二型糖尿病诊断标志物

摘要

本发明公开了肠道微生物B.coprocola菌株的EDU99824.1基因可作为二型糖尿病诊断的分子标志物。本发明利用PCR和Sanger测序的方法发现EDU99824.1基因第879位点和第880位点的基因型在健康人和未用药的二型糖尿病病人肠道B.coprocola菌株中存在差异，即可以通过检测粪便基因组中EDU99824.1基因的上述两个SNP位点来判断受试者是否患有二型糖尿病。本发明的诊断试剂盒可用于二型糖尿病的诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于二型糖尿病诊断的分子标志物，具体涉及粪便基因组中B.coprocola菌株的EDU99824.1基因的SNP位点在制备诊断二型糖尿病的产品中的应用。

背景技术

二型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)是一种代谢性疾病。二型糖尿病是一种长期的代谢疾病，患者特征为高血糖，相对缺乏胰岛素，有胰岛素抗性等。常见症状有烦渴，频尿，不明原因的体重减轻。二型糖尿病主要发生在肥胖却又缺乏运动身上，具有先天基因者风险更高。

30多年来，我国成人糖尿病患病率显著增加。2010年中国疾病预防控制中心(CDC)和中华医学会内分泌学分会调查了中国18岁及以上人群糖尿病的患病情况，显示糖尿病的患病率为9.7％。2013年我国慢性病及其危险因素监测显示，18岁及以上人群糖尿病患病率为10.4％。

二型糖尿病的诊断包括血糖值检测与糖尿病特有的慢性并发症诊断：

实验室检查指标：

血糖的正常值和糖代谢异常的诊断切点主要依据血糖值与糖尿病特有的慢性并发症(糖尿病视网膜病变)和糖尿病发生风险的关系来确定。目前常用的诊断标准为空腹血糖(FPG)和糖负荷后2h血糖(OGTT)。部分国家将HbA1c(糖化血红蛋白)作为筛查糖尿病高危人群和诊断糖尿病的一种方法。HbA1c较OGTT试验简便易行，结果稳定，变异性小，且不受进食时间及短期生活方式改变的影响，患者依存性好。但鉴于HbA1c检测在我国尚不普遍，检测方法的标准化程度不够，测定HbA1c的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求。目前基于血糖检测来诊断二型糖尿病费用高且不适于普遍筛查。

慢性并发症的诊断：包括糖尿病肾病，糖尿病视网膜病变，糖尿病神经病变，下肢血管病变，糖尿病足病。慢性并发症检查的对象一般都是二型糖尿病晚期患者，不能用于早期二型糖尿病的筛查。

基于现有技术中检测二型糖尿病的手段的局限性，寻找一种有效、廉价的能够在早期诊断或筛查二型糖尿病的方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于二型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)早期诊断的分子标志物。相比于传统的二型糖尿病的诊断方法，使用肠道微生物B.coprocola(Bacteroides coprocola)菌株的基因SNP来诊断二型糖尿病具有低成本，快速，高通量的特点，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，同时该方法也适用于二型糖尿病的大批量筛查。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测肠道微生物B.coprocola菌株中EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的产品在制备诊断二型糖尿病的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测肠道微生物B.coprocola菌株中EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的产品包括：通过PCR，实时定量PCR，Taqman探针分型，基因芯片，数字PCR，Sanger测序等方法检测EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的产品。

进一步，所述用PCR诊断二型糖尿病的产品包括扩增EDU99824.1基因的引物；所述用Taqman探针分型诊断二型糖尿病的产品包括扩增EDU99824.1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断二型糖尿病的产品包括扩增EDU99824.1基因的引物；所述用基因芯片诊断二型糖尿病的产品包括扩增EDU99824.1基因的引物；所述用数字PCR的方法包括扩增EDU99824.1基因的引物；所述用Sanger测序的方法包括扩增EDU99824.1基因的引物。

在本发明的具体实施方案中，扩增EDU99824.1基因的引物包括特异性扩增EDU99824.1基因的引物和/或非特异性扩增DU99824.1基因的引物；其中特异性扩增EDU99824.1基因的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，非特异性扩增EDU99824.1基因的引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了一种诊断二型糖尿病的工具，所述工具能够通过检测样本中B.coprocola菌株中EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型来诊断二型糖尿病。

进一步，所述诊断工具包括芯片、试剂盒或高通量测序平台。

其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人肠道微生物基因表达图谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群肠道微生物基因表达图谱，容易分析出哪个基因异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知B.coprocola菌株的EDU99824.1基因的SNP位点与二型糖尿病相关也属于B.coprocola菌株的EDU99824.1基因的SNP的用途，同样在发明的保护范围之内。

进一步，所述芯片包括基因芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的寡核苷酸探针；所述基因芯片可用于检测包括EDU99824.1基因在内的多个基因(例如，与二型糖尿病相关的多个肠道微生物基因)。通过将多个与二型糖尿病相关的标志物同时检测，可大大提高二型糖尿病的准确率。

进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的试剂。

更进一步，所述试剂包括使用PCR，Taqman探针分型，实时定量PCR，基因芯片，数字PCR的方法检测EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型所需的试剂。

优选地，所述试剂包括针对EDU99824.1基因的引物和/或探针。根据EDU99824.1基因的核苷酸序列及特异的SNP位点信息容易设计出可以用于检测EDU99824.1基因的SNP位点的引物和探针。

与EDU99824.1基因和EDV01869.1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所以探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。

进一步，所述高通量测序平台包括检测EDU99824.1基因第879位点和/或880位点的基因型的试剂。

进一步，所述检测B.coprocola菌株中EDU99824.1第879位点和/或880位点的基因型的试剂包括针对EDU99824.1基因的引物和/或探针。

更进一步，扩增EDU99824.1基因的引物包括特异性扩增EDU99824.1基因的引物和/或非特异性扩增DU99824.1基因的引物；其中特异性扩增EDU99824.1基因的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，非特异性扩增EDU99824.1基因的引物序列如SEQ IDNO.7-SEQ ID NO.10所示。

本发明所述的用于诊断二型糖尿病的EDU99824.1基因的来源为受试者肠道微生物基因组DNA。在本发明的具体实施方案中，用于诊断二型糖尿病的EDU99824.1基因的来源是粪便样本基因组DNA。

NCBI提供的EDU99824.1基因参考基因序列如SEQ ID NO.11所示。

在本发明的上下文中，“诊断二型糖尿病”既包括判断受试者是否已经患有二型糖尿病，也包括判断受试者是否存在患有二型糖尿病的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次从肠道微生物基因组DNA中采用PCR的方法特异扩增出B.coprocola菌的基因，首次发现了肠道微生物B.coprocola菌EDU99824.1基因的SNP位点基因型与二型糖尿病的相关性，通过检测受试者中EDU99824.1基因特异的SNP位点基因型，可以判断受试者是否患有二型糖尿病，或者判断受试者是否存在患有二型糖尿病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的肠道微生物基因分子标记物EDU99824.1基因SNP位点，相比传统的检测手段，针对肠道微生物基因的诊断为二型糖尿病的诊断提供了新的方法，也为临床治疗二型糖尿病提供了新的参考价值。

附图说明

图1显示EDU99824.1基因突变区域比对结果图；

图2显示EDU99824.1部分基因进化树分析结果图，其中A：聚类结果图；B：突变位点分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或说明书建议的条件。

实施例 筛选与二型糖尿病相关的肠道微生物B.coprocola菌中EDU99824.1基因的SNP位点

1、研究对象

二型糖尿病组：随机抽取医院内分泌科收治的74例二型糖尿病初诊患者，纳入标准：符合《WHO1999年糖尿病诊断标准》。

正常组：选取健康志愿者77例。

所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。

2、粪便基因组DNA的提取

取已保存于-80℃冰箱的粪便样本200g，使用天根粪便基因组DNA提取试剂盒按照《天根粪便基因组DNA提取说明书》的操作流程，提取粪便样本基因组DNA。

3、DNA纯度检测

DNA纯度：OD260/OD280比值是衡量DNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的DNA样品，OD260/OD280值在1.8左右。

4、PCR扩增目的基因

(1)引物设计

根据Genbank中EDU99824.1基因的编码序列设计PCR扩增产物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。所合成的能够特异扩增目的基因(二次PCR引物)的具体引物序列如下：

第一对特异性扩增引物：

正向引物5’-ACACTCTCCAAAGCCTCTGC-3’(SEQ ID NO.1)，

反向引物5’-AAAGGCATGTGCTGTTGCTG-3’(SEQ ID NO.2)

第二对特异性扩增引物：

正向引物5’-CCCCTAATCCAGCAACAGCA-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物5’-GCAAGCGAGAAAAATGGGCA-3’(SEQ ID NO.4)

第三对特异性扩增引物：

正向引物5’-ATACAGAATCACGTCCCGGC-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物5’-TGCAGTTTGATGGTCAGCCT-3’(SEQ ID NO.6)

所合成的能够非特异扩增目的基因(一次PCR引物)的具体引物序列如下：

第一对非特异性扩增引物：

正向引物5’-CTTTCGGGTCATTATCACGTACAAG-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物5’-TAGCTTAGACCGTATAAATTCGGGG-3’(SEQ ID NO.8)

第二对非特异性扩增引物：

正向引物5’-TCGTATTTTGCACATCCTCTCCTAT-3’(SEQ ID NO.9)

反向引物5’-TCAGATAAAGATTGTTGCACGTCAC-3’(SEQ ID NO.10)

(2)扩增方式采用普通PCR，运用二次扩增的方式，选用预先设计好的两对非特异扩增引物进行一次PCR(20μl体系)，反应体系见表1，反应条件：94℃3min，(94℃30s，58℃30s，72℃2min)*40个循环，72℃5min。选用预先设计好的三对特异性扩增引物进行二次PCR(30μl体系)，反应体系见表2，反应条件：94℃3min，(94℃30s，55℃30s，72℃2min)*40个循环，72℃5min。

表1一次PCR反应体系

表2二次PCR反应体系

试剂体积正向引物0.6μl反向引物0.6μl天根2×Pfu PCR MasterMix15μl模板1μlddH₂O补足30μl

5、检测目的条带

采用普通琼脂糖凝胶电泳的方法(电泳条件：1％胶；1×TAE电泳缓冲液；90v，30分钟)检测目的条带。

6、PCR产物测序

PCR产物通过Sanger测序。

7、测序结果分析

用MEGA7和RAxML对得到的测序结果做进化树分析，用SeqMan统计序列中的SNP。

8、结果

结果如图1和图2所示，与NCBI提供的EDU99824.1基因参考基因序列相比(Ref)，40例健康人(HC)在EDU99824.1基因的第879位点(图1中的a位点)发生突变，该位点由A碱基突变为G碱基，但编码的氨基酸未发生变化，仍然为谷氨酸，属于同义突变；而39例二型糖尿病患者(T2D)在EDU99824.1基因的第880位点(图1中的a+1位点)发生突变，该位点由C碱基变为了T碱基，编码氨基酸由脯氨酸变为了丝氨酸，属于错义突变。

图2A中三角形代表健康人，圆点代表糖尿病患者，聚类结果明显分为两类，第一类主要是糖尿病患者，健康人集中在第二类，图2B是相应的突变位点分析，第一类发生的都是第880位点的突变，第二类发生879位点的突变或者不发生突变，OR(odds ratio)值为3.65，卡方检验p＝3.8×10^-4，表明B.coprocola菌EDU99824.1基因的第879位点基因型与880位点基因型在糖尿病患者和健康人之间有显著差别。

上述实例的说明只适用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 二型糖尿病诊断标志物

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acactctcca aagcctctgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaggcatgt gctgttgctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccctaatcc agcaacagca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaagcgaga aaaatgggca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atacagaatc acgtcccggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcagtttga tggtcagcct 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagcttagac cgtataaatt cgggg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcgtattttg cacatcctct cctat 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcagataaag attgttgcac gtcac 25

<210> 11

<211> 2100

<212> DNA

<213> Bacteroides coprocola

<400> 11

atgaaaaaca gaagtatttt attagggtgt ttgggagcta tgctttgtat tacaagtatg 60

gctcagacta cagaagattt tccaaaaaaa cagaaacctt ggtctgtacg aatggccgaa 120

tcggaaatgg tacgtaatcc agaatcttgg caagtagatt ttcagccttc tttaaaatgg 180

gattattgcc atggattaga attgggggct atgatggatg tgtatgatcg atatggcgat 240

tcgaaatttt atgattatgc gctggcgtat gcagatacaa tggtaaatga ggatgggaca 300

ataaagaaat ataagttgac agattatagc ttagaccgta taaattcggg gaaaatgctt 360

ttccggattt atgagcagac taaggatgaa aaatataaaa aggctttaaa tctgttgaga 420

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tgtaagttaa cagcagaaga gggagttgat aaagtttatt taggaagacc atggcgcccg 1860

tacgcttata ctttatttat gaattgtgaa ttaggaaagc atatagtaaa agctggttgg 1920

gataattgga gaaatcctaa aaacgaaaag acagctcgtt atgcagagta taagaacacg 1980

ggagaaggag ctgatataag tcagcgtgta agttgggcac ggcaattatc tgataaagat 2040

gttaagatgc tggtgaaatc tgagttctat actttctcga atacatggga tttgtactaa 2100