT-SP1、基质金属蛋白酶(MMP) (

本文提供的可活化抗体包括蛋白酶的底物，其可用于影响肿瘤细胞中的蛋白酶活性，实现在治疗和/或诊断部位的靶向的抗体活化。使用底物选择方法鉴别具有许多合乎需要的特征的底物。例如，所选的底物是全身稳定的（即在受试者的体循环中是稳定的），一般不易被循环的蛋白酶（诸如纤溶酶、凝血酶、组织型纤溶酶原激活物（tPA））切割，是无毒的，一般不易在毒性的潜在位点（诸如皮肤）被蛋白酶（诸如ADAM 9、ADAM 10、ADAM 17）和/或激肽释放酶（诸如KLK-5和KLK-7）切割，并且在预期的治疗和/或诊断部位是有活性的。在某些实施方案中，对于在预期的治疗和/或诊断部位过表达、但是在正常的、健康的或以其它方式未患病或受损的组织处或其中通常没有活性的蛋白酶选择经鉴别的底物，然后将所选的底物随后针对在正常的（例如，未患病的）组织中表达的蛋白酶进行反选（counter-screened）。

作为一个非限制性实例，AB是在表1中列出的任何靶标的结合配偶体。

表1: 示例性的靶标

作为一个非限制性实例，AB是或衍生自在表2中列出的抗体。

表2: Ab的示例性来源

在某些实施方案中，所述AB结合表皮生长因子受体(EGFR)。在某些实施方案中，结合EGFR的AB包括下面显示的重链和/或轻链序列中的一个或多个。

在某些实施方案中，所述AB结合白介素6受体(IL-6R)。在某些实施方案中，结合IL-6R的AB包括下面显示的重链和/或轻链序列中的一个或多个。

Av1抗体重链氨基酸序列：

Av1抗体轻链氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述AB结合Jagged靶标，例如，Jagged 1、Jagged 2或Jagged1和Jagged 2二者。在某些实施方案中，结合Jagged靶标的AB包括下面显示的重链和/或轻链序列中的一个或多个。

4D11轻链序列

4D11重链序列

4D11v2重链序列

4D11v2轻链序列

在某些实施方案中，结合Jagged靶标的AB包括下面显示的可变重链和/或可变轻链序列中的一个或多个。

可变轻链氨基序列Lc4

可变重链氨基序列Hc4

可变轻链氨基序列Lc5

可变重链氨基序列Hc5

可变轻链氨基序列Lc7

可变重链氨基序列Hc7

可变轻链氨基序列Lc8

可变重链氨基序列Hc8

可变轻链氨基序列Lc13

可变重链氨基序列Hc13

可变轻链氨基序列Lc16

可变重链氨基序列Hc16

可变轻链氨基序列Lc19

可变重链氨基序列Hc19

可变轻链氨基序列Lc21

可变重链氨基序列Hc21

可变轻链氨基序列Lc24

可变重链氨基序列Hc24

可变轻链氨基序列Lc26

可变重链氨基序列Hc26

可变轻链氨基序列Lc27

可变重链氨基序列Hc27

可变轻链氨基序列Lc28

可变重链氨基序列Hc28

可变轻链氨基序列Lc30

可变重链氨基序列Hc30

可变轻链氨基序列Lc31

可变重链氨基序列Hc31

可变轻链氨基序列Lc32

可变重链氨基序列Hc32

可变轻链氨基序列Lc37

可变重链氨基序列Hc37

可变轻链氨基序列Lc39

可变重链氨基序列Hc39

可变轻链氨基序列Lc40

重链氨基序列Hc40

可变轻链氨基序列Lc47

可变重链氨基序列Hc47

可变4B2轻链

可变4B2重链

可变4D11轻链

可变4D11重链

可变4E7轻链

可变4E7重链

可变4E11轻链

可变4E11重链

可变6B7轻链

可变6B7重链

可变6F8轻链

可变6F8重链

作为非限制性实例，所述CM包括这样的氨基酸序列：其是被在表3中列出的以下酶或蛋白酶中的一种或多种切割的底物或衍生自所述底物。

表3 -示例性的酶/蛋白酶

本文中提供的可活化抗体包括掩蔽部分。在某些实施方案中，所述掩蔽部分是这样的氨基酸序列：其偶联或以其它方式连接至可活化抗体且位于可活化抗体构建体内，使得掩蔽部分会降低所述抗体的特异性地结合靶标的能力。使用多种已知技术中的任一种，鉴别合适的掩蔽部分。例如，使用Daugherty等人在美国专利号8,293,685（其内容特此通过引用整体并入）中描述的方法，鉴别肽掩蔽部分。

在某些实施方案中，选择掩蔽部分用于与特异性抗体或抗体片段一起使用。例如，用于与结合EGFR的抗体一起使用的合适掩蔽部分包括含有序列CISPRG (SEQ ID NO: 43)的MM。作为非限制性实例，所述MM可以包括序列诸如CISPRGCG (SEQ ID NO: 44)；CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 12)；CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 45)、CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 46)和CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 47)。其它合适的掩蔽部分包括在PCT公开号WO 2010/081173中公开的EGFR-特异性的掩蔽物中的任一种，例如，作为非限制性实例，

用于与结合Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）的抗体一起使用的合适掩蔽部分包括，作为非限制性实例，含有诸如以下序列的掩蔽部分：

用于与结合白介素6靶标（例如，白介素6受体(IL-6R)）的抗体一起使用的合适掩蔽部分包括，作为非限制性实例，含有诸如以下序列的掩蔽部分：

在某些实施方案中，选择掩蔽部分用于与任何抗体或抗体片段一起使用。例如，在某些实施方案中，所述掩蔽部分是非结合性空间部分(NB)或非结合性空间部分的结合配偶体(BP)，其中BP将NB募集或以其它方式吸引至可活化抗体。例如，在某些实施方案中，所述NB是可溶性的球状蛋白。在某些实施方案中，所述NB是在血流中循环的蛋白。在某些实施方案中，所述NB选自白蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白结构域和其它血清蛋白。在某些实施方案中，所述BP选自白蛋白结合肽、纤维蛋白原结合肽、纤连蛋白结合肽、血红蛋白结合肽、转铁蛋白结合肽、免疫球蛋白结构域结合肽、和其它血清蛋白结合肽。在某些实施方案中，所述可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：NB-CM-AB、AB-CM-NB、BP-CM-AB或AB-CM-BP。在其中所述可活化抗体包括BP且所述可活化抗体是在有对应NB存在下的实施方案中，所述可活化抗体在未切割状态具有如下从N-端至C-端的结构排列：NB:BP-CM-AB或AB-CM-BP:NB，其中“:”代表NB和BP之间的相互作用，例如，结合。在某些实施方案中，所述可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：NB-LP1-CM-LP2-AB、AB-LP2-CM-LP1-NB、BP-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-BP。在其中所述可活化抗体包括BP且所述可活化抗体是在有对应NB存在下的实施方案中，所述可活化抗体在未切割状态具有如下从N-端至C-端的结构排列：NB:BP-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-BP:NB，其中“:”代表NB和BP之间的相互作用，例如，结合。

本文中提供的可活化抗体包括可切割部分。在某些实施方案中，所述可切割部分包括这样的氨基酸序列：其是蛋白酶（通常是胞外蛋白酶）的底物。使用多种已知技术中的任一种，鉴别合适的底物。例如，使用Daugherty等人在美国专利号7,666,817（其内容特此通过引用整体并入）中描述的方法，鉴别肽底物(

在某些实施方案中，选择CM用于与特定蛋白酶一起使用。在某些实施方案中，所述CM是至少一种选自以下的蛋白酶的底物：ADAM 17、BMP-1、半胱氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶、HtrA1、豆荚蛋白、matriptase (MT-SP1)、基质金属蛋白酶(MMP)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TMPRSS诸如TMPRSS3或TMPRSS4、凝血酶和u-型纤溶酶原激活物(uPA，也被称作尿激酶)。

在某些实施方案中，所述CM是ADAM17的底物。在某些实施方案中，所述CM是BMP-1的底物。在某些实施方案中，所述CM是组织蛋白酶的底物。在某些实施方案中，所述CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在某些实施方案中，所述CM是HtrA1的底物。在某些实施方案中，所述CM是豆荚蛋白的底物。在某些实施方案中，所述CM是MT-SP1的底物。在某些实施方案中，所述CM是MMP的底物。在某些实施方案中，所述CM是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在某些实施方案中，所述CM是凝血酶的底物。在某些实施方案中，所述CM是TMPRSS的底物。在某些实施方案中，所述CM是TMPRSS3的底物。在某些实施方案中，所述CM是TMPRSS4的底物。在某些实施方案中，所述CM是uPA的底物。

在某些实施方案中，选择可切割部分用于与特定蛋白酶（例如，已知与可活化抗体的靶标共定位的蛋白酶）一起使用。例如，用在本公开内容的可活化抗体中的合适的可切割部分被至少一种蛋白酶诸如尿激酶、豆荚蛋白、至少一种基质金属蛋白酶(MMP)和/或MT-SP1 (matriptase)切割，且包括序列

在某些实施方案中，所述CM是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物。MMP的实例包括MMP1；MMP2；MMP3；MMP7；MMP8；MMP9；MMP10；MMP11；MMP12；MMP13；MMP14；MMP15；MMP16；MMP17；MMP19；MMP20；MMP23；MMP24；MMP26；和MMP27。在某些实施方案中，所述CM是MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和MMP19的底物。在某些实施方案中，所述CM是MMP9的底物。在某些实施方案中，所述CM是MMP14的底物。在某些实施方案中，所述CM是两种或更多种MMP的底物。在某些实施方案中，所述CM是至少MMP9和MMP14的底物。在某些实施方案中，所述CM包含相同MMP的两种或更多种底物。在某些实施方案中，所述CM包含至少两种或更多种MMP9底物。在某些实施方案中，所述CM包含至少两种或更多种MMP14底物。

在某些实施方案中，所述CM是MMP的底物且包括序列

在某些实施方案中，使用重组DNA技术和在真核或原核物种中的表达，可以生物合成地制备用在本公开内容的可活化抗体中的可活化抗体。可以将编码掩蔽部分、接头序列(其可以包括可切割部分(CM)和抗体链(重或轻))的cDNA连接成5’至3’(在翻译产物中N-至C-端)序列以建立核酸构建体，将其按照常规抗体表达方法表达为可活化抗体蛋白。在某些实施方案中，可以通过如下半合成地制备可活化抗体：表达CM-抗体，然后在蛋白的N-端处或附近化学偶联所述掩蔽物。在某些实施方案中，可以如下生产可活化抗体：表达抗体，然后在蛋白的N-端处或附近化学偶联所述掩蔽物和CM，使得可活化抗体在未切割状态具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。

本文描述的可活化抗体还可以包括与所述可活化抗体缀合的试剂。在某些实施方案中，所述缀合的试剂是治疗剂，诸如抗肿瘤剂。在这样的实施方案中，所述试剂缀合至所述可活化抗体的碳水化合物部分，例如，其中所述碳水化合物部分位于所述可活化抗体的抗体或抗原结合片段的抗原结合区以外。在某些实施方案中，所述试剂缀合至可活化抗体的抗体或抗原结合片段的巯基。在某些实施方案中，所述试剂缀合至可活化抗体的抗体或抗原结合片段的氨基。在某些实施方案中，所述试剂缀合至可活化抗体的抗体或抗原结合片段的羧酸基。在某些实施方案中，所述试剂是含有巯基的试剂。在某些实施方案中，所述试剂经过工程改造以包括一个或多个巯基基团。

在某些实施方案中，所述试剂是细胞毒性剂诸如毒素（例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素(

在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是含有巯基的试剂。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂经过工程改造以包括一个或多个巯基基团。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是多拉司他汀或其衍生物(

在某些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法以外，还可以修饰所述缀合的可活化抗体，用于通过在所述可活化抗体序列中插入或以其它方式包含的经修饰的氨基酸序列进行位点特异性的缀合。设计这些经修饰的氨基酸序列以允许缀合的试剂在缀合的可活化抗体内的受控放置和/或剂量。例如，可以工程改造可活化抗体以在轻链和重链上的位置包括提供反应性巯基的半胱氨酸置换，并且不会负面地影响蛋白折叠和装配，也不改变抗原结合。在某些实施方案中，可以工程改造可活化抗体以在可活化抗体中包括或以其它方式引入一个或多个非天然氨基酸残基，以提供合适的缀合位点。在某些实施方案中，可以工程改造可活化抗体以在可活化抗体序列内包括或以其它方式引入酶促地可活化的肽序列。

在某些实施方案中，所述试剂是可检测的部分，例如，标记或其它标志物。例如，所述试剂是或包括放射性地标记的氨基酸、可以通过标记的抗-生物素抗体或抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热法来检测的荧光标志物或酶活性的抗-生物素抗体或抗生蛋白链菌素)来检测的一种或多种生物素基团、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶促标记和/或一种或多种化学发光剂。在某些实施方案中，可检测的部分通过间隔物分子连接。

可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(得自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆（Phytolacaamericana）蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素。多种放射性核素可用于产生放射性缀合的抗体。实例包括

使用多种双功能的蛋白-偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛(glutareldehyde))、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(诸如二-(对-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，可以制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如在Vitetta等人,Science 238: 1098 (1987)中所述，制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至抗体的一种示例性螯合剂(

本领域普通技术人员会认识到，多种可能的部分可以偶联至本发明的所得的抗体。(

表4列出了可在本文所述的发明中采用的一些示例性药学试剂，但绝不意在成为穷尽性清单。

表4: 用于缀合的示例性药学试剂

在某些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法以外，通过使用将结合所述两种分子的任何化学反应，只要所述抗体和其它部分保留它们各自的活性即可，也可以偶联所述可活化抗体。该连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。在某些实施方案中，所述结合是共价结合。通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥连分子的掺入，可以实现共价结合。许多二价或多价连接试剂可用于将蛋白分子（诸如本发明的可活化抗体）与其它分子偶联。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物，诸如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和环己二胺。该列表并非意图穷尽本领域已知的各类偶合剂，而是相反，是更常见的偶联剂的示例(

在文献中描述了合适的接头。（

上述接头含有具有不同属性的组分，从而导致具有不同的物理-化学性质的缀合物。例如，接头SMPT含有空间受阻的二硫键，并可以形成具有增加的稳定性的缀合物。一般而言，二硫键比其它连接更不稳定，因为二硫键在体外被切割，导致更少的缀合物可用。

试剂EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐可用于从羧酸和伯胺或仲胺开始制备羧酰胺。因此，EDC可用于将抗体中的赖氨酸残基与接头或毒素中羧酸连接，或者将抗体中天冬氨酸或谷氨酸残基与接头或毒素中的胺连接。此类利用EDC的缀合反应可以通过添加NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)或磺基-NHS (N-羟基-3-氧基磺酰基琥珀酰亚胺)来增强。NHS或磺基-NHS向这些缀合反应的添加可以提高缀合反应的速率、完整性、选择性和/或再现性。

在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两个或更多个接头都相同，例如，可切割的或不可切割的，或所述两个或更多个接头是不同的，例如，至少一个是可切割的且至少一个是不可切割的。

在某些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法以外，使用几种将试剂连接至AB的方法中的任一种，可以缀合所述可活化抗体：(a)连接至AB的碳水化合物部分，或(b)连接至AB的巯基，或(c)连接至AB的氨基，或(d)连接至AB的羧酸基。根据本发明，AB可以通过中间接头共价连接至试剂，所述中间接头具有至少两个反应基团，一个与AB反应并且一个与试剂反应。可以选择所述接头（其可以包括任何相容的有机化合物），使得与AB（或试剂）的反应不会不利地影响AB反应性和选择性。此外，接头与试剂的连接可能不会破坏试剂的活性。对于与氧化的抗体或氧化的抗体片段的反应而言合适的接头包括含有胺的那些接头，所述胺选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯基肼、氨基脲和氨基硫脲基团。此类反应性官能团可以作为接头的结构的组成部分存在，或者可以通过不含有这种基团的接头的合适化学修饰而引入。

用于连接至还原的AB的合适接头包括具有某些能够与还原的抗体或片段的巯基反应的反应基团的那些接头。这样的反应基团包括，但不限于：反应性的卤代烷基（包括，例如，卤代乙酰基）、对-汞基苯甲酸酯基团和能够发生Michael-型加成反应的基团（包括，例如，马来酰亚胺和Mitra和Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110所述的类型的基团）。

用于连接至既非氧化的AB也非还原的AB的合适接头包括具有某些能够与存在于AB的未修饰的赖氨酸残基中的伯氨基反应的官能团的那些接头。这样的反应基团包括，但不限于，NHS羧酸或碳酸酯、磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。

用于连接至既非氧化的AB也非还原的AB的合适接头包括具有某些能够与存在于AB的天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧酸基团反应的官能团的那些接头，所述AB已经用合适的试剂活化。合适的活化剂包括EDC（加或不加NHS或磺基-NHS）以及用于羧酰胺形成的其它脱水剂。在这些情况下，存在于合适接头中的官能团将包括伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。

可以在将接头连接至AB之前或之后，将所述试剂连接至接头。在某些应用中，可能合乎需要的是，首先产生AB-接头中间体，其中所述接头不含相关的试剂。根据具体的应用，然后可以将特定试剂共价连接至接头。在其它实施方案中，首先将AB连接至MM、CM和相关的接头，然后连接至用于缀合的目的接头。

可替换地，通过单位点接头在AB上的多个位点处的连接，可以实现较高的比活性（或较高的试剂与AB的比率）。这样的多个站点可以通过两种方法中的任一种引入AB中。首先，可以在相同AB中产生多个醛基和/或巯基。其次，可以将具有多个功能位点的“有分支的接头”连接至AB的醛基或巯基以便随后连接至接头。有分支的接头或多位点接头的功能性位点可以是醛基或巯基，或可以是接头可以与其连接的任何化学位点。通过组合这两种方案，也就是说，在AB上的几个位点处连接多位点接头，可以获得更高的比活性。

可切割的接头序列的非限制性实例提供在表5中。

表5: 用于缀合的示例性接头序列

另外，试剂可以经由二硫键（例如，在半胱氨酸分子上的二硫键）连接至AB。因为许多肿瘤天然地释放高水平的谷胱甘肽（一种还原剂），这可以还原二硫键并随后在递送位点释放试剂。在某些具体实施方案中，会修饰CM的还原剂也将修饰缀合的可活化抗体的接头。

W - (CH

其中

W是--NH--CH

Q是氨基酸、肽；且

n是0-20的整数。

在仍其它实施方案中，所述接头可以包含间隔物元件和可切割的元件。所述间隔物元件用于使可切割的元件的位置远离AB的核心，使得可切割的元件更易于被负责切割的酶接近。某些上述有分支的接头可以充当间隔物元件。

贯穿本讨论，应当理解，接头与试剂（或间隔物元件与可切割的元件，或可切割的元件与试剂）的连接不需要通过特定连接或反应模式来实现。提供具有合适的稳定性和生物相容性的产物的任何反应都是可接受的。

接头（或接头的间隔物元件）可以具有任何期望的长度，其一端可以共价连接至可活化抗体的AB的特定位点。接头或间隔物元件的另一端可以连接至氨基酸或肽接头。

因此，当这些缀合物在有补体存在下结合抗原时，会切割将试剂连接至接头的酰胺或酯键，导致处于其活性形式的试剂的释放。当施用给受试者时，这些缀合物将实现试剂在靶位点的递送和释放，并且对于药学试剂、抗生素、抗代谢剂、抗增生性试剂等（如在表4中所示但不限此）的体内递送而言是特别有效的。

可被溶酶体蛋白酶切割的肽基接头也是有用的，例如，Val-Cit、Val-Ala或其它二肽。另外，可以使用在溶酶体的低pH环境中可切割的酸不稳定接头，例如：二唾液酸基醚。其它合适的接头包括组织蛋白酶不稳定的底物，特别是在酸性pH表现出最佳功能的那些。

在表6中提及了示例性的异双功能交联接头。

表6: 示例性的异双功能交联接头

这些不可切割的接头可以包括氨基酸、肽、D-氨基酸或其它有机化合物，其可以被修饰以包括可以随后用于通过本文所述方法连接至AB的官能团。这样的有机接头的通式可以是

W - (CH

其中

W是--NH--CH

Q是氨基酸、肽；且

n是0-20的整数。

除非另有定义，关于本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，本文描述的关于细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名法及其技术是本领域众所周知和常用的那些。关于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)使用标准技术。酶反应和纯化技术根据生产商的说明书进行，或者如本领域常规实现的进行，或者如本文中所述进行。前述技术和规程通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更具体的参考文献中所记载的常规方法进行

如根据本公开内容使用的，除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：

本文中使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子（即

已知基础抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻”链(约25 kDa)和一个“重”链(约50-70 kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。一般而言，从人类获得的抗体分子涉及种类IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一种，所述种类彼此的差别在于分子中存在的重链的性质。某些种类还具有亚类，诸如IgG

本文中使用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”表示这样的抗体分子群体：其仅含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的一个分子种类。具体地，单克隆抗体的互补性决定区(CDR)在群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点，其特征在于对该表位的独特结合亲和力。

术语“抗原结合位点”或“结合部分”表示免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重（“H”）链和轻（“L”）链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的段（被称作“高变区”）插入在被称作“框架区”或“FR”的更保守的侧接段之间。因而，术语“FR”表示在免疫球蛋白的高变区之间或附近天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称作“互补性决定区”或“CDR”。根据Kabat Sequences of Proteinsof Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987和1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、Chothia

本文中使用的术语“表位”包括能够特异性地结合免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性地结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子（诸如氨基酸或糖侧链）的化学活性的表面分型（grouping）组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。例如，可以针对多肽的N-端或C-端肽产生抗体。当解离常数≤1 μM时，认为抗体特异性地结合抗原；在某些实施方案中，所述解离常数≤100 nM；在某些实施方案中，所述解离常数≤10 nM。

本文中使用的术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫学结合性质”表示在免疫球蛋白分子和所述免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的非共价相互作用类型。可以以相互作用的解离常数(K

本文提供的组合物和方法能够将一个或多个试剂连接至AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害可活化抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。

本文中使用的术语“分离的多核苷酸”应当指基因组、cDNA或合成起源或它们的某种组合的多核苷酸，根据其起源，“分离的多核苷酸”（1）不与在自然界中在其中发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或一部分结合，（2）可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸，或（3）在自然界中不作为更大序列的一部分存在。根据本发明的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子、和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。

在本文中提及的术语“分离的蛋白”是指从cDNA或重组RNA表达的蛋白或合成起源的蛋白或它们的某种组合，根据其起源或衍生来源，所述“分离的蛋白”（1）不与自然界中存在的蛋白结合，（2）不含有来自相同来源的其它蛋白，（3）由来自不同物种的细胞表达，或（4）在自然界中不存在。

术语“多肽”在本文中用作通用词，表示多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽属的种。根据本发明的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子以及通过组合形成的抗体分子，所述组合包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，诸如κ轻链免疫球蛋白分子，并且反之亦然，及其片段和类似物。

本文中使用的术语“天然存在的”当应用于对象时表示对象可以在自然界中找到的事实。例如，可以从自然界来源中分离并且没有被人在实验室中或以其它方式有意地修饰的、存在于生物体（包括病毒）中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

本文中使用的术语“可操作地连接”表示，如此描述的组分的位置处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接：在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

本文中使用的术语“控制序列”表示这样的多核苷酸序列：其是实现它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的。这样的控制序列的性质随宿主生物而不同；在原核生物和真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意图至少包括其存在对于表达和加工而言是必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分，例如，前导序列和融合配偶体序列。本文提及的术语“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基的核苷酸，其呈核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。

本文提及的术语寡核苷酸包括通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸连接物连接在一起的、天然存在的和经修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更少的长度的多核苷酸子集。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为10-60个碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如，对于探针而言，但是寡核苷酸可以是双链的，例如，用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸是有义或反义寡核苷酸。

本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸连接物”包括寡核苷酸连接物，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯等。

如本文中使用的，20种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。

类似地，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称作5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向被称作转录方向。具有与RNA相同的序列的DNA链上的序列区域（并且其是在RNA转录物的5'末端的5'侧）被称作“上游序列”。具有与RNA相同的序列的DNA链上的序列区域（并且其是在RNA转录物的3'末端的3'侧）被称作“下游序列”。

当应用于多肽时，术语“实质同一性”是指，当最佳比对时，诸如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT，两个肽序列具有至少80%序列同一性。在某些实施方案中，两个肽序列具有至少90%序列同一性。在某些实施方案中，两个肽序列具有至少95%序列同一性。在某些实施方案中，两个肽序列具有至少99%序列同一性。

在某些实施方案中，不相同的残基位置的差别在于保守氨基酸取代。

如本文所讨论的，考虑到抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化被本发明包括，条件是氨基酸序列中的变化维持与参照序列(例如，野生型序列)的至少75%氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，氨基酸序列中的变化维持与参照序列的至少80%、90%、95%或99%氨基酸同一性。具体地，考虑到保守氨基酸替换。保守替换是在它们的侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些替换。遗传上编码的氨基酸通常分为以下家族：（1）酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；（2）碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3）非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和（4）不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包括（i）丝氨酸和苏氨酸，其是脂族-羟基家族；（ii）天冬酰胺和谷氨酰胺，其是含有酰胺的家族；（ⅲ）丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其是脂族家族；和（iv）苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其是芳族家族。例如，合理地预见到，用异亮氨酸或缬氨酸分离替换亮氨酸，用谷氨酸替换天冬氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸对氨基酸的类似替换，不会对所得分子的结合或其它性质产生重要影响，例如，在所述替换不涉及互补性决定区(CDR)或其它可变区内的氨基酸的情况下。通过测定多肽衍生物的比活性，可以容易地确定氨基酸变化是否产生功能性肽。在本文中详细描述了测定。本领域普通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。在某些实施方案中，片段或类似物的氨基端和羧基端存在于功能结构域的边界附近。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行对比，可以鉴别结构和功能结构域。在某些实施方案中，使用计算机化的对比方法来鉴别存在于已知结构和/或功能的其它蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie

在某些实施方案中，所述氨基酸取代是这样的氨基酸取代，其：（1）降低对蛋白酶解的易感性，（2）降低对氧化的易感性，（3）改变关于形成蛋白复合物的结合亲和力，（4）改变结合亲和力，和（4）赋予或修饰这些类似物的其它物理化学或功能性质。类似物可以包括天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中（例如，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中）进行单个或多个氨基酸置换（例如，保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代不应当实质上改变亲本序列的结构特征（例如，替换氨基酸不应倾向于破坏发生在亲本序列中的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构）。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and MolecularPrinciples (Creighton, 编, W. H. Freeman and Company, New York (1984));Introduction-Protein Structure (C. Branden和J. Tooze, 编, Garland Publishing,New York, N.Y. (1991))；和Thornton等人，Nature 354:105 (1991)。

本文中使用的术语“多肽片段”表示这样的多肽：其具有氨基端和/或羧基端缺失和/或一个或多个内部缺失，但是其中剩余的氨基酸序列与推导（例如，从全长cDNA序列推导）的天然存在的序列中的对应位置相同。片段的长度通常为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，所述片段是长度为至少14个氨基酸的抗体片段。在某些实施方案中，所述片段是长度为至少20个氨基酸的AB的片段。在某些实施方案中，所述片段是长度为至少50个氨基酸的AB的片段。在某些实施方案中，所述片段是长度为至少70个氨基酸的AB的片段。本文中使用的术语“类似物”表示包含至少25个氨基酸的区段的多肽，其与推导的氨基酸序列的一部分具有实质同一性，且其在合适的结合条件下特异性地结合靶标。通常，相对于天然存在的序列，多肽类似物包括保守氨基酸取代（或添加或缺失）。类似物的长度通常是至少20个氨基酸，在某些实施方案中，长度是至少50个氨基酸或更长，并且经常可以与天然存在的全长多肽一样长。

术语“试剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物学材料制备的提取物。

本文中使用的术语“标记”或“标记的”表示掺入可检测的标记物，例如，通过放射性地标记的氨基酸的掺入或生物素基部分与多肽的连接，所述生物素基部分可以通过标记的抗-生物素抗体或抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热法来检测的荧光标志物或酶活性的抗-生物素抗体或抗生蛋白链菌素)检测到。在某些情形下，所述标记或标记物还可以是治疗性的。多种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，

本文中使用的术语“药物”是指元件、化合物、试剂或分子实体，包括、例如药物、治疗剂或药理学化合物。药物可以是天然的或合成的或它们的组合。“治疗药物”是单独地或与另一种试剂组合地(例如，与前药组合的前药转换酶)对癌细胞或免疫细胞(例如，活化的免疫细胞)发挥治疗(例如，有益)作用的试剂。通常，根据本文描述的方法和组合物有用的治疗药物是发挥细胞毒性作用、细胞生长抑制作用或免疫抑制作用的那些。在某些实施方案中，药物不是放射性元素。药物可以是含有巯基的试剂，和/或药物可以经工程改造成包括一个或多个巯基基团。

关于试剂对细胞的作用，“细胞毒性剂”是指杀死细胞。“细胞抑制剂”是指抑制细胞增殖。

在抗体的背景下，术语“链间二硫键”表示在2个重链之间或在重链和轻链之间的二硫键。

术语“链间巯基”表示抗体重链或轻链的可以参与链间二硫键形成的巯基。

当特定类型和/或类似反应性的所有缀合点缀合至药物从而产生蛋白-药物缀合物的同质群体时，蛋白被称作“完全负载的(fully-loaded)”。当特定类型和/或类似反应性的仅一些可能缀合点缀合至药物从而导致蛋白-药物缀合物的某一种或几种异构体的形成时，蛋白被称作“部分地负载的”。

本文中的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms (Parker, S., 编, McGraw-Hill, San Francisco(1985))举例说明的。

本文中使用的“基本上纯的”是指，目标物质是存在的优势物质（

通常，基本上纯的组合物占存在于所述组合物中的所有大分子物质的超过约80%，在某些实施方案中，超过约85%、90%、95%和99%。在某些实施方案中，将目标物质纯化至基本上同质（通过常规检测方法在组合物中不可检测出污染物物质），其中该组合物基本上由单一大分子物质组成。

术语患者包括人和兽医受试者。应当理解，术语受试者和患者在本文中可互换地使用。

在本公开内容的试剂盒和/或方法中使用的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体对生物样品中的至少一种靶标是特异性的。生物样品是例如新鲜的细胞样品、冷冻的细胞样品、新鲜的组织样品和/或冷冻的组织样品。在某些实施方案中，所述样品得自遭受其它肿瘤病症、处于遭受癌症或其它肿瘤病症的风险中或者疑似遭受癌症或其它肿瘤病症的患者。在某些实施方案中，所述样品得自遭受炎症和/或炎症性病症、处于遭受炎症和/或炎症性病症的风险中或者疑似遭受炎症和/或炎症性病症的患者。在某些实施方案中，所述样品得自遭受自身免疫疾病、处于遭受自身免疫疾病的风险中或者疑似遭受自身免疫疾病的患者。在某些实施方案中，所述样品得自遭受纤维化病症、处于遭受纤维化病症的风险中或者疑似遭受纤维化病症的患者。在某些实施方案中，所述样品得自遭受听力损失、处于遭受听力损失的风险中或者疑似遭受听力损失的患者。

在样品是或衍生自遭受癌症、处于遭受癌症的风险中或者疑似遭受癌症的患者的情况下，对表皮生长因子受体(EGFR)特异性的可活化抗体和/或对EGFR特异性的缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，例如，作为非限制性实例，所述乳腺癌是三重阴性的乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是三重阴性的乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，所述癌症是胃癌。在某些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，所述癌症是头颈癌，例如，作为非限制性实例，食管癌。在某些实施方案中，所述癌症是食管癌。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌，例如，作为非限制性实例，非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢/子宫内膜癌。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。在某些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肾癌。在某些实施方案中，所述癌症是肉瘤，例如，作为非限制性实例，骨肉瘤。在某些实施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在某些实施方案中，所述癌症是皮肤癌，例如，作为非限制性实例，鳞状细胞癌、基底细胞癌和/或黑素瘤。在某些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是基底细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是黑素瘤。

在样品是或衍生自遭受炎症性病症和/或自身免疫疾病、处于遭受炎症性病症和/或自身免疫疾病的风险中或者疑似遭受炎症性病症和/或自身免疫疾病的患者的情况下，对EGFR特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述炎症性病症和/或自身免疫疾病是银屑病。

在样品是或衍生自遭受癌症、处于遭受癌症的风险中或者疑似遭受癌症的患者的情况下，对Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述癌症是白血病，包括T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)，成淋巴细胞性疾病，包括多发性骨髓瘤，和实体瘤，包括肺、结肠直肠、前列腺、胰腺和乳房，包括三重阴性乳腺癌。

在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，作为非限制性实例，包括ER/PR+ 乳腺癌、Her2+ 乳腺癌、三重阴性的乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，所述癌症是胃癌。在某些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，所述癌症是头颈癌。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌，诸如作为非限制性实例，非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肉瘤。在某些实施方案中，所述癌症是肾癌，诸如作为非限制性实例，肾细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是皮肤癌，诸如作为非限制性实例，鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤。

在样品是或衍生自遭受骨疾病或癌症转移（不论原发肿瘤起源）、处于遭受骨疾病或癌症转移（不论原发肿瘤起源）的风险中或者疑似遭受骨疾病或癌症转移（不论原发肿瘤起源）的患者的情况下，对Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。

在样品是或衍生自遭受纤维化疾病、处于遭受纤维化疾病的风险中或者疑似遭受纤维化疾病的患者的情况下，对Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是肾、肝、肺和皮肤的纤维化疾病。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是纤维化病症，诸如特发性肺纤维化(IPF)。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是肾纤维化疾病。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是肝纤维化疾病。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是腹膜透析诱导的纤维化。在某些实施方案中，所述纤维化疾病是硬皮病。

在样品是或衍生自遭受听力损失、处于遭受听力损失的风险中或者疑似遭受听力损失的患者的情况下，对Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。

在样品是或衍生自遭受癌症、处于遭受癌症的风险中或者疑似遭受癌症的患者的情况下，对白介素6受体(IL-6R)特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，包括、但不限于，三重阴性乳腺癌(TNBC)。在某些实施方案中，所述癌症是卡斯尔曼病。在某些实施方案中，所述癌症是肝细胞癌。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。

在样品是或衍生自遭受炎症和/或炎症性病症、处于遭受炎症和/或炎症性病症的风险中或者疑似遭受炎症和/或炎症性病症的患者的情况下，对IL-6R特异性的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用在方法和/或试剂盒中。在某些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫疾病。

应当理解，根据本发明的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的应用将与合适的载体、赋形剂和其它试剂（其被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等）一起施用。可以在所有药物化学家已知的处方中发现大量的许多适当的制剂：Remington'sPharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA(1975))，特别是其中Blaug、Seymour的第87章。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡状物、油、脂质、含脂质(阳离子的或阴离子的)的囊泡(诸如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。任何前述混合物在根据本发明的治疗、疗法和/或诊断中可以是适当的，条件是，制剂中的活性成分不被制剂灭活，并且所述制剂是与施用途径生理上相容的和可耐受的。关于药物化学家众所周知的与制剂、赋形剂和载体有关的其它信息，

使用本发明的制剂（其包括缀合的可活化抗体）诊断、分期或以其它方式分析与靶标的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。例如，使用本发明的制剂检测或以其它方式分析癌症或其它肿瘤病症。

在某些实施方案中，使用所述制剂检测或以其它方式分析与EGFR的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。在某些实施方案中，使用所述制剂检测或以其它方式分析与Jagged靶标（例如，Jagged 1和/或Jagged 2）的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。在某些实施方案中，使用所述制剂检测或以其它方式分析与IL-6R的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。

结合任何已知的用于诊断或治疗与异常靶标表达和/或活性有关的疾病或病症的方法，确定诊断、分期和/或其它分析。

可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以以组合物（包括药物组合物）的形式用在本公开内容的方法和/或试剂盒中。在这样的组合物的制备中涉及的原理和考虑因素，以及组分的选择的指导，提供在例如以下文献中：Remington : The Science And Practice OfPharmacy第19版(Alfonso R. Gennaro, 等人, 编) Mack Pub. Co., Easton, Pa.:1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, AndTrends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；和Peptide AndProtein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, 第4卷), 1991, M.Dekker, New York。

可活化抗体片段的一个实施方案是特异性地结合靶蛋白的结合结构域的最小片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列的能力的肽分子。可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生这样的肽。(

活性成分也可以包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)中或在大乳剂中。

要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过穿过无菌过滤膜过滤容易地实现。

在某些实施方案中，所述可活化抗体含有可检测标记。使用完整抗体或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)

可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可用于检测患者样品中的靶标，且因此可用作诊断剂。例如，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用在体外测定（例如，ELISA）中，以检测患者样品中的靶标水平。在某些实施方案中，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用在原位测定（例如，如在本文中公开的原位成像）中，以检测患者样品（例如，组织）中的靶标水平。在某些实施方案中，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用在先体外后体内测定（诸如本文中公开的那些）中，以检测患者或患者样品（例如，器官或组织）中的靶标水平。在某些实施方案中，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用在体内测定（例如，如在本文中公开的体内成像）中，以检测患者中的靶标水平。在这些实施方案中的任一个中，所述靶标是例如得自表1中列出的那些的靶标或它们的任意组合。

在一个实施方案中，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体固定化在固体支持物(例如，微孔滴定板的孔)上。固定化的可活化抗体和/或固定化的缀合的可活化抗体充当可能存在于试验样品中的任何靶标的捕获抗体。在将固定化的抗体与患者样品接触之前，将所述固体支持物冲洗并用阻滞剂（诸如乳蛋白或白蛋白）处理以防止分析物的非特异性吸附。

随后，将孔用疑似含有抗原的试验样品或用含有标准量的抗原的溶液处理。这样的样品是，例如，得自疑似具有被认为是病理学诊断的循环抗原水平的受试者的血清样品。冲洗掉试验样品或标准品以后，将固体支持物用可检测地标记的第二抗体处理。所述标记的第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与得自标准样品的标准曲线进行对比来确定试验样品中的靶标的浓度。

应当理解，基于使用可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在体外诊断测定中得到的结果，可能基于靶标的表达水平而将受试者的疾病分期。对于给定的疾病，从被诊断为处于疾病进展的不同阶段和/或处于疾病的治疗性处理的不同点的受试者获取生物样品。使用为进展或治疗的每个阶段提供统计学显著结果的样品群体，指定可以考虑为每个阶段的特征的抗原浓度范围。

可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可以用在诊断和/或成像方法中。在某些实施方案中，这样的方法是体外方法。在某些实施方案中，这样的方法是体内方法。在某些实施方案中，这样的方法是原位方法。在某些实施方案中，这样的方法是先体外后体内方法。例如，具有酶促地可切割的CM的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以用于检测能够切割CM的酶的存在或不存在。这样的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以用在诊断中，所述诊断可以包括通过测量的活化的抗体(

例如，可以将CM选择为在肿瘤部位、在病毒或细菌感染部位、在生物学上限定的部位(例如，诸如在脓肿中、在器官中等)等发现的蛋白酶的蛋白酶底物。所述AB可以是结合靶抗原的AB。使用本领域技术人员熟知的方法，可以将可检测标记(例如，荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的AB或其它区域。在以上筛选方法的上下文中讨论了合适的可检测标记，且在下面提供了其它具体实例。使用对疾病状态的蛋白或肽特异性的AB、以及其活性在目标疾病组织中升高的蛋白酶，与其中CM特异性的酶不以可检测水平存在或者以比在疾病组织中更低的水平存在或者无活性(例如，以酶原形式或与抑制剂形成复合物)的组织相比，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体将表现出增加的结合疾病组织的速率。由于小蛋白和肽通过肾过滤系统迅速地从血液清除，且因为对CM特异性的酶不以可检测水平存在(或以更低的水平在非疾病组织中存在，或以无活性构象存在)，活化的抗体在疾病组织中的积累与非疾病组织相比增强。

在另一个实施例中，可以使用可活化抗体和/或缀合的可活化抗体检测切割试剂在样品中的存在或不存在。例如，其中可活化抗体和/或缀合的可活化抗体含有易于被酶切割的CM，可以使用可活化抗体和/或缀合的可活化抗体检测(定性地或定量地)酶在样品中的存在。在另一个实施例中，其中可活化抗体和/或缀合的可活化抗体含有易于被还原剂切割的CM，可以使用可活化抗体和/或缀合的可活化抗体检测(定性地或定量地)还原条件在样品中的存在。为了促进在这些方法中的分析，可以将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可检测地标记，且可以结合至支持物(例如，固体支持物，诸如载玻片或珠子)。可以将可检测标记定位在可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的在切割后不释放的部分上，例如，所述可检测标记可以是淬灭的荧光标记或在切割已经发生之前不可检测的其它标记。可以进行测定，例如，通过使固定化的、可检测地标记的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与疑似含有酶和/或还原剂的样品接触足以使切割发生的时间，然后洗涤以除去多余的样品和污染物。然后通过在与样品接触之前可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的可检测信号的变化，例如，由于样品中的切割试剂对可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的切割引起的可检测信号的存在和/或增加，评估切割试剂(例如，酶或还原剂)在样品中的存在或不存在。

可以改进这样的检测方法也提供靶标的存在或不存在的检测，所述靶标能够结合可活化抗体的AB（当被切割时）。因而，可以改进测定以评估切割试剂的存在或不存在以及目标靶标的存在或不存在。通过如上所述的可活化抗体的可检测标记的存在和/或增加，可以检测切割试剂的存在或不存在，且通过检测靶标-AB复合物（例如，通过使用可检测地标记的抗-靶标抗体），可以检测靶标的存在或不存在。

可活化抗体和/或缀合的可活化抗体也可用在原位成像中用于验证可活化抗体活化，例如，通过蛋白酶切割，和与特定靶标的结合。原位成像是能够定位生物样品（诸如细胞培养物或组织切片）中的蛋白水解活性和靶标的技术。使用该技术，可能基于可检测标记(例如，荧光标记)的存在而证实与给定靶标的结合和蛋白水解活性。

这些技术可以与从疾病部位(

在这些技术中，用可检测标记标记可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。所述可检测标记可以是荧光染料(

在某些实施方案中，所述可检测标记是生物发光标记。所述生物发光标记经由可释放的接头缀合至所述可活化抗体。在某些实施方案中，所述可释放的接头是可切割的接头。在某些实施方案中，所述可释放的接头是不可切割的接头。合适的可切割的接头包括本文描述的任何可切割接头和本领域技术人员已知的其它接头。合适的不可切割的接头包括本文描述的任何可切割接头和本领域技术人员已知的其它接头。在某些实施方案中，所述可释放的接头是二硫键。

在某些实施方案中，所述可检测标记是D-萤光素底物。D-萤光素在由萤光素酶催化的、ATP依赖性的生物发光反应中充当底物。因而，D-萤光素可以缀合至可活化抗体，且在可活化抗体的活化、与受体结合和内化以后排它地产生生物发光。因而，缀合的可活化抗体的这些实施方案不需要使用猝灭剂分子。

D-萤光素经由可释放的接头缀合至可活化抗体。在某些实施方案中，所述可释放的接头是可切割的接头。合适的可切割的接头包括本文描述的任何可切割的接头。在某些实施方案中，所述可释放的接头是二硫键。

在某些实施方案中，所述可检测标记是萤光素酶。因而，在注射D-萤光素底物后会发生反应。该方案是有利的，因为它不需要内源性萤光素酶的存在。此外，该反应会导致更强的信号——萤光素酶可以活化数百个D-萤光素分子，而一个D-萤光素分子将仅导致一个反应。

萤光素酶经由可释放的接头缀合至可活化抗体和/或缀合的可活化抗体。在某些实施方案中，所述可释放的接头是可切割的接头。合适的可切割的接头包括本文描述的任何可切割的接头。在某些实施方案中，所述可释放的接头是二硫键。

已经与标记的可活化抗体一起温育的样品中标记的检测指示，样品含有靶标，且含有对可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的CM特异性的蛋白酶。在某些实施方案中，可以如下证实蛋白酶的存在：使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那些，和/或通过使用对蛋白酶特异性的试剂，例如，抗体诸如A11，其对于蛋白酶matriptase (MT-SP1)是特异性的并且抑制MT-SP1的蛋白水解活性；参见例如，2010年11月11日公布的国际公开号WO 2010/129609。使用广谱蛋白酶抑制剂（诸如本文描述的那些）和/或通过使用更高选择性的抑制剂的相同方案，可以用于鉴别对可活化抗体的CM特异性的一种蛋白酶或一类蛋白酶。在某些实施方案中，可以使用对靶标特异性的试剂（例如，另一种抗体）证实靶标的存在，或者可检测标记可以与未标记的靶标竞争。在某些实施方案中，可以使用未标记的可活化抗体，用标记的第二抗体或更复杂的检测系统进行检测。

在其中缀合的可活化抗体包括生物发光标记的实施方案中，这些缀合的可活化抗体可用于监测缀合的可活化抗体的活化的体内方法中。这些体内成像方法的一个示例性实施方案显示在图15中。在这些方法中，可活化抗体经由可释放的（例如，可切割的）接头与一种或多种成像试剂缀合。在缀合的可活化抗体的活化、受体结合和内化以后，释放成像试剂。在进入以后释放的每个显像剂分子产生可以测量的信号，从而允许在体内实时定量可活化抗体活化。因而，成像试剂-缀合的可活化抗体可用作可活化抗体向活化部位的靶向递送的标志物。

在某些实施方案中，与可活化抗体缀合的成像试剂是D-萤光素。在这些方法中，可活化抗体经由可释放的（例如，可切割的）接头与D-萤光素底物缀合，并暴露于用萤光素酶稳定转染的细胞。例如，将D-萤光素-缀合的可活化抗体施用给萤光素酶转基因小鼠或已经接种了萤光素酶转染的细胞系的异种移植物小鼠模型。在缀合的可活化抗体的活化、受体结合和内化以后，释放D-萤光素。在进入以后释放的每个游离萤光素分子产生可以测量的光子，从而允许在体内实时定量可活化抗体活化。因而，D-萤光素-缀合的可活化抗体可用作可活化抗体向活化部位的靶向递送的标志物。

类似的技术也可用于体内成像，其中受试者(例如，哺乳动物，包括人)中的荧光信号的检测指示，所述疾病部位含有靶标，且含有对可活化抗体的CM特异性的蛋白酶。这样的技术的一个实例显示在实施例9和图13A和13B中。

基于可活化抗体中的蛋白酶特异性的CM，这些技术还可以用在试剂盒中和/或用作试剂，用于检测、鉴别或表征多种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。

在某些实施方案中，原位成像和/或体内成像可用在鉴别哪个患者要治疗的方法中。例如，在原位成像中，使用可活化抗体筛选患者样品以鉴别在适当的位置（例如，在肿瘤部位）具有适当的蛋白酶和靶标的那些患者。

在某些实施方案中，使用原位成像来鉴别或以其它方式细化适合于用本公开内容的可活化抗体治疗的患者群体。例如，将靶标和蛋白酶试验阳性的患者(例如，在疾病部位积累活化的抗体)鉴别为用包含这样的CM的这样的可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在要试验的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物。同样地，可能将靶标和蛋白酶中的任一种或两种试验阴性的患者鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人，所述蛋白酶在使用这些方法试验的可活化抗体中的CM中切割底物。在某些实施方案中，可以用包含不同CM的其它可活化抗体试验就第一种可活化抗体而言试验阴性的这样的患者，直到鉴别出适合用于治疗的可活化抗体(例如，包含CM的可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。

在某些实施方案中，使用体内成像来鉴别或以其它方式细化适合于用本公开内容的可活化抗体治疗的患者群体。例如，将靶标和蛋白酶试验阳性的患者(例如，在疾病部位积累活化的抗体)鉴别为用包含这样的CM的这样的可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在要试验的可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物。同样地，可能将试验阴性的患者鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人。在某些实施方案中，可以用包含不同CM的其它可活化抗体试验就第一种可活化抗体而言试验阴性的这样的患者，直到鉴别出适合用于治疗的可活化抗体(例如，包含CM的可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。

在某些实施方案中，使用体内成像来监测缀合的可活化抗体的活化。例如，使用磁共振成像(MRI)在体内监测缀合的可活化抗体的活化。

磁共振成像(MRI)是能够基于不同的弛豫时间而区分组织的诊断方法。造影剂会改变弛豫时间，且被用于增强与患者解剖学和生理学有关的性质的可视化。使用两类MR造影剂来增强与患者解剖学和生理学有关的性质的可视化：T1造影剂，其会缩短附近质子的自旋-晶格弛豫时间，和T2造影剂，其会增强自旋-自旋弛豫以减小含有介质的结构的信号。

目前，最杰出的T2造影剂是基于超顺磁的氧化铁(SPIO)纳米颗粒，其与T1造影剂不同，在血管内保留更长的时间，从而实现更长的图像获取时间窗。此外，SPIO纳米颗粒在临床实践中已经被广泛地用于MRI用于诊断应用(例如，Feridex IV™和Endorem™)。

已知的是，纳米颗粒的对比增强依赖于它们的大小、表面性质和聚集程度。值得注意的是，用纳米颗粒形成的簇的较大流体动力学直径对T2弛豫率的增强，是超顺磁纳米颗粒的特有特征(参见

此外，该原理可以用于开发基于SPIO的MRI传感器，其充当磁弛豫开关以检测在分散的磁性颗粒可逆自装配成稳定的纳米集合部件从而产生显著的T2对比变化中的分子相互作用(Perez等人, 2002 Magnetic relaxation switches capable of sensingmolecular interactions. Nat. Biotechnol. 20, 816-820; Atanasijevic等人,“Calcium-sensitive MRI contrast agents based on superparamagnetic iron oxidenanoparticles and calmodulin.”Proc Natl Acad Sci U S A. 103.40(2006):14707-12; Zhao M, Josephson L, Tang Y, Weissleder R. Magnetic sensors for proteaseassays. Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(12):1375-8)。类似地，Atanasijevic等人已经开发了基于钙依赖性的蛋白-蛋白相互作用的、用于体内功能性MRI研究的钙指示剂家族(Atanasijevic等人, 2006)。在Zhao等人的工作中使用相反方案，其中开发的测定采用蛋白酶可切割的底物，其在每个末端上侧接生物素化的残基，所述残基与抗生物素蛋白-磁性纳米颗粒相互作用，由此诱导具有高T2弛豫率的簇集状态(Zhao等人, 2003)。因而，在有蛋白酶存在下，底物序列将在两个生物素之间被切割，从而产生单生物素化的片段，所述片段与抗生物素蛋白-磁性纳米颗粒相互作用，而不诱导聚集。

因而，在某些实施方案中，体内磁共振(MR)成像方法采用所述簇的流体动力学直径增加以后SPIO纳米颗粒的T2弛豫率的增强效应。这些体内MR成像方法的一个示例性实施方案显示在图17中。在这些方法中，如在图17中所示，将可活化抗体的掩蔽部分(MM)生物素化，以产生具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体，其在本文中也被称作基于缀合的可活化抗体的磁性传感器。然后将具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体施用进受试者中，也将抗生物素蛋白包被的磁性纳米颗粒和/或抗生蛋白链菌素包被的磁性纳米颗粒在MR成像之前的时间注射进受试者中。在某些实施方案中，用抗-生物素包被磁性纳米颗粒，所述抗-生物素可以被标记。在某些实施方案中，同时施用具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体和包被的磁性纳米颗粒。例如，可以将具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体和包被的磁性纳米颗粒配制在单一组合物中或作为两种或更多种单独的组合物施用。在某些实施方案中，依次施用具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体和包被的磁性纳米颗粒。

在这些体内MR成像方法中，施用具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体以后立即的MR成像会提供高MR对比图像(高弛豫率)，其在具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体活化后下降，这会导致低MRI对比。因而，这些体内MR成像方法提供了用于在体内监测具有生物素化的MM的缀合的可活化抗体的活化的非侵袭性方式。

在某些实施方案中，将缀合的可活化抗体用在体内监测缀合的可活化抗体的多种特征（例如，作为非限制性实例，缀合的可活化抗体的分布、积累和/或活化）的方法中。这些方法的几个示例性实施方案显示在图18中。

在图18所示的实施方案中，使用针对可活化抗体和/或针对可活化抗体的某个部分的抗体，例如，结合抗体或其抗原结合片段(AB)的抗体、结合掩蔽部分(MM)的抗体、和/或结合可切割部分(CM)的抗体，可以检测“经标记的”可活化抗体，其在本文中也被称作缀合的可活化抗体。

在图18所示的实施方案中，经标记的可活化抗体是用显像剂（例如，荧光标志物、近红外(NIR)标记、PET/SPECT示踪剂、MRI造影剂）标记或缀合的可活化抗体，且这样，使用对应的仪器或其它本领域公知的检测装置，可以检测经标记的可活化抗体。在某些实施方案中，将可活化抗体或其某个部分（例如，MM、CM、AB和/或它们的组合）生物素化，这将允许从生物样品捕获经标记的可活化抗体。在某些实施方案中，将生物素化的可活化抗体用作含有抗生物素蛋白和/或抗生蛋白链菌素的标记，用于检测方法诸如组织学染色或蛋白质印迹中。

在某些实施方案中，所述可活化抗体是包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的半可活化抗体构建体，其中所述第一抗原结合结构域没有被掩蔽，且所述第二抗原结合结构域被掩蔽且含有标记的接头，如在图19中所示。为了促进有效的异源二聚体形成，将掩蔽肽和其它部分（包括接头、探针、可检测标记诸如此类）与重链融合。所述半可活化抗体可用在验证可活化抗体的活化和证实活化的抗体与生物样品中的靶标的结合的方法中。这样的方法在本文中被称作“反向”原位成像技术，其中标准的（即

本文中提供的反向原位成像方法能够通过检测标记的接头切割来表征相同组织切片上的蛋白酶和靶标表达。这样，半可活化抗体的未被掩蔽的抗体臂将结合组织受体，从而将半可活化抗体构建体锚定至所述组织。在底物切割的情况下，接头将掩蔽抗原结合位点和/或标记将从抗原结合位点解离，从而导致标记(

使用本文提供的或本领域中以其它方式已知的任何方法，可以制备半可活化抗体。

在某些实施方案中，这些反向原位成像方法包括下述步骤中的一个或多个。首先，将冷冻切片覆盖在载玻片上。将含有半可活化抗体（其具有经标记的可活化抗体接头(

另外，可以改造这些方法用于与细胞培养物或新鲜组织温育一起使用。可替换地，这些方法可以在有选择性蛋白酶抑制剂存在下进行。例如，可以进行活化可活化抗体的蛋白酶的鉴别。后一种方法修改将能够原位表征不同底物序列的特异性和选择性。

这些方法提供了许多优点，作为非限制性实例，包括检测亲本抗体结合和相同组织样品/切片中的可活化抗体的活化的能力，这可以改善可活化抗体的活化的定量。

将在下述实施例中进一步描述本发明，所述实施例不会限制在权利要求书中描述的发明的范围。

实施例

实施例1. 可活化抗体原位成像的开发和表征

本文中提供的实施例使用抗-EGFR可活化抗体，在本文中被称作可活化抗体3954-1204-C225v5 (在本文中也被称作3954-1204-C225v5可活化抗体或3954-1204-C225v5)，其包括EGFR结合序列、掩蔽部分(MM)和为蛋白酶底物的可切割部分(CM)。这些实施例还使用被掩蔽的抗-EGFR抗体构建体，在本文中被称作被掩蔽的抗体3954-NSUB-C225v5 (在本文中也被称作3954-NSUB-C225v5被掩蔽的抗体或3954-NSUB-C225v5)，其包括位于MM和EGFR结合序列之间的不可切割部分。应当理解，尽管本文中提供的实施例使用这些抗-EGFR可活化抗体构建体，这些方法可应用于任何可活化抗体。

[间隔物(SEQ ID NO: 5)][

[间隔物(SEQ ID NO: 11)][

3954-NSUB-C225v5掩蔽的抗-EGFR抗体构建体包括与上述的3954-1204-C225v5可活化的抗-EGFR抗体相同的重链。3954-NSUB-C225v5掩蔽的抗-EGFR抗体构建体包括下述轻链序列：

[间隔物(SEQ ID NO: 5)][

[间隔物(SEQ ID NO: 11)][

在3954-1204-c225v5可活化的抗-EGFR抗体中使用的可切割部分(CM)可以被两种已知在多种人癌中增量调节的丝氨酸蛋白酶切割：尿激酶-型纤溶酶原激活物(uPA)和膜型丝氨酸蛋白酶1 (MT-SP1/matriptase)；该CM还可以被豆荚蛋白切割。3954-NSUB-c225v5掩蔽的抗-EGFR抗体用作阴性对照，因为它含有不可切割的底物序列从而产生蛋白酶抗性的可活化抗体。

可活化抗体在被选定的蛋白酶活化以后排它地结合靶细胞受体的独特特征会导致新颖的和有效的技术的建立，该技术能够检测生物系统中的蛋白酶活性，在本文中被称作可活化抗体的原位成像。该技术是基于可以选择性地积累在蛋白酶活性部位处的经标记的可活化抗体的应用。开发了一种简单方案以将该技术应用于使不同组织切片中的蛋白酶活性成像的方法中。该方案包括3个主要步骤：(1)将冷冻的(或新鲜的)组织切片放在载玻片上，并用PBS简短地冲洗；(2)将含有经标记的可活化抗体(例如，用荧光染料Alexa Fluor®680)的溶液在组织切片上在暗处温育；和(3)将组织样品用PBS或其它合适的缓冲液充分洗涤，并通过荧光显微术使活化的(

实施例2. H292异种移植肿瘤组织中的蛋白酶活性的表征

EGFR在H292人非小细胞肺癌细胞中高度表达，且已经通过多个研究确定了西妥昔单抗在该异种移植肿瘤模型中的效力(

实施例3. 使用可活化抗体原位成像筛选患者肿瘤样品

在上面实施例2所述的技术中使用冷冻的结直肠癌患者肿瘤样品，以评价可活化抗体原位成像用于验证人组织上的蛋白酶活性的适用性。首先，进行关于3954-1204-c225v5原位成像和EGFR免疫组织化学(IHC)的双重染色以证实荧光信号的共定位(图3)。此外，用广谱蛋白酶抑制剂(PI)对肿瘤组织的预处理完全消除了3954-1204-c225v5的结合(图3)，从而指示3954-1204-c225v5活化所需的蛋白酶活性的成功抑制。

接着，研究了不同肿瘤组织之间的蛋白酶活性的异质性。这些研究用能够被uPA(3954-1204-C225v5)和MMP-14 (3954-LS9-C225v5)活化的可活化抗体筛选了2种三重阴性乳腺癌(TNBC)患者肿瘤样品。值得注意的是，如在图4中所示，然而在含有被uPA、Mt-SP1和豆荚蛋白切割的底物的样品中检测到有差别的3954-1204-C225v5活化速率，证实了两种肿瘤组织的高MMP活性水平。关于人三重阴性乳腺癌患者的组织样品的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力的结果总结在表7中。

表7. 人三重阴性乳腺癌患者的肿瘤组织中的3954-1204-C225v5和3954-LS9- C225v5可活化抗体的原位成像.

*将西妥昔单抗染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：

-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

** 将蛋白酶活性定量为相对于西妥昔单抗染色的可活化抗体染色强度的百分比。

这样的原位成像技术能够检测生物样品（诸如细胞培养物或组织切片）中的蛋白水解活性。使用该技术，可能基于可检测标记(例如，荧光标记)的存在而定量蛋白水解活性。这些技术可与从疾病部位(

实施例4. 抗-EGFR可活化抗体的原位成像

本实施例描述了本公开内容的抗-EGFR可活化抗体的活化和结合的原位成像的应用。结果指示，本公开内容的抗-EGFR可活化抗体可以被组织表达的蛋白酶活化并结合该组织上的EGFR靶标。

可活化抗体的原位成像代表表征细胞和组织中的蛋白酶活性的独特方案。该技术能够验证在表达能够切割可活化抗体的蛋白酶的细胞和组织的组织切片中的可活化抗体的活化和与靶标的结合。这样的原位方案的示意图显示在图1中。

通过能够在与活化的抗体所识别的靶标共定位的部位切割可活化抗体的细胞或组织对抗-EGFR可活化抗体的活化和结合的原位成像(在本文中也被称作原位成像)如下进行：将冷冻的组织切片放置在载玻片上。将含有标记的抗-EGFR可活化抗体（例如，用荧光标签标记）的溶液施加于组织上，并在50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4的温育缓冲液中在室温(约22-24℃)温育例如1小时，所述温育缓冲液含有150 mM NaCl、100µM ZnCl

图6证实，3954-1204-C225v5在广泛的人肿瘤样品中是可活化的。第2列指示多种人癌症组织样品的EGFR受体的表达水平，如通过EGFR抗体（单克隆兔抗-EGFR抗体，CellSignaling）所检测的。第3列指示多种人癌症组织样品中的活性matriptase (MT-SP1)的量，如通过抗体A11所检测的。第4和5列代表EGFR可活化抗体（第5列）相比于西妥昔单抗(Cetux)组织染色（第4列）的原位活化和结合的评价。将测量结合组织样品的EGFR、A11和西妥昔单抗抗体的量的染色评分为-至3+：-，无染色；1+ (

这些数据提示原位成像在有效地和高效地鉴别或以其它方式细分适合于用本公开内容的抗-EGFR可活化抗体（诸如可活化抗体3954-1204-C225v5）治疗的患者群体的方法中的实用性。例如，使用这些原位成像技术对于靶标(例如，EGFR)和蛋白酶(例如，MT-SP1)而言试验阳性的患者可以被鉴别为用试验的抗-EGFR可活化抗体治疗的合适候选人，所述蛋白酶在抗-EGFR可活化抗体的可切割部分(CM)中切割底物。同样地，使用这些原位成像技术对于靶标(例如，EGFR)和蛋白酶(例如，MT-SP1)中的任一种或两种而言试验阴性的患者可以被鉴别为另一种形式的治疗的合适候选人，所述蛋白酶在CM中切割底物。在某些实施方案中，可以用其它抗-EGFR可活化抗体试验这样的患者，直到鉴别出治疗的合适抗-EGFR可活化抗体(例如，包含CM的抗-EGFR可活化抗体，所述CM在疾病部位处被患者切割)。

实施例5. 抗-EGFR可活化抗体的原位成像

本实施例描述了关于抗-EGFR可活化抗体的活化和结合，原位成像方案用于筛选患者的组织样品的用途。结果指示，本公开内容的抗-EGFR可活化抗体可以被癌症患者的组织表达的蛋白酶活化并结合该组织上的EGFR受体。

通过用标记的EGFR和A11抗体（分别在1 μg/ml和5 μg/ml浓度）处理冷冻的组织1小时，关于EGFR和MT-SP1表达来概述Cooperative Human Tissue Network（其由美国国立癌症研究所资助）提供的人结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和肝转移组织样品(图7和表8-11)。此外，使用原位成像来评价抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225V5的被活化和结合人肿瘤或肝转移组织的能力(图7和表8-11)。如上所述用Alexa Fluor®680 (Invitrogen)标记可活化抗体。根据本文描述的原位成像方案，将得到的可活化抗体3954-1204-C225V5-AF680 (也被称作1204-C225v5或1204-C225)与冷冻的患者组织样品一起温育。图8图示了结直肠癌肝转移组织的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力。图12图示了结直肠癌和NSCLC组织的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力。关于癌症患者的组织样品的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力的结果总结在表8-11中。将测量与组织样品结合的EGFR和A11抗体的量的IHC染色从-至3+进行评分：-，无染色；1+ (

表8. 针对EGFR和MT-SP1表达的筛选以及人结直肠癌患者肿瘤组织中的3954-1204-C225可活化抗体的原位成像.

*将IHC染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：

-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

**原位成像染色评分是基于与亲本抗体染色的对比：-，无染色；1+，与亲本抗体相比弱染色；2+，与亲本抗体相比中等染色；和3+，与亲本抗体类似的染色。

表9. 针对EGFR和MT-SP1表达的筛选以及人结直肠癌肝转移组织中的3954-1204-C225可活化抗体的原位成像.

*将IHC染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：

-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

**原位成像染色评分是基于与亲本抗体染色的对比：-，无染色；1+，与亲本抗体相比弱染色；2+，与亲本抗体相比中等染色；和3+，与亲本抗体类似的染色。

表10. 针对EGFR和MT-SP1表达的筛选以及人NSCLC患者组织中的3954-1204-C225可活化抗体的原位成像.

*将IHC染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

**原位成像染色评分是基于与亲本抗体染色的对比：-，无染色；1+，与亲本抗体相比弱染色；2+，与亲本抗体相比中等染色；和3+，与亲本抗体类似的染色。

表11. 针对EGFR和MT-SP1表达的筛选以及人结直肠癌患者的肿瘤组织中的3954- 1204-C225可活化抗体的原位成像.

将西妥昔单抗染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

**PB1染色评分是基于与亲本抗体(西妥昔单抗)染色的对比：-，无染色；1+，与亲本抗体相比弱染色；2+，与亲本抗体相比中等染色；和3+，与亲本抗体类似的染色。

实施例6. 抗-EGFR可活化抗体的原位成像的定量

本实施例描述了与抗-EGFR抗体IHC和A11抗体IHC组合的、抗-EGFR可活化抗体的活化和对先体外后体内生物组织结合的原位成像。商购可得的抗-EGFR抗体IHC的应用允许将亲本抗体(

与EGFR IHC组合进行的、细胞或组织对抗-EGFR可活化抗体的切割的原位成像的定量如下进行：将冷冻的组织切片放置在玻璃载玻片上并在PBS中、然后在PBS-T中冲洗。将含有标记的抗-EGFR可活化抗体（例如，用荧光标签标记）的溶液施加在组织上，并在50 mMTris-HCl缓冲液pH 7.4的温育缓冲液中在室温温育例如1小时，所述温育缓冲液含有150mM NaCl、100µM ZnCl

其中PbA =抗-EGFR可活化抗体相比于亲本抗体(

针对EGFR和MT-SP1表达来概述人食管和胰腺癌组织样品；使用原位成像评价抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5被活化并结合人肿瘤的能力。如上所述，用Alexa Fluor®680 (Invitrogen)标记可活化抗体。根据本文所述的原位成像方案，将得到的可活化抗体3954-1204-C225v5-AF680与冷冻的患者组织样品一起温育。此外，通过分别以1 μg/ml和5 μg/ml浓度处理冷冻组织1小时，使用EGFR和Alexa Fluor®750标记的A11抗体。图9图示了食管癌组织的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力。关于食管和胰腺癌患者的组织样品的活化和结合抗-EGFR可活化抗体的能力的结果总结在表12中。将测量结合组织样品的西妥昔单抗、EGFR和A11抗体的量的IHC染色从-至3+评分：-，无染色；1+ (

表12. 针对EGFR和MT-SP1表达的筛选以及人食管和胰腺癌患者肿瘤组织中的3954-1204-C225可活化抗体的原位成像.

*将IHC和西妥昔单抗染色从-至3+评分，其测量抗体结合的量：-，无染色；1+，弱染色；2+，中等染色；和3+，强染色。

** 3954-1204-C225原位成像评分是基于与标准化为EGFR IHC染色的亲本抗体染色的对比，且被鉴别为活化的百分比：-，无活化；100%活化，导致与亲本抗体染色类似的染色。

图9的一系列图像显示了原位成像的三重染色：EGFR IHC和A11 IHC。图像的上行证实了在原位成像条件下在单个组织切片上进行的染色，证实了（左到右）：EGFR表达、matriptase (MT-SP1)的活性和西妥昔单抗的结合。图像的下行证实了在单个组织切片上进行的染色，证实了（左到右）：EGFR表达、matriptase (MT-SP1)的活性和抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5 (1204)的原位成像。图9中图像的右列对比了在原位成像条件下西妥昔单抗的结合（上图像）和通过组织衍生的蛋白水解性裂解活化的抗-EGFR可活化抗体的结合（下图像）。如图9图像左列所示，通过将商购可得的抗-EGFR抗体暴露于组织，检测组织染色的相同模式。图9图像的中列证实了matriptase (MT-SP1)活性与EGFR表达的共定位。本文中使用的术语“共定位”并不旨在暗示EGFR和/或A11染色的任何重叠或其它重叠，并且术语“共定位”用来指示MT-SP1活性在表达EGFR的患者组织中的存在。总体而言，这些数据证实了人食管癌组织样品对抗-EGFR抗体3954-1204-C255v5的约90%活化。

实施例7 . 抗-Jagged可活化抗体的原位成像

本实施例描述了本公开内容的抗-Jagged可活化抗体的活化和结合的原位成像的应用。

这里提供的实施例使用抗-Jagged可活化抗体，在本文中被称作可活化抗体5342-1204-4D11 (在本文中也被称作5342-1204-4D11可活化抗体或5342-1204-4D11)，其包括特异性地结合Jagged 1和Jagged 2二者的抗体或其抗原结合片段(AB)、掩蔽部分(MM)和为蛋白酶底物的可切割部分(CM)。这里提供的实施例使用抗-Jagged可活化抗体，在本文中被称作可活化抗体5342-PLGL-4D11 (在本文中也被称作5342-PLGL-4D11可活化抗体或5342-PLGL-4D11)，其包括特异性地结合Jagged 1和Jagged 2二者的抗体或其抗原结合片段(AB)、掩蔽部分(MM)和为蛋白酶底物的可切割部分(CM)，其包括序列PLGL。这里提供的实施例使用抗-Jagged抗体，在本文中被称作4D11，其包括特异性地结合Jagged 1和Jagged 2二者的抗体或其抗原结合片段(AB)。应当理解，尽管这里提供的实施例使用这些抗-Jagged可活化抗体构建体，但这些方法适用于任何可活化抗体。

抗-Jagged抗体构建体和抗-Jagged可活化抗体构建体:

4D11抗-Jagged抗体包括下述重链和轻链序列：

5342-1204-4D11可活化的抗-Jagged抗体构建体包括上面在SEQ ID NO: 28中所示的4D11抗体的重链序列和下述轻链序列：

5342-PLGL-4D11可活化的抗-Jagged抗体构建体包括上面所示的4D11抗体的重链序列和下述轻链序列：

可活化抗体的原位成像代表表征细胞和组织中的蛋白酶活性的独特方案。该技术能够验证表达蛋白酶的细胞和组织的组织切片中的可活化抗体活化和向靶标的结合，所述蛋白酶能够切割所述可活化抗体。这样的原位方案的示意图显示在图1中。

通过能够在与活化的抗体所识别的靶标共定位的部位切割可活化抗体的细胞或组织对抗-Jagged可活化抗体的活化和结合的原位成像(在本文中也被称作原位成像)如下进行：将冷冻的组织切片放置在载玻片上。将含有标记的抗-Jagged可活化抗体（例如，用荧光标签标记）的溶液施加于组织上，并在50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4的温育缓冲液中在室温(约22-24℃)温育例如1小时，所述温育缓冲液含有150 mM NaCl、100 μM ZnCl

使用原位成像评价了抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11和5342-PLGL-4D11的被活化和结合BxPC3异种移植肿瘤组织的能力。将可活化抗体用Alexa Fluor

还通过人胰腺癌组织的原位成像评价了抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11和5342-PLGL-4D11的活化。将4D11-AF680 4D11)、1204-4D11-AF680 (1204)和PLGL-4D11-AF680 (PLGL)中的每一种与冷冻的组织样品一起温育，所述组织样品分离自具有胰腺癌的人患者。结果分别显示在图11的第1列第1、2和3行的图中。第2、3和4列中的图分别代表4D11-AF680、1204-4D11-AF680和PLGL-4D11-AF680与冷冻的胰腺癌患者组织一起温育以后得到的荧光图像，所述组织经过用10µg/ml抗体A11 (A11是特异性地结合MT-SP1蛋白酶（也被称作matriptase）的活性部位的抗体) (图11、第2列)、用50µM广谱MMP抑制剂Galardin(Calbiochem, Millipore) (图11、第3列)或用广谱蛋白酶抑制剂混合液集合III (目录号539134, EMD Millipore)和50 μM Galardin的1:100稀释液(图11、第4列)预处理。蓝色染色代表DAPI核染色。结果提示，胰腺组织样品产生有活性的matriptase和金属蛋白酶，其存在实现各种可活化抗体可切割部分的切割，由此释放掩蔽部分和实现活化的抗体与组织上的Jagged靶标的稳定结合。

实施例8. 抗-Jagged可活化抗体的原位成像

本实施例描述了原位成像用于针对抗-Jagged可活化抗体的活化和结合而筛选胰腺癌异种移植肿瘤组织和人胰腺癌组织的用途。结果指示，本公开内容的抗-Jagged可活化抗体可以被这样的组织表达的蛋白酶活化并结合这样的组织上的Jagged靶标。

通过将冷冻的组织用标记的抗-Jagged抗体4D11和抗-matriptase A11抗体（分别在1 μg/ml和5 μg/ml浓度）处理1小时，针对Jagged和MT-SP1表达来概述BxPC3肿瘤样品和人胰腺癌组织样品。结果分别显示在表13的第2和3列中。

另外，使用原位成像评价了抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11和5342-PLGL-4D11的被活化和结合BxPC3异种移植物和人胰腺癌组织的能力。如上所述(实施例7)，用Alexa Fluor®680 (Invitrogen)标记可活化抗体。根据上述的原位成像方案(实施例7)，将这些经标记的可活化抗体，即

表13. Jagged和MT-SP1表达的筛选以及BxPC3异种移植物和人胰腺癌组织中的抗-Jagged可活化抗体的原位成像。

实施例9. 抗-EGFR可活化抗体的体内和先体外后体内成像

这里提供的实施例使用抗-EGFR可活化抗体，在本文中被称作可活化抗体3954-1204-C225v4 (在本文中也被称作3954-1204-C225v4可活化抗体或3954-1204-C225v4)，其包括EGFR结合序列、掩蔽部分(MM)和为蛋白酶底物的可切割部分(CM)。这些实施例还使用被掩蔽的抗-EGFR抗体构建体，在本文中被称作被掩蔽的抗体3954-NSUB-C225v4 (在本文中也被称作3954-NSUB-C225v4被掩蔽的抗体或3954-NSUB-C225v4)，其包括位于MM和EGFR结合序列之间的不可切割部分。应当理解，尽管这里提供的实施例使用这些抗-EGFR可活化抗体构建体，这些方法适用于任何可活化抗体。

3954-1204-C225v4可活化的抗-EGFR抗体构建体包括下述重链和轻链序列：

[C225v4 (SEQ ID NO: 243)]

[间隔物(SEQ ID NO: 5)][掩蔽物(SEQ ID NO: 6)][

[间隔物(SEQ ID NO: 11)][掩蔽物(SEQ ID NO: 12)][

3954-NSUB-C225v4掩蔽的抗-EGFR抗体构建体包括与上面显示的3954-1204-C225v4可活化的抗-EGFR抗体相同的重链。3954-NSUB-C225v4掩蔽的抗-EGFR抗体构建体包括下述轻链序列：

[间隔物(SEQ ID NO: 5)][掩蔽物(SEQ ID NO: 6)][

[间隔物(SEQ ID NO: 11)][掩蔽物(SEQ ID NO: 12)][

在3954-1204-c225v4可活化的抗-EGFR抗体中使用的掩蔽部分(MM)可以被两种已知在多种人癌中增量调节的丝氨酸蛋白酶切割：尿激酶-型纤溶酶原激活物(uPA)和膜型丝氨酸蛋白酶1 (MT-SP1/matriptase)。3954-NSUB-c225v4掩蔽的抗-EGFR抗体用作阴性对照，因为它含有不可切割的底物序列从而产生蛋白酶抗性的可活化抗体。

实施例10. 未标记的抗-EGFR可活化抗体的原位成像

本实施例描述了未标记的抗-EGFR可活化抗体的原位成像的应用，所述抗体含有被单一蛋白酶切割的底物。使用特异性地结合可活化抗体的AB部分的第二抗体检测切割。结果指示评价未标记的可活化抗体的活化和结合的能力。

如下进行含有底物1203 (氨基酸序列TGRGPSWV, SEQ ID NO:196；可被uPA切割)的未标记的抗-EGFR可活化抗体3954-1203-C225v5在H292异种移植肿瘤组织上的活化和结合的原位成像：将冷冻的组织切片放置在载玻片上。将含有未标记的抗-EGFR可活化抗体的溶液施加于组织，并在50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4的温育缓冲液中在室温(约22-24℃)温育例如1小时，所述温育缓冲液含有150 mM NaCl、100µM ZnCl

实施例11.使用组织微阵列的原位成像

本实施例描述了使用可活化抗体检测组织微阵列(TMA)中的表达和/或活化。将抗-Jagged抗体4D11与非小细胞肺癌(NSCLC) TMA和乳腺癌(BC) TMA一起使用。大多数NSCLC和BC患者肿瘤样品是Jagged表达阳性的。使相同的NSCLC和BC TMA与可活化的抗-Jagged抗体（在本文中被称作5342-1204-4D11）接触。对于5342-1204-4D11可活化的抗-Jagged抗体的结合和活化而言，97%的NSCLC和100%的BC患者肿瘤样品是阳性的。此外，超过80%的肿瘤样品的特征在于高活化率(++或+++)，如在图21中所示。使相同的NSCLC和BC TMA与A11抗体接触，所述A11抗体结合蛋白酶MT-SP1。77%的NSCLC和98%的BC患者肿瘤样品是MT-SP1活性阳性的。8个NSCLC肿瘤缺少MT-SP1活性，但是表现出5342-1204-4D11可活化的抗-Jagged抗体的结合和活化，这提示蛋白酶在5342-1204-4D11可活化的抗-Jagged抗体的活化中的参与。

实施例12. 细针抽吸样品的原位成像

本实施例描述了使用得自H292异种移植物研究的细针抽吸样品上的原位成像。简而言之，使用下述抽吸方法：将小结节用镊子夹住后（post-sacrifice）固定化。在前后运动中使用23号针，其最接近在诊所中使用的规格(例如，22-25)，并施加轻微抽吸大约20秒。将针头排空进小瓶中并立即在干冰上冷冻。将异种移植物在抽吸操作后收集，标记以匹配抽吸样品，并在提取后立即冷冻。

然后在有广谱蛋白酶抑制剂(BSPI) (Broad Spectrum Protease Inhibitor SetIII, 无EDTA, 目录号539134, Calbiochem, Millipore, Billerica, MA)和50µM广谱MMP抑制剂Galardin (目录号364205，Calbiochem, Millipore)存在下，使细针抽吸(FNA)样品与标记的亲本抗-EGFR抗体(西妥昔单抗-AF680)、标记的抗-EGFR可活化抗体(3954-1204-C225v5-AF680)或标记的抗-EGFR可活化抗体(3954-1204-C225v5-AF680)接触。得自两个受试者的结果显示在图22和23中。在所有3个样品中观察到亲本抗体和可活化抗体的染色。

因而，这些结果证实，在含有足够数目的细胞的FNA样品中，本文提供的原位成像技术可用在本文描述的任何诊断方法中。

实施例13. 在癌细胞系中使用冷竞争的抗-Jagged抗体和可活化的抗-Jagged抗体的体内成像

这里提供的研究使用抗-Jagged抗体4D11和可活化的抗-Jagged抗体5342-1204-4D11。使用BxPC3细胞（一种人原发性胰腺腺癌癌细胞系）试验了抗-Jagged抗体和可活化的抗-Jagged抗体。

将这里描述的研究设计成，通过使用“冷的”4D11预处理对照的体内成像，评价抗-Jagged抗体4D11和抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11在BxPC3异种移植肿瘤中的积累。在第一组研究中使用的组的概要显示在下面表14中：

表14: 研究组(n = 3)

通过受体占据的成像(图24A)，估计抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11的活化。

如在图24A和24B中所见，体内成像结果(图24B)与先体外后体内成像结果(图24C)相关联。

实施例14. 在癌细胞系中使用冷竞争的可活化的抗-EGFR抗体的体内成像

这里提供的研究使用可活化的抗-EGFR抗体3954-1204-C225v5。使用H292细胞（一种人非小细胞肺癌细胞系）试验了可活化的抗-EGFR抗体。

将这里描述的研究设计成，通过使用“冷的”C225v5预处理对照的体内成像，评价可活化的抗-EGFR抗体3954-1204-C225v5在H292异种移植肿瘤中的积累。在第一组研究中使用的组的概要显示在下面表15中：

表15: 研究组(n = 3)

通过受体占据的成像(图25)，估计抗-EGFR可活化抗体3954-1204- C225v5的活化。

在BxPC3异种移植肿瘤模型中使用”冷”竞争的抗-Jagged抗体4D11和可活化的抗-Jagged抗体5342-1204-4D11的体内成像和在H292异种移植肿瘤模型中使用”冷”竞争的可活化的抗-EGFR抗体3954-1204- C225v5的体内成像已经证实，这些方法是检测抗体结合的可行方法。这样，这些方法可用于在体内肿瘤模型中筛选底物可切割性。

实施例15. 人多发性骨髓瘤骨髓活组织检查切片规程

为了开发一种将难以操作的骨髓和其它组织切片和染色的方法，在建立合适的方案之前试验了几种规程。最初，尝试了使用可调换式刀片的常规切片规程。这之后评价了16 cm碳化钨刀，因为当用在硬样品上时它具有更大的稳定性和减小的振动。接着，如下尝试了胶带的应用：将组织放在胶带上，然后切片；将附着于胶带的组织放在载玻片上，使得组织直接接触载玻片；尝试了多种除去胶带和将组织切片转移至载玻片的方法，但是没有成功；这样的方法包括评价允许组织切片附着于载玻片的温度和时间的影响。这些失败导致在染色规程中使组织切片剩在胶带上而不尝试将样品转移至载玻片的评价，从而导致下述的成功方案。应当理解，尽管下面的方案描述了骨髓组织的切片和染色，这样的方法还可以用于将其它难操作的组织切片和染色。

将分离自多发性骨髓瘤患者的骨髓活组织检查组织放在设定于-30℃的低温恒温器中，并在切片前使其达到温度。将组织附着于卡盘并将卡盘插入卡盘夹具中以后，将一块胶带施加于所述块的面。用塑料滚筒使胶带滚上以促进均匀粘附。用镊子夹住胶带的底边缘，同时将所述块缓慢地降低至刀片并做出切片。利用16 cm碳化钨刀将组织切成7微米(um)的切片，并将组织切片在-30℃保持在胶带上和在-80℃长期储存。

如下所述，直接在胶带上将得到的组织切片用各种免疫荧光染色方案染色。任意合适的IHC方案，包括标准的IHC方案，可以用在这些方法中。在这里描述的研究中使用下述免疫荧光染色方案。

使用原位成像评价抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11的被活化和结合多发性骨髓瘤肿瘤组织的能力。用Alexa Fluor

结果展示在图26和27中。图26指示，多发性骨髓瘤骨髓活组织检查组织表达Jagged (如抗-Jagged抗体4D11染色所指示)和CD138 (如抗-CD138抗体染色所指示)。图27指示，抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11被多发性骨髓瘤骨髓活组织检查组织活化，并且这样的活化在有广谱蛋白酶抑制剂存在下被抑制。

其它实施方案

尽管已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述说明书意在只是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由随后的权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改是在下述权利要求书的范围内。