一种含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成方法

摘要

本发明属于高分子合成技术领域，具体为一种含α‑D‑甘露糖和β‑D‑葡萄糖的无规共聚物的合成方法。本发明以炔烃为端基的7‑氧杂降冰片烯衍生物及含叠氮基的糖类化合物为原料，利用铜催化的叠氮‑端炔[3+2]环加成(CuAAC)反应合成制备7‑ox‑NB‑man和7‑ox‑NB‑glu两类无保护基的含糖聚合物单体，随后通过开环易位聚合(ROMP)制备出含异类糖单元的无规共聚物P((7‑ox‑NB‑man)‑r‑(7‑ox‑NB‑glu))。本发明聚合物单体合成方法简单，聚合物合成方法可靠，聚合物结构为线性、分子量可控，可应用于高分子材料和生物医药工程领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成方法，属于高分子合成技术领域。

背景技术

糖参与生命体内包括细胞识别、细胞增殖、信号传递和病原体感染等很多行为，已成为科学研究领域的一个热点，利用糖与蛋白质的特异性识别，可以提高治疗疾病的效果。但单个配体与蛋白质的作用力是有限的，需要多价配体才能增强与受体间的作用力。但自然界中存在的含糖高分子不仅难以提纯而且结构较为复杂，大大的限制了其利用率。人工合成的含糖聚合物具有结构明确分子量可控等优点，受到很多化学工作者的青睐，因此含糖聚合物的合成技术得到了迅速的发展。目前，通过化学合成法制备含糖聚合物主要有两种途径：含糖单体直接聚合或者是对聚合物进行糖基化的后修饰。前者比较简单，可直接得到含糖聚合物，但由于糖单元的溶解性问题，大部分是含保护基糖单体的聚合，最后对其进行脱保护，增加了聚合反应步骤。后者是对纯化后的聚合物前体进行修饰，需要高效的化学反应来确保后修饰的接枝率，且往往需要加入过量的糖基修饰物。

近年来，开环易位聚合(ROMP)由于反应条件温和、单体普适性高且具备活性聚合的特点受到工业界的广泛关注并成为制备功能化含糖聚合物的重要方法之一。同时，将开环易位聚合与“Click”化学相结合为设计合成结构规整的含糖聚合物又提供了新的途径。其中铜(I)催化的叠氮-端炔[3+2]环加成反应(CuAAC)具有高产率、高选择性、反应条件温和等优点是“Click”化学中的典型代表。然而目前报道的关于无保护基含糖单体的ROMP聚合大部分都是通过乳液分散的方式进行聚合反应，操作较复杂且后处理繁琐。尽管有报道利用微波辐射合成的方法提高此类合成的效率，但是微波反应器的使用大大限制了其实际应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单、高效的含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成方法。本发明解决了含保护基糖聚合物的脱保护、乳液分散以及后修饰等步骤的合成劣势，进一步拓宽了含糖聚合物的合成途径以及ROMP的实际应用范围，该含糖共聚物可与刀豆蛋白A(concanavalin A)进行特异性识别，可应用于生物医药工程领域。

本发明利用CuAAC反应和开环易位聚合(ROMP)相结合的方法，制备得到侧链含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的分子量可控、窄分子量分布的含糖共聚物。其中CuAAC反应具有高产率、高选择性、反应条件温和等优点，同时ROMP可得到分子量可控且结构明确的高分子化合物。

本发明中，首先利用呋喃和马来酸酐发生Diels-Alder环加成反应得到7-氧杂降冰片烯衍生物，接着通过乙醇胺将其羟基化，再利用威廉森成醚反应在末端引入端炔烃，最后分别与α-D-甘露糖叠氮化合物和β-D-葡萄糖叠氮化合物进行CuAAC反应，得到了两种7-氧杂降冰片烯含糖衍生物单体7-ox-NB-man和7-ox-NB-glu。随后通过开环易位聚合(ROMP)获得含双异类糖的共聚物。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成方法，其合成路线如下式所示：

其中：m，n为整数，其限定范围为20<m<80，20<n<80；

具体步骤如下：惰性气氛下，将α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2和Grubbs三代催化剂在溶剂中，40-60℃条件下反应6-10h，之后加入乙烯基乙醚终止聚合反应，再经后处理得到含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))。

本发明中，α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2和Grubbs三代催化剂的摩尔比为(1～3):(1～3):(0.9～1.8)。

本发明中，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

本发明中，后处理步骤如下：向乙烯基乙醚终止后反应液中加入甲醇进行搅拌沉降，析出的固体洗涤、干燥，得到含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))。

本发明中，α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2的合成路线如下式所示：

其具体步骤如下：

步骤1)取呋喃和马来酸酐于溶剂中室温反应生成化合物1；

步骤2)化合物1和乙醇胺反应生成化合物2；

步骤3)化合物2和炔丙基溴在碱作用下反应生成化合物3；

步骤4)化合物3与α-D-甘露糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，75-85℃的温度下搅拌10-14h后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为α-D-甘露糖单体M1；

步骤5)取化合物3与β-D-葡萄糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，75-85℃的温度下搅拌10-14h后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为β-D-葡萄糖单体M2。

本发明中，步骤4)中，化合物3、α-D-甘露糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，叔丁醇与水的体积比为1:2～2:1；步骤5)中，化合物3、β-D-葡萄糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，叔丁醇与水的体积比为1:2～2:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明利用CuAAC反应和开环易位聚合相结合的方法，简单、高效的制备出了含双类糖的无规共聚物，分子量可控且较窄的分子量分布宽度。

2.本发明所合成的含双异类糖共聚物结构明确，可与生物蛋白特异识别，应用于生物医药领域。

3.本发明制备含糖共聚物的方法还可适用于半乳糖、海藻糖等含糖聚合物的制备。

附图说明

图1为实施例1中2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁氢谱图。

图2为实施例1中2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁碳谱图。

图3为实施例1中含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图。

图4为实施例1中含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁碳谱图。

图5为实施例1中含β-D-葡萄糖单体7-ox-NB-glu核磁氢谱图。

图6为实施例1中含β-D-葡萄糖单体7-ox-NB-glu核磁碳谱图。

图7为实施例1得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))核磁氢谱图。

图8为实施例1得到的含糖共聚物P(50％(7-ox-NB-man)-r-50％(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。

图9为实施例2得到的含糖共聚物P(75％(7-ox-NB-man)-r-25％(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。

图10为实施例2得到的含糖共聚物P(25％(7-ox-NB-man)-r-75％(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。

图11为实施例2得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)核磁氢谱图。

图12为实施例2得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)的凝胶渗透色谱图。

图13浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例，来详细说明本发明的技术方案。

实施例中，含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成路线如下式所示：

实施例1

1. 7-氧杂降冰片烯二酸酐7-ox-NB的合成

在干燥的圆底烧瓶中加入马来酸酐(50g，0.51mol)，并加入乙醚250mL。待马来酸酐溶解之后加入呋喃(125mL，1.72mol)。在室温条件下反应24h，反应结束后，过滤除去乙醚和呋喃，用乙醚洗涤三次，得到白色固体76g，产率为90％。¹H>3)δ＝6.58(s,2H),5.47(s,2H),3.18(s,2H).

2. 7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙基醇7-ox-NB-OH的合成

取经高温处理后冷却的单口圆底瓶，加入7-氧杂降冰片烯二酸酐(20g，0.12mol)，甲醇(210mL)，在0℃条件下搅拌。然后乙醇胺(11mL,0.18mmol)溶于30mL甲醇滴入反应体系中，滴加时间不小于30min，接着继续0℃条件搅拌1h，移去冰浴在室温条件下反应1h，再加热至65℃回流12h。待反应结束后冷却至室温，减压蒸馏除去大量甲醇后重结晶，过滤用石油醚洗涤得到白色固体16g，产率为64％。¹H>3)δ＝6.52(s,2H),5.28(s,2H),3.76(s,2H),3.70(s,2H),2.89(s,2H),2.15(s,1H).

3. 2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的合成

将7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙基醇(1.05g，5.02mmol)溶于30mL的N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃条件下缓慢滴入炔丙基溴(1.08mL，10.04mmol)，继续反应10min后，加入氢氧化钾(0.56g，10.04mmol)。继续在0℃条件反应1h，接着移去冰浴，在室温条件下搅拌24h。反应结束后，加入20mL的乙酸乙酯和20mL的去离子水，水相用乙酸乙酯洗涤三次，之后收集有机相用饱和食盐水洗涤三次。有机相用无水硫酸钠干燥，产品由硅胶色谱纯化，得到白色固体0.68g，产率为55％。图1和图2分别是2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁氢谱图和核磁碳谱图。¹H>3)δ＝6.53(s,2H),5.29(s,2H),4.16(d,J＝2.3Hz,2H),3.71(dd,J＝6.6,3.9Hz,4H),2.88(s,2H),2.43(t,J＝2.3Hz,1H).¹³C>3)δ＝176.11,136.56,80.91,79.25,74.78,65.64,57.91,47.47,38.13.HRMS(ESI):C₁₃H₁₃NO₄H(M+H⁺)calc.for248.091734；found:248.092064.

4.含α-D-甘露糖的7-氧杂降冰片烯衍生物单体7-ox-NB-man的合成

取干燥的反应瓶，分别加入α-D-甘露糖叠氮化合物(0.11g，0.53mmol)，并加入7-ox-NB-alkyne(0.15g，0.63mmol)溶于4mL的叔丁醇/水的混合溶剂中(体积比为1：1)，接着加入五水合硫酸铜(0.13g，0.53mmol)和抗坏血酸钠(0.21g，1.06mmol)，80℃条件下搅拌12h，过滤除去不溶物，用甲醇洗涤，直接过硅胶柱，得到白色固体0.17g，产率为74％。图3、图4分别为含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图和核磁碳谱图。¹H>2O)δ＝8.19(s,1H),6.57(s,2H),6.14(s,1H),5.28(d,J＝3.4Hz,2H),4.65(s,2H),4.14(dd,J＝8.9,3.0Hz,1H),3.90–3.79(m,3H),3.66(dd,J₁＝14.2,J₂＝7.2Hz,J₃＝3H),3.34(d,J＝3.3Hz,1H),3.11(s,2H).¹³C>2O)δ＝179.20,144.47,136.37,124.21,87.56,81.02,78.99,76.06,72.39,69.09,66.25,62.88,60.59,47.43,38.41.HRMS(ESI):C₁₃H₁₃NO₄H(M+H⁺)calc.for:453.161605；found:453.161643.

5.含β-D-葡萄糖的7-氧杂降冰片烯衍生物单体7-ox-NB-glu的合成

取干燥的反应瓶，分别加入β-D-葡萄糖叠氮化合物(0.10g，0.48mmol)，并加入7-ox-NB-alkyne(0.15g，0.57mmol)溶于4mL的叔丁醇/水的混合溶剂中(体积比为1：1)，接着加入五水合硫酸铜(0.12g，0.48mmol)和抗坏血酸钠(0.19g，0.96mmol)，80℃的条件下搅拌反应2h，过滤除去不溶物，用甲醇洗涤，直接过硅胶柱，得到白色固体0.16g，产率为78％。图5、图6分别为含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图和核磁碳谱图。¹H>2O)δ＝8.06(s,1H),6.45(s,2H),6.01(s,1H),5.15(d,J＝3.4Hz,2H),4.52(s,2H),4.01(dd,J₁＝8.9,J₂＝3.0Hz,2H),3.80–3.62(m,1H),3.61–3.43(m,9H),3.36–3.13(m,1H),2.98(s,2H).¹³C>2O)δ＝179.26,144.44,136.38,124.68,86.76,81.03,76.29,70.63,68.39,66.64,66.21,62.83,60.55,47.45,38.39.HRMS(ESI):C₁₃H₁₃NO₄H(M+H⁺)calc.for:453.161605；found:453.161731.

6.含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的合成

取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg，0.044mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg，0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(3.5mg，0.0039mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水二甲基甲酰胺(1mL)。在水浴50℃条件下反应8h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体36mg，产率为90％。图7为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))核磁氢谱图。图8为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为24543，分子量分布为1.30。¹H>2O)δ＝8.14(d,J＝31.4Hz,1H),5.89(dd,J₁＝133.8,J₂＝47.3Hz,3H),4.56(s,2H),4.08(s,1H),3.93(s,1H),3.75–3.54(m,7H),3.26(s,1H),2.99(s,2H).

实施例2

α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体的制备同实施例1。

取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg，0.044mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(7mg，0.015mmol)和Grubbs 3代催化剂(2.3mg，0.0026mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴50℃条件下反应12h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体25mg，产率为92％。图9为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为17089，分子量分布为1.27。

实施例3

α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体的制备同实施例1。

取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(7mg，0.015mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg，0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(2.3mg，0.0026mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴25℃条件下反应20h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体26mg，产率为96％。图10为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为24648，分子量分布为1.30。

对比例1

取β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg，0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(1.8mg，0.0019mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴50℃条件下反应12h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体19mg，产率为95％。图11为得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)核磁氢谱图。图12为得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为22229，分子量分布为1.25。¹H>2O)δ＝8.18(s,1H),6.07–5.61(m,3H),4.56(s,2H),4.04–3.43(m,10H),3.01(s,2H)。

应用实施例 浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A的特异性识别作用

配制刀豆蛋白A(1mg/mL)的HBS缓冲溶液(HEPES，10mmol/L)，pH＝7.4，NaCl(50mmol/L)，CaCl₂(5mmol/L)，MnCl₂(5mmol/L)和四种含糖聚合物(分别根据实施例1-3、对比例1条件制备得到)的HBS缓冲溶液(1mg/mL)。测试时取400μL的刀豆蛋白A溶液置于比色皿中，接着加入100μL的含糖聚合物溶液，混匀后迅速放入样品池中，每3s记录一次420nm处的吸光值，并持续记录至10min。图13为浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。结果显示，含甘露糖的共聚物与刀豆蛋白A混合后很快变浑浊，而且吸光值也随着时间的增长而增长。只含β-D-葡萄糖的均聚物与刀豆蛋白A的混合溶液没有变化，吸光值也没有改变，其中含甘露糖比例越多的共聚物其与豆蛋白A的结合越快，这些结果表明含α-D-甘露糖的共聚物能与刀豆蛋白A发生特异性识别，而只含β-D-葡萄糖的均聚物不能与其识别，共聚物中甘露糖占比越大其与刀豆蛋白A的结合速率越快。