含芳香杂环的a,β-不饱和酮化合物及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种含芳香杂环的α,β‑不饱和酮化合物及其制备方法与应用，该类化合物具有较强的抗肿瘤活性，其结构如式(I)所示：

说明书

技术领域

本发明涉及有机化合物合成及医药应用领域，尤其涉及含芳香杂环的α,β-不饱和酮化合物及其制备方法与应用。

背景技术

谷胱甘肽转移酶(也可称为谷胱甘肽S-转移酶或GSTs)是广泛存在于自然界的多功能超基因家族。在真核和原核生物中，谷胱甘肽转移酶均是非常重要的II相代谢酶(Laborde E.Glutathione transferases as mediators of signaling pathwaysinvolved in cell proliferation and cell death[J].Cell Death& Differentiation,2010,17(9):1373.)。根据氨基酸的同源性、基因的物理结构、免疫原性的差异，此家族可分为α(A),μ(M),π(P),σ(S),θ(T),ω(O)和ζ(Z) 七个亚型(Hayes,J.D.；Flanagan,J.U.；Jowsey,I.R.Glutathione Transferases. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2005,45,51-88.)。在众多的亚型中，GSTπ占有非常重要的地位，此亚型被发现过度的表达于胃癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌等多种肿瘤细胞中(Rotili D,De Luca A,Tarantino D,etal.Synthesis and structure–activity relationship of new cytotoxic agentstargeting human glutathione-S-transferases[J].European journal of medicinalchemistry,2015, (89):156-171.)。

在人体内，GSTπ催化还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)与亲电性化合物结合(如环氧化物、α,β-不饱和酮及氯代烃等各种化疗药物)，形成水溶性较大、易于泵出细胞外的复合物，经过胆汁或者肾脏排泄(Townsend DM,Tew KD.The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance[J].Oncogene,2003,22(47):7369-7375.)。当GSTπ表达增加或活性增强时，抗肿瘤药物的排泄也随之增加，从而诱发耐药性的发生，cAMP-依赖的蛋白激酶A(Protein Kinese A，PKA)和蛋白激酶C(Protein Kinese C，PKC) 分别以GSH-依赖和GSH-不依赖的方式磷酸化GSTπ，增强其代谢活性，加剧GSTπ诱导的耐药性。另外，GSTπ是内源性的c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂，通过蛋白-蛋白相互作用与JNK结合，使细胞免于应激性凋亡。JNK是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的一员，其在细胞的存活和凋亡通路中起着关键作用(Zhao,G.；Wang,X.Advance in antitumor agents targetingglutathione S-transferase.Curr.Med.Chem.2006,13,1461-1471)。

依他尼酸(Ethacrynic acid，简写EA)是被发现的第一个GSTs抑制剂， EA可以与GSTs的底物结合位点形成可逆性的共价键，直接抑制α,μ,π亚型的活性；EA可以自发性地或通过GSTs催化与GSH形成复合物，从而耗竭GSH (Ploemen,J.H.；Van Schanke,A.；VanOmmen,B.；Van Bladeren,P.J. Reversible conjugation of ethacrynic acid withglutathione and human glutathione S-transferase P1-1.Cancer Res.1994,54,915-919.)。但其在临床应用中仍存在利尿、耳毒性等副作用。

发明内容

本申请的目的在于提供一类含芳香杂环的α,β-不饱和酮类化合物及其制备方法和应用，该类化合物能够抑制GSTπ以及HL-60细胞的生长，具有较强的抗肿瘤活性。

本申请通过如下技术方案实现：

首先，本申请提供了一种式(I)所示化合物或其异构体或溶剂化物或可药用盐：

其中，A为连接基团，选自B为取代或未被取代的杂芳环基。

进一步地，B为取代或未被取代的具有4～10个碳原子的杂芳环基。

进一步地，B为取代或未被取代的具有4～8个碳原子的杂芳环基。

进一步地，所述杂芳环基中含有至少两个相同或不相同的杂原子，所述杂原子选自N、O和S。

进一步地，所述杂芳环基中含有2～4个相同或不相同的杂原子，所述杂原子选自N、O和S；进一步地，所述杂原子选自N和S。

进一步地，B选自：

进一步地，所述R₁、R₂或R₃各自独立地选自氢、卤素、氨基、取代氨基和C_1～6烷基。

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基，R₁进一步选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基，R₁进一步选自氢、卤素和氨基，进一步选自氢和卤素，R₁进一步选自氢、氟、氯、溴和碘，R₁更进一步选自氢和溴。

进一步地，所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基，R₂进一步选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基，R₂进一步选自氢、卤素和C_1～3烷基，R₂进一步选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基，R₂更进一步选自氢、氯、溴和甲基。

进一步地，所述R₃选自氢、卤素和取代氨基，R₃进一步选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基，R₃进一步选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基，R₃进一步选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基，R₃更进一步选自氢、氯和甲氨基。

进一步地，B选自

进一步地，在本申请的一个或多个实施方式中，A选自：B选自：

进一步地，所述R₁、R₂或R₃各自独立地选自氢、卤素、氨基、取代氨基和C_1～6烷基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基，进一步选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基，进一步选自氢、卤素和氨基，进一步选自氢和卤素，进一步选自氢、氟、氯、溴和碘，更进一步选自氢和溴；

进一步地，所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基，进一步选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基，进一步选自氢、卤素和C_1～3烷基，进一步选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基，更进一步选自氢、氯、溴和甲基；

进一步地，所述R₃选自氢、卤素和取代氨基，进一步选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基，进一步选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基，进一步选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基，更进一步选自氢、氯和甲氨基；

更进一步地，在本申请的一个或多个实施方式中，A选自：B选自进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基；所述R₃选自氢、卤素和取代氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素和氨基；所述R₂选自氢、卤素和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、氟、氯、溴和碘；所述R₂选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基；所述R₃选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基；

进一步地，所述R₁为氢或溴；所述R₂为氢、氯、溴或甲基；所述R₃为氢、氯或甲氨基。

进一步地，在本申请的一个或多个实施方式中，A为B选自进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基；所述R₃选自氢、卤素和取代氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素和氨基；所述R₂选自氢、卤素和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、氟、氯、溴和碘；所述R₂选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基；所述R₃选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基；

进一步地，所述R₁为氢或溴；所述R₂为氢、氯、溴或甲基；所述R₃为氢、氯或甲氨基。

进一步地，在本申请的一个或多个实施方式中，A为B 选自B进一步选自：B再进一步为

进一步地，A为时，B与A的连接方式为B与的亚氨基端相连或B与的哌啶N端相连，进一步为B与的亚氨基端相连；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基；所述R₃选自氢、卤素和取代氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素和氨基；所述R₂选自氢、卤素和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、氟、氯、溴和碘；所述R₂选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基；所述R₃选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基；

进一步地，所述R₁为氢或溴；所述R₂为氢、氯、溴或甲基；所述R₃为氢、氯或甲氨基。

进一步地，所述式(I)化合物选自下列化合物：

1-(4-(2-(4-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-1)

1-(4-(2-(4-(3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-2)

1-(4-(2-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-3)

1-(4-(2-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-4)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-5)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-6)

1-(2,3-二氯-4-(2-氧代-2-(4-(喹唑啉-4-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-7)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-8)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-氯嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-9)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-10)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(6-(甲基氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-11)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-12)

1-(4-(2-(4-(9H-嘌呤-6-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-13)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-14)

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-15)

N-(1-(2-氯嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-2-(2,3-二氯-4-(2-亚甲基丁酰基)苯氧基)乙酰胺(I-16)。

上述优选的16个化合物名称后的括号中为其相应的代号，为叙述方便和表达简洁，上述括号中的代号在本说明书以下内容中将被直接应用。

其次，本申请提供了一种上述式(I)化合物的方法，所述方法按如下所示反应进行：

其中，A、B的定义如上所述；

进一步地，所述方法包括以下步骤：

(1)将起始原料B-Cl溶于溶剂中，依次加入N,N-二异丙氨基乙胺 (DIEA)和Boc-AH，反应得中间体Boc-A-B；

进一步地，步骤(1)中所述溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和 N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一种或多种；

(2)将步骤(1)得到的中间体Boc-A-B溶于乙酸乙酯溶液中，加入浓盐酸，反应得中间体HA-B·2HCl；

(3)将依他尼酸(EA)用二氯甲烷(DCM)溶解，依次加入苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA，加入步骤(2)得到的HA-B·2HCl，室温反应过夜，萃取，静置，分层；合并有机相，洗涤有机相，干燥，过滤，除溶剂得式(I)化合物粗品，分离纯化得式(I)化合物；

进一步地，在本申请的一个或多实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将起始原料B-Cl溶于DMF或NMP中，依次加入DIEA和 Boc-AH，反应得中间体Boc-A-B；

(2)将步骤(1)得到的中间体Boc-A-B溶于乙酸乙酯溶液中，加入浓盐酸，室温反应，得中间体HA-B·2HCl；

(3)将EA用二氯甲烷(DCM)溶解，依次加入HBTU和DIEA，室温活化15min后，加入步骤(2)得到的HA-B·2HCl，室温反应过夜，，用DCM萃取，静置，分层；合并有机相，依次用氯化铵、食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得式(I)化合物粗品，柱层析分离纯化得式(I)化合物；

进一步地，在这些实施方式中，A和B的定义如上所述；

进一步地，在本申请的一个或多实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将起始原料B-Cl溶于DMF中，依次将DIEA和Boc-AH加入反应瓶中90℃反应4h，TLC检测反应完全，将反应液倒入冰水中，析出大量白色固体，过滤，用水洗滤饼，干燥，得中间体Boc-A-B；

(2)将步骤(1)得到的中间体Boc-A-B加入反应瓶中，用乙酸乙酯溶解，室温下，加入浓盐酸，室温搅拌6h析出灰白色固体，过滤，干燥，得中间体HA-B·2HCl；

(3)将EA用DCM溶解，依次加入HBTU和DIEA，室温活化15min 后，加入步骤(2)得到的HA-B·2HCl，室温反应过夜，TLC检测反应完全后，用DCM萃取，静置，分层；合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除DCM得式(I) 化合物粗品，柱层析分离纯化得式(I)化合物；

进一步地，步骤(3)中的洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(V/V＝30:1)；

进一步地，在这些实施方式中，A和B的定义如上所述；

进一步地，在这些实施方式中，A为B选自其中，R₁、R₂、>3的定义如上所述；

进一步地，A为B选自所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基；所述R₃选自氢、卤素和取代氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素和氨基；所述R₂选自氢、卤素和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、氟、氯、溴和碘；所述R₂选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基；所述R₃选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基；

进一步地，所述R₁为氢或溴；所述R₂为氢、氯、溴或甲基；所述R₃为氢、氯或甲氨基。

进一步地，在本申请的一个或多实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将起始原料B-Cl用NMP溶解，加入DIEA和Boc-AH，150℃微波反应，反应完全后，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，静置，分层；合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得Boc-A-B粗品，柱层析纯化得中间体 Boc-A-B；

进一步地，步骤(1)中的洗脱系统为乙酸乙酯/石油醚(V/V＝1:2)；

(2)将步骤(1)得到的中间体Boc-A-B加入反应瓶中，用乙酸乙酯溶解，室温下，加入浓盐酸，室温搅拌6h析出灰白色固体，过滤，干燥，得中间体HA-B·2HCl；

(3)将EA用DCM溶解，依次加入HBTU和DIEA，室温活化15min 后，加入步骤(2)得到的HA-B·2HCl，室温反应过夜，TLC检测反应完全后，用DCM萃取，静置，分层；合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除DCM得式(I) 化合物粗品，柱层析分离纯化得式(I)化合物；

进一步地，步骤(3)中的洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(V/V＝30:1)；

进一步地，在这些实施方式中，A和B的定义如上所述；

进一步地，在这些实施方式中，A为B选自B进一步选自B再进一步为其中；R₁、R₂、R₃的定义如上所述；

进一步地，在这些实施方式中，所述R₁选自氢、卤素、氨基和取代氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～6烷基；所述R₃选自氢、卤素和取代氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素、氨基和被C_1～6烷基取代的氨基；所述R₂选自氢、卤素、氨基和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～6烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、卤素和氨基；所述R₂选自氢、卤素和C_1～3烷基；所述R₃选自氢、卤素和被C_1～3烷基取代的氨基；

进一步地，所述R₁选自氢、氟、氯、溴和碘；所述R₂选自氢、氟、氯、溴、碘和甲基；所述R₃选自氢、氟、氯、溴、碘和甲氨基；

进一步地，所述R₁为氢或溴；所述R₂为氢、氯、溴或甲基；所述R₃为氢、氯或甲氨基。

进一步地，在这些实施方式中，A为时，B与A的连接方式为B与的亚氨基端相连或B与的哌啶N端相连，进一步为B与A的连接方式为B与的亚氨基端相连。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，式(I)化合物可以通过如下所示反应制备：

上述反应路线中，a、b、c、d为反应条件，其中，a：1-叔丁氧羰基哌嗪，N,N-二异丙氨基乙胺(DIEA)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，90℃；b：4-叔丁氧羰基氨基哌啶或1-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶，N,N-二异丙氨基乙胺(DIEA)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，微波，150℃。c：乙酸乙酯/浓盐酸溶液，室温；d：依他尼酸(EA)，苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N,N-二异丙氨基乙胺(DIEA)，二氯甲烷(DCM)；

再次，本申请提供了一种药物组合物，其包含上述化合物或其异构体或溶剂化物或可药用盐。

应当理解，本领域技术人员可以将本申请的化合物或其异构体或溶剂化物或可药用盐与其他常规的药用辅料或载体制备成组合物或药物剂型，本申请中所述的药物剂型通常指药学工业中的剂型，比如液体剂型、气体剂型、固体剂型等，比如溶液剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、片剂、胶囊剂等。

此外，本申请中所述的“可药用盐”指通常用于药学工业中的无毒性盐，其可以根据本领域中公知的方法制备。

再次，本申请提供了上述式(I)化合物或其异构体或溶剂化物或可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用或者在制备GSTπ抑制剂中的应用。

此外，本申请提供了上述式(I)化合物或其异构体或溶剂化物或可药用盐在制备用于治疗白血病的药物中的应用；

进一步地，所述白血病为急性早幼粒细胞白血病。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

作为示例本申请按照如下所示的反应路线具体制备了I-1～I-16个化合物，本领域技术人员可根据以下路线及具体的-B和Z(-A-B)的结构选择合适的反应物。应当知晓，本领域技术人员在本申请的公开下，可根据本申请进行调整或改进，在不偏离本申请发明精神的前提下，这些调整或改进都应包含在本申请的范围内。

实施例1中间体2的制备

称取起始原料B-Cl(1a-n)(12.94mmol)用DMF(10mL)溶解，依次将DIEA(51.76mmol)，1-Boc哌嗪(15.53mmol)加入反应瓶中，90℃反应4h，TLC检测反应完全，将反应液倒入10倍量冰水中，析出大量白色固体，过滤，用水(20ml×3)洗滤饼，干燥，得中间体2。

4-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶)-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(中间体2a)

上述制备过程中，1a为4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶，得到2a为白色固体，产率89％，¹H>6)δ8.94(s,1H),8.60(s,1H)，1.39>

4-(3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶)-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(中间体2b)

上述制备过程中，1b为3-溴-4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶，得到2b为白色固体，产率88％，¹H>6)δ8.38(s,1H)，1.41(s,9H)

4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2c)

上述制备过程中，1c为4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，得到2c为灰白色固体，收率90％，¹H>6)δ11.72(s,1H),8.15(s,1H),>

4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2d)

上述制备过程中，1d为4-氯-5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，得到2d未经纯化直接投入下一步反应。

4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2e)

上述制备过程中，1e为4,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，得到2e未经纯化直接投入下一步反应。

4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2f)

上述制备过程中，1f为4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，得到2f为灰白色固体，收率93％，MS(ESI)m/z：318.4[M+H]+。

4-(喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2g)

上述制备过程中，1g为4-氯喹唑啉，得到2g为白色固体，收率88％，¹H>6)δ8.88(s,1H),8.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.09–>

4-(2-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2h)

上述制备过程中，1h为2,4-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，得到2h未经纯化直接投入下一步反应。

4-(2-甲氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2i)

上述制备过程中，1i为4-氯-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺，得到 2i为白色固体，产率86％，¹H>6)δ10.93(s,1H),6.73>

4-(2-甲氨基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2j)

上述制备过程中，1j为4-氯-N-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺，得到2j为白色固体，产率76％，¹H>6)δ7.96(d,J＝5.5Hz,1H),>

4-(6-(甲氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2k)

上述制备过程中，1k为6-氯-N-甲基嘧啶-4-胺，得到2k未经纯化直接投入下一步反应。

4-(2-(甲氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2l)

上述制备过程中，1l为4-氯-N-甲基嘧啶-2-胺，得到2l未经纯化直接投入下一步反应。

4-(9H-嘌呤-6-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体2m)

上述制备过程中，1m为6-氯-9H-嘌呤，得到2m为类白色固体，产率 91％，¹H>6)δ13.09(s,1H),8.23(s,1H),8.15(s,1H),>

4-(2-氯嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(中间体2n)

上述制备过程中，1n为2,4-二氯嘧啶，得到2n为白色固体，产率95％，¹H>6)δ8.10(d,J＝6.2Hz,1H),6.84(d,J＝6.2Hz,>

实施例2中间体4的制备

称取起始原料1n(即2,4-二氯嘧啶，13.43mmol)，用6ml NMP溶解，依次加入1-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶或4-叔丁氧羰基氨基哌啶(16.11mmol) 和DIEA(53.70mmol)，150℃微波反应，反应完全后，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用氯化铵，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得粗品，柱层析纯化得中间体4，洗脱系统为乙酸乙酯/石油醚(1:2)。

4-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体4a)

白色固体，产率80％，¹H>6)δ8.04(d,J＝6.2Hz,>

(1-(2-氯嘧啶-4-基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体4b)

中间体4b未经纯化直接投入下一步。

实施例3中间体3或5的制备

称取中间体2或中间体4(分别由实施例1和2制备得到)，用乙酸乙酯(6mL)溶解，室温下，加入浓盐酸(2mL)，室温搅拌6h，析出类白色固体，过滤，干燥，分别得中间体3或中间体5。中间体未经纯化直接投入下一步。

其中，中间体3和5的结构如下所示：

实施例4本申请目标化合物I系列的制备

将EA(0.5mmol)用二氯甲烷(6mL)溶解，依次加入HBTU(0.53mmol)，DIEA(1.5mmol)，室温搅拌15min，加入中间体3a(即4-(哌嗪-1-基)-1H- 吡唑并[3,4-d]嘧啶盐酸盐，0.5mmol)，室温反应过夜，TLC检测反应完全后，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液(20ml ×3)，饱和食盐水(20ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除二氯甲烷得粗品，柱层析分离纯化得化合物I-1，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(30:1)。

同样的方法，使用实施例3中制备得到的其他化合物替换3a(4-(哌嗪-1- 基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶盐酸盐)，分别得到化合物I-2～I-16。

1-(4-(2-(4-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-1)

白色固体，产率：42％，Mp:138-142℃。¹H>3)δ8.48>13C>3)δ195.59,165.71,157.00,155.75,155.08,154.96,150.21,134.09,>

1-(4-(2-(4-(3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-2)

类白色固体，产率：46％，Mp:191-193℃。¹H>3)δ13.05(br,1H),8.48(d,J＝16.0Hz,1H),7.17(t,J＝6.5Hz,1H),7.02(d,J＝8.6>13C>3)δ>

1-(4-(2-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-3)

类白色固体，产率：46％，Mp:167-170℃。¹H>3)δ>13C>3)δ195.86,165.55,156.81,155.03,152.16,150.64,150.07,>

1-(4-(2-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-4)

白色固体，产率：56％，Mp:170-173℃。¹H>6)δ12.35(s,1H),8.34(s,1H),7.61(s,1H),7.33(d,J＝8.6Hz,1H),7.15(d,J＝8.7>13C>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-5)

白色固体，产率：48％，Mp:163-165℃。¹H>3)δ11.14>13C>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-6)

白色固体，产率：48％，Mp:170-173℃。¹H>3)δ8.42>13C>3)δ195.68,165.46,157.18,156.98,155.36,152.32,150.21,133.80,131.44,128.84,>

1-(2,3-二氯-4-(2-氧代-2-(4-(喹唑啉-4-基)哌嗪-1-基)乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-7)

白色固体，产率：53％，Mp:112-115℃。¹H>3)δ8.76>13C>3)δ195.81,165.64,164.48,155.09,153.61,>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-8)

类白色固体，产率：45％，Mp:132-136℃。¹H>3)δ>13C>3)δ195.71,165.73,157.15,155.02,152.84,152.09,150.14,133.92,131.50,128.84,>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-氯嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-9)

类白色固体，产率：43％，Mp:171-173℃。¹H>3)δ>13C>3)δ195.71,165.58,162.31,>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-10)

白色固体，产率：48％，Mp:174-176℃。¹H>3)δ7.62>13C>3)δ195.72,165.52,160.64,158.45,155.07,150.19,133.94,131.84,131.52,>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(6-(甲基氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-11)

白色固体，产率：43％，Mp:176-178℃。¹H>3)δ7.84>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-12)

类白色固体，产率：47％，Mp:171-176℃。¹H>3)δ8.35(s,1H),7.15(d,J＝8.1Hz,1H),6.99(d,J＝8.1Hz,1H),6.38(s,1H),5.96>13C>3)δ195.90,>

1-(4-(2-(4-(9H-嘌呤-6-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)-2,3-二氯苯基)-2-亚甲基丁酮(I-13)

白色固体，产率：43％，Mp:158-161℃。¹H>3)δ8.42>13C>3)δ195.87,>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-(2-(甲基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-14)

白色固体，产率：61％，Mp:145-148℃。¹H>3)δ10.08>13C>

1-(2,3-二氯-4-(2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-亚甲基丁酮(I-15)

白色固体，产率：48％，Mp:140-143℃。¹H>3)δ8.35>13C>3)δ195.90,165.19,>

N-(1-(2-氯嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-2-(2,3-二氯-4-(2-亚甲基丁酰基)苯氧基)乙酰胺(I-16)

白色固体，产率：46％，Mp:128-130℃。¹H>3)δ8.38>13CNMR(100MHz,CDCl₃)δ>

实验例5化合物对GSTπ抑制活性测试及对HL-60细胞的生长抑制测定实验

1、化合物对GSTπ抑制活性实验：

实验材料和仪器：

1-胆碱-2,4-二硝基苯(CDNB)，谷胱甘肽(GSH)，磷酸钾缓冲液，磷酸钠-EDTA缓冲液(pH 6.5)，离心机。

实验步骤：

使用CDNB和GSH作为底物，在25℃下用分光光度法测量GST P1-1 活性。CDNB-GSH产物在340nm处具有强吸收性，消光系数为9.6mM^-1cm^-1用于计算GST>

抑制率的计算公式为：

其中V_c代表对照组的GST>t代表处理组的GST>

目标化合物(即实施例4中制备的化合物I-1～I-16)对GSTπ抑制测定实验结果见表1。

2、化合物对人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)的生长抑制实验

实验材料和仪器：

台盼蓝染色液(台盼蓝母液4％，4g台盼蓝加水研磨，加水致100ml 过滤，4℃保存，使用时用PBS稀释到0.4％)。血细胞计数板，血细胞计数器，光学显微镜。

实验方法：

药物对细胞的抑制活性通过台盼蓝排斥法测定。称取台盼蓝，加少量 PBS研磨，加PBS稀释到4％，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该母液用PBS稀释至0.4％工作浓度。取HL-60细胞(4×10⁴/mL)接种于24>

细胞存活率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％

生长抑制率(％)＝[1-(加药孔细胞总数/对照孔细胞总数)]×100％

化合物(实施例4中制备的化合物I-1～I-16)对HL-60细胞生长抑制活性测定结果见表1。

表1.目标化合物的活性测定数据

表1实验数据表明，化合物(实施例4中制备的化合物I-1～I-16)对GSTπ具有较好的活性，虽然其该活性并不明显优于EA，但本申请的化合物对 HL-60细胞的生长显示出较强的抑制活性，其抑制活性为EA的8～276倍，明显优于EA(相同条件下EA的GI₅₀为44.2μM)。