基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器及其制备与应用

摘要

本发明属于电化学生物传感器技术领域，公开了基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器及其制备与应用。所述生物传感器由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，修饰后的工作电极由基底电极及固化在基底电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由氮掺杂石墨烯分散液、辣根过氧化物酶溶液及壳聚糖溶液混合，成膜制备而成。本发明还公开了传感器的制备方法。本发明的制备方法简单且成本低；获得的传感器具有良好的选择性、灵敏度和稳定性，具有较好的电催化性能；对对苯二酚进行准确检测，抗干扰能力强；同时具有较宽的检测范围，较低的检测限。

说明书

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的检测对苯二酚的生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

酚类化合物是一类应用广泛的化工原料，其中，对苯二酚作为精细化学品的基本原料，广泛地用于化妆品、染料、农药、医药、制革行业等。但是对苯二酚具有高毒性和难降解性，因此，它被认定为环境污染物。对苯二酚对人体的影响不容忽视，低浓度的对苯二酚就可以导致头痛和心动过速等症状。因此，开发出快捷灵敏的检测对苯二酚的方法具有重要的意义。目前已经有许多种方法用于检测对苯二酚，比如高效液相色谱法、气相色谱法，pH流动注射分析法、同步荧光法、分光光度法等。但是，上述提及的方法大都有耗费时间长、仪器昂贵、灵敏度低、样品前处理繁琐等缺点，相对比而言，电化学传感器具有对目标物有较高的识别能力，样品用量少、响应快，成本低、体积小，便于普及的优点，而电化学酶生物传感器又以其催化能力高、反应条件温和、专一性好等特点被广泛应用，因此，研发简便、快速、精准、灵敏度高的对苯二酚电化学酶生物传感器有重大应用前景。

在电化学酶生物传感器的制备过程中，影响其性能的一个非常重要的问题就是酶催化剂的氧化还原活性中心外面包裹着一层不导电的蛋白质外壳，这个蛋白质外壳阻止了酶活性中心和电极表面进行电子传递，影响了电极的性能；影响酶生物传感器性能的另外一个重要因素是酶修饰电极的稳定性和寿命问题，其与酶催化剂的固定方式密切相关，采用合适的酶固定方法制备稳定的酶修饰电极一直是生物传感器研究人员研究的热点问题。

发明内容

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器在对苯二酚检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由基底电极及固化在基底电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由氮掺杂石墨烯分散液(N-GN)、辣根过氧化物酶溶液(HRP)及壳聚糖溶液(CS)混合，成膜制备而成；

所述氮掺杂石墨烯分散液(N-GN)是由氮掺杂石墨烯分散于水中得到；辣根过氧化物酶溶液(HRP)是将辣根过氧化物酶溶于PBS溶液中得到；壳聚糖溶液是将壳聚糖配成溶液得到。

所述氮掺杂石墨烯：辣根过氧化物酶：壳聚糖的质量比为(2～20)：(15～35)：10。

所述氮掺杂石墨烯材料具体通过以下方法制备得到：

(a)将氧化石墨烯与苯胺分散均匀；在氧化剂的作用下和酸性介质中，苯胺发生聚合反应，置于水热反应釜中进行水热反应，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物；

(b)将聚苯胺-氧化石墨烯复合物进行煅烧，获得氮掺杂石墨烯复合材料。

所述氧化石墨烯与苯胺的质量体积比为(50～200)mg：0.5mL；

所述氧化剂为过硫酸铵，所述酸性介质为盐酸，所述氧化剂与酸性介质的摩尔比为(2～2.5)：1，苯胺与酸性介质的体积比为1:(10～20)；酸性介质以水溶液的形式加入，酸性介质的浓度为0.5mol/L；所述聚合反应的温度为4～10℃，聚合反应的时间为6～12h；水热反应的温度为160～200℃，水热反应时间为12～20h。

步骤(b)中所述煅烧的氛围为保护性氛围，所述保护性氛围为氮气或惰性气氛，所述煅烧是指先在400～500℃下煅烧，所述煅烧的时间为1.5～2.5小时；后在700～800℃继续煅烧，所述继续煅烧的时间为0.5～1.5小时。

步骤(a)的具体步骤为将氧化石墨烯在水中超声剥离，加入苯胺超声分散均匀；然后低温下，加入氧化剂与酸性介质的混合物，聚合反应，水热反应，获得聚苯胺-氧化石墨烯复合物。所述氧化石墨烯与水的质量体积比为(50～200)mg：50mL，超声剥离的时间为1～4h，反应的时间为6～12小时。

反应完成后，过滤，洗涤，真空干燥，研磨，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物。

上述基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)对基底电极进行表面预处理；

(2)将氮掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得分散液；将辣根过氧化物酶溶于PBS溶液中，获得辣根过氧化物酶溶液；将壳聚糖配成溶液，获得壳聚糖溶液；将分散液、辣根过氧化物酶溶液与壳聚糖溶液混合均匀，获得复合溶液；

(3)将复合溶液滴加到经表面预处理的基底电极表面，室温晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的酶修饰工作电极；

(4)将酶修饰的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测对苯二酚的生物传感器。

步骤(1)中所述表面预处理具体是指：将基底电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，晾干。

步骤(2)中所述掺杂石墨烯材料分散液的浓度为2-20mg/mL。

步骤(2)中所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为15～35mg/mL，酶溶液是采用PBS溶液配制的(pH 6.5，0.1M)。

步骤(2)中所述壳聚糖溶液是由0.1-2wt％乙酸溶液配制的，浓度为10mg/mL。

步骤(2)中所述掺杂石墨烯分散液、辣根过氧化物酶溶液与壳聚糖溶液体积比为1:1:1。

步骤(3)中所述复合溶液滴加量为3-10μL。

上述基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚酶的生物传感器在对苯二酚定量检测中的应用。

本发明的原理：

本发明首先是制备掺杂石墨烯材料，该材料借助不同组分的协同作用克服石墨烯本身卷曲、层间堆叠和溶剂中分散性差的不足，然后，利用壳聚糖的成膜性，并利用掺杂石墨烯的载体特性，有力增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化；最后，取适量混合液滴于已表面预处理的工作电极上，得到修饰后的工作电极；再利用所述的修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成三电极体系，制得一种检测对苯二酚的酶生物传感器。

本发明将氮掺杂石墨烯、辣根过氧化物酶应用于酶生物传感器，制备得到的检测对苯二酚的传感器检测性能良好，检测范围为9×10^-5～5.075×10^-3mol/L，线性方程为I(μA)＝-11.37-5.89C(mmol/L)，相关系数为R²＝0.998。检测限为1×10^-5mol/L(S/N＝3)。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明所述的检测对苯二酚的生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度。

(2)本发明所述的检测对苯二酚的生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对对苯二酚进行准确检测，抗干扰能力强。

(3)本发明所述的检测对苯二酚的生物传感器可用于水中对苯二酚或土壤中对苯二酚的检测，制备简单，具有较宽的检测范围，较低的检测限，反应在室温中性环境下进行，性能稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例3中基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶修饰工作电极在不同溶液中的循环伏安图；曲线a为酶修饰工作电极在PBS中的循环伏安曲线，曲线b为酶修饰工作电极在0.5mM对苯二酚(HQ)中的循环伏安曲线，曲线c为酶修饰工作电极在0.5mM对苯二酚与0.5mM H₂O₂混合溶液中的循环伏安曲线；

图2为实施例3制备的基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚的生物传感器在不同浓度的对苯二酚溶液中的循环伏安图，图中方框内为对应的对苯二酚浓度；

图3为实施例3制备的基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚的生物传感器对不同浓度对苯二酚的响应电流的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚的电化学酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯与50mL去离子水混合，超声剥离4h，加入0.5mL苯胺，搅拌均匀后继续超声30min，低温搅拌下(10℃以下)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后转入反应釜中，180℃水热16小时，反应后得到的溶液用砂芯过滤器过滤，并用蒸馏水洗涤数次，80℃真空干燥过夜后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得氮掺杂石墨烯材料；

(3)将氮掺杂石墨烯材料在水中分散为浓度为10mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH6.5)配制浓度为15mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用1wt％乙酸溶液配制10mg/ml壳聚糖溶液，将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取6μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞为参比电极)，得到检测对苯二酚的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL含0.5mM H₂O₂磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH6.5)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加对苯二酚溶液，测试稳定后滴加50μL对苯二酚溶液。

本实施例在对苯二酚浓度为0.5mmol/L时，测试的还原峰催化电流为7.921μA。

实施例2

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯与50mL去离子水混合，超声剥离4h，加入0.5mL苯胺，搅拌均匀后继续超声30min，低温搅拌下(10℃以下)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后转入反应釜中，180℃水热16小时，反应后得到的溶液用砂芯过滤器过滤，并用蒸馏水洗涤数次，80℃真空干燥过夜后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯材料；

(3)将掺杂石墨烯材料分散于水中，得到浓度为10mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用1wt％乙酸溶液配制10mg/ml壳聚糖溶液，将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取6μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞为参比电极)，得到检测对苯二酚的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL含0.5mM H₂O₂磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH6.5)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加对苯二酚溶液，测试稳定后依次滴加50μL对苯二酚溶液。

本实施例在对苯二酚浓度为0.5mmol/L时，测试的还原峰催化电流为9.819μA。

实施例3

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯与50mL去离子水混合，超声剥离4h，加入0.5mL苯胺，搅拌均匀后继续超声30min，低温搅拌下(10℃以下)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后转入反应釜中，180℃水热16小时，反应后得到的溶液用砂芯过滤器过滤，并用蒸馏水洗涤数次，80℃真空干燥过夜后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯材料；

(3)将掺杂石墨烯材料在水中分散为浓度为10mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用1％乙酸溶液配制10mg/ml壳聚糖溶液，将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取6μL混合溶液滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞为参比电极)，得到检测对苯二酚的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL含0.5mM H₂O₂磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH6.5)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加对苯二酚溶液，测试稳定后依次滴加50μL对苯二酚溶液。

本实施例的生物传感器在对苯二酚浓度为0.5mmol/L时，测试的还原峰催化电流为10.89μA。

本实施例中酶修饰工作电极在不同溶液中的循环伏安图如图1所示。曲线a为酶修饰工作电极在PBS中的循环伏安曲线，曲线b为酶修饰工作电极在0.5mM对苯二酚中的循环伏安曲线,，曲线c为酶修饰工作电极在0.5mM对苯二酚与0.5mM H₂O₂混合溶液中的循环伏安曲线。从图1可知，当单独加入对苯二酚溶液，出现了一对明显的氧化还原峰，当对苯二酚与H₂O₂同时存在，还原峰出现了明显增加，氧化峰明显降低，说明加入H₂O₂，有利于酶对对苯二酚的催化作用。

本实施例制备的基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚的生物传感器在不同浓度对苯二酚溶液中的循环伏安图如图2所示。在0.1mo1/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液中，不断加入对苯二酚得到的循环伏安曲线，其中氧化曲线右端从下到上依次对应的对苯二酚浓度为0.09mmo1/L、0.5mmo1/L、1.5mmo1/L、2mmo1/L、3mmo1/L、4mmo1/L、5.075mmo1/L。利用了掺杂石墨烯的载体特性，有力增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化。

本实施例制备的基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶检测对苯二酚的生物传感器对不同浓度对苯二酚的响应电流的标准曲线图如图3所示。该修饰电极对底物检测范围为9×10^-5～5.075×10^-3mol/L，线性方程为I(μA)＝-11.37-5.89C(mmol/L)，相关系数为R²＝0.998。检测限为1×10^-5mol/L(S/N＝3)。

实施例4

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯与50mL去离子水混合，超声剥离4h，加入0.5mL苯胺，搅拌均匀后继续超声30min，低温搅拌下(10℃以下)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后转入反应釜中，180℃水热16小时，反应后得到的溶液用砂芯过滤器过滤，并用蒸馏水洗涤数次，80℃真空干燥过夜后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯材料；

(3)将掺杂石墨烯材料在水中分散为浓度为10mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为30mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用1％乙酸溶液配制10mg/ml壳聚糖溶液，将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取6μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞为参比电极)，得到检测对苯二酚的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL含0.5mM H₂O₂磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH6.5)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加对苯二酚溶液，测试稳定后依次滴加50μL对苯二酚溶液。

本实施例在对苯二酚浓度为0.5mmol/L时，测试的还原峰催化电流为9.466μA。

实施例5

一种基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的对苯二酚酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L>3Fe(CN)₆+0.1mol/L>

(2)将100mg氧化石墨烯与50mL去离子水混合，超声剥离1～4h，加入0.5mL苯胺，搅拌均匀后继续超声30min，低温搅拌下(10℃以下)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后转入反应釜中，180℃水热16小时，反应后得到的溶液用砂芯过滤器过滤，并用蒸馏水洗涤数次，80℃真空干燥过夜后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料在水中分散为浓度为10mg/mL的分散液，采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为35mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，采用1％乙酸溶液配制10mg/ml壳聚糖溶液，将三种溶液以1:1:1体积比混合得到混合溶液，取6μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干，得到基于氮掺杂石墨烯复合辣根过氧化物酶的修饰工作电极；

(4)将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，饱和甘汞为参比电极)，得到检测对苯二酚的生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL含0.5mM H₂O₂磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH6.5)中进行，测试之前通N₂，测试过程中采用循环伏安法。其中空白对照未滴加对苯二酚溶液，测试稳定后依次滴加50μL对苯二酚溶液。

本实施例在对苯二酚浓度为0.5mmol/L时，测试的还原峰催化电流为7.235μA。

所述氧化石墨烯的制备：

(a)清洗石墨粉；

(b)取清洗后的石墨粉，采用修正的Hummers方法制备氧化石墨烯。

步骤(a)中所述石墨粉清洗过程操作如下：称取2.5～10g石墨粉于大烧杯中，加入100mL蒸馏水，再在通风厨中加入100mL浓盐酸，在60～80℃水浴中加热并搅拌2h，真空抽滤后，依次用蒸馏水、丙酮、乙醇清洗，清洗完毕后，放入真空干燥箱中100℃烘干，之后用石英研钵研磨成粉状备用。

步骤(b)中所述氧化石墨烯制备操作过程如下：(1)低温反应(0～4℃)：在冰水浴中放入1000mL大烧杯，再加入110mL浓H₂SO₄，同时搅拌使其温度降至低温反应区间，然后依次加入已清洗好的2.5～10g石墨粉，2.5g>3，15g>4。加完后计时，搅拌反应90min，溶液呈紫绿色；(2)中温反应(30～40℃)：将温度升高，在搅拌下使其温度保持在35℃左右，计时反应90min，溶液依然呈紫绿色；(3)高温反应(70～100℃)：中温反应后，向烧杯中缓慢加入220mL去离子水，然后加热将温度控制在85℃，随后缓慢加入一定量双氧水(5％约13mL)至溶液逐渐变成金黄色即可；(4)待该制备反应完毕后，趁反应液温热之时，将反应后的溶液用去离子水洗涤并过滤，并用转速为4000rpm的离心机反复离心再清洗过滤，直到滤液中检测不到SO₄^2-为止(用BaCl₂检验)。此时将所得到的黑色产物用去离子水超声清洗40min后，在40℃下干燥24h，即可得到黑棕色的氧化石墨烯。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。