法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-07-31
授权
授权
2019-01-04
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K7/06 申请日:20180815
实质审查的生效
2018-12-11
公开
公开
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一类阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的类似物及其制备方法与应用。
背景技术
疼痛是一种令人不快的感觉和情绪上的感受，伴有实质上的或潜在的组织损伤，它是一种主观感受。正常生理情况下，疼痛作为一种保护机制以防机体受到伤害，但在病理情况下，疼痛与自主神经活动、运动反射、心理和情绪反应交织在一起，给患者带来痛苦，特别是慢性疼痛是临床尚未完全解决的难题。目前临床一线的阿片类镇痛药物在治疗中度或重度疼痛的同时，常伴随阿片样副作用，如便秘、呕吐、呼吸抑制、镇静和药物依赖等，从而使其应用受到了极大的限制。已有研究显示阿片肽能介导高效的镇痛作用，但其阿片样副作用与传统阿片镇痛药相比有所降低。因此，阿片肽可作为化学模板分子以用于高效、低副作用的阿片类镇痛新药研发。
近年来，多靶点药物研究逐渐得以重视，此类药物能平衡与疾病相关且具有内在联系的多个药物作用靶点，从而产生更好的疗效、更低的副作用，其疗效已在癌症、糖尿病、抑郁症以及感染性疾病(如艾滋病的鸡尾酒疗法)方面的治疗中得以验证。最新研究发现多靶点药物在镇痛新药的研发，特别是在复杂性疼痛治疗药物的研发中具有潜在的应用前景。如阿片-NK1、阿片-CB1、阿片-孤啡肽(NOR)等多靶点分子均具有无耐受镇痛活性。
神经肽FF(NPFF)是一类内源性阿片调节肽，可激活NPFF1和NPFF2受体，并参与阿片镇痛、耐受和成瘾等生物活性的调节。本课题组在专利ZL201210098832.2中公开了一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的全新嵌合肽BN-9(Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2)，该嵌合肽能同时激活Mu-、Delta-、Kappa-阿片受体、NPFF1和NPFF2受体，并且体内药理学鉴定发现BN-9的中枢镇痛作用优于吗啡，并且与吗啡相比，BN-9在耐受、便秘、成瘾等方面的阿片样副作用均显著降低。但嵌合肽BN-9不能穿透血脑屏障，外周注射时其镇痛作用与吗啡相当(Br>
多肽类药物与小分子药物以及大蛋白相比，合成技术成熟，用药量少、选择性强、特异性好、作用效果好、副作用小。但是多肽类药物半衰期一般很短，不稳定而且缺乏细胞渗透力，影响细胞吸收。因此为了提高多肽药物的稳定性以及细胞穿透能力，对于多肽的长效性以及血脑屏障的穿透能力的研究成为了多肽领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更具成药性的多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物。发明人经过大量的实验研究，通过在母体分子中引入侧链含有巯基结构的氨基酸残基，通过二硫键环化修饰而获得阿片/NPFF受体的多靶点分子BN-9的环化类似物，结果表明该类新型的BN-9二硫键环化类似物具有更长的镇痛作用时间，更低的有效镇痛剂量，克服了母体分子的血脑屏障通透性差等缺陷，并保持了母体无耐受、低成瘾性、低便秘等优点。与已报道的BN-9及其类似物相比，其体内镇痛药效和成药性均有大幅的提升，可用于各类疼痛等疾病的治疗。
本发明的另一目的是提供上述的多靶点肽类分子BN-9的二硫键环化类似物的合成方法。
本发明还有一个目的在于提供上述多靶点肽类分子BN-9的二硫键环化类似物的治疗用途，该类新型的BN-9的二硫键环化类似物可作为新一代治疗疼痛的潜在药物，能用于缓解各类疼痛症状，同时降低传统阿片类镇痛药物的副作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一类阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物，其氨基酸序列如下所示：
Tyr-Xaa2-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Arg-Phe-NH2
其中，Xaa2为Cys，D-Cys或D-Pen；
Xaa4为Phe或N-Me-Phe；
Xaa5为Cys，D-Cys或Gln；
Xaa6为D-Cys或Pro；
Xaa7为D-Cys或Gln；
所述的氨基酸序列中，Xaa5，Xaa6或Xaa7中仅有一个为Cys或D-Cys，
所述氨基酸序列中两个侧链含巯基的氨基酸残基通过二硫键连接的方式成环形成环肽。
优选的，所述的多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物选自下述化合物之一：
化合物1：Tyr-c[2，5][Cys-Gly-Phe-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物2：Tyr-c[2，5][D-Cys-Gly-Phe-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物3：Tyr-c[2，5][Cys-Gly-Phe-D-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物4：Tyr-c[2，5][D-Cys-Gly-Phe-D-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物5：Tyr-c[2，6][D-Cys-Gly-Phe-Gln-D-Cys]-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物6：Tyr-c[2，7][D-Cys-Gly-Phe-Gln-Pro-D-Cys]-Arg-Phe-NH2
化合物7：Tyr-c[2，5][D-Cys-Gly-N-Me-Phe-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
化合物8：Tyr-c[2，5][D-Pen-Gly-Phe-Cys]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
本发明化合物基于已有的阿片肽和NPFF的构效关系研究结果，对于激活阿片和NPFF受体起关键作用的氨基酸残基予以保留，如Tyr1、Gly3、Arg8和Phe9。在BN-9的基础上引入侧链含有巯基结构的氨基酸残基。同时，根据多肽二硫键环化修饰能稳定其优势构象，从而有效提高其生物活性、生物利用度和血脑屏障通透性，这样的二硫键成环是通过多肽分子中两个侧链含巯基结构的氨基酸残基侧链间通过二硫键化学连接而实现的。二硫键成环的残基位点分别为：2与5、2与6或者2与7侧链之间形成。
上述阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物的制备方法，利用固相合成的方法由氨基酸依次逐个地偶联在固相载体上，再经过固相肽-固相载体环氧化形成二硫键，最后裂解获得目的肽。
其中，所述的固相载体优选为氨基树脂。
其中，所述的固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂优选为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂优选为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合。上述氨基脱保护试剂以及偶联剂的使用量，使用配比，使用时机和处理方式为本领域技术人员公知的技术。
其中，所述的固相肽-固相载体环氧化形成二硫键的过程中，所使用的环氧化反应试剂优选为碘、或者K3Fe(CN)6与水与DMF的混合溶液、或者TI(tfa)3与苯甲醚与DMF的混合溶液。上述环氧化反应条件包括温度，压力，时间，以及试剂的使用剂量和使用时机为本领域技术人员公知的技术。
其中，所述的裂解过程中，使用的裂解剂优选为TFA与H2O按体积比95∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80∶5∶5∶5∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5∶2.5∶2.5∶2.5的混合溶液。上述裂解剂的使用量，使用配比，使用时机和处理方式为本领域技术人员公知的技术。
上述制备方法中，更为优选的工艺步骤如下：
包括以下工艺步骤：
i.固定装置及溶胀树脂：将手动玻璃多肽合成仪与带搅拌棒的电动搅拌器连接固定好，在合成仪中加入一定量的树脂，然后加入二氯甲烷(DCM)进行溶胀，搅拌30min，抽干30min，最后用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗树脂，洗3次每次3min。茚检树脂，正常情况下，树脂无色，溶液淡黄色；
ii.依次循环缩合氨基酸
ii.i.脱Fmoc保护基：加入体积比为1∶1∶98的六氢吡啶、1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯、DMF的混合溶液，搅拌反应3次，前两次5min最后一次10min，之后用DMF洗4次，每次3min。茚检通常为：树脂蓝色，溶液深蓝色；
ii.ii.缩合氨基酸：将Fmoc-AA-OH、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)、N-羟基苯并三氮唑(HOBt)依次溶解于DMF中，最后加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，搅拌均匀后直接加入合成仪，氩气保护下搅拌反应1h。反应完之后抽干用DMF洗3次，每次3min，茚检：树脂无色，溶液淡黄色；
氨基酸及其缩合剂的投量比例为Fmoc-AA-OH/HOBt/HBTU/DIEA＝1/1/1/2
ii.iii.肽链的延长：根据多肽序列，依次接入不同的Fmoc保护氨基酸，最后一个氨基酸通常使用Boc保护的氨基酸，省去最后一步脱保护步骤，氨基酸缩合方法同上所述；
iii.多肽的环化
iii.i.加入I2(8>
iii.ii.反应结束后，依次用DCM(2×3min)，2％抗坏血酸DMF溶液(2×3min)，NMP(N-甲基-吡咯烷酮)(5×3min)，DCM(2×3min)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。
iv.压缩树脂：依次用DCM(2×3min)，MeOH(1×3min)，DCM(1×3min)，MeOH(2×3min)交替洗树脂，之后移去搅拌棒抽干4h。
v.多肽的切割和沉淀萃取：加入切割剂(切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、乙二硫醇、水以94∶1∶2.5∶2.5的体积比混合形成的溶液)(每1g树脂加入15mL切割液)，反应一般是在室温条件下3h。切割液用旋转蒸发仪(小于40℃)旋转蒸发掉TFA，在冰箱预冷15min。然后加入预冷的乙醚，静置沉淀。先用20％的醋酸水溶液萃取乙醚相，然后用水相溶解沉淀，再用20％的醋酸水溶液反复将沉淀萃取几遍。将萃取液冻干，得到粗肽。
vi.多肽的纯化：用反相高效液相色谱柱对粗肽进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到多靶点多肽产品。
当然本发明不局限于上述具体的工艺步骤，本领域技术人员可以基于固相合成以及环氧化的思路，对上述工艺步骤进行适应性调整和改进，最终制得本发明的目标肽产品。
一种药物组合物，含有权利要求1所述的一类阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物，例如以所述的BN-9类似物作为活性成分添加药学上可接受载体和/或辅料制成药物组合物。
上述阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物在制备治疗疼痛药物中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的疼痛包括但不限于急性疼痛或慢性疼痛，例如手术后切口痛、炎症痛(含关节炎痛)、神经痛和癌痛等各种病理性疼痛。研究实验显示，本发明的BN-9的二硫键环化类似物具有高效镇痛，并降低传统阿片类镇痛药物耐受、成瘾和便秘等副作用，在高效、低副作用的治疗急性痛和病理性疼痛等各类疼痛药物方面具有潜在的用途。
本领域技术人员可以理解，含有本发明的BN-9的二硫键环化类似物的药物组合物可适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、鞘内给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。适当剂型的实例为可用于注射的无菌溶液和干粉针剂，片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、气雾剂、鼻喷剂，以及用于皮肤表面的油膏和药贴。
含有本发明多肽药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或者其他可药用的载体将粉末重新配置，溶液配方一般是缓冲液、等渗溶液或水溶液。
本发明多肽的药用剂量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素，如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
在本说明书中，采用常规的三字母代码代表天然氨基酸，并采用公认的三字母代码代表其他氨基酸，如N-Me-Phe(Nα-甲基苯丙氨酸)、D-Cys(D型半胱氨酸)和D-Pen(D型青霉胺)。
本发明中，所使用的物料缩写方式为本领域公知，具体英文缩写和中文全称的对照详见表1。
表1实际英文缩写与中文全称对照表
有益效果：本发明公开的一类阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物可同时激活阿片和神经肽FF受体，并且介导高效、无耐受镇痛作用，该类BN-9的环化类似物的半衰期、血脑屏障穿透能力以及体内镇痛时间相对母体均有大幅的提高。具体优势体现如下：
(1)在分子数相同时，与母体BN-9相比，二硫键环化类似物的镇痛活性有大幅提高；
(2)与母体BN-9相比，二硫键环化类似物的代谢稳定性显著延长，其有效镇痛作用时间可延长至240分钟；
(3)与母体BN-9相比，二硫键环化类似物具有血脑屏障通透性，即皮下等外周注射能产生高效的镇痛活性。
附图说明
图1为小鼠侧脑室注射化合物2所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图2为小鼠侧脑室注射化合物4所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图3为小鼠皮下注射化合物2所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图4为小鼠皮下注射化合物4所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图5为小鼠注射甲碘化纳洛酮和纳洛酮对皮下注射BN-9的血脑屏障通透性机制结果；
图6为小鼠注射甲碘化纳洛酮和纳洛酮对皮下注射化合物2的血脑屏障通透性机制结果；
图7为小鼠注射甲碘化纳洛酮和纳洛酮对皮下注射化合物4的血脑屏障通透性机制结果；
图8为小鼠连续八天侧脑室注射芬太尼和化合物1、2、3、4和7所产生的镇痛作用的变化；
图9为小鼠连续八天皮下注射芬太尼和化合物1、2、3、4和7所产生的镇痛作用的变化；
图10为小鼠皮下注射化合物2对胃肠运动的作用；
图11为小鼠皮下注射化合物4对胃肠运动的作用；
图12为小鼠皮下注射化合物7对胃肠运动的作用；
图13为小鼠皮下注射芬太尼，化合物2和4对运动活性的调节作用；
图14为小鼠皮下注射芬太尼，化合物2和4对条件位置的调节作用；
图15为小鼠皮下注射芬太尼，化合物2和4对纳洛酮戒断后的反应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在具体的实施方案中，涉及下述多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物，其具体序列如表2所示：
表2多靶点分子BN-9及其二硫键环化类似物的氨基酸序列
实施例1化合物1-8的合成方法：
实验试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin(取代值S为0.43mmol/g；天津南开和成公司)，O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)(上海吉尔生化有限公司)，N-羟基苯并三氮唑(HOBt)(上海吉尔生化有限公司)，N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(北京百灵威)，1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU；百灵威)。茚三酮为上海试剂三厂产品。二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、六氢吡啶(哌啶)、甲醇(MeOH)和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸(TFA)、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。
实验仪器：固相多肽合成仪(由本实验室自主设计)，旋转蒸发仪(RE-5298A，上海亚荣)，冷冻干燥机(VIRTIS，美国)，质谱仪(ESI-Q-TOF maXis-4G，Bruker Daltonics，德国道尔顿公司)，循环水泵(SHB-III型，郑州长城)，高效液相色谱仪(HPLC)为Waters公司的Delta 600；分析柱：XBridge TM BEH 130 Prep C18，4.6mm×250mm；制备柱：XBridge TMBEH 130 Prep C18，19mm×250mm。
合成方法：
1.化合物1的合成
(1)树脂预处理：称取1g的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8>[2，5][Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin
(7)肽链的压缩抽干：依次用DCM(2×3min)，MeOH(1×3min)，DCM(1×3min)，MeOH(2×3min)交替洗树脂，之后移去搅拌棒抽干4h。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末367.5mg，粗肽产率为76.49％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物1样品，上样量50.0mg，通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末31.9mg，纯肽产率63.8％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
2.化合物2的合成
(1)树脂预处理：称取1g的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末392mg，粗肽产率81.59％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物2样品，上样量43.4mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末10.0mg，纯肽产率23.04％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
3.化合物3的合成
(1)树脂预处理：称取1g的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末405.5mg，粗肽产率84.40％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物3样品，上样量71.2mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末12.0mg，纯肽产率16.85％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
4.化合物4的合成
(1)树脂预处理：称取1g的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-D-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末360mg，粗肽产率74.93％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物4样品，上样量150mg，通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末25.0mg，纯肽产率16.67％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
5.化合物5的合成
(1)树脂预处理：称取600mg的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-D-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-D-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，6][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-D-Cys(Trt)]-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Tyr(tBu)-c[2，6][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-D-Cys(Trt)]-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末224.6mg，粗肽产率75.81％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物5样品，上样量60.0mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末15.0mg，纯肽产率25.00％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
6.化合物6的合成
(1)树脂预处理：称取800mg的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-Pro-D-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-Pro-D-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，7][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-Pro-D-Cys(Trt)]-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，7][D-Cys(Trt)-Gly-Phe-Gln(Trt)-Pro-D-Cys(Trt)]-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末200mg，粗肽产率69.34％。
(9)粗肽的纯化：反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物6样品，上样量50.0mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末14.0mg，纯肽产率28.00％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
7.化合物7的合成
(1)树脂预处理：称取800mg的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-N-MePhe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-N-Me Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Cys(Trt)-Gly-N-MePhe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-N-MePhe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Cys(Trt)-Gly-N-MePhe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末194.2mg，粗肽产率49.90％。
(9)粗肽的纯化；反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物7样品，上样量150.0mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末35.0mg，纯肽产率23.3％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
8.化合物8的合成
(1)树脂预处理：称取800mg的Rink MBHA树脂(取代值为0.43mmol/g)，然后加入适量的DCM溶胀树脂，搅拌反应30min之后抽干30min。
(2)脱除Fmoc保护基团：同化合物1合成过程中脱除Fmoc保护基团的操作。
(3)茚检：同化合物1合成过程中茚检的操作。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1∶1∶1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，然后溶解在少量的DMF中，搅拌溶解。然后再加入2倍摩尔量的DIEA，搅拌均匀之后加入已经脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护的条件下，在合成仪之中搅拌反应60min。反应完之后按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Pen(Trt)-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH依次缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Pen(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：在得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-D-Pen(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入I2(8equiv)的DMF溶液，缓慢搅拌反应4h，合成仪的通气口与外界相通，DMF溶液加到与通气口平行的位置。反应结束后，依次用(2×DCM、2×2％抗坏血酸的DMF溶液、5×NMP(N-甲基-吡咯烷酮)、2×DCM)洗树脂，直到完全洗掉树脂上碘单质的颜色。得到环化肽Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Pen(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(7)肽链的压缩抽干：同化合物1合成过程中压缩抽干的操作。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-c[2，5][D-Pen(Trt)-Gly-Phe-Cys(Trt)]-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(TFA∶EDT∶H2O∶Tis＝94∶2.5∶2.5∶1，每1g的肽树脂中加入15ml的切割剂)。于室温下搅拌反应3h，每15min搅拌一次。然后在不高于40℃的条件下充分减压旋干，然后加入冰乙醚，充分振荡混匀。振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。然后用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽。然后将萃取到的肽的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末280.0mg，粗肽产率71.07％。
(9)粗肽的纯化；反相高效液相色谱(HPLC)C18柱(XBridge TM BEH 130 PrepC18，19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，流动相为乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)，经分离后收集主峰样品，得到纯化的化合物8样品，上样量100.0mg。通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末24.0mg，纯肽产率24.0％。质谱和色谱分析检测结果如表3所示。
基于以上合成步骤，本发明合成包括如表2所列的多靶点分子BN-9类似物，其化学表征结果如表3所示。
表3多靶点分子BN-9类似物的化学表征
注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-80％乙腈/水(0.1％TFA)(30分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridgeTMBEH>18，4.6mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-100％乙腈/水(0.1％TFA)(30分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridgeTMBEH>18，4.6mm×250mm。
实施例2类似物对阿片和NPFF受体的体外功能活性测定：
在稳定表达Mu-、Delta-、Kappa-阿片以及NPFF1和NPFF2受体的HEK293细胞中，通过检测该类阿片与NPFF受体的多靶点环化多肽对Forskolin引起的细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的积累的调节来检测它们对这五种受体的激动活性。具体方法为：将稳定表达Mu-、Delta-、Kappa-阿片以及NPFF1和NPFF2受体的HEK293细胞以每孔种12万细胞接种于24孔板中，培养箱中培养20小时以上。实验开始时，将细胞培养液置换为预热的含1mM>3]cAMP，迅速混匀后，4℃孵育大于2小时。孵育结束后，每管再加入100μL活性炭悬浮液，涡旋震荡均匀后冰浴放置1min，5000rpm离心4min。每管吸取离心后的上清液200μL加入到24孔板中，每孔再加入700μL闪烁液，之后用胶膜封闭24孔板，放置3小时后将其置于闪烁仪上测量。
cAMP的抑制效应用药物对Forskolin诱导的胞内cAMP积累的抑制百分比(％control)表示，％control＝(Forskolin处理的cAMP含量-待测药物与Forskolin共处理的cAMP含量)/(Forskolin处理的cAMP含量-溶剂处理的cAMP含量)。相关的％control数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)表示。药物剂量效应关系用非线性回归模型统计，利用统计软件GraphPad Prism 5.0版本，分别计算出该类阿片与NPFF受体的多靶点环化多肽对Forskolin引起的细胞内cAMP的积累抑制的IC50值，结果见表4和表5。
表4 多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物在阿片受体上的cAMP功能实验
表5 多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物在NPFF受体上的cAMP功能实验
如表4所示，在稳定表达Mu-、Delta-和Kappa-阿片受体的HEK293细胞系中，化合物1-4和7都剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累，从而说明这些化合物均表现为Mu-、Delta-和Kappa-阿片受体的激动活性。并且，如表5所示，在稳定表达NPFF1和NPFF2受体的HEK293细胞系中，化合物1-4和7都剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累，从而说明这些化合物同时还具有NPFF1和NPFF2受体的激动活性。综上所述，化合物1-4和7能同时激活阿片和NPFF受体，表现为一类阿片和NPFF受体的多靶点激动剂。
实施例3类似物的离体酶解稳定性测定：
酶解稳定性实验，一种在体外鉴定药物在脑匀浆或者血浆中稳定性的实验。将化合物与脑匀浆或者血浆孵育之后，样品通过反向HPLC来分析样品的浓度。然后计算化合物的半衰期。酶解稳定性实验的具体方法如下：
30±5g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑(去除小脑及脑桥)，用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗几次，除去大脑上的残留血，滤纸吸干，称重。加50倍体积冰冷的1mM Tris-HCl(pH＝7.4)(w/v＝2％)缓冲液，置于冰上匀浆。匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl，再次匀浆，吹打悬浮。4℃，49,000g离心45min，弃上清，沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷的Tris-HCl(50mM)中，吹打悬浮。同样条件下再次离心45min，弃上清，最后将沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中，混匀，用BCA试剂盒测定蛋白含量。终浓度是2.1mg/mL的Tris-HCl脑匀浆溶液。分装，-80℃冻存。
取10ul的多肽母液(0.01mM)加到190ul的脑匀浆中，肽的终浓度0.05mM。然后迅速取出20ul作为0min的点，然后剩下的肽继续37℃水浴。然后于5、10、15、30、60、90、120、240以及360min的时间点各取20ul孵育液。在取出的孵育液中加入等体积的冰乙腈，振荡混匀后冰上放置5min，迅速沉淀脑匀浆中的蛋白，终止酶解反应。13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。
化合物的酶解过程符合一级动力学方程：At＝A0e-Kt，其中A0：初始峰面积，At：t时峰面积，K代表消除速率常数，t：降解时间。由上式推出lnAt/A0＝-Kt，则当At/A0＝0.5时，则t1/2＝ln2/K＝0.693/K。结果再通过excell线性回归分析，计算获得线性相关性的R2值。
如表6所示，这些BN-9的二硫键环化类似物在脑匀浆中的酶解稳定性与母体相比，均具有一定程度的延长。特别是化合物2、3、4和7在脑匀浆中的体外半衰期分别为母体BN-9的4、5、5和6倍。
表6多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物的酶解稳定性实验
注，DN-9为中国专利201610252648.7中公开的化合物9，以下实施例中涉及到DN-9与本实施例使用的DN-9为同一化合物。
实施例4化合物1-8的体内镇痛活性测定：
采取中枢水平的侧脑室给药和外周水平的皮下给药两种给药方式，之后通过急性痛模型小鼠光热甩尾实验检测类似物的在体镇痛活性。
中枢水平的侧脑室给药需要提前进行侧脑室埋管手术，以保证给药位点的准确性以及对小鼠的伤害最小。使用小鼠立体定位仪进行侧脑室埋管，昆明系雄鼠，体重21±2g；首先腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉小鼠，准备所有手术器械，并进行消毒。然后将小鼠头顶手术区的毛剪干净。将小鼠的头部固定在立体定位仪上，然后先用碘伏对手术区进行消毒，沿矢状缝剪开头皮，露出颅骨然后找到前囟位置。从前囟向后3mm，向右1mm，同时用针在此处扎孔标记，即为侧脑室的上方位置。然后将自己做的带有PE10的不锈钢管子在扎针处向下移动3mm，此处即为侧脑室。然后用胶水和牙托粉固定管子，等牙托粉凝固之后，用外科手术线缝合起来，同时在不锈钢管上插入琴弦，以防止外物进入管子并堵塞不锈钢管。做完手术之后小鼠休息恢复3-4天，第4/5天可以用来给药做实验。小鼠侧脑室每次注射4μl药物，然后用1μl生理盐水冲洗钢管，给药总体积5μL。
皮下选择颈背部皮肤给药，使用1mL的无菌注射器，按0.1mL/10g的体积注射给药。左手将皮肤抓起，右手持注射器。将针头刺入皮下，针头向左右摆动，若容易摆动则表明已注入皮下。
辐射热甩尾实验，最初由D’Amour和Smith总结的实验方法，到现在有稍微的修改。实验中使用的是昆明雄系小鼠，实验之前小鼠可以自由饮水，并将其放在实验台上适应30min。光热甩尾实验测定中，右手紧握小鼠，辐射热集中照在距离小鼠尾部2-3cm处。辐射热的强度调到小鼠的甩尾基础阈值在3～5s之间。小鼠给药之后，根据不同的药物设计不同的时间点测定小鼠的甩尾潜伏期。将10s设置为最大潜伏期，因为辐射热照射时间太长会烫伤小鼠的尾巴。甩尾时间超过10s的均计为10s。
表7侧脑室和皮下注射多靶点分子BN-9类似物所产生的镇痛活性
小鼠给药之后，一般用最大镇痛效应MPE(％)来评价药物的镇痛效果；MPE(％)的计算方法为：MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈-基础痛阈)/(10秒-基础痛阈)]。ED50半数有效量(50％effective>50)在量效反应中指引起50％最大反应强度的药量。通过统计学软件GraphPad>50以及95％的置信区间。
在小鼠的光热甩尾急性镇痛实验中，侧脑室注射所有类似物的镇痛ED50如表6所示。所有类似物的ED50值均低于母肽BN-9(390.0pmol)，尤其是2、4、7和8号类似物的ED50分别为BN-9的27857、390000、931和1857倍，两个最优化合物的侧脑室镇痛图如图1和2所示。
此外，同样在小鼠的光热甩尾急性镇痛实验中，皮下注射所有类似物的镇痛ED50如表7所示。BN-9镇痛ED50值为1.461mg/kg。表6所列5个类似物的ED50值均低于1mg/kg。其中2和4号类似物的ED50值分别为BN-9的487和730倍。两个最优化合物的皮下镇痛图如图3和4所示。
实施例5>
血脑屏障通透性的药理学评价实验通过注射甲碘化纳洛酮来检测药物是否通过血脑屏障，甲碘化纳洛酮是一种不能通过血脑屏障的药物。实验中通过不同位点注射甲碘化纳洛酮，纳洛酮和化合物，然后通过光热甩尾实验来检测化合物镇痛的改变。
血脑屏障渗透性机制实验选用21±2g的昆明雄系小鼠，环境温度控制在22±2℃，小鼠可自由进食、饮水。甲碘化纳洛酮和纳洛酮都是提前10min给药，甲碘化纳洛酮选择侧脑室和皮下两种给药方式，纳洛酮和不同的化合物主要选择皮下外周水平给药，然后通过光热甩尾实验来检测给完拮抗剂和药物之后镇痛的改变。
实验数据用MPE(maximum possible effect)表示，MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈-基础痛阈)/(10秒-基础痛阈)]。药物的拮抗作用利用相关药物最大镇痛效应时间点的MPE值来进行比较。MPE数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)来表示，镇痛作用的差异使用单因素方差分析(one-way ANOVA的Bonferroni检验)进行统计，*P＜0.05，**P＜0.01以及***P＜0.001表示只注射相关药物组与同时注射拮抗剂组和相关化合物的差异显著性。
血脑屏障渗透性检测结果如表8所示，吗啡和芬太尼两个阳性化合物可以穿透血脑屏障，而母体BN-9不能穿透血脑屏障。侧脑室注射甲碘化纳洛酮能拮抗皮下注射化合物1-4和7所引起的外周镇痛，皮下注射甲碘化纳洛酮却不能拮抗皮下注射化合物1-4和7所引起的外周镇痛，从而说明化合物1-4和7均能穿透血脑屏障。如图5、6和7所示，BN-9和二硫键环化类似物(化合物2和4为代表)的血脑屏障通透性研究的具体结果。
表8多靶点分子BN-9类似物的血脑屏障通透性
实施例6>
镇痛耐受实验是通过观察连续8天给药之后，药物在光热甩尾实验中镇痛作用，从而评价本中类似物在镇痛耐受方面的药理活性。
21±2g的昆明雄系小鼠，环境温度控制在22±2℃，小鼠可自由进食、饮水。小鼠每天同一时间侧脑室注射同一浓度的药物，1天/次，连续8天，利用光热甩尾仪来检测药物连续注射之后对药物镇痛作用的影响。第一天测定甩尾潜伏期(3～5s)及给药之后不同时间点的镇痛，后面几天一般测最高镇痛作用点的镇痛活性。小鼠在注射传统阿片类镇痛药物一般会在第4天产生耐受现象，即镇痛活性出现下调。
侧脑室和皮下注射阳性对照药芬太尼，以及化合物1、2、3、4和7测定每种化合物最高镇痛作用点的镇痛活性。
实验数据用甩尾时间表示。药物的镇痛耐受作用利用不同化合物的最大镇痛效应时间点的甩尾潜伏期来进行比较。甩尾潜伏期数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)来表示，小鼠侧脑室以及皮下连续给药八天镇痛作用的差异使用单因素方差分析(one-wayANOVA的Tukey HSD检验)进行统计，***P＜0.001表示与第一天注射该药物的镇痛作用相比有极显著性差异。实验结果如图8-9所示。
图8是侧脑室注射盐水，芬太尼以及5种类似物的耐受结果，每组7-10只小鼠。连续注射8天之后，芬太尼在第四天镇痛出现了明显的下降，甩尾阈值从9.49s降到8.11s，而其它5种类似物没有出现甩尾阈值的下降，即没有出现镇痛耐受现象。
图9是皮下注射盐水，芬太尼以及5种环化类似物的镇痛耐受结果。连续注射8天之后盐水组没有任何变化，芬太尼组连续注射8天之后在第4天镇痛出现了明显的下降，甩尾阈值从9.5s降到8.6s。而其他5种类似物没有出现甩尾阈值的下降，即没有出现镇痛耐受现象。
实施例7>
便秘是阿片药物常见的副作用，因此一般用胃肠运动实验来评价药物对小鼠胃肠道运动的影响。小鼠在体胃肠运动检测实验一般选用体重在25±2g的昆明系雄性小鼠，实验过程如下，首先小鼠禁食16h，但小鼠可自由饮水。然后皮下注射不同剂量的类似物2、4和7。15min之后口服灌胃，每只小鼠口服活性炭悬浮液250ul(0.1ul/10g)(一种含5％活性炭和10％阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液)。灌胃30min之后颈椎脱臼法处死小鼠。马上解剖，取小肠全长，从胃幽门到盲肠这段距离。然后测量小肠总长以及碳粉移动的长度。
胃肠运动用胃肠运动百分比来表示，具体计算方法为碳粉移动的距离除以小肠总长之后的百分比来表示。数据用胃肠运动百分比的平均值±标准误(Means±S.E.M.)来表示，化合物与盐水之间的差异用单因素方差分析(one-wayANOVA的Dunnett检验)进行数据统计和分析，*P＜0.05，**P＜0.01以及***P＜0.001表示只注射盐水与注射和相关化合物的差异显著性。类似物6，8和11的胃肠运动实验结果如图10-12所示。
在图10中，生理盐水组为空白对照组，皮下分别注射0.1、1以及10mg/kg的化合物2，每组小鼠数为7-8只。实验结果表明空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为79.22％，注射0.1、1以及10mg/kg的化合物2之后胃肠运动百分比分别为86.07％、57.42％和35.37％，胃肠抑制的ED50值为2.51mg/kg。化合物2的镇痛ED50为0.003mg/kg，即胃肠运动的便秘副作用ED50值是镇痛ED50的837倍，也就是说在有效镇痛剂量范围内，化合物2无便秘副作用。
在图11中，生理盐水组为空白对照组，皮下分别注射注射0.01、0.1以及1mg/kg的化合物4，每组小鼠数为7-8只。实验结果表明，空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为75.02％，注射0.01、0.1以及1mg/kg的化合物4之后胃肠运动百分比分别为67.34％、42.27％和34.59％，胃肠抑制的ED50值为0.073mg/kg。化合物4的镇痛ED50为0.002mg/kg，即胃肠运动的便秘副作用ED50值是镇痛ED50的36倍，也就是说在有效镇痛剂量范围内，化合物4无明显的便秘副作用。
在图12中，生理盐水组为空白对照组，然后皮下分别注射注射0.1、1、10和30mg/kg的化合物7，每组小鼠数为5-8只。实验结果表明，空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为77.93％，注射0.1、1、10以及30mg/kg的化合物7之后胃肠运动百分比分别为73.30％、62.90％、51.45％和17.57％，胃肠运动的ED50值为3.71mg/kg。化合物7的镇痛ED50为0.002mg/kg，即胃肠运动的便秘副作用ED50值是镇痛ED50的1855倍，也就是说在有效镇痛剂量范围内，化合物7无便秘副作用。
实施例8>
化合物2和4的成瘾性通过运动活性、条件位置偏爱实验(CPP)和纳洛酮促瘾的成瘾戒断实验来评价。阿片类药物注射后能促进脑区释放多巴胺，从而出现运动活性加强的现象，因此阿片的运动增强与阿片类药物成瘾性存在一定的功能性联系。选用21±2g的昆明系雄性小鼠，运动活性通过旷场实验来检测，实验装置由一个50×50×50cm的无顶黑色有机玻璃盒及一套运动监测系统组成。实验中室温控制在22±1℃之间，否则温度过高或过低都会影响小鼠自身的运动活性，实验之前要用75％酒精将盒子擦干净，以免其他气味影响小鼠的运动活性。实验开始后首先记录小鼠30min内自由运动的路程，皮下注射阳性对照物，芬太尼，以及化合物2和4，并记录给药之后150min之内小鼠运动情况。小鼠运动活性用运动总路程来表示，即小鼠运动总路程±标准误(Means±S.E.M.)来表示，化合物与盐水对照组之间的差异用单因素方差分析(one-way ANOVA的Bonferroni检验)进行数据统计和分析，*P＜0.05，**P＜0.01以及***P＜0.001表示表示只注射盐水与注射和相关化合物的差异显著性。
条件位置偏爱实验是一种测试小鼠心里成瘾的实验方法。其主要优点是不仅能测出药物的奖赏效果，也能测出药物的厌恶效果，普遍用于评价药物的奖赏作用，即药物的心理成瘾性。CPP的实验装置由三个盒子组成，旁边两个大盒子(20×20×20cm)中间被一个小盒子(5×20×20cm)分开。两个大格子底部开一个5×5的小门供小鼠出入，小门可以关闭。两个大盒子一个是黑色的一个是白色的，而且两个盒子四周都是光滑的。实验选用25±5g的雄系小鼠。小鼠筛选前一天可将小鼠置于CPP盒中适应15min，不做记录。有效的消除小鼠对陌生环境的紧张心里，第二天测定的基础值更加接近真实值。实验第一天将小鼠放在CPP装置中，中间的小门打开，小鼠可以在两个盒子中间自由移动，小鼠在盒子中测定的总时间为15min，记录小鼠在两个盒子中逗留的时间，将在其中一个盒子中逗留时间超过9min的小鼠剔除；挑选出的小鼠编号，每组10只。后面三天连续药物处理三天，中间的小门关闭，每天上午在将小鼠放在一侧的偏爱箱注射化合物6，8和芬太尼，每天下午将小鼠放在另一侧的偏爱箱注射盐水。第五天将中间的小门打开，记录总时间15min内小鼠在药物匹配偏爱箱停留的时间。实验的相关数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)表示，CPP实验的结果用条件位置偏爱分数代表，每只小鼠第5天在注射药物的偏爱箱停留的时间减去第一天在此偏爱箱的时间。CPP实验中不同药物处理的组间差异和纳洛酮戒断实验中跳跃次数的差异使用成对T检验进行统计，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001表示药物处理组与生理盐水组之间存在显著性差异。
纳洛酮戒断实验是一种经典的评价药物生理成瘾性的实验。皮下连续给药的时间和剂量参考Venetia Zachariou(2003)的实验方法。每隔8h注射一次芬太尼、化合物2和4，药物的剂量是逐渐增加的，参考吗啡(20、40、60、80、100、100、100mg/kg)的给药剂量，即剂量依次是吗啡镇痛ED50(1.68mg/kg)的10、20、30、40和50倍。芬太尼的ED50为0.02mg/kg，因此其逐渐递增的给药剂量为0.2、0.4、0.6、0.8、1、1和1mg/kg。化合物2和4的ED50为0.002mg/kg，因此其逐渐递增的给药剂量为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.1和0.1mg/kg。最后一次给药2h后，皮下注射10mg/kg的纳洛酮，然后将小鼠立即放入内径9cm、高32cm的不透明桶状结构中，记录30min内小鼠的跳跃次数。
如图13所示，皮下注射盐水作为空白对照组，皮下注射三种药物的最高镇痛剂量，即0.1mg/kg的芬太尼、化合物2和4。皮下注射盐水对照组和芬太尼，总路程分别为94.01±18.89m和231.7±21.58m，注射芬太尼之后小鼠的运动活性明显加强(P＜0.01)。而皮下注射化合物2和4之后，其总路程分别为186.4±40.02m和194.7±44.13m，与盐水对照组相比，小鼠的运动活性没有显著改变。
如图14所示，皮下注射盐水作为空白对照组，皮下注射最高镇痛剂量(0.1mg/kg)的芬太尼、化合物2和4。与注射盐水对照组相比，皮下注射芬太尼和化合物4均出现了显著的条件位置偏爱现象(P＜0.001)，而皮下注射化合物2之后，未出现明显的条件位置偏爱或者厌恶现象。
如图15所示，皮下注射盐水作为空白对照组，皮下注射最高镇痛剂量(0.1mg/kg)的芬太尼、化合物2和4。皮下注射盐水组、芬太尼、化合物2和4的跳跃次数分别为5、36、6和8次。与盐水组相比，芬太尼组跳跃次数显著增加，即出现了明显的成瘾戒断现象(P＜0.001)，而皮下注射化合物2和4未出现明显的戒断现象。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一类阿片和神经肽FF受体多靶点分子BN-9的二硫键环化类似物及其制备方法与应用
<130> SG180815001
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Cys Gly Phe Cys Pro Gln Arg Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Cys Gly Phe Cys Pro Gln Arg Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Tyr Cys Gly Phe Gln Cys Gln Arg Phe
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<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Cys Gly Phe Gln Pro Cys Arg Phe
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<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Tyr Cys Gly Phe Cys Pro Gln Arg Phe
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<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Tyr Gly Phe Cys Pro Gln Arg Phe
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机译： 混合μ阿片受体和神经肽FF受体结合分子，其制备方法和在治疗中的应用
机译： 混合MU阿片受体和神经肽FF受体结合分子，其制备方法及在治疗中的应用
机译： 混合MU阿片受体和神经肽FF受体结合分子，其制备方法及在治疗中的应用
