外源微生物诱导家蚕幼虫血液黑化以及黑色素代谢中间产物分析

摘要

家蚕作为一种重要的经济昆虫，在我国农业经济中占有重要地位，但是家蚕容易遭受多种病原物的侵袭，往往给国家和农民造成巨大的经济损失。家蚕是节肢动物中的重要模式昆虫，节肢动物没有像哺乳动物那样完善的获得性免疫防御系统，当有外源物侵染时，它们只能依靠先天性免疫防御系统进行广谱性应答。因此，研究家蚕先天免疫防御机制对提高家蚕抗病能力和推动蚕业发展具有重要的理论意义，此外，研究家蚕的免疫防御机制对于推进鳞翅目其他昆虫相关研究也具有重要意义，也可为鳞翅目害虫的防治提供借鉴。
　　黑色素沉积在入侵病原体的表面是节肢动物进行免疫应答的主要表现之一，黑化反应是否参与节肢动物的免疫防御早就引起了人们的关注，学者们也进行了很多的关于昆虫黑化免疫机制的研究，主要集中在果蝇和蚊子。目前关于家蚕先天性免疫的研究报道主要集中在抗菌肽、信号通路、以及模式识别蛋白受体等方面，而关于家蚕黑化免疫的报道还相对较少。本文通过对家蚕幼虫血液体外颜色变化观察、外源微生物诱导家蚕幼虫血液黑化分析、以及微生物侵染对幼虫血液中黑色素代谢中间产物含量的影响等实验来探索家蚕黑化反应在免疫防御过程中扮演的角色。主要研究结果如下:
　　1.家蚕幼虫血液体外变化观察本研究使用的毛细针可以在很大程度上阻断外界空气与针管内物质的接触。家蚕幼虫血液在毛细针中可以保持透明状较长时间。我们在三种不同的温度(37℃、室温、4℃)条件下观察毛细针中壮蚕时期的血液颜色变化。结果显示:4龄第一天血液颜色变黑变深速度最慢，5龄第六天变黑变深速度最快，有随着幼虫食桑生长血液颜色变黑变深速度逐渐加快的特点;在不同的温度条件下，37℃高温下血液变黑最快，变黑变深现象也最明显，室温次之，4℃低温条件下最慢，血液变黑速度和明显程度有随着温度的降低逐渐减弱的特点。
　　2.外源微生物诱导家蚕幼虫血液黑化分析用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白僵菌三种微生物，以微生物:血液体积比为1∶2、1∶1和2∶1三种比值在毛细针中观察4龄第三天和5龄第六天幼虫血液颜色变化。结果显示:当有外源微生物时，血液颜色变黑变深的速度明显加快;5龄幼虫血液变黑速度比4龄幼虫血液变黑速度快;当外源微生物为大肠杆菌时，血液变黑变深速度最快，现象最明显，枯草芽孢杆菌次之，白僵菌最慢;微生物:血液体积比为1∶2时，血液变黑变深速度相对较快。
　　3.家蚕幼虫血液体外对微生物生长的影响用前述微生物与4龄第三天、5龄第三天和5龄第六天的血液反应6h和24h后统计微生物的生长情况。结果显示:与5龄第六天血液反应的微生物生长最差，5龄第三天次之，4龄第三天生长相对较好;与幼虫血液反应的大肠杆菌生长比其它微生物生长差;微生物:血液体积比值1∶2的微生物生长比2∶1的生长差;反应6h的微生物比反应24h的生长差。
　　4.免疫诱导对家蚕幼虫血液中多巴、多巴胺含量影响用大肠杆菌溶液注射5龄第三天幼虫，HPLC检测注射后6h和24h幼虫血液中多巴和多巴胺含量。结果显示:注射6h后多巴含量有下降趋势，注射24h后多巴含量明显下降;注射大肠杆菌溶液后未检测到血液中多巴胺含量明显变化。
　　综上结果认为:外源微生物可以诱导家蚕幼虫血液发生黑化;家蚕幼虫血液的黑化反应能够抑制外源微生物的生长，黑化反应越强，抑制效果越好，家蚕幼虫血液黑化具有免疫防御作用;家蚕的黑化免疫可能与黑色素合成代谢有关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 概述

1．2 昆虫免疫研究进展

1．2．1 病原相关分子

1．2．2 模式识别受体

1．2．3 Toll受体及传导途径

1．2．4 Imd信号传导途径

1．3 家蚕免疫研究进展

1．3．1 家蚕免疫系统概况

1．3．2 家蚕免疫相关基因及模式识别蛋白

1．3．3 家蚕黑化免疫

第二章 引言

2．1 研究背景及意义

2．2 主要研究内容

2．3 研究的技术路线

第三章 家蚕幼虫血液体外黑化观察

3．1 材料和试剂

3．1．1 材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 主要仪器设备

3．2 方法

3．2．1 毛细针的制作

3．2．2 毛细针量体积，标刻度

3．2．3 家蚕血液提取

3．3．4 家蚕血液体外黑化观察

3．3 结果与分析

3．3．1 家蚕4龄幼虫血液体外黑化观察

3．3．2 家蚕5龄幼虫血液体外黑化观察

3．3．3 家蚕壮蚕期血液体外自然状态下黑化比较

3．4 讨论

第四章 外源微生物诱导家蚕血液黑化分析

4．1 材料和试剂

4．1．1 材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要试剂配制

4．1．4 主要仪器设备

4．2 方法

4．2．1 毛细针的制作及体积的量取

4．2．2 家蚕幼虫血液提取

4．2．3 外源微生物诱导家蚕血液

4．2．4 微生物活力检测

4．3 结果与分析

4．3．1 外源微生物诱导家蚕幼虫血液黑化

4．3．2 家蚕血液黑化对外源微生物的影响

4．4 讨论

第5章 家蚕血液中黑色素代谢中间产物的含量测定

5．1 材料和试剂

5．1．1 材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要试剂配制

5．1．4 主要仪器设备

5．2 方法

5．2．1 免疫诱导

5．2．2 多巴、多巴胺含量测定

5．3 结果与分析

5．3．1 HPLC标准曲线的制作

5．3．2 家蚕幼虫血液中多巴含量测定

5．3．3 家蚕幼虫血液中多巴胺含量测定

5．4 讨论

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表文章及参研课题情况