一种利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的制备方法及应用。具体是以负载金纳米粒子的氨基化石墨烯(Au NPs/NH

说明书

技术领域

本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于负载金钯核壳纳米枝晶的吸附Fe²⁺的壳聚糖功能化聚吡咯纳米管复合材料构建电流型免疫传感器的方法，以及该免疫传感器在利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法检测癌胚抗原中的应用。

背景技术

据世界卫生组织2018年2月的报道，2015年全球约有880万人死于癌症。陈万青等人在《Cancer statistics in China, 2015》一文中也提到2015年中国人口预期癌症新发病例总数为429.2万人，预期死亡人数281.4万人。这些统计结果说明癌症已经严重威胁人们的生命安全。癌胚抗原(CEA)是一种广谱肿瘤标志物，其正常水平为0 ~ 2.5 ng/mL(British Journal of Haematology, 110, 743-754, 2000)，不仅能作为早期诊断结肠癌和直肠癌的特异性标志物，而且在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤的血清中CEA值也有升高。因此，CEA在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，具有重要的临床价值。

电化学免疫传感器是将电化学分析方法和免疫技术结合在一起构建而成的一种分析方法，具有迅速检测、低检出限、高灵敏度和低制备成本等优点。近年来，电化学免疫传感器备受青睐，被广泛应用于在生物、环境、医学、食品、农业等领域。田亮亮等在专利CN103770568A中利用聚邻苯二胺微球/HRP标记的CEA抗体构建电化学免疫传感器，其线性范围较窄(0.1 ~ 50 ng/mL)，检测限(0.05 ng/mL)有待提升。李娜等在专利CN104865299B中利用花状纳米金钯和三氧化二锰复合材料构建了免疫传感器，并对前列腺特异性抗原有较大的线性检测范围(0.0005 ~ 20 ng/mL)和较低的检出限(0.11 pg/mL)，此外在文中作者还强调了金钯纳米粒子的催化作用。Manoj B. Gawande等发表有关核壳型纳米粒子的综述，阐述了核壳型纳米粒子在催化和电催化领域的优点及应用(Chemical SocietyReviews, 44, 7540-7590, 2015)。侯鹏飞等也发表有关核壳状贵金属纳米粒子的综述，文中论述了贵金属核壳型纳米的优点(CrystEngComm, 17, 1826-1832, 2015)。李月云等在专利CN104198563A和CN105241939B中通过吸附铅离子和镉离子来提高信号放大器对信号源(过氧化氢)还原的催化作用，增强对传感器的灵敏性。通过以上研究背景说明在利用过氧化氢作为信号源时，核壳状贵金属和金属离子对放大传感器响应信号具有重要意义，然而以上专利仅通过一种方法来进行检测，其准确度不能很到的证明。

本发明采用Au@Pd>2+-CS/PPy>2+与过氧化氢形成的芬顿试剂效应，构建的免疫传感器不仅在采用时间-电流曲线法检测时具有灵敏的反应，而且通过方波脉冲伏安法检测时Fe²⁺可以作为信号源也具有较宽的线性范围。单一的检测方法不能够说明所构建传感器的准确度。但是对比同一传感器利用两种检测方法的结果，可以准确地验证该传感器的准确度。

发明内容

本发明提供了一种利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极的为玻碳电极，其表面利用依次修饰Au>2-GS、癌胚抗体、牛血清蛋白、癌胚抗原、Au@Pd>2+-CS/PPy>2。所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。

本发明的目的之一是提供一种利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器用于癌胚抗原的定量检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤：

（1）制备负载金钯核壳纳米枝晶的吸附Fe²⁺的壳聚糖功能化聚吡咯纳米管复合材料的癌胚抗体免疫复合物(Au@Pd>2+-CS/PPy>2)；

（2）制备负载金纳米粒子的氨基化石墨烯(Au>2-GS)；

（3）制备利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的工作电极；

（4）利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法制作电流型免疫传感器检测癌胚抗原的工作曲线。

其中步骤（1）制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2包括：

①制备金钯核壳纳米枝晶(Au@Pd NDs)

取0.4 ~ 0.6 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到49 mL的二次水中，加热至沸腾，快速加入1.0 ~ 1.5 mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，搅拌条件下维持沸腾10 min后得金纳米粒子分散液；向15 ~ 20 mL金纳米粒子分散液中依次加入80 ~ 90 mg的十六烷基氯化吡啶、8.0mL的二次水和0.5 ~ 1.0 mL、20 mmol/L的氯化钯溶液，搅拌10 min后加入1.0 ~ 1.5 mL、0.1 mol/L新配的抗坏血酸溶液，40℃下放置4 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd NDs；

②制备壳聚糖功能化聚吡咯纳米管(CS/PPy NTs)

取0.2 ~ 0.3 g三氯化铁分散在12 ~ 15 mL二次水中，在搅拌条件下加入12 ~ 15 mL、10 mmoL/L的甲基橙溶液，磁力搅拌3 min后，滴加90 ~ 100 μL吡咯，室温下反应12 h，离心、水洗至上清液pH呈中性，将下层沉淀冷冻干燥，得聚吡咯纳米管；将0.2 ~ 0.3 g的壳聚糖加入到50 mL、0.1 ~ 0.2 wt%的乙酸溶液中，超声分散均匀后加入15 ~ 20 mg聚吡咯纳米管，连续超声2 h后离心水洗至上清液pH呈中性，冷冻干燥得CS/PPy NTs；

③制备Au@Pd>2+-CS/PPy>

取15 ~ 20 mg的CS/PPy NTs超声分散在20 mL、0.2 ~ 0.5 mg/mL的Au@Pd NDs分散液中，室温下振荡6 h后加入60 ~ 100 mg的硫酸亚铁，继续振荡另外6 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd>2+-CS/PPy>

④制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2

取4 ~ 8 mg的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液(pH = 7.0)，4℃下振荡孵化10 h，离心后将下层沉淀分散在4.0 mL、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得Au@Pd>2+-CS/PPy>2分散液，4℃下保存备用。

其中步骤（2）制备Au>2-GS包括：

①制备氨基化石墨烯(NH₂-GS)

取96 mL、98 wt%的浓硫酸加入0.5 ~ 1.0 g石墨粉和10 mg硝酸钠，搅拌30 min后，冰水浴搅拌条件下缓慢加入5 ~ 7 g高锰酸钾，继续搅拌30 min后加热至60 ~ 90℃，反应8 h后，加40 mg的冰，再加0.5 ~ 1.0 mL、30 wt%的过氧化氢，搅拌20 min后离心、水洗至上清液pH呈中性，将沉淀加到40 mL的水，超声40 min后5000 rpm离心，将上层液体冷冻干燥得到氧化石墨烯；取50 mg氧化石墨烯加入20 mL乙二醇，超声30 min，加0.5 mL的浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应8 h，冷却到室温后离心分离，室温下干燥得NH₂-GS；

②制备Au>2-GS

取15 ~ 20 mg的NH₂-GS>2-GS。

其中步骤（3）制备利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的工作电极包括：

①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用抛光粉抛光成镜面，依次用无水乙醇、超二次水彻底冲洗；

②取6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的Au>2-GS分散液滴到抛光好的电极表面，室温下晾干；

③将6.0 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的癌胚抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；

④将3.0 µL、0.5 ~ 1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑤滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑥将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化45>

其中步骤（4）利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法制作电流型免疫传感器检测癌胚抗原的工作曲线包括：

①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

②方法一：利用时间-电流曲线法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1s，运行时间120 s；当背景电流趋于稳定后，向磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5.0 mol/L的过氧化氢溶液，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

③方法二：利用方波脉冲伏安法对分析物进行检测，电压范围为0.4 V到-1.0 V，振幅为25 mV，频率为15 Hz，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

④利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原的浓度，并对比两种检测方法的检测结果，从而起到相互验证的目的。

本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明以Au>2-GS作为为基底平台，其中氨基化石墨烯具有良好的导电性、较大的表面积，不仅能够加速电子的传递，还能为金纳米粒子的负载提供较多的活性位点。金纳米粒子具有良好的生物相容性和卓越的导电性，能够负载到氨基化石墨烯上固载癌胚抗体。此外，我们还利用循环伏安法通过Laviron原理(Journal>s)进行测试，测试结果(k_s>-1)显示Au>2-GS可以加速电子转移；

（2）本发明以Au@Pd>2+-CS/PPy>2+和过氧化氢形成芬顿试剂可以催化过氧化氢分解，能够进一步提高传感器的灵敏度。此外，由于Fe²⁺也可以作为信号源直接用于癌胚抗原的检测；

（3）本发明所构建的电流型免疫传感器通过时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法对癌胚抗原进行检测，实现了精确定量检测癌胚抗原目的，时间-电流曲线法线的性检测范围是50 fg/mL ~ 50 ng/mL，最低检测下限为17 fg/mL；方波脉冲伏安法的性检测范围是500fg/mL ~ 5 ng/mL，最低检测下限为167 fg/mL；

（4）本发明通过对比线性范围在500 fg/mL ~ 5 ng/mL的检测结果，说明该电流型免疫传感器具有良好的准确性，从而起到两种方法相互验证的目的。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2包括：

①制备金钯核壳纳米枝晶(Au@Pd NDs)

取0.4 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到49 mL的二次水中，加热至沸腾，快速加入1.0mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，搅拌条件下维持沸腾10 min后得金纳米粒子分散液；向15 mL金纳米粒子分散液中依次加入80 mg的十六烷基氯化吡啶、8.0 mL的二次水和0.5 mL、20mmol/L的氯化钯溶液，搅拌10 min后加入1.0 mL、0.1 mol/L新配的抗坏血酸溶液，40℃下放置4 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd NDs；

②制备壳聚糖功能化聚吡咯纳米管(CS/PPy NTs)

取0.2 g三氯化铁分散在12 mL二次水中，在搅拌条件下加入12 mL、10 mmoL/L的甲基橙溶液，磁力搅拌3 min后，滴加90 μL吡咯，室温下反应12 h，离心、水洗至上清液pH呈中性，将下层沉淀冷冻干燥，得聚吡咯纳米管；将0.2 g的壳聚糖加入到50 mL、0.1 wt%的乙酸溶液中，超声分散均匀后加入15 mg聚吡咯纳米管，连续超声2 h后离心、水洗至上清液pH呈中性，冷冻干燥得CS/PPy NTs；

③制备Au@Pd>2+-CS/PPy>

取15 mg的CS/PPy NTs超声分散在20 mL、0.2 mg/mL的Au@Pd NDs分散液中，室温下振荡6 h后加入60 mg的硫酸亚铁，继续振荡另外6 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd>2⁺-CS/PPy>

④制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2

取4 mg的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液(pH = 7.0)，4℃下振荡孵化10 h，离心后将下层沉淀分散在4.0 mL、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得Au@Pd>2+-CS/PPy>2分散液，4℃下保存备用。

实施例2制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2包括：

①制备金钯核壳纳米枝晶(Au@Pd NDs)

取0.5 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到49 mL的二次水中，加热至沸腾，快速加入1.3mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，搅拌条件下维持沸腾10 min后得金纳米粒子分散液；向18 mL金纳米粒子分散液中依次加入85 mg的十六烷基氯化吡啶、8.0 mL的二次水和0.8 mL、20mmol/L的氯化钯溶液，搅拌10 min后加入1.3 mL、0.1 mol/L新配的抗坏血酸溶液，40℃下放置4 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd NDs；

②制备壳聚糖功能化聚吡咯纳米管(CS/PPy NTs)

取0.25 g三氯化铁分散在14 mL二次水中，在搅拌条件下加入13 mL、10 mmoL/L的甲基橙溶液，磁力搅拌3 min后，滴加95 μL吡咯，室温下反应12 h，离心、水洗至上清液pH呈中性，将下层沉淀冷冻干燥，得聚吡咯纳米管；将0.25 g的壳聚糖加入到50 mL、0.15 wt%的乙酸溶液中，超声分散均匀后加入18 mg聚吡咯纳米管，连续超声2 h后离心、水洗至上清液pH呈中性，冷冻干燥得CS/PPy NTs；

③制备Au@Pd>2+-CS/PPy>

取18 mg的CS/PPy NTs超声分散在20 mL、0.3 mg/mL的Au@Pd NDs分散液中，室温下振荡6 h后加入80 mg的硫酸亚铁，继续振荡另外6 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd>2⁺-CS/PPy>

④制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2

取6 mg的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液(pH = 7.0)，4℃下振荡孵化10 h，离心后将下层沉淀分散在4.0 mL、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得Au@Pd>2+-CS/PPy>2分散液，4℃下保存备用。

实施例3制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2包括：

①制备金钯核壳纳米枝晶(Au@Pd NDs)

取0.6 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到49 mL的二次水中，加热至沸腾，快速加入1.5mL、1.0 wt%的柠檬酸钠溶液，搅拌条件下维持沸腾10 min后得金纳米粒子分散液；向20 mL金纳米粒子分散液中依次加入90 mg的十六烷基氯化吡啶、8.0 mL的二次水和1.0 mL、20mmol/L的氯化钯溶液，搅拌10 min后加入1.5 mL、0.1 mol/L新配的抗坏血酸溶液，40℃下放置4 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd NDs；

②制备壳聚糖功能化聚吡咯纳米管(CS/PPy NTs)

取0.3 g三氯化铁分散在15 mL二次水中，在搅拌条件下加入15 mL、10 mmoL/L的甲基橙溶液，磁力搅拌3 min后，滴加100 μL吡咯，室温下反应12 h，离心、水洗至上清液pH呈中性，将下层沉淀冷冻干燥，得聚吡咯纳米管；将0.3 g的壳聚糖加入到50 mL、0.2 wt%的乙酸溶液中，超声分散均匀后加入20 mg聚吡咯纳米管，连续超声2 h后离心、水洗至上清液pH呈中性，冷冻干燥得CS/PPy NTs；

③制备Au@Pd>2+-CS/PPy>

取20 mg的CS/PPy NTs超声分散在20 mL、0.5 mg/mL的Au@Pd NDs分散液中，室温下振荡6 h后加入100 mg的硫酸亚铁，继续振荡另外6 h后离心、水洗，冷冻干燥得Au@Pd>2+-CS/PPy>

④制备Au@Pd>2+-CS/PPy>2

取8 mg的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液(pH = 7.0)，4℃下振荡孵化10 h，离心后将下层沉淀分散在4.0 mL、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得Au@Pd>2+-CS/PPy>2分散液，4℃下保存备用。

实施例4制备Au>2-GS包括：

①制备氨基化石墨烯(NH₂-GS)

取96 mL、98 wt%的浓硫酸加入0.5 g石墨粉和10 mg硝酸钠，搅拌30 min后，冰水浴搅拌条件下缓慢加入5 g高锰酸钾，继续搅拌30 min后加热至60℃，反应8 h后，加40 mg的冰，再加0.5 mL、30 wt%的过氧化氢，搅拌20 min后离心、水洗至上清液pH呈中性，将沉淀加到40 mL的水，超声40 min后5000 rpm离心，将上层液体冷冻干燥得到氧化石墨烯；取50 mg氧化石墨烯加入20 mL乙二醇，超声30 min，加0.5 mL的浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应8 h，冷却到室温后离心分离，室温下干燥得NH₂-GS；

②制备Au>2-GS

取15 mg的NH₂-GS>2-GS。

实施例5制备Au>2-GS包括：

①制备氨基化石墨烯(NH₂-GS)

取96 mL、98 wt%的浓硫酸加入0.8 g石墨粉和10 mg硝酸钠，搅拌30 min后，冰水浴搅拌条件下缓慢加入6 g高锰酸钾，继续搅拌30 min后加热至70℃，反应8 h后，加40 mg的冰，再加0.8 mL、30 wt%的过氧化氢，搅拌20 min后离心、水洗至上清液pH呈中性，将沉淀加到40 mL的水，超声40 min后5000 rpm离心，将上层液体冷冻干燥得到氧化石墨烯；取50 mg氧化石墨烯加入20 mL乙二醇，超声30 min，加0.5 mL的浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应8 h，冷却到室温后离心分离，室温下干燥得NH₂-GS；

②制备Au>2-GS

取18 mg的NH₂-GS>2-GS。

实施例6制备Au>2-GS包括：

①制备氨基化石墨烯(NH₂-GS)

取96 mL、98 wt%的浓硫酸加入1.0 g石墨粉和10 mg硝酸钠，搅拌30 min后，冰水浴搅拌条件下缓慢加入7 g高锰酸钾，继续搅拌30 min后加热至90℃，反应8 h后，加40 mg的冰，再加1.0 mL、30 wt%的过氧化氢，搅拌20 min后离心、水洗至上清液pH呈中性，将沉淀加到40 mL的水，超声40 min后5000 rpm离心，将上层液体冷冻干燥得到氧化石墨烯；取50 mg氧化石墨烯加入20 mL乙二醇，超声30 min，加0.5 mL的浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应8 h，冷却到室温后离心分离，室温下干燥得NH₂-GS；

②制备Au>2-GS

取20 mg的NH₂-GS>2-GS。

实施例7制备利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的工作电极包括：

①将直径为3.0 mm的玻碳电极用抛光粉抛光成镜面，依次用无水乙醇、超二次水彻底冲洗；

②取6.0 µL、1.0 mg/mL的Au>2-GS分散液滴到抛光好的电极表面，室温下晾干；

③将6.0 µL、8.0 µg/mL的癌胚抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；

④将3.0 µL、0.5 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑤滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑥将6.0 µL、1.0 mg/mL的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化45>

实施例8制备利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的工作电极包括：

①将直径为4.0 mm的玻碳电极用抛光粉抛光成镜面，依次用无水乙醇、超二次水彻底冲洗；

②取6.0 µL、2.0 mg/mL的Au>2-GS分散液滴到抛光好的电极表面，室温下晾干；

③将6.0 µL、10.0 µg/mL的癌胚抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；

④将3.0 µL、1.0 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑤滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑥将6.0 µL、2.0 mg/mL的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化45>

实施例9制备利用双检测方法相互验证的电流型免疫传感器的工作电极包括：

①将直径为5.0 mm的玻碳电极用抛光粉抛光成镜面，依次用无水乙醇、超二次水彻底冲洗；

②取6.0 µL、3.0 mg/mL的Au>2-GS分散液滴到抛光好的电极表面，室温下晾干；

③将6.0 µL、12.0 µg/mL的癌胚抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；

④将3.0 µL、1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑤滴加6.0 µL、0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥将6.0 µL、3.0 mg/mL的Au@Pd>2+-CS/PPy>2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化45>

实施例10利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法制作电流型免疫传感器检测癌胚抗原的工作曲线包括：

①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

②方法一：利用时间-电流曲线法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1s，运行时间120 s；当背景电流趋于稳定后，向磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5.0 mol/L的过氧化氢溶液，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

③方法二：利用方波脉冲伏安法对分析物进行检测，电压范围为0.4 V到-1.0 V，振幅为25 mV，频率为15 Hz，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

④利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原的浓度，并对比两种检测方法的检测结果，从而起到相互验证的目的。

实施例11利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法制作电流型免疫传感器检测癌胚抗原的工作曲线包括：

①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

②方法一：利用时间-电流曲线法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1s，运行时间120 s；当背景电流趋于稳定后，向磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5.0 mol/L的过氧化氢溶液，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

③方法二：利用方波脉冲伏安法对分析物进行检测，电压范围为0.4 V到-1.0 V，振幅为25 mV，频率为15 Hz，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

④利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原的浓度，并对比两种检测方法的检测结果，从而起到相互验证的目的。

实施例12利用时间-电流曲线法和方波脉冲伏安法制作电流型免疫传感器检测癌胚抗原的工作曲线包括：

①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

②方法一：利用时间-电流曲线法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1s，运行时间120 s；当背景电流趋于稳定后，向磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

③方法二：利用方波脉冲伏安法对分析物进行检测，电压范围为0.4 V到-1.0 V，振幅为25 mV，频率为15 Hz，记录不同浓度下癌胚抗原所对应的电流值，绘制检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；

④利用工作曲线法，得到待测样品中癌胚抗原的浓度，并对比两种检测方法的检测结果，从而起到相互验证的目的。