一种适于植物染色体rDNA物理定位的探针组合和方法

摘要

本发明公开了一种适于植物染色体rDNA物理定位的探针组合和方法；涉及分子细胞遗传学技术领域。该探针组合包括SEQ ID NO.1‑4的探针，分别是5S rDNA探针、5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针；采用该探针组合及方法进行植物染色体原位杂交，可以捕获到较高分辨率的染色体及荧光原位杂交信号，适用于多种植物的染色体原位杂交；且该探针组合为寡核苷酸探针，具有制作成本低、使用方便、操作简单等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及分子细胞遗传学技术领域，具体而言，涉及一种适于植物染色体 rDNA物理定位的探针组合和方法。

背景技术

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是把用生物素等荧光标记物质标记的DNA片段作为探针(probe)，与染色体DNA进行分子 杂交，在荧光显微镜下直接检测与探针互补的DNA片段的存在部位。

通过荧光原位杂交技术可以将rDNA(Ribosomal DNA，核糖体DNA)在 染色体上进行物理定位。目前，rDNA已在重要的模式作物和经济作物的基因组 中进行了广泛的物理定位，为这些物种的染色体识别，基因组结构分析，物理图 谱构建，以及物种亲缘关系的研究提供了直接的信息。

常用的rDNA探针的制备方法：通过提取质粒获取rDNA的双链DNA序 列，然后通过缺刻平移法标记探针，探针标记结束后应用凝胶电泳检测探针大小， 合适大小的探针才可用于荧光原位杂交。地高辛和生物素标记的探针由于稳定性 相对较高，因而在研究工作中得到广泛应用。

该探针的缺点：探针标记对DNA质量要求较高，从获取高质量的DNA到 探针标记及大小检测需要花费较高的试剂费用；而且需要保存菌液，摇菌扩繁大 肠杆菌，过程比较繁琐，耗费时间和人力；缺刻平移法标记的探针为双链且长度 不一致，杂交效率较低。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适于植物染色体rDNA物理定位的探针组合，采 用该探针组合进行植物染色体原位杂交，可以产生较清晰的荧光信号，适用于多 种植物的染色体原位杂交；且该探针组合为寡核苷酸探针，具有制作成本低、使 用方便、操作简单等特点。

本发明的另一目的在于提供一种用于植物染色体原位杂交的方法，采用该方 法进行植物染色体原位杂交，可以产生清晰的荧光信号，便于对植物染色体的 rDNA进行物理定位；该方法使用的rDNA探针为寡核苷酸探针，使用方便，操 作简单。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种适于植物染色体rDNA物理定位的探针组合，其 包括5SrDNA探针和/或45S rDNA探针；

上述5S rDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

上述45S rDNA探针由5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针 组成，上述5.8S rDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，上述18S rDNA 探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，上述25S rDNA探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

通过本发明的发明人的科学合理的设计，本发明提供的探针组合包括的SEQ IDNO.1的5S rDNA探针，其根据拟南芥5S rDNA(GenBank AJ307346.2)转 录区5'端的第1-59位碱基设计而成，得到长度59nt的如SEQ ID NO.1所示的5S rDNA探针。

另外，区别于传统45S rDNA质粒序列，本发明的发明人根据拟南芥45S rDNA的3个转录区共设计了3个59nt的寡核苷酸探针(命名为5.8S rDNA探 针、18S rDNA探针和25SrDNA探针)。其中，本发明提供的5.8S rDNA探针根 据拟南芥5.8S rDNA(GenBank NR_141643.1)5'端的第1-59位碱基设计而成，本 发明提供的18S rDNA探针根据拟南芥18SrDNA(GenBank NR_141642.1)5'端的 第1-59位碱基设计。通过对比发现，拟南芥25S rDNA探针5'端的第25-84区 域的碱基较保守，根据该区域设计出长度为59nt的如SEQ ID NO.4所示25S rDNA探针。

上述的5S rDNA探针(SEQ ID NO.1)、5.8S rDNA探针(SEQ ID NO.2)、 18S rDNA探针(SEQ ID NO.3)和25S rDNA探针(SEQ ID NO.4)均为寡核苷 酸探针，与传统FISH体系所用的质粒探针相比，寡核苷酸荧光原位杂交不需要 用质粒DNA标记探针，变性探针，也不需要加抗体，既节约成本，也节约时间。

此外，各探针的长度均为59nt，各探针都选自拟南芥rDNA合适的区域，这 样的设计有利于提高探针的灵敏度、可靠性及应用的广泛性，使其可以用于多种 植物的染色体原位杂交，产生较清晰的荧光信号，便于对植物染色体的rDNA进 行物理定位。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述5S rDNA探针的两端标记有 第一荧光基团；上述45S rDNA探针的两端标记有第二荧光基团即5.8S rDNA探 针、18S rDNA探针和25S rDNA探针的两端均标记有第二荧光基团。上述第一 荧光基团和上述第二荧光基团不同。

本发明的发明人发现，相较于传统的一端的荧光基团标记策略，采用在探针 的两端标记荧光基团的策略能够增加荧光信号，是探针杂交后显示出更清晰的荧 光信号，易于检测和观察。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一荧光基团为羧基荧光素 (FAM)；

上述第二荧光基团为羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。

需要说明的是，荧光基团的类别并不限于上述类别，其他荧光基团或理解为 荧光染料例如Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、 AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、 BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲 氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、 6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、 6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二 甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲 酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化 合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla 蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青 蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、 TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红等也 是可以被用来标记本发明所提供的探针。

无论选用何种荧光染料，只要是用于标记本发明所提供的探针例如5S rDNA 探针(SEQ ID NO.1)、5.8S rDNA探针(SEQ ID NO.2)、18S rDNA探针(SEQ ID NO.3)或25S rDNA探针(SEQ ID NO.4)，其均属于本发明的保护范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述植物为郁金香、百合、玉米、 牵牛花、秋海棠等。

再一方面，本发明提供了一种植物染色体原位杂交的方法，其包括如下步骤：

原位杂交步骤：往植物染色体制片上加入杂交液，进行杂交；

其中，上述杂交液含有上述的探针组合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述杂交液中5S rDNA探针浓度 为1-2ng/μl。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述杂交液中45S rDNA探针的浓 度为1-2ng/μl。即5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针三种探针 的浓度之和为1-2ng/μl。

探针的浓度是影响后续应该荧光信号的一个重要因素，探针在合适的浓度范 围内，既可以产生比较明显的荧光信号，又能节约成本。探针浓度过低，容易导 致目标信号不明显，探针浓度过高，会导致使用成本的增加，且荧光信号强度的 增加并不明显。

将5S rDNA探针浓度控制在1-2ng/μl的范围内，和将45S rDNA探针中的 各探针(5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针)浓度控制在0.3-0.7 ng/μl的范围内即可以产生明显的可观测信号，在此范围基础上进一步增加探针 浓度，荧光信号的增强并不显著。

需要说明的是，5S rDNA探针浓度可以是1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、 1.8、1.9和2ng/μl中的任意一者或两者的范围。

5.8S rDNA探针浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6和0.7ng/μl中的任意一者或 两者的范围。

18S rDNA探针浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6和0.7ng/μl中的任意一者或两 者的范围。

25S rDNA探针浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6和0.7ng/μl中的任意一者或 两者的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述杂交液还含有：去离子甲酰胺(dFA)、SSC缓冲液和硫酸葡聚糖(DS)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在原位杂交步骤之前，上述方法还 包括预处理步骤；

上述预处理步骤包括：将取得的植物体根尖用环乙酰胺在室温下浸泡，用蒸 馏水冲洗后转移到卡诺固定液中。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述植物为郁金香、百合、玉米、 牵牛花、秋海棠等。

形态良好的分裂相是进行原位杂交的前提，采用上述的预处理步骤可使染色 体保持良好形态，有利于后续的原位杂交产生清晰的信号。

总之，采用本发明提供的植物染色体原位杂交的方法，不仅可以产生清晰的 荧光信号，且还具有操作步骤简单便捷等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使 用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因 此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例3中的伊犁郁金香染色体的荧光原位杂交检测结果；图 中：A：未进行荧光原位杂交的染色体检测结果图；B：进行了荧光原位杂交后 的5S rDNA(绿色)和45S rDNA(红色)信号的合成图；C：从C2中剪裁并依 据染色体形态及寡核苷酸rDNA探针信号配对排列的染色体；比例尺为10μm。

图2为本发明实施例4中的垂蕾郁金香染色体的荧光原位杂交检测结果；图 中：A：未进行荧光原位杂交的染色体检测结果图；B：进行了荧光原位杂交后 的5S rDNA(绿色)和45S rDNA(红色)信号的合成图；C：从G2中剪裁并 依据染色体形态及寡核苷酸rDNA探针信号配对排列的染色体；比例尺为10μm。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施 例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规 条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种用于植物染色体原位杂交的探针组合，其包括5S rDNA 探针和45S rDNA探针；

5S rDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

45S rDNA探针由5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针组成。

5.8S rDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，18S rDNA探针的核苷 酸序列如SEQ ID NO.3所示，25S rDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，5S rDNA探针两端标记FAM荧光基团；

5.8S rDNA探针、18S rDNA探针和25S rDNA探针这三种探针的两端均标 记TAMRA荧光基团。

各rDNA寡核苷酸探针的核苷酸序列及修饰如下表1所示：

表1各rDNA探针的核苷酸序列及修饰

实施例2

本实施例提供了的一种植物染色体原位杂交的方法，其包括如下步骤：

1中期染色体的制备

(1)取材：取植物生长旺盛的的根尖(0.5-1.5cm)作为材料。

(2)预处理：将新鲜取得的根尖用0.7mM的环乙酰胺在室温下预处理4-8小 时(不同物种所需时间不同，根据实际情况确定)，用蒸馏水冲洗后，转移到卡 诺固定液中(3:1乙醇:乙酸，v/v)。

(3)酶解：将固定好的根尖置于蒸馏水中彻底冲洗干净，然后切取根尖分生 组织，并放入含有4％的纤维素和2％的果胶酶的酶混合物中，在37℃的恒温箱 中酶解大约0.5-1.5h(不同物种所需时间不同，根据实际情况确定)。

(4)制片：

将酶解后的根尖分生组织置于水中，然后转移1-2团分生组织到载玻片上， 用镊子轻轻挤压出根尖分生组织细胞，滴加约20μl的60％乙酸，用解剖针混匀， 将载玻片置于温度为55℃的热台上，用解剖针涂抹细胞悬液，立即用新鲜的卡 诺固定液冲洗并风干。

2中期染色体拍照及制片预处理

(1)拍照：制片加含有DAPI的Vectashield后，盖上盖玻片，在荧光显微镜 下观察并拍照良好的染色体分裂相，同时记录所拍分裂相的坐标位置。

(2)清洗：将具有2个以上良好分裂相的制片在1×PBS中泡掉盖玻片，于42℃ 的1×PBS中洗10分钟，70％，90％和100％乙醇逐级脱水，各5分钟，然后风 干。

(3)预固定：将制片在4％的甲醛溶液中固定15分钟；2×SSC洗涤3次，每 次5分钟；70％，90％和100％乙醇逐级脱水，各5分钟，然后风干。

3原位杂交

(1)染色体制片变性：染色体制片在85℃、70％去离子甲酰胺中变性2-6min (不同物种所需时间不同)，立即转移到-20℃的70％，90％和100％的冰乙醇中 逐级脱水，每次5min，然后风干。

(2)配制杂交液：根据表2配制杂交液。

杂交液成分如下表2所示：

表2 20μl杂交液的成分及配比

其中，45SrDNA探针由5.8S rDNA探针(20ng/μl)、18S rDNA探针(20ng/μl)、25SrDNA探针(20ng/μl)等体积混合而成。5SrDNA探针和45SrDNA探针均为实施例1 提供的探针。

(3)原位杂交：每张制片滴加20μl的杂交液，然后将染色体制片置于湿盒 中，37℃杂交过夜。

(4)杂交后漂洗及封片：甩掉盖玻片，室温下，2×SSC漂洗5min，1×TNT 漂洗5min。用去离子水冲洗后，吹干制片，最后用20μl的Vectashield(含有 DAPI)封片。

5照相及图像处理

根据所记录的分裂相坐标位置，在荧光显微镜下(Model BX51；Olympus, Tokyo,Japan)观察制片，并使用附带的CCD拍摄图像。用ImagJ软件将拍摄的 灰度图像合成照片，并使用ADOBE PHOTOSHOP 5.0(Adobe Systems,http:// www.adobe.com)对图片进行处理，最终使用原位杂交前拍摄的染色体和荧光信 号合成图片，保障了最佳染色体形态和清晰的杂交信号。

实施例3

本实施例以郁金香属的伊犁郁金香(T.iliensis Regel)为材料，按照实施例2 的方法进行荧光原位杂交，结果如图1所示。

从图1可以看出，染色体形态良好，荧光信号非常清晰，伊犁郁金香中有5 个5SrDNA位点(绿色)，其中4个位于4号和10号同源染色体的短臂上近着 丝粒区，另外1个位于11号同源染色体中一条染色体的长臂上。伊犁郁金香共 有15个45S rDNA位点(红色)，大部分位于长臂末端，其中2个分布于11号 染色体的短臂末端，12个位点分布于5、6、8、9、10和12号同源染色体的长 臂末端。7号同源染色体中有一条染色体的长臂末端有45S rDNA位点，另外一 条没有信号。

实施例4

本实施例以郁金香属的垂蕾郁金香(T.patens Agardh.ex Schult.)为材料，按照实施例2的方法进行荧光原位杂交，结果如图2所示。

从图2可以看出，荧光信号非常清晰，垂蕾郁金香有两对5S rDNA位点(绿 色)，分别位于1和10号染色体短臂近着丝粒的位置。45S rDNA大部分位于染 色体的短臂。垂蕾郁金香有22个45S rDNA位点(红色)，其中16个位于短臂 末端，6个位于长臂末端。3、4、6、8、9和12号同源染色体有1对位点位于短 臂末端。2和11号同源染色体染色体中有一条染色体没有信号，另外一条同源 染色体在短臂末端有45S rDNA的位点。5和7号同源染色体的长臂末端有1对 信号点。10号同源染色体的长短臂各有1对45SrDNA位点。1号同源染色体短 臂末端有时会出现极弱的45S rDNA信号点。

综上，可以看出，采用本发明实施例提供的探针组合对郁金香染色体进行原 位杂交，产生了非常清晰的荧光信号。由此说明，采用本发明提供的探针组合及 方法进行植物染色体原位杂交，可以捕获到较高分辨率的染色体及荧光原位杂交 信号，其可适用于多种植物例如百合、玉米、牵牛花、秋海棠等的染色体原位杂 交。且该探针组合为寡核苷酸探针，具有制作成本低、使用方便、操作简单等特 点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种适于植物染色体rDNA物理定位的探针组合和方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatgcgatc ataccagcac taatgcaccg gatcccatca gaactccgca gttaagcgt 59

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaacgactc tcggcaacgg atatctcggc tctcgcatcg atgaagaacg tagcgaaat 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacctggttg atcctgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcatgtg 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccgctgagt ttaagcatat caataagcgg aggaaaagaa actaacaagg attccctta 59