一种竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法

摘要

本发明公开了一种竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，在竹叶采集后，先立即用70％FAA液中固定，再进行复水，然后采用氢氟酸进行去硅预处理，再进行脱水和常规石蜡制片法制片，Leica DM2500光学显微镜观察拍照，Photoshop CS6拼构竹叶三维示意图。本发明利用石蜡制片获得竹叶三个面的切片结构，再用Photoshop CS6软件进行拼接，操作简便，能够获得清晰完整的竹叶三维立体结构图。试验证实，获得竹叶三个切片的石蜡制片后，将各切片的图用Photoshop CS6处理，可以获得高质量的竹叶内部结构立体图片。因此本发明是一种有效观察竹叶内部立体显微结构的技术，有效解决了竹类植物竹叶切片过程中只能观察某一切面的问题，为建立和丰富完善竹类植物竹叶结构观察方法奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于竹类植物显微结构观察技术领域，具体涉及一种通过石蜡切片和Photoshop CS6软件拼构竹叶三维示意图，以获得竹叶片完整内部立体解剖结构的方法。

背景技术

竹亚科作为禾本科中的一个大类，是一种重要的经济树种，竹类植物种类多样，经济效益高，是许多学者研究的对象。在早期的研究中，人们通过对竹子各部分营养器官，根[Raechal L J，Curtis J D.Root anatomy of the Bambusoideae (Poaceae).[J].American Journal ofBotany，1990，77(4)：475-482]、地下茎[Ding Y L，Grosser D，Liese W，et al.Anatomic studies on the rhizomes of some monopodial bamboos[J].Chinese Journal of Botany，1993，5(2)：122-129]、维管束[温太辉等.中国竹类维管束解剖形态的研究(之一)[J].竹子研究汇刊，1989.3(1)：1-21]、叶[钱领元，方伟.国产16种竹叶的比较解剖研究[J].竹子学报，1986，5(2)：78-86]的解剖形态研究，来作为竹子系统分类上的依据。多种分类学特征之中，由于竹叶的解剖结构独特，使得许多人将研究的目光集中在竹叶的解剖形态对竹子分类上起到的意义。在1958年Brawn[Brawn W V.Leafanatomy in grass systematica[J].Botanical Gazette，1958，119(3)：170-178]在对101种禾本科植物进行解剖比较后，将禾本科植物的叶部解剖结构分为竹型(Bambusoid)、黍型(Panicoid)、芦竹型(Arundoid)、虎尾草型(Chloridoid)、羊茅型(Festucoid)、三芒草型(Aristidoid)六类。其中竹叶横切面上显示的指状臂细胞(arm cells)和叶肉中出现的梭型细胞(fusoid cells)[Metcalfe C R.Some thoughts on the structure of Bambooleaves[J].Botanical Magazine Tokyo，2006，69(820-821)：391-400]也成为了竹亚科植物重要的分类学特征。

我国从1986年钱领元和方伟[钱领元，方伟.国产16种竹叶的比较解剖研究[J].竹子研究汇刊.1986，5(2)：78-86]对16种国产竹叶进行系统的比较解剖后，刘友全等人[刘友全，梁达丽，何友钊.竹类叶肉细胞的形态比较[J].林业科学，1986，22(2)：172-177]又对10种不同属的竹类叶肉细胞进行形态学比较。1994年丁雨龙[丁雨龙，赵奇僧，陈志银，等.竹叶结构的比较解剖及其对系统分类意义的评价[J].南京林业大学学报.1994，18(3)：1-6]等人对24种竹子的营养叶进行横切纵切结构的比较观察后提出，弄清楚叶片解剖构造的变化模式对竹类植物的系统分类具有较大价值。1995年赵惠如和龚祝南[赵惠如，龚祝南.竹类叶片的内部解剖与系统演化[J].南京师大学报(自然科学版)，1995(4)：102-108]对21属27种竹种竹叶的上下表皮和横切观察，对叶肉细胞和维管束梭型细胞进行系统的比较后推测出各竹种在系统分类中的演化地位。

前人对竹叶的解剖观察多是从竹叶的表皮结构，和竹叶横切叶肉细胞形态上去分析比较各竹种竹叶之间存在的差异，而至今未从叶片的三个切面，全面地观察竹叶的整体三维结构特征。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种竹类植物叶片立体显微结构观察的方法，克服观察竹叶结构仅限于单一切面等问题。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，竹叶采集后，先立即在70％FAA液中固定；再进行复水；然后采用氢氟酸进行去硅预处理，再进行脱水和常规石蜡制片法制片，获得竹叶的纵切面和横切面切片；番红固绿双重染色法染色，中性树胶封片，获得竹叶的纵切面和横切面结构图；FAA固定后的竹叶样品，通过酒精梯度脱水，二甲苯透明过夜，换至70％酒精后直接镜检获得平切面结构图；再用拼图软件将纵切面、横切面和平切面结构图拼构出竹叶三维示意图。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，随机采集完全舒展的健康功能竹叶，并用锋利刀片迅速切下竹叶中部，大小为0.5cm×0.5cm。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，将采集的竹叶立即放入固定液70％FAA中固定至少48h，取出固定后的竹叶进行梯度复水处理。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，复水处理：分别将叶片取出放置50％酒精-30％酒精-15％酒精-纯水各1h。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，去硅预处理为将竹叶置于25％氢氟酸中处理36-48h。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，去硅处理结束后，将竹叶取出，用纯水清洗后，进行梯度酒精脱水，依次将竹叶置于15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精各1h。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，常规石蜡制片法为：常规石蜡制片法为：将前期处理好的竹叶经70％、80％、90％乙醇逐级脱水，每级停留2h，后再用无水乙醇脱水2次，每次停留1h；脱水处理后的竹叶从无水乙醇中分别转入1∶1、1∶3二甲苯-无水乙醇混合液中，各级停留1.5h，后转入纯二甲苯中2次，每次停留1h，进行透明处理；将石蜡与二甲苯按1∶2比例配成混合液，将透明好的材料放入上述混合液中于38℃烘箱过夜，后更换1∶1石蜡-二甲苯混合液于58℃烘箱2h再转入纯蜡中2次，每次停留1h；最后进行包埋；然后使用(Leica RM2255)自动切片机切取厚度为8μm的切片。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，切片做好后，Leica DM2500光学显微镜下观察。

所述的竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，竹叶三面结构获得后，用Photoshop CS6软件拼构竹叶三维示意图。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用石蜡制片可获得高质量的竹叶的纵切面(平行于侧脉)、横切面(垂直于侧脉)图片以及平行于叶片的平切结构，并用Photoshop CS6软件拼构竹叶三维示意图，操作简便，能够获得完整的竹叶立体显微结构。因此本发明是一种有效观察竹叶内部三维显微结构的技术，有效解决了竹类植物竹叶内部结构片面观察的问题，为形象直观地观察和认识竹叶内部结构提供了方法，具有很好的实用性。

附图说明

图1是七彩红竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.七彩红竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮；

图2是靓竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.靓竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮；

图3是菲白竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.菲白竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮；图4是淡竹其他浓度的氢氟酸去硅效果图，均显示效果较差。

图4是锦竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.锦竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮；

图5是黄条金刚竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.黄条金刚竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮；

图6是花叶唐竹三维示意图和各切面光学显微图；图中，a.花叶唐竹三维拼接示意图；b.竹叶横切图，切面垂直于侧脉；c.竹叶纵切图，切面平行于侧脉；d.竹叶平切，切面平行于叶表皮。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种竹叶内部解剖结构三维立体图的获得方法，包括以下步骤：

1)试验材料为六种竹类植物竹叶，于2018年1月中旬在南京采集，详细信息如表1所示，随机采集完全舒展的健康功能竹叶，并用锋利刀片迅速切下竹叶中部，切片大小为0.5cm×0.5cm，采后立即用70％FAA液中固定。

表1 6个竹种采集信息表

2)固定48h后，进行复水：分别将叶片取出放置50％酒精-30％酒精-15％酒精-纯水各1h；复水后在进行去硅处理，将各竹种叶片复水后用25％氢氟酸处理36-48h，然后对竹叶进行梯度酒精脱水(15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精各1h)再按照常规石蜡制片法制片，即采用去硅预处理，然后进行常规石蜡制片法制片。

常规石蜡制片法为：将固定好的竹叶经70％、80％、90％乙醇逐级脱水，每级停留2h，后再用无水乙醇脱水2次，每次停留1h；脱水处理后的竹叶从无水乙醇中分别转入1∶1、1∶3二甲苯-无水乙醇混合液中，各级停留1.5h，后转入纯二甲苯中2次，每次停留1h，进行透明处理；将石蜡与二甲苯按1∶2比例配成混合液，将透明好的材料放入上述混合液中于38℃烘箱过夜，后更换1∶1石蜡-二甲苯混合液于58℃烘箱2h再转入纯蜡中2次，每次停留1h；最后进行包埋；然后使用(Leica RM2255)自动切片机切取厚度为8μm的切片，获得竹叶的纵切面和横切面切片；番红固绿双重染色法染色，中性树胶封片。切片做好后，Leica DM2500光学显微镜下观察拍照。

3)平行于叶片的平切结构制片：FAA固定后的竹叶样品，通过酒精梯度脱水，二甲苯透明过夜，换至70％酒精后直接镜检。

4)竹叶三面结构获得后，用拼图软件Photoshop CS6对三个平面图片进行“编辑-变换-斜切”调整，再将调整后的图片拼构成竹叶三维示意图。

从六个竹种的三维示意图中(图1-图6)可以看出，六个竹种叶片内部结构排列整齐有规律，叶肉细胞之间排列紧密分层明显。叶肉中的绿色薄壁组织包括指状臂细胞和梅花状细胞，每个竹种靠近叶片上表皮的一层叶肉细胞为指状臂细胞，在横切面上，其细胞壁向下内折，整齐指状排列在上表皮内侧。从纵切面上观察，细胞呈长条状，下部细胞壁内折较少，而平切面中从上到下表现为长条状到散圆状，推断其细胞三维结构应为两层手掌重叠状，各竹种的指状臂细胞形态无明显差异；其余叶肉细胞为梅花状。从纵切面可以看出：七彩红竹叶肉细胞层数最少，为4层；靓竹的叶肉细胞层数最多，为6层；其余菲白竹、黄条金刚竹、花叶唐竹叶肉细胞孢层数在排列最多处均有5层。叶片两侧脉之间的上表皮分布有泡状细胞，从各图中的上表皮显微图像可以看出，各竹种上表皮均由长细胞、短细胞和泡状细胞组成，从横切面可见到泡状细胞与长短细胞相比，靠近表皮部分细胞壁无增厚角质层。六个竹种叶片中都有梭型细胞，通过这六个竹种的三维示意图和三面切片图我们可以看出，梭型细胞在横切面上呈现两头小中间大的弯曲状，在纵切和平切面中均为皱缩扁平的“I”型。七彩红竹、白纹阴阳竹和花叶唐竹中梭型细胞数量最多，叶片中梭型细胞在泡状细胞和侧脉之间的位置纵向排成一列，与泡状细胞列和侧脉一起，贯穿整个叶片。菲白竹的梭型细胞数量较少，从纵切面可以看到，在第四排的梅花状叶肉细胞中，偶然出现一些梭型细胞排列其中。而黄条金刚竹和靓竹的叶肉细胞中则极少见到梭型细胞。本实施例中的六个叶片也都有出现小横脉，从各竹种的半透明叶片制片中，可以发现横脉与左右两边的侧脉相连接，叶片平切面和纵切面可以看到横脉及其与上下表皮相连的机械组织。通过三维图构建，能清楚地了解竹类植物竹叶内部立体构造。