一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法

摘要

本发明公开了一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法：将家蚕目的时期幼虫对应造血器官的部位暴露在隔离板的通孔处，通过此通孔对家蚕幼虫进行重离子射线或激光辐照刺激；当为重离子射线刺激时，剂量控制在20～40Gy；当为激光辐照刺激时，辐照时间为20s～80s。本发明较好地解决了目前家蚕幼虫血液贮藏蛋白质SP在5龄早期生产量少的问题，通过物理刺激家蚕幼虫第2、3胸节的左侧及右侧(造血器官存在部位)诱导家蚕5龄早期大量生产贮藏蛋白质SP，诱导处理可以分别提高血液贮藏蛋白质SP‑1含量15‑21％、血液贮藏蛋白质SP‑2含量14‑17％。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高家蚕幼虫血液贮藏蛋白质SP量的方法，尤其是一种通过物理刺激家蚕幼虫造血器官诱导提高5龄早期血液贮藏蛋白质SP量的方法。

背景技术

家蚕是鳞翅目的模式昆虫。家蚕的血液承担着许多重要的生理机能，其蛋白质的变化将有效揭示家蚕生理和病理方面的变化机制；特别是在蛹化及羽化等变态的重要时期，其生理结构及功能会发生巨大的变化，而这些变化是靠血液中一些重要的蛋白质、特别是贮藏蛋白质的参与完成的。家蚕血液蛋白质的功能研究处于刚起步阶段，目前国内外的相关研究及报道不多；特别是对贮藏蛋白质(Storage protein，SP)的研究几乎为零，仅知道家蚕贮藏蛋白质存在有SP-1及SP-2两种形式，其中SP-1为雌性特异蛋白质，但对他们的合成与分泌机理及其在家蚕体内的生理功能等还不清楚。虽家蚕本身能生产贮藏蛋白质，但家蚕5龄早期产生的量非常少，5龄后期虽能生产一定量的贮藏蛋白质，但饲养至5龄后期需要大量的人力和物力。因此，迫切需要有一种在5龄早期能大量生产贮藏蛋白质的方法，为开展家蚕贮藏蛋白质SP的生理功能研究及其将来的应用提供可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法，该方法通过物理刺激家蚕幼虫造血器官诱导5龄早期大量生产贮藏蛋白质SP。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法：

将家蚕目的时期幼虫对应造血器官的部位暴露在隔离板的通孔处，通过此通孔对家蚕幼虫(即家蚕幼虫的造血器官)进行重离子射线或激光辐照刺激；

当为重离子射线刺激时，剂量控制在20～40Gy；

当为激光辐照刺激时，辐照时间为20s～80s。

作为本发明的一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法的改进：

所述重离子射线为碳离子射线(¹²C⁵⁺,LET＝116keV/μm)，剂量为30Gy；

所述激光辐照为He-Ne激光仪(波长632nm，输出功率32mW，工作电流10mW)，辐照时间为30～50s。

作为本发明的一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法的进一步改进：家蚕目的时期幼虫为4龄第3天～5龄第1天的家蚕幼虫。

作为本发明的一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法的进一步改进：所述通孔的直径为3～4mm。

作为本发明的一种提高家蚕幼虫早期血液贮藏蛋白质SP量的方法的进一步改进：所述家蚕幼虫对应造血器官的部位为家蚕幼虫胸部第2、3体节的左侧及右侧部位。

在本发明中，隔离板例如可选用丙烯酸树脂板，厚度一般为2～3mm，太薄不能起到隔断的效果，太厚可以隔断，但操作上不太方便。

本发明的整体技术方案包括：家蚕目的时期幼虫的制备；家蚕造血器官的物理刺激；刺激后家蚕的继续饲养；刺激家蚕血液的收集；目的蛋白质的鉴定。

本发明的物理刺激家蚕幼虫造血器官的方法是：将家蚕幼虫胸部第2、3体节的左侧及右侧部位(造血器官存在部位)暴露在丙烯酸树脂板孔(直径3-4mm)处，对家蚕幼虫的造血器官部位进行重离子射线或激光等辐照刺激；诱导处理一定时间后收集幼虫血淋巴，通过电泳进行家蚕血液蛋白质的分析，并用免疫印迹反应进行家蚕贮藏蛋白质的鉴定，确认5龄早期是否高效生产了家蚕血液贮藏蛋白质SP。

本发明具有如下技术优势：

本发明较好地解决了目前家蚕幼虫血液贮藏蛋白质SP在5龄早期生产量少的问题，通过物理刺激家蚕幼虫第2、3胸节的左侧及右侧(造血器官存在部位)诱导家蚕5龄早期大量生产贮藏蛋白质SP，诱导处理可以分别提高血液贮藏蛋白质SP-1含量15-21％、血液贮藏蛋白质SP-2含量14-17％。

经过本发明所设定的物理刺激后，家蚕的存活率为100％。

本发明方法简单、易于实施，并且能在家蚕5龄早期大量生产贮藏蛋白质SP，缩短饲养周期，大大提高了贮藏蛋白质SP的产量及其提取的经济效率；通过硫铵沉淀、离子交换柱层析及凝胶柱层析等常规方法可以快速精制纯化该蛋白质，为进行家蚕贮藏蛋白质SP的生理功能研究及其将来的应用提供了可能。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为刺激造血器官后家蚕5龄第1天血液70kDa附近的2个蛋白质的变化结果图；

图2为用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清分别进行血液免疫印迹反应的结果图；

图3为刺激造血器官后家蚕5龄第3天血液70kDa附近的2个蛋白质的变化结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例l、一种重离子射线辐照刺激家蚕幼虫造血器官诱导5龄早期大量生产贮藏蛋白质SP的方法，依次进行以下步骤：

1、家蚕目的幼虫的制备：

将孵化蚁蚕按常规方法用桑叶或人工饲料饲养，至4龄第3天，备用。

2、家蚕造血器官的重离子射线辐照刺激(物理刺激)：

先在2.0mm厚的丙烯酸树脂板上制作直径3.5mm大小的孔，将孔对准4龄第3天幼虫第2、3胸节的左侧及右侧(造血器官存在部位)，并用透明胶带纸将幼虫部分固定，用30Gy相当的重离子射线(具体为碳离子：¹²C⁵⁺,LET＝116keV/μm，也可用相似的重离子射线)进行局部照射刺激。

3、刺激家蚕的继续饲养：

辐照刺激后的家蚕继续按常规方法用桑叶或人工饲料饲养，至5龄第1天，放到4℃环境中保存。

4、刺激家蚕血液的收集：

取出4℃保存的家蚕，针刺家蚕幼虫腹足或尾角采取血淋巴，血淋巴直接滴入含少量苯基硫脲的1.5mL Eppendorf离心管内(4℃)，静置5-10min；4℃，3000r/min离心10min，收集血清，贮于-30℃备用。作为试验组。

空白对照为：取消上述步骤2的重离子射线辐照刺激，其余同上(即为常规饲养至5龄第1天的家蚕)。

5、血液目的蛋白质的鉴定：

取上述血清按Laemmli(1970)的方法进行SDS-PAGE电泳，电泳结果显示重离子射线局部辐照造血器官后诱导家蚕大量生产了血液70kDa附近的2个蛋白质(图1)；血清经SDS-PAGE后，转写到PVDF膜上，然而用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清分别进行免疫印迹反应，结果显示该2个蛋白质分别为家蚕血淋巴贮藏蛋白质SP-1及SP-2(图2)；造血器官局部照射蚕血淋巴中的SP-1及SP-2蛋白质的浓度明显比空白对照蚕要高(表1)，差异达极显著水平(P<0.01)。

表1、造血器官重离子射线局部照射诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

注：上表中的A、B、C分别表示显著性比较达p<0.01。

对照组1-1为：将实施例1中的辐照部位造血器官改成第5体节，30Gy，其余同试验组；

对照组1-2为：将实施例1中的辐照剂量由30Gy改成10Gy，其余同试验组；

对照组1-3为：将实施例1中的辐照剂量由30Gy改成50Gy，其余同试验组。

将上述对照组1-1～对照组1-3按照上述实施例1的试验组所述方法进行检测，所得结果如表1所述。

实施例2、一种激光辐照刺激家蚕幼虫造血器官诱导5龄早期大量生产贮藏蛋白质的方法，依次进行以下步骤：

1、家蚕目的幼虫的制备：

将孵化蚁蚕按常规方法用桑叶或人工饲料饲养，至4龄第3天，备用。

2、家蚕造血器官的激光辐照刺激

先在2.0mm厚的丙烯酸树脂板上制作直径3.5mm大小的孔，将孔对准4龄第3天幼虫第2、3胸节的左侧及右侧(造血器官存在部位)，并用透明胶带纸将幼虫部分固定，用He-Ne激光仪(波长632nm，输出功率32mW，工作电流10mW)进行30s照射刺激。

步骤3～4同实施例1。

5、血液目的蛋白质的鉴定：

取上述血清按Laemmli(1970)的方法进行SDS-PAGE电泳，电泳结果显示激光局部辐照造血器官后诱导家蚕大量生产了血液70kDa附近的2个蛋白质(与实施例1所得的图1相似)；血清经SDS-PAGE后，转写到PVDF膜上，然而用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清分别进行免疫印迹反应，结果显示该2个蛋白质分别为家蚕血淋巴贮藏蛋白质SP-1及SP-2(与实施例1所得的图2相似)；造血器官局部照射蚕血淋巴中的SP-1及SP-2蛋白质的浓度明显比对照蚕要高(表2)，差异达极显著水平(P<0.01)。

表2、造血器官局部激光照射诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

对照组2-1为：将实施例2中的辐照部位造血器官改成第5体节，30s，其余同试验组；

对照组2-2为：将实施例2中的辐照剂量由30s改成10s，其余同试验组；

对照组2-3为：将实施例2中的辐照剂量由30s改成50s，其余同试验组。

对照组2-4为：将实施例2中的辐照剂量由30s改成100s，其余同试验组。

将上述对照组2-1～对照组2-4按照上述实施例2的试验组所述方法进行检测，所得结果如表2所述。

实施例3、一种重离子射线辐照刺激家蚕幼虫造血器官诱导5龄早期大量生产贮藏蛋白质的方法：

将家蚕目的幼虫改为5龄第1天；血液采样时间改为5龄第3天；其余等同于实施例1。

血液目的蛋白质的鉴定结果为：

取上述血清按Laemmli(1970)的方法进行SDS-PAGE电泳，电泳结果显示重离子射线局部辐照造血器官后诱导家蚕大量生产了血液70kDa附近的2个蛋白质(图3)；血清经SDS-PAGE后，转写到PVDF膜上，然而用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清分别进行免疫印迹反应，结果显示该2个蛋白质分别为家蚕血淋巴贮藏蛋白质SP-1及SP-2(与实施例1所得的图2相似)；造血器官局部照射蚕血淋巴中的SP-1及SP-2蛋白质的浓度明显比对照蚕要高(表3)，差异达极显著水平(P<0.01)。

表3、造血器官重离子射线局部照射诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

SP－1浓度指数SP－2浓度指数空白对照100A100A30Gy辐照(实施例3)119B116B对照组3-199A100A对照组3-2103A101A对照组3-383BC89BC

对照组3-1为：将实施例3中的辐照部位造血器官改成第5体节，30Gy，其余同试验组；

对照组3-2为：将实施例3中的辐照剂量由30Gy改成10Gy，其余同试验组；

对照组3-3为：将实施例3中的辐照剂量由30Gy改成50Gy，其余同试验组。

将上述对照组3-1～对照组3-3按照上述实施例3的试验组所述方法进行检测，所得结果如表3所述。

实施例4、一种激光辐照刺激家蚕幼虫造血器官诱导5龄早期大量生产贮藏蛋白质的方法：

将家蚕目的幼虫改为5龄第1天；血液采样时间改为5龄第3天；其余等同于实施例2。

血液目的蛋白质的鉴定为：

取上述血清按Laemmli(1970)的方法进行SDS-PAGE电泳，电泳结果显示激光局部辐照造血器官后诱导家蚕大量生产了血液70kDa附近的2个蛋白质(与实施例3所得的图3相似)；血清经SDS-PAGE后，转写到PVDF膜上，然而用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清分别进行免疫印迹反应，结果显示该2个蛋白质分别为家蚕血淋巴贮藏蛋白质SP-1及SP-2(与实施例1所得的图2相似)；造血器官局部照射蚕血淋巴中的SP-1及SP-2蛋白质的浓度明显比对照蚕要高(表4)，差异达极显著水平(P<0.01)。

表4、造血器官局部激光照射诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

SP－1浓度指数SP－2浓度指数对照100A100A30s(实施例4)117B115B对照组4-196A97A对照组4-2102A104A对照组4-3114BC111BC对照组2-485BC83BC

对照组4-1为：将实施例4中的辐照部位造血器官改成第5体节，30s，其余同试验组；

对照组4-2为：将实施例4中的辐照剂量由30s改成10s，其余同试验组；

对照组4-3为：将实施例4中的辐照剂量由30s改成50s，其余同试验组。

对照组4-4为：将实施例4中的辐照剂量由30s改成100s，其余同试验组。

将上述对照组4-1～对照组4-4按照上述实施例4的试验组所述方法进行检测，所得结果如表4所述。

对比例1、将实施例1中的家蚕目的幼虫改为4龄第1天；剂量分别为10Gy、30Gy；其余等同于实施例1。所得的家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度指数结果如下表5所述；物理刺激后家蚕的存活率如表5所述。

表5、4龄第1天造血器官局部重离子射线辐照诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓

度变化

存活率SP－1浓度指数SP－2浓度指数对照10010010010Gy辐照76％989630Gy辐照58％112106

对比例2、将实施例1中的重离子射线改用氦离子：⁴He²⁺,LET＝16.2keV/μm；剂量为30Gy；其余等同于实施例1。所得的家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度指数结果如下表6所述；物理刺激后家蚕的存活率如表6所述。

表6、造血器官氦离子射线局部照射诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

存活率SP－1浓度指数SP－2浓度指数对照10010010030Gy辐照(对比例2)1009593

对比例3、将实施例1中的孔径分别改为1.5mm、5.5mm；剂量为30Gy；其余等同于实施例1。所得的家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度指数结果如下表7所述；物理刺激后家蚕的存活率如表7所述。

表7、不同孔径局部辐照诱导家蚕血淋巴中的SP-1及SP-2的浓度变化

存活率SP－1浓度指数SP－2浓度指数空白对照100100100孔径1.5mm100104105孔径5.5mm92120115

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。