一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光定量PCR扩增的上游引物、下游引物和逆转录引物，所述逆转录引物中与HBV pgRNA Poly A尾进行特异逆转录部分包含15‑22个T。本发明HBV pgRNA检测试剂盒灵敏度高和特异性检测效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。HBV DNA长链为负链，位置和长度相对固定。短链为正链，其长度可变，约为负链的50％～80％。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，世界卫生组织报告全球约有20亿人感染过HBV，其中3-4亿人为慢性HBV感染。在我国肝硬化和肝癌患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60％和80％以上。现有的治疗药物主要为核苷酸类似物，虽然能够有效抑制病毒，但是存在长期用药、病毒耐药、病毒载量反弹等问题。对于慢性HBV感染患者，何时能够安全停药一直是困扰患者的一个问题，因此了解HBV感染肝细胞的机制能够有助于我们找到上述问题的原因。

通过研究者们对慢性HBV感染患者体内HBV复制机制的不断探索，目前更全面的HBV感染复制周期如下：HBV病毒颗粒通过与肝细胞表面受体结合，进入细胞，病毒DNA进入宿主细胞核后，在DNA聚合酶的作用下，形成共价闭合环状的cccDNA，以cccDNA为模板，转录形成3.5kb长的pgRNA。然后病毒DNA聚合酶启动逆转录过程，以pgRNA为模板，合成出病毒DNA，即rcDNA，合成的rcDNA一部分以Dane颗粒的形式释放到细胞外，另一部分直接返回细胞核内补充cccDNA池；但小部分核衣壳内的pgRNA未启动逆转录，直接获得外包膜，以pgRNA病毒样颗粒的形式释放到细胞外，进入血液系统。

根据HBV的复制感染机制，目前的停药指标主要有三种。一是血清HBV DNA低于检测下限作为停药的治疗终点，但研究发现该指标并不能客观反映cccDNA的转录活跃状态，有很大的病毒学反弹和疾病复发风险；二是临床上以血清HBV表面抗原(HBsAg)转阴作为临床治愈的指标，结果也不尽如人意，因为除了完整的Dane颗粒，HBsAg还有另外两种存在形式，数量远超Dane颗粒，且随着HBV病毒核酸长期存在于肝细胞内，HBV核酸片段能够整合到宿主基因组中，也能转录翻译产生HBsAg，会使多数慢乙肝患者面临着终生用药。三是cccDNA的清除，这是最理想的停药指标，但由于cccDNA存在于感染的肝细胞内，只能通过肝组织活检来判断病毒的清除和安全停药，这在临床实践中并不适用。

随着研究者对HBV感染复制机制更全面的认识，血清HBV pgRNA的水平就成了反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录活性状态的最好指标。当血清中检测不到HBV pgRNA时，提示患者肝细胞内cccDNA的消失或者转录静默，预示着可以安全停药。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光定量PCR扩增的上游引物、下游引物和逆转录引物，所述逆转录引物中与HBVpgRNA Poly A尾进行特异逆转录部分包含15-22个T。

在一种实施方式中，所述逆转录引物的Poly A与HBV pgRNA序列连接处设计有与靶标特异结合的兼并碱基GW。

在一种实施方式中，所述逆转录引物的序列依次包括HBV pgRNA荧光定量PCR的下游引物序列、15-22个T和兼并碱基GW。

在一种实施方式中，所述上游引物是针对不同基因型HBV高度保守的序列，确保不会因为HBV序列型别差异导致漏检或检测灵敏度低；所述下游引物是不同基因型HBV高度不保守的序列，以避免HBV DNA序列的干扰。

在一种实施方式中，所述上游引物序列是SEQ ID NO 1：GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTC；下游引物序列是SEQ ID NO 2：ATCGTCGTCGTAGGCTGCTC；和所述逆转录引物序列为SEQ ID NO 3：ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTGW。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括TaqMan探针，所述探针Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％。

在一种实施方式中，所述探针5’端标记的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；并且所述探针3’端标记的是一种荧光猝灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

在一种实施方式中，所述TaqMan探针序列是SEQ ID NO 11：CCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTG。

在一种实施方式中，所述试剂盒进一步包括：ROX校正液、聚合酶、逆转录酶、PCR增强剂、dUTP/UDG防污染系统、核糖核苷酸抑制剂和缓冲液。

本发明实验结果表明，在试剂盒的逆转率引物中，随着T由8增加到15，随着T数量的增加灵敏度都有所提高，15-22个T灵敏度基本一致，说明特异逆转录部分包含15-22个T时逆转录效率更高。本发明试剂盒使用的特异性逆转录引物连接处碱基GW的逆转录效果更高。另外，由于本发明逆转率引物的存在，使得本发明试剂盒有很好的特异性，有效避免样本中DNA的干扰，避免假阳。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是在本发明的试剂盒中不同数量T的特异性逆转录引物灵敏度结果图，其中A曲线为带8T逆转录引物序列结果，B曲线为带10T逆转录引物序列结果，C曲线为带12T逆转录引物序列结果，D曲线为带14T逆转录引物序列结果，E曲线为带15T逆转录引物序列结果，F曲线为带19T逆转录引物序列结果，和G曲线为带22T逆转录引物序列结果；

图2所示Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基灵敏度评价结果图，其中A曲线为Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基GW图，B为Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基VN图；

图3是本发明试剂盒检测HBV pgRNA灵敏度检测结果图，其中A为1x105copies/ml的假病毒RNA曲线,B为1x104copies/ml的假病毒RNA曲线,C为1x103copies/ml的假病毒RNA曲线,D为100copies/ml的假病毒RNA曲线；和

图4是本发明试剂盒特异性检测效果图，其中A为本发明试剂盒反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；B为文献专利反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；C为文献专利不加逆转录酶反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；D为本发明试剂盒不加逆转录酶反应体系检RNA(DNase I消化)效果图。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，所用的材料，如无特殊说明，均为本领域常规生化试剂公司购买得到的。

在下列实施例中均使用病毒RNA提取试剂盒制备样本RNA。

实施例1本发明HBV pgRNA检测试剂盒特异性逆转录引物灵敏度评价

1)引物设计

实验设计了上游引物，下游引物，带兼并碱基VN的逆转录引物，带不同数量T和特异性标签GW的HBV pgRNA特异性逆转录引物，

相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％。

上游引物序列：GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTC(SEQ ID NO 1)

下游引物序列：ATCGTCGTCGTAGGCTGCTC(SEQ ID NO 2)

逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 3)

带8T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 4)

带10T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 5)

带12T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 6)

带14T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 7)

带15T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 3)

带19T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 8

带22T逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 9)

带兼并碱基VN的逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO 10)

2)探针设计

在HBV各型别高度保守区域设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：探针：5'-FAM-CCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-BHQ1-3'(SEQ ID NO 11)

3)荧光定量PCR扩增反应

4)荧光PCR反应程序：50℃20分钟、95℃10分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。

5)所用仪器：ABI 7500、上海宏石SLAN 96P等。

6)特异性逆转录引物不同数量T灵敏度评价：本发明HBV pgRNA检测试剂盒中的逆转录引物由两部分组成，第一部分为标签序列部分，第二部分为与HBV pgRNA互补配对结合的序列部分，在反应体系中对比评价不同数量T的特异性逆转录引物灵敏度，如图1所示：A:为带8T逆转录引物序列，B:为带10T逆转录引物序列,C为带12T逆转录引物序列,D为带14T逆转录引物序列，E为带15T逆转录引物序列，F为带19T逆转录引物序列，G为带22T逆转录引物序列。结果表明随着T由8增加到15，随着T数量的增加灵敏度都有所提高，15-22个T灵敏度基本一致。说明特异逆转录部分包含15-22个T时逆转录效率更高。

7)Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基灵敏度评价：在反应体系中评价Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基GW和兼并碱基VN的灵敏度，如图2所示：A为Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基GW，B为Poly A与HBV序列连接处设计与靶标特异结合碱基VN。结果显示本发明试剂盒使用的特异性逆转录引物连接处碱基的逆转录效果更高。

实施例2本发明HBV pgRNA检测试剂盒灵敏度和特异性检测效果

1)引物设计

实验设计了上游引物，下游引物，HBV pgRNA特异性逆转录标签引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％。

上游引物序列：GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTC(SEQ ID NO 1)

下游引物序列：ATCGTCGTCGTAGGCTGCTC(SEQ ID NO 2)

逆转录引物序列:

ATCGTCGTCGTAGGCTGCTCTTTTTTTTTTTTTTTGW(SEQ ID NO 3)

2)探针设计

在HBV各型别高度保守区域设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：探针：5'-FAM-CCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-BHQ1-3'(SEQ ID NO 11)

3)荧光定量PCR扩增反应

4)荧光PCR反应程序：50℃20分钟、95℃10分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。

5)所用仪器：ABI 7500、上海宏石SLAN 96P等。

6)灵敏度评价：目前市场上HBV pgRNA检测试剂盒的灵敏度都在250copies/ml以上，本发明试剂盒最低检出限能达到100copies/ml。具体评价方式为：构建pgRNA假病毒溶液并提取RNA，用Thermo Fisher的NanoDrop分光光度计测定RNA的浓度及纯度，将原液进行梯度稀释为1x10⁵copies/ml，1x10⁴copies/ml，1x10³copies/ml，100copies/ml，并进行检测，如图3所示，A为1x10⁵copies/ml的假病毒RNA,B为1x10⁴copies/ml的假病毒RNA,C为1x10³copies/ml的假病毒RNA,D为100copies/ml的假病毒RNA。实验结果表明本发明试剂盒100copies/ml能很好检出，说明本发明试剂盒的灵敏度较市场上检测试剂盒高。

7)特异性评价：传统的DNase I虽然能消化部分样本中的DNA，但消化能力有限，而且对于未知浓度样本更不能保证完全消化，会出现假阳性。本发明试剂盒采用特异性逆转录引物来排除HBV DNA的干扰，提高HBV pgRNA的灵敏度及特异性，避免造成假阳性。具体方法为：按照天根病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，目录号：DP315-R)制备样本RNA，在裂解混合物过柱离心完全后(RNA包括残留DNA吸附到离心柱硅胶膜上)，加入去蛋白液RW1步骤前加入以下操作：取45ul DNase I buffer和5ul RNase free DNase I在离心管中轻轻吹打混匀成工作液；向吸附柱RA中央加入350ul去蛋白液RW1,12000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱RA中央加入50ul的DNase I工作液，室温放置15分钟；向吸附柱RA中加入350ul的去蛋白液RW1,12000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；接漂洗液RW步骤等后续操作完成提取。提取完成后用本发明试剂盒中的反应体系和专利文献(专利号：CN 106555013 A)报道反应体系对比体系加逆转录酶和不加逆转录酶检测效果。如图4所示，A为本发明试剂盒反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；B为文献专利反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；C为文献专利不加逆转录酶反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；D为本发明试剂盒不加逆转录酶反应体系检RNA(DNase I消化)效果图；结果显示本发明试剂盒反应体系RNA能很好检出且体系中未消化干净的DNA完全检不出，专利文献报道体系检测RNA能检出同时未消化干净的DNA也能检出，会造成假阳性，本发明试剂盒有很好的特异性，有效避免样本中DNA的干扰，避免假阳。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司

<120> 一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaggctgta ggcataaatt ggtc 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgtcgtcg taggctgctc 20

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt tttttgw 37

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcgtcgtcg taggctgctc ttttttttgw 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt gw 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt ttgw 34

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt ttttgw 36

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt tttttttttg w 41

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt tttttttttt ttgw 44

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcgtcgtcg taggctgctc tttttttttt tttttvn 37

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctactgttc aagcctccaa gctgtg 26